Summary
يتم تصنيع الجسيمات النانوية أكسيد الحديد عن طريق إجراء هلام سول غير ية ومغلفة بجزيئات قصيرة أنيونية أو بوليمر. 10- ويُثبت استخدام علم المغنطيسية لرصد دمج الجسيمات النانوية المغنطيسية في الخلايا الجذعية البشرية والكائنات الحية في داخلها باستخدام مقياس مغناطيسي لعينة تهتز.
Abstract
جسيمات نانوية مغناطيسية، مصنوعة من أكسيد الحديد، تمثل مصلحة غريبة لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية التي غالبا ما يتم استيعابها في الخلايا ثم تترك داخل. ويتمثل أحد التحديات في تقييم مصيرهم في البيئة داخل الخلايا بمنهجيات موثوقة ودقيقة. هنا، نقدم استخدام مقياس المغنطيسية العينة تهتز (VSM) لتحديد بدقة سلامة الجسيمات النانوية المغناطيسية داخل الخلايا عن طريق قياس لحظتها المغناطيسية. الخلايا الجذعية هي الأولى وصفت مع نوعين من الجسيمات النانوية المغناطيسية; الجسيمات النانوية لديها نفس النواة المنتجة عن طريق الميكروويف سريعة وفعالة القائمة على تخليق هلام سول غير ناظر وتختلف في طلاء: يتم مقارنة جزيء حمض الستريك شائعة الاستخدام إلى حمض polyacrylic. ثم يتم تحقيق تشكيل الخلايا ثلاثية الأبعاد عن طريق الطرد المركزي ويتم قياس اللحظة المغناطيسية لهذه الـ spheroids في أوقات مختلفة مع VSM. لحظة الحصول عليها هي بصمة مباشرة من سلامة الجسيمات النانوية ، مع انخفاض القيم التي تدل على تدهور الجسيمات النانوية. بالنسبة لكل من الجسيمات النانوية ، تقل اللحظة المغناطيسية خلال وقت الثقافة مما يكشف عن تحللها الحيوي. كما يظهر تأثير وقائي من طلاء حمض polyacrylic، بالمقارنة مع حمض الستريك.
Introduction
هناك اهتمام متزايد في الميزات المغناطيسية للجسيمات النانوية أكسيد الحديد لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية. استجابتها للرنين المغناطيسي يجعلها عوامل التباين موثوقة للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، ميزة في الطب التجديدي حيث يمكن تتبع الخلايا المسماة بالجسيمات النانوية المغناطيسية في الجسم الحي بعد زرع1. باستخدام المجالات المغناطيسية، يمكن أيضا أن تسترشد الخلايا على مسافة؛ بهذه الطريقة، يمكن هندسة الخلايا spheroids2،3، حلقات4، أو أوراق5 مغناطيسيا وأيضا حفزت عن بعد6، وهو أصل في تطوير الأنسجة سقالة خالية. وتشمل مجموعة من الاحتمالات لهذه الجسيمات النانوية أيضا أنظمة تسليم المخدرات7,8 و المغناطيسية والمستحثة ضوئيا العلاج فرط الحرارة لقتل الخلايا السرطانية9,10,11. لجميع هذه التطبيقات، يتم دمج الجسيمات النانوية في البيئة البيولوجية إما عن طريق الحقن الوريدي أو عن طريق استيعاب مباشر في الخلايا ثم يتم تركها داخل، مما يشكك في مصيرها داخل الخلايا.
في تحليلات فيفو نقل فهم عام للمصير الجسيمات النانوية في الكائن الحي: عند الحقن في مجرى الدم، يتم التقاطها لأول مرة في الغالب من قبل الضامة للكبد (خلايا كوبفر)، الطحال ونخاع العظام، تتحلل تدريجيا، والانضمام إلى بركة الحديد للكائن الحي12،13،14،15،16،17،18،19. الملاحظات النوعية غير ممكنة إلا بسبب دوران الجسيمات النانوية في جميع أنحاء الكائن الحي. عادة، يمكن استخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM) لمراقبة الجسيمات النانوية بشكل مباشر ويمكن تحديد وجود الحديد في الأعضاء عن طريق الجرعة. في الآونة الأخيرة ، تم تقييم مصيرهم مباشرة على مجموعة من الخلايا ، وهذا يعني في دائرة قريبة مع عدم وجود هروب الحديد ، والسماح للقياس الكمي من التحولات الحيوية على مستوى الخلية20،21،22. ويمكن إجراء هذه القياسات من خلال تحليل الخصائص المغناطيسية للجسيمات النانوية التي ترتبط ارتباطاً وثيقاً بسلامتها الهيكلية. تذبذب العينة علم المغنطيسي (VSM) هو تقنية حيث تهتز العينة بشكل دوري بحيث لفائف قياس تدفق الناجمة يوفر لحظة المغناطيسي للعينة في المجال المغناطيسي التطبيقية. هذا الكشف المتزامن يسمح للقياس السريع ، وهو أحد الأصول لتحديد اللحظات المغناطيسية لعدد كبير من العينات20،21،22،23. ثم يعطي التوقيع المغناطيسي العياني الذي يسترجعه VSM نظرة عامة كمية عن العينة البيولوجية بأكملها المرتبطة مباشرة بحجم وهيكل الجسيمات النانوية. على وجه الخصوص، فإنه يوفر لحظة المغناطيسي في التشبع (أعرب في الاتحاد الاقتصادي والنقدي) من العينات، وهو تحديد كمي مباشر لعدد الجسيمات النانوية المغناطيسية الموجودة في العينة، على التوالي لخصائصها المغناطيسية المحددة.
وقد تبين أن معالجة داخل الخلايا من الجسيمات النانوية المغناطيسية يرتبط بإحكام إلى ميزاتها الهيكلية20. ويمكن التحكم في هذه الميزات عن طريق بروتوكولات التوليف الأمثل. كل بروتوكول يعرض مزايا وقيود. يتم تصنيع جسيمات أكسيد الحديد النانوية عادة في المحاليل مائي عن طريق coprecipitation من أيونات الحديد24. للتغلب على قيود الجسيمات النانوية تعدد التخصصات، وقد وضعت أساليب التوليف الأخرى مثل بوليول بوساطة سول هلام أساليب25. النهج غير المتخصصة من قبل التحلل الحراري يؤدي إلى إنتاج الجسيمات النانوية أكسيد الحديد جيدا جدا معايرة26. ومع ذلك، فإن استخدام كميات هائلة من المواد السطحية مثل الأوليلامين أو حمض الأوليك يعقد وظيفيتها ونقل المياه للتطبيقات الطبية الحيوية. لهذا السبب، ونحن توليف هذه الجسيمات النانوية المغناطيسية من خلال مسار هلام سول غير ية مما يؤدي إلى البلورة العالية، والنقاء والتكرار27. ينتج هذا البروتوكول جسيمات نانوية الحجم التي يتم التحكم فيها بشكل جيد ويمكن ضبطها من خلال تباين درجة الحرارة28. ومع ذلك، فإن الطريق غير مائي سول هلام بمساعدة الميكروويف لديه الحد الأقصى للجسيمات النانوية التي تم الحصول عليها من حوالي 12 نانومتر. ولن يتم تكييف هذا الإجراء للتطبيقات التي تستخدم الجسيمات المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى التوليف الأساسي، ميزة رئيسية أخرى للنظر فيها هي طلاء. الكذب على سطح الجسيمات النانوية، يعمل الطلاء كجزيء الرسو، مما يساعد على استيعاب المستهدفة من الجسيمات النانوية، أو أنها يمكن أن تحمي الجسيمات النانوية من التدهور. منذ البنزيل الكحول بمثابة مصدر الأكسجين ويغاند في نفس الوقت، يتم إنتاج جسيمات نانوية عارية دون الحاجة إلى مواد سطحية إضافية أو يغاند. ثم يتم اسطح جسيمات النانو وظيفية بسهولة بعد التوليف دون عملية تبادل السطحي.
هنا، يتم تقييم نوعين من الجسيمات النانوية التي تمتلك نفس النواة وتختلف في الطلاء. يتم تصنيعها الأساسية باستخدام تقنية الميكروويف سريعة وعالية الكفاءة على أساس. الطلاء اثنين مقارنة تتكون من حمض الستريك، واحدة من أكثر تستخدم كعامل طلاء في التطبيقات الطبية الحيوية29،30، وحمض polyacrylic (PAA) ، وطلاء البوليمر مع عدد كبير من وظائف chelating. ثم يتم استخدام قياسات قياس المغنطيسية VSM أولاً لتحديد امتصاص الجسيمات النانوية من قبل الخلايا، ثم كتقييم مباشر للسلامة الهيكلية للجسيمات النانوية عند الاستيعاب الداخلي في الخلايا الجذعية. وتبين النتائج أن تركيز الحضانة يؤثر على امتصاص الجسيمات النانوية وأن الطلاء يؤثر على تدهورها، مع وجود عدد كبير من جزيئات الرسو من PAA التي تحمي القلب من التدهور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليف الجسيمات النانوية المغناطيسية
- التوليف الأساسي – بمساعدة الميكروويف
- تذوب 400 ملغ من الحديد (الثالث) أسيتيlacetonate (> 99.9٪ في 10 مل من الكحول البنزيل (بكالوريوس، 99.8٪ داخل 30 مل أحادية الموجات الزجاج القارورة.
- زيادة درجة حرارة التعليق من 25 إلى 250 درجة مئوية في 20 دقيقة (بمعدل 11.25 درجة مئوية / دقيقة) والحفاظ عليه عند 250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام مفاعل الميكروويف.
- نقل الجسيمات النانوية الناتجة المعلقة في الكحول البنزيل إلى قارورة زجاجية وفصل الجسيمات النانوية باستخدام مغناطيس النيودميوم لمدة 30 دقيقة.
- غسل الترسبات في القارورة الزجاجية السابقة 100 مل مع 10 مل من ثنائي كلوروميثان، 1 M هيدروكسيد الصوديوم، الإيثانول، درجة الH 7 الماء (ثلاث مرات) باستخدام مغناطيس النيوديميوم لمدة 5 دقائق كل خطوة لتكوير الجسيمات النانوية وإزالة عظمى.
- ضبط تعليق الجسيمات النانوية في الماء إلى درجة الحموضة 2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك M 1، ومن ثم الطرد المركزي في 100 مرشحات طاردة فائقة في 2200 x ز لمدة 10 دقيقة.
- إزالة الترشيح، إضافة 12 مل من 10-2 M حمض الهيدروكلوريك إلى حل الجسيمات النانوية والطرد المركزي في 100 مرشحات 100 KDa الطرد في 2200 × ز لمدة 10 دقيقة (ثلاث مرات). ثم تخفيف حل الجسيمات النانوية داخل 10 مل من حمض الهيدروكلوريك10 -2 M قبل الطلاء.
- طلاء
- تمييع 175 ملغ من حمض الستريك وحمض بولياكريل في الماء في درجة الحموضة 2 في قارورة زجاجية 100 مل وتعديل درجة الحموضة إلى 2 مع محلول حمض الهيدروكلوريك 1 M.
- إضافة جسيمات نانوية 10 مل مائي تشتت إلى الحل جزيء الطلاء، المقابلة لنسبة كتلة من 5 بين جزيء الطلاء والجسيمات النانوية. تهيج لمدة 2 ساعة تحت التحريك المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة.
- بعد التفاعل، ضبط درجة الH إلى 7 مع 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
- الطرد المركزي حل الجسيمات النانوية 3 مرات مع المياه deionized (DI) في 100 مرشحات 100 KDa طاردة للغاية في 2200 × ز لمدة 10 دقيقة؛ إزالة الترشيح وتمييع حل الجسيمات النانوية في 12 مل من المياه DI.
2. الثقافة ووضع العلامات المغناطيسي للخلايا الجذعية
- ثقافة الخلايا الجذعية المسكية البشرية (MSC) في كامل Mesenchymal الخلايا الجذعية نمو المتوسطة (MSCGM) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. عندما تكون الخلايا في التقاء 90٪ ، أضف 10 مل من التربسين -EDTA قبل تسخينها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لكل 150 سم قارورة مربعة واترك لمدة 2-3 دقائق لفصل الخلايا.
- لمعرفة متى يتم فصل الخلايا، لاحظ لهم مع المجهر حقل مشرق. إعادة تعليق الخلايا المنفصلة في MSCGM وتقسيمها إلى أربع قارورة 150 سم مربع. تضخيم الخلايا بهذه الطريقة حتى مرور 4 إلى 5.
- إعداد حل من الجسيمات النانوية المغناطيسية لوضع العلامات الخلية: تفريق التركيز المختار من الجسيمات النانوية أكسيد الحديد في مصل خال من روزويل بارك معهد النصب التذكاري المتوسط (RMPI-1640) دون الجلوتامين. يستخدم نظام RPMI لاحتضان الجسيمات النانوية (وخطوات الشطف ذات الصلة) حيث أن له قوة أيونية أقل من DMEM ويمنع بشكل أفضل أحداث تجميع الجسيمات النانوية.
- عندما تكون الخلايا في مرور 4 أو 5 و 90٪ التقاء، وإزالة المتوسطة MSCGM، وشطف الخلايا مع الدم مجانا RPMI (دون الجلوتامين) وإضافة 10 مل من الحديد أكسيد جزيئات نانوية حل لكل 150 سم2 قارورة الثقافة، وهو الحد الأدنى من حجم المطلوب لتغطية جميع الخلايا.
- احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة ثم تجاهل حل الجسيمات النانوية. غسل مرة واحدة مع المصل مجانا RPMI-1640 (لا الجلوتامين) واحتضان مع Dulbecco معدلة النسر المتوسط (DMEM) تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستربتوميسين (25 مل لكل 150 سم2 قارورة) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح بتمويل استيعاب الجسيمات النانوية.
3. تشكيل الخلايا الجذعية- spheroids
- إعداد حديثا خلية-spheroid ثقافة المتوسطة تتألف من DMEM ارتفاع الجلوكوز مع L-الجلوتامين تستكمل مع 50 ميكرومتر L-اسكوربيك حمض 2-الفوسفات, 0.1 ميكرومتر dexamethasone, 1 mM بيروفات الصوديوم, 0.35 mM L-proline, و 1٪ ملحق الثقافة العالمية التي تحتوي على الأنسولين, الإنسان Transferrin وحمض سيلينوس (ITS-Premixx).
- فصل MSCs المغناطيسي بإضافة 10 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA قبل warmed عند 37 درجة مئوية لكل 150 سم2 قارورة لمدة 2-3 دقائق. عندما يتم فصل الخلايا، فورا تعطيل التربسين بإضافة 1/3 من حجم DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين قبل warmed في 37 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الخلايا المتفككة في 260 × ز لمدة 5 دقائق، وpirate وسائل الإعلام وإعادة تعليق الخلايا في حجم صغير (أقل من 1 مل لكل 150 سم مربع قارورة) من خلية- spheroid ثقافة المتوسطة مثل وجود 200،000 الخلايا في حوالي 50 ميكرولتر من المتوسط. عد رقم الخلية باستخدام مقياس الهيموسيت وضبط مستوى الصوت إذا لزم الأمر.
- إضافة 1 مل من الطازجة خلية-spheroid ثقافة المتوسطة في أنبوب مخروطي معقم 15 مل وإضافة حجم حل resuspended المقابلة ل 200،000 الخلايا.
- الطرد المركزي هذه الخلايا المسمى مغناطيسيا في 180 × ز لمدة 3 دقائق مثل تشكيل بيليه خلية في الجزء السفلي من الأنبوب والحفاظ على supernatant، وهو متوسطة ثقافة الخلية.
- فتح أنابيب قليلا للسماح تبادل الهواء واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة تصل إلى 21 يوما، و وقت الثقافة على طول الخلايا التي تشكل هيكل 3D متماسكة التي تؤدي إلى شكل كامل spheroid. تغيير الوسط مرتين في الأسبوع.
- في أيام معينة، وغسل spheroids مرتين مع العازلة cacodylate مصنوعة من 0.2 M cacodylate المخفف في المياه demineralized وإصلاحها باستخدام 2٪ غلوتارالديهيد في 0.1 M cacodylate العازلة المخففة في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخزين spheroids الثابتة في برنامج تلفزيوني حتى استخدامها لقياس VSM أو التصوير TEM. هذه الخطوة التثبيت توقف جميع العمليات البيولوجية ويسمح الحفظ على المدى الطويل.
4. القياس الكمي للجسيمات النانوية المغناطيسية في الحل وفي السيلولو باستخدام جهاز قياس مغناطيسي لعينة تهتز (VSM)
- ضع إما حجمًا معينًا من محلول الجسيمات النانوية المغناطيسية (بحد أقصى 10 ميكرولتر) أو خلية واحدة في حامل العينة المصمم خصيصًا ليلائم VSM.
- أدخل العينة في VSM وتفحص لإزاحة العينة. ضع العينة في الموضع المقابل لأقصى مغنطة.
- قم بإجراء القياس الأول في مجال مغناطيسي منخفض (بين -1500 Oe و +1500 Oe) بمعدل 20 أوي/ث.
- إجراء قياس ثانٍ في مجال مغناطيسي عالي (بين -000 30 أوي و+000 30 أوي) بمعدل 200 أوي/ث.
5. نقل المجهر الإلكتروني (TEM) تحليل
- بالنسبة إلى حلول الجسيمات النانوية، قم بإيداع 10 ميكرولتر من المحلول مائي على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة.
- لجسيمات نانوية استيعابها في الخلايا، على النقيض من الخلايا الثابتة spheroids مع استخراج الشاي أولونغ (OTE) في 0.5٪ المخفف في 0.1 M cacodylate العازلة، بعد إصلاح مع 1٪ أوسوم تيتروبيك يحتوي على 1.5٪ سيانوفيرات البوتاسيوم ثم الجفاف في حمامات الإيثانول متدرج، المدرجة في ايبون. شريحة القطع الفائقة من 70 نانومتر وإيداعها على شبكات كوبر.
- التقاط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني في 80 كيلوفولت مع التكبير من 1K لمراقبة الخلايا بأكملها إلى 40k لمراقبة مقصورات endosomal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام التوليف بمساعدة الميكروويف، يتم إنتاج الجسيمات النانوية المغناطيسية مع أحادية الديسبيرس 8.8 ± 2.5 نانومتر حجم الأساسية ومغلفة إما مع سترات أو PAA(الشكل 1A). ثم يتم احتضان الخلايا الجذعية مع هذه الجسيمات النانوية المنتشرة في وسط الثقافة في تركيز معين لمدة 30 دقيقة، مما يؤدي إلى بطانة الرحم والحبس داخل السوسس الخلوية(الشكل 1B). ثم يتم تعليق الخلايا الجذعية المغناطيسية في المتوسط، الطرد المركزي، ويتم استزراع بيليه خلية شكلت لمدة تصل إلى 21 يوما (الشكل 1C). يتم إصلاح الـ spheroids التي تم الحصول عليها ، مثل إيقاف العمليات البيولوجية ، والاحتفاظ بها في PBS حتى يتم قياسها عبر VSM.
أولا، يتم قياس لحظة المغناطيسية من حل الجسيمات النانوية باستخدام VSM: 10μL من تشتت مائي نانوي تحتوي على 7 ميكروغرام من الحديد يتم قياسها، ويتم عرض المنحنى الذي تم الحصول عليه في الشكل 2A. بسبب وجود الماء في هذا الحل ، وإلى حامل العينة ، يتم التقاط إشارة غشاء مغناطيسي بالإضافة إلى إشارة superparamagnetic للجسيمات النانوية. يمكن قياس ثابت غشاء (Mdia)المقابل لمنحدر الجزء الثاني من المنحنى ، كما هو موضح في الشكل 2A، ويمكن طرح هذا الثابت مثل الحصول على اللحظة المغناطيسية للجسيمات النانوية فقط(M عينة = M - Mdia). ويمكن بعد ذلك استخلاص تشبع الجسيمات النانوية(M)؛ فإنه يتوافق مع 518 μemu لتشتت مائي، وهذا يعني أن الحل هو في 74 emu/g من الحديد (Fe) المقابلة ل 52 emu/g من الجسيمات النانوية (Fe3O4).
ويمكن بالمثل الحصول على اللحظة المغناطيسية لـ الخلايا اللولبية. في هذه الحالة، يتم إدراج خلية-spheroid (مصنوعة من 200،000 خلية) في حامل العينة، وضعت في VSM، وقياسها (الشكل 2B). القيم اللحظة المغناطيسية التي تم الحصول عليها هنا أقل بكثير من تلك التي حل جسيمات نانوية أولية; ومع ذلك، تظل ضمن نطاق الكشف. مغنطة التشبع من هذه العينة خاصة من 69 μemu. الى جانب ذلك ، هذا spheroid يحتوي على 1.3 ميكروغرام من الجسيمات النانوية (6.7 pg من الجسيمات النانوية لكل خلية) ، بما يتفق مع قيمة التشبع في 52 الاتحاد الاقتصادي والنقدي / غرامFe3O4. وبالتالي يمكن استخدام هذه القيمة لتحديد كمية الجسيمات النانوية في العينات الخلوية. في الشكل 2C، يتم قياس الزفيرويدات المقابلة للخلايا الموسومة بثلاثة تركيزات من الجسيمات النانوية المغلفة بالسيترات بعد يوم واحد من وضع العلامات. تظهر النتائج بوضوح أن امتصاص الجسيمات النانوية يعتمد على تركيز الحضانة ، مع تركيزات 0.125 و 0.25 و 0.5 mM مما يؤدي إلى امتصاص 0.3 و 0.7 و 1.3 ميكروغرام من الحديد لكل زهرية ، مما يعني 1.3 و 3 و 3 و 6.7 pg من الحديد لكل خلية على التوالي.
وقد تم جلب الاهتمام على أهمية طلاء السطح، الذي يتفاعل مباشرة مع البيئة البيولوجية20. وقد تم إنتاج اثنين من الطلاء هنا: طلاء سيترات، وتستخدم عادة لتطبيقات الطب الحيوي، وطلاء PAA، مع عدد أكبر من وظائف التهيج. وتوجد تسمية للخلايا الجذعية مع هذين النوعين من الجسيمات النانوية وطاردة للأجهزة مثل تشكيل بيليه الخلية التي تصبح بعد ذلك متماسكة خلية spheroid (الشكل 3A). يتم قياس المغناطيسية من هذه الخلايا spheroids عبر VSM في اليوم 1 واليوم 21 (الشكل 3B والشكل 3C). تظهر النتائج انخفاضًا في المغناطيسية على مدى 21 يومًا من الثقافة ، مما يشير إلى التحلل الحيوي للجسيمات النانوية ، وهذا التدهور أكثر أهمية للجسيمات النانوية المغلفة بالسيترات(الشكل 3B)من تلك المغلفة PAA(الشكل 3C). تؤكد صور TEM تدهور الجسيمات النانوية وتظهر ظهور نقاط رمادية فاتحة أصغر (6 نانومتر في الحجم) ، نموذجية من الفيريتين المحملة بالحديد. ويمكن أيضا ملاحظة بعض الجسيمات النانوية المتبقية سليمة، لا سيما مع طلاء PAA.
الشكل 1: توليف أكسيد الحديد بمساعدة الميكروويف (Fe3O4) الجسيمات النانوية، واستيعابها في الخلايا الجذعية والثقافة اللاحقة للخلايا كقماة. (أ) التخطيطي لمختلف الخطوات من توليف الجسيمات النانوية. أولا، يتم تصنيعها الأساسية عن طريق إجراء هلام سول غير مائي. ثم يتم تطعيم جزيء الطلاء، إما سيترات (سيت) أو حمض البولي أكريليك (PAA)، على سطح نواة أكسيد الحديد. تُظهر صورة TEM التمثيلية الجسيمات النانوية المركبة مع طلاء سيترات. (ب) التخطيطي لاداخل الجسيمات النانوية داخل الخلايا الجذعية، وتظهر الجسيمات النانوية المحصورة في إندوسومس عند استيعابها. تظهر صور TEM التمثيلية أيضًا الجسيمات النانوية المغلفة بـ PAA داخل الخلايا ، المحصورة في إندوسومات. (C) التخطيطي لتشكيل الخلايا الجذعية- spheroids. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياس العينات لحظة المغناطيسي عبر VSM. (A) 10 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المنتشرة في محلول مائي يتم قياسها عبر VSM. وتمثل الإشارة التي تم الحصول عليها اللحظة المغناطيسية لهذا الحل الجسيمات النانوية في وظيفة المجال المغناطيسي (B). ويمكن بعد ذلك قياس ال diamagnetism القادمة من وجود الماء وحامل العينة كما يتوافق مع المنحدر من الجزء الثاني من المنحنى وطرح مثل الحصول على لحظة المغناطيسية من الجسيمات النانوية فقط. يمكن بعد ذلك تحديد اللحظة المغناطيسية عند التشبع(M). (B) يمكن الحصول على لحظة مغناطيسية من الخلايا spheroids بالمثل؛ في هذه الحالة يتم قياس خلية واحدة spheroid في فترة زمنية معينة. (C) منحنيات من الزاويات المقابلة للخلايا التي تحمل علامات على الجسيمات النانوية المغلفة بالسيترات بثلاثة تركيزات مستقلة من 0.125 mM (برتقالي)، 0.25 mM (رمادي) و0.5 mM (أزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القياس الكمي لتحلل الجسيمات النانوية المغنطيسية في السليولو عبر VSM. (A) عند وضع العلامات على الخلايا مع الجسيمات النانوية المغناطيسية ، يتم تشكيل بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي (يوم 0). الخلايا ثم تشكيل بنية متماسكة مما أدى إلى سهلة لمعالجة خلية- spheroid التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة دون فقدان الخلية لفترات زمنية طويلة (أشهر). (B, C) هنا، يتم استيعاب نوعين من الجسيمات النانوية المغناطيسية، المغلفة بالسيترات(ب)أو PAA(C)،في الخلايا الجذعية ويتم استزراع الخلايا كـ spheroids لمدة تصل إلى 21 يومًا. المغناطيسية من الزفيرويدات المستزرعة لمدة 1 يوم (منحنيات البرتقال) و 21 يوما (منحنيات رمادية) تقاس مع VSM، مع انخفاض في المغناطيسية مما يدل على تدهور الجسيمات النانوية. تظهر صور TEM التمثيلية التي تم التقاطها في اليوم 21 نقاطًا رمادية فاتحة حول 6 نانومتر هو الحجم داخل إندوسومس وcytoplasm للخلايا ، والحجم النموذجي وشكل الفيريتين ، بروتين تخزين الحديد (السهام السوداء). ويمكن أيضا ملاحظة بعض الجسيمات النانوية سليمة، ومعظمها لجسيمات نانوية PAA المغلفة (السهم البني). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام توليف سريع وفعال قائم على الميكروويف، يمكن بسهولة توليف الجسيمات النانوية المغناطيسية، مع حجم تسيطر عليها، ومزيد من المغلفة مع جزيئات معينة. خطوة حاسمة هي لتخزين ملح الحديد والكحول البنزيل تحت فراغ للحفاظ على تشتت صغير في الحجم. يعمل الكحول البنزيل كما المذيبات و ligand في نفس الوقت السماح مباشرة للحصول على أكسيد الحديد العاري معايرة دون الحاجة إلى liga إضافية. بعد نقل الجسيمات النانوية في الماء يمكن أن تكون الجسيمات النانوية المغناطيسية العارية مغلفة بسهولة مع مجموعة متنوعة كبيرة من الأربطة. هذا الطلاء يمنح بين نانو جسيمات والخلايا النانوية التفاعل الخصائص التي يمكن أن تؤثر على استيعابها الخلوية، وهي المعلمة التي تحتاج إلى أن تكون خاضعة لرقابة مشددة كما مطلوب استيعاب الحد الأدنى للتطبيقات الطبية الحيوية في حين أن استيعاب عالية جدا يمكن أن تكون ضارة للخلايا ويحتمل أن تنشأ الأحداث السامة للخلايا31. علم المغنطة هو أداة قوية لتقييم هذا استيعاب فضلا عن مصير الجسيمات النانوية المغناطيسية في السيلولو. عند دمج الجسيمات النانوية المغناطيسية في الخلايا الجذعية، يمكن تشكيل الإسفنجات عن طريق طرد مركزي بسيط تتبعه الثقافة في وسط يوقف انتشار الخلايا ويدفع إنتاج المصفوفة خارج الخلية. الخلايا تصبح متماسكة للغاية والبدء في خلق الأنسجة. ثم تكون الـ spheroids سهلة التعامل معها ويمكن استزراعها لفترات زمنية طويلة (أشهر) تسمح بالتتبع طويل الأجل لمصير الجسيمات النانوية المغناطيسية في بيئة بيولوجية. من خلال وقف انقسام الخلايا ، لا يوجد تخفيف للجسيمات النانوية من الأم إلى الخلية الابنة . وعلاوة على ذلك، فقد تم التحقق من أنه، مع هذا النموذج خلية-spheroid، لا يوجد أي هروب الحديد على مدى شهر من الثقافة21،22،23. ونتيجة لذلك، يمكن أن يقابل انخفاض في قيم المغناطيسية فقط تدهور الجسيمات النانوية وليس الحديد الذي يتم تصديره من الخلايا.
المغناطيسية من الخلايا spheroids هنا يقاس عبر VSM التي توفر الكم بسرعة ودقة. كما تم استكشاف أساليب أخرى لقياس المغناطيسية الخلوية ، مثل استخدام جهاز واجهة فائقة التوصيل (SQUID) ، وهو جهاز عادة أكثر دقة من VSM مع حساسية حول 10-7 الاتحاد الاقتصادي والنقدي مقارنة مع 10-6 الاتحاد الاقتصادي والنقدي لـ VSM ، ولكن التكلفة التشغيلية أعلى32. حساسية VSM السماح قياسات جرعة الحديد المغناطيسي أدنى من 2 بيكوغرام / خلية في الإعداد التجريبية هي هنا دقيقة بما فيه الكفاية كجرعات الحديد أدنى من 2 بيكوغرام / خلية ستكون منخفضة جدا للتطبيقات المستهدفة، مثل جذب الخلايا نحو المغناطيسية لتوجيه الخلايا وهندسة الأنسجة الأغراض. يمكن لكل من VSM و SQUID علم المغنطيسية، بالإضافة إلى السماح لكم القياس الكمي لمغناطيسية الخلايا، إعطاء تفاصيل إضافية حول ميزات الجسيمات النانوية. بتحليل من الإشارة ينال, الحجم من الجسيمات nanoparticles يستطيع كنت يخصّم22,23 وأيضا فكرة عامّة من سماتهم مغنطيسيّة يستطيع كنت حصلت, إسترسيس والإكراه من مواد نانويّة يستطيع مثلا كنت كشفت. توجد أيضاً طرق بديلة لقياس المغنطيسية، مثل المغنطيسية التي تتكون في قياس سرعة الخلايا الفردية عندما تنجذب نحو مغناطيس ويتم استقراء المغناطيسية من الخلايا المفردة33،34. ويمكن الحصول على المغناطيسية على مستوى الخلية الواحدة بهذه الطريقة؛ ومع ذلك، لا يمكن تحديد ميزات جسيمات نانوية إضافية. بالإضافة إلى ذلك، تم مؤخراً استخدام جهاز استشعار مغناطيسي صغير يوفر إشارة تتناسب مع العينة المغناطيسية مع نموذج مماثل من الخلايا. هذا الاستشعار المغناطيسي يسمح لتتبع التحلل الحيوي للجسيمات النانوية المغناطيسية في الوقت الحقيقي ، بشكل مستمر ، على مدى 7 أيام35. ومع ذلك، لا يمكن ترجمة إشارة هذا المستشعر المغناطيسي مباشرة إلى لحظة مغناطيسية لأنها تعتمد على حجم الجسيمات النانوية. لهذا السبب، منحنى المعايرة يجب أن يتم تنفيذها لكل تصميم جسيمات نانوية، منحنى يمكن تحقيقه باستخدام VSM.
تُظهر القياسات التي يتم إجراؤها هنا مع VSM تدهورًا تدريجيًا للجسيمات النانوية المغناطيسية في البيئة الخلوية ، يشير إليها انخفاض في المغناطيسية. كما أنها تثبت أن نفس الأساسية المغلفة مع جزيئات مختلفة المتدهورة بمعدلات متفاوتة اعتمادا على الطلاء. عند مقارنة PAA وطلاء سيترات، وباهات يؤدي إلى حماية أعلى الأساسية للتدهور، على الأرجح بسبب رسوها قوية إلى الأساسية المغناطيسي20. يتم تقييم مصير الجسيمات النانوية المغناطيسية في البيئة داخل الخلايا على الخلايا اللوهيرويدات; ومع ذلك، الأسلوب غير محدود إليه. في الواقع، يمكن استقراء إلى تعليق الخلية، والتي استخدمت بالفعل لتقييم تأثير تمايز الخلايا الجذعية على مصير الجسيمات النانوية22. وكشفت أنه، اعتمادا على مسار التمايز، تتم معالجة الجسيمات النانوية المغناطيسية بشكل مختلف من قبل الخلايا، مع، في بعض الحالات، تبلور الحديد الجديد عند انحلاله. وبالتالي فإن قياس المغناطيسية VSM هو أداة مفيدة لمواصلة استكشاف تأثير كل من الجسيمات النانوية وملامح الخلايا على المعالجة داخل الخلايا للأجسام النانوية أكسيد الحديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم من الاتحاد الأوروبي (مشروع ERC-2014-CoG MaTissE #648779). الكتاب يود أن نعترف CNanoMat الفيزيائية الكيميائية وصف منصة جامعة باريس 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
