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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Abstract

Les procédures présentées décrivent une méthodologie généralisée pour infecter les moustiques Aedes aegypti avec le virus Zika dans des conditions de laboratoire afin de déterminer le taux d’infection, d’infection disséminée et de transmission potentielle du virus dans la population de moustiques en question. Ces procédures sont largement utilisées avec diverses modifications dans les évaluations des compétences vectorielles à l’échelle mondiale. Ils sont importants pour déterminer le rôle potentiel qu’un moustique donné (c.-à-d. espèce, population, individu) peut jouer dans la transmission d’un agent donné.

Introduction

La compétence vectorielle est définie comme la capacité au niveau de l’espèce, de la population, et même d’un individu, d’un arthropode donné tel qu’un moustique, une tique ou une phlébotomine, d’acquérir et de transmettre biologiquement un agent avec réplication ou développement chez l’arthropode1,2. En ce qui concerne les moustiques et les virus transmis par les arthropodes (c.-à-d. les arbovirus), l’agent est absorbé d’un hôte virémique par un moustique femelle. Après l’ingestion, le virus doit infecter de manière productive l’une des petites populations de cellules épithéliales de l’intestin moyen3,en surmontant divers obstacles physiologiques tels que la dégradation protéolytique par les enzymes digestives, la présence du microbiote (barrière d’infection de l’intestin moyen, ou MIB) et la matrice péritrophique sécrétée. L’infection de l’épithélium de l’intestin moyen doit être suivie d’une réplication du virus et d’une éventuelle fuite de l’intestin moyen dans le système circulatoire ouvert du moustique, ou hémolymphe, qui représente l’apparition d’une infection disséminée surmontant la barrière d’échappement de l’intestin moyen (MEB). À ce stade, le virus peut établir des infections de tissus secondaires (par exemple, les nerfs, les muscles et les corps gras) et continuer à se répliquer, bien qu’une telle réplication secondaire puisse ne pas être strictement nécessaire pour que le virus infecte les cellules acineuses des glandes salivaires (en surmontant la barrière d’infection des glandes salivaires). La sortie des cellules acineuses des glandes salivaires dans leurs cavités apicales, puis le mouvement dans le canal salivaire permettent l’inoculation du virus dans les hôtes ultérieurs lors de la morsure et complètent le cycle de transmission1,2,4,5,6,7.

Compte tenu de ce mécanisme de propagation bien caractérisé et généralement conservé au sein d’un moustique vecteur, les évaluations des compétences des vecteurs de laboratoire sont souvent méthodologiquement similaires, bien qu’il existe des différences dans les protocoles1,2. Généralement, après une exposition au virus oral, les moustiques sont disséqués de sorte que les tissus individuels tels que l’intestin moyen, les jambes, les ovaires ou les glandes salivaires peuvent être testés pour l’infection virale, l’infection disséminée, l’infection disséminée / transmission transovarienne potentielle et l’infection disséminée / la compétence de transmission potentielle, respectivement8. La simple présence d’un virus dans les glandes salivaires, cependant, n’est pas une preuve définitive de la capacité de transmission, étant donné la preuve d’une barrière d’échappement/ sortie des glandes salivaires (SGEB) dans certaines combinaisons vecteur/virus1,2,4,5,7,9. La méthode standard pour prouver la compétence de transmission reste la transmission par les moustiques à un animal sensible10,11,12. Cependant, étant donné que pour de nombreux arbovirus, cela nécessite l’utilisation de modèles murins immunodéprimés13,14,15,16, cette méthode est souvent prohibitive. Une alternative couramment utilisée est la collecte de la salive du moustique, qui peut être analysée par réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-PCR) ou un test infectieux pour démontrer la présence du génome viral ou de particules infectieuses, respectivement. Il convient de noter que de telles méthodes de collecte de salive in vitro peuvent surestimer12 ou sous-estimer17 la quantité de virus déposée lors de l’alimentation in vivo, ce qui indique que ces données doivent être interprétées avec prudence. Néanmoins, la méthode in vitro est très précieuse lorsqu’elle est analysée du point de vue de la simple présence de virus dans la salive, indiquant un potentiel de transmission.

Deux approches majeures existent pour déterminer le rôle des moustiques vecteurs dans les épidémies de maladies arbovirales. La première méthode implique une surveillance sur le terrain, dans laquelle les moustiques sont collectés dans le cadre de la transmission active18,19,20,21,22,23,24. Cependant, étant donné que les taux d’infection sont généralement assez faibles (p. ex., le taux d’infection estimé à 0,061 % des moustiques dans les zones de circulation active du virus Zika (ZIKV) aux États-Unis21), l’incrimination des espèces vecteurs potentielles peut être fortement biaisée par la méthode de piégeage25,26 et le hasard aléatoire (p. ex., échantillonnage d’une personne infectée sur 1 600 non infectées)21 . Compte tenu de cela, une étude donnée peut ne pas acquérir suffisamment de moustiques en nombre brut ou en diversité d’espèces pour échantillonner avec précision les moustiques impliqués dans la transmission. En revanche, les analyses de compétence vectorielle sont effectuées en laboratoire, ce qui permet un contrôle strict de paramètres tels que la dose orale. Bien qu’elles ne soient pas entièrement capables de représenter la véritable complexité de l’infection par les moustiques et de la capacité de transmission sur le terrain, ces évaluations en laboratoire demeurent des outils puissants dans le domaine de l’arbovirologie.

Sur la base de diverses analyses de compétence vectorielle avec ZIKV chez plusieurs espèces, populations et méthodes de moustiques27,28,29,30,31,32, ainsi que d’un examen récent des évaluations de compétence vectorielle1, nous décrivons ici plusieurs des protocoles associés à un flux de travail de compétence vectorielle typique. Dans ces expériences, trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (la ville de Salvador, Brésil; République dominicaine; et la basse vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une seule souche de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) à des doses de 4, 5 ou 6 log10 unités focalisantes (FFU) / mL au moyen de farines de sang artificielles. Par la suite, ils ont été analysés pour détecter des signes d’infection, d’infection disséminée et de compétence en matière de transmission après diverses périodes d’incubation extrinsèque (2, 4, 7, 10 et 14 jours) au moyen d’une dissection et d’un test infectieux basé sur la culture cellulaire. Bien que le flux de travail et les protocoles actuels soient optimisés pour le ZIKV, de nombreux éléments sont directement transposables à d’autres arbovirus transmis par les moustiques dans les niveaux de confinement et de biosécurité des arthropodes 2 et 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).

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Protocol

Toutes les procédures effectuées dans le cadre de ces protocoles ont été effectuées en pleine conformité avec les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité et le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston.

1. Amplifier le ZIKV dans les cellules Vero

  1. Cultiver des cellules Vero (CCL-81 ou VeroE6) dans la modification par Dulbecco du milieu essentiel minimal (DMEM) d’Eagle complété par 10% v/v de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 1% (v/v) de pénicilline-streptomycine (100 U/mL et 100 μg/mL, respectivement) dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 à une confluence comprise entre 80 et 90% dans une fiole de culture tissulaire de 150 cm2.
  2. Dans une armoire de biosécurité (ESB), retirer le milieu et éliminer soit dans de l’eau de Javel à 10 %, soit dans une dilution de travail de l’ammonium quaternaire double(Table des matériaux). Inoculer immédiatement la monocouche avec 1 mL de stock viral, en visant 0,1−1 particule virale infectieuse par cellule. Agiter immédiatement la fiole de telle sorte que l’inoculum entre en contact avec la monocouche dans son intégralité.
  3. Complétez le milieu jusqu’à un volume de 5 mL à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2 % v/v et une pénicilline-streptomycine à 1 % (v/v). Déplacez ensuite la fiole dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 60 min.
  4. Retirez la fiole de l’incubateur et apportez-la dans un ESB. Ajouter un milieu supplémentaire à un volume total de 15 mL à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2 % v/v et une pénicilline-streptomycine à 1 % (v/v). Déplacer la fiole dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.
  5. Examiner la fiole quotidiennement en microscopie à contraste de phase pour détecter des effets cytopathiques (EPC). Procéder à la récolte virale (étape 1.7) lorsqu’il ne reste qu’environ 40 à 50 % des cellules dans la monocouche, généralement 3 à 5 jours après l’infection, selon la souche de ZIKV utilisée.
  6. Aspirer le surnageant et le placer dans un flacon conique de 50 mL. Clarifier le surnageant des débris cellulaires par centrifugation (3 500 x g pendant 20 min).
    REMARQUE: Si plusieurs flacons ont été infectés de manière identique, les surnageants de plusieurs flacons peuvent être combinés en tubes coniques de 50 mL.
  7. Retirez le surnageant du tube conique de 50 mL pour le faire sortir d’un tube frais, en prenant soin de ne pas perturber la pastille. Complétez le surnageant avec du FBS inactivé par la chaleur jusqu’à une concentration finale de 30% (v / v). Aliquoter ce mélange dans des tubes de bouchon à vis individuels et congeler à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation de farines de sang artificielles

  1. Le jour où les moustiques doivent être exposés à des farines sanguines infectieuses, allumez la source d’alimentation (Table des matériaux) dans une installation de confinement des arthropodes de sorte que les unités d’alimentation (Table des matériaux) soient préchauffées au moment où les moustiques sont préparés pour l’exposition.
  2. Préparez des farines de sang artificielles en utilisant l’une des méthodes décrites ci-dessous.
    1. Méthode 1 : Mélanger du sang humain fraîchement récolté (dans un délai d’une semaine) citré ou héparinisé acheté dans le commerce 1:1 v/v avec du matériel viral (préparé comme décrit à la rubrique 1).
      REMARQUE: Cette méthode est subordonnée à l’absence d’anticorps contre la famille de virus / virus présents dans le sang.
    2. Si l’absence d’anticorps ne peut être confirmée ou si la source de sang est connue pour avoir déjà été exposée au flavivirus, laver et emballer manuellement les érythrocytes.
      1. Dans un ESB, ajouter 30 mL de sang humain total dans un tube conique de 50 mL et compléter jusqu’à 50 mL avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Centrifuger à 3 500 x g pendant 20 min.
      3. Aspirer le surnageant soit en versant doucement dans un plateau contenant soit 10% d’eau de Javel, soit en travaillant une dilution d’ammonium quaternaire double, en prenant soin de ne pas jeter la pastille érythrocytaire.
      4. Ajouter 10 mL de PBS et tapoter doucement le fond du tube conique contre le fond du BSC de manière à reconstituer la pastille érythrocytaire. Porter le volume de la suspension jusqu’à 50 mL avec PBS. Mélanger par inversion douce.
      5. Répétez les étapes 2.2.2.1−2.2.2.4 un total de 4−6x. Confirmez que le surnageant est clair ou seulement légèrement rose et n’est plus opaque. Retirez tout le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Remettre en suspension la pastille érythrocytaire dans 1−2 mL de PBS.
      6. Assembler la farine de sang : 350 μL d’érythrocytes emballés, 100 μL de saccharose à 10 %, 200 μL de FBS inactivé par la chaleur, 900 μM d’ATP recombinant et 2 mL de stock de virus dilué de manière appropriée à l’aide de DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur à 2 % v/v et de 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine.
  3. Superposez une unité de réservoir standard de 3 mL(Table des matériaux)avec la peau d’une souris non infectée (d’autres options incluent un film de paraffine, des membranes collagènes ou un boyau de saucisse).
  4. Placez le réservoir couvert sur des serviettes en papier blanc. Ajouter ~2 mL de farine de sang infectieuse au réservoir 1 mL à la fois. Inspectez la serviette sous le chargeur pour détecter toute preuve de fuite. Si des fuites sont présentes, récupérez la farine de sang des mangeoires et jetez les couvercles. Scellez les mangeoires avec des bouchons. Une fois de plus, confirmez qu’aucune fuite n’est présente.

3. Contre-titrage des farines de sang/dosage de la plaque

  1. En utilisant le volume restant de la farine de sang préparée, effectuer une série de dilution en série 10x (c.-à-d. 6 dilutions, allant de dilué 10x à 1 000 000x) en utilisant du DMEM complété par un FBS inactivé par la chaleur de 2% v / v et 1% (v / v) de pénicilline-streptomycine.
  2. Aliquote 100 μL des dilutions dans les puits de 24 ou 12 plaques de puits de la plus diluée à la plus concentrée.
  3. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2.
  4. À la fin de la période d’incubation de 1 h, ramener les plaques dans le BSC et ajouter 1 mL ou 2 mL de superposition de méthylcellulose aux plaques de 24 puits ou 12 puits, en conséquence.
  5. Replacez les plaques superposées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et incubez pendant 3 à 7 jours (en fonction de la souche virale).
  6. Après l’incubation, retirez les plaques de l’incubateur et apportez-les dans le BSC. Jeter la superposition de méthylcellulose dans un plateau contenant 10% d’eau de Javel ou un désinfectant à double ammonium quaternaire.
  7. Lavez chaque puits 2x avec du PBS, en jetant le lavage dans un bac contenant 10% d’eau de Javel ou d’ammonium quaternaire double.
  8. Ajouter ~1 mL de méthanol:acétone (1:1 v:v) et laisser les cellules se fixer sur plaque pendant au moins 30 min dans le BSC à température ambiante (RT). Jeter le méthanol: acétone selon la politique institutionnelle sur les déchets organiques.
  9. Visualisez ZIKV à l’aide de l’une des deux méthodes décrites ci-dessous.
    1. Après l’élimination du méthanol:acétone, tacher immédiatement avec une solution de violet cristallin (0,25% p/v dans 30% de méthanol) pendant 5 min. Rincer 2x à l’eau du robinet et laisser sécher, puis visualiser directement à l’œil nu pour détecter les signes de plaques ou de destruction de monocouche.
    2. Alternativement, effectuez un test de formation de mise au point.
      1. Laissez les plaques sécher à l’air libre jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fixateur organique.
        REMARQUE: Cela devrait prendre environ 2−3 h à l’extérieur de l’ESB, mais peut être accéléré par séchage à l’air dans une hotte BSC ou chimique.
      2. Lavez chaque puits 3x pendant 15 min chacun dans du PBS non stérile (sans Mg2+ et Ca2+) sur une bascule à plaque orbitale. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de solution bloquante (PBS + 3% FBS) à chaque puits et roche pendant 15 min à RT.
      3. Ajouter 100 μL par puits d’anticorps primaire α-ZIKV ou α-flavivirus (p. ex. hybridome du groupe flavivirus D1-4G2-4-15 [4G2]) à une dilution de 1:2 000 en solution bloquante. Incuber avec bascule pendant un minimum de 4 h (de préférence pendant la nuit, ne dépassant pas 18 h) à RT.
      4. Retirez l’anticorps primaire et lavez 3x pendant 15 minutes chacun avec du PBS (sans Mg2+ et Ca2+) sur une bascule à plaque orbitale.
      5. Ajouter 100 μL par puits de l’anticorps secondaire (marqué HRP de chèvre α souris) dilué à 1:2 000 dans un tampon bloquant. Incuber avec bascule pendant 1 h à RT.
      6. Lavez 3x pendant 15 min chacun avec PBS (Mg2+ et Ca2+ libre) sur une bascule à plaque orbitale.
      7. Aliquote 100 μL de réactif de développement du substrat (Table des matériaux) par puits. Plaques rocheuses à RT pendant 15 min.
      8. Arrêtez la réaction lors du développement des foyers / plaques en retirant le substrat et en rinçant les plaques 2x avec de l’eau du robinet. Versez l’eau du robinet et laissez sécher les plaques à l’air libre avant de quantifier.
      9. Compter les foyers viraux pour déterminer le nombre d’UFC présents dans l’échantillon donné.

4. Administration de farines sanguines

  1. Utilisez les moustiques Ae. aegypti 2 à 4 jours après l’eclosion. Trier les moustiques femelles dans des cartons de 0,5 L avec des couvercles grillagés et les priver de sucre (généralement 36 à 48 h avant la farine de sang infectieuse). Fournir de l’eau ad libitum via des boules de coton saturées d’eau.
  2. Retirez les boules de coton saturées d’eau le matin où les moustiques seront exposés à la farine de sang infectieuse.
  3. Fixez des réservoirs contenant des farines de sang artificielles aux fils de l’unité d’alimentation dans une boîte à gants en plastique transparent.
  4. Dans la boîte à gants, placez un carton de 0,5 L avec un couvercle grillagé, contenant 50 à 100 moustiques Ae. aegypti affamés, sous l’unité d’alimentation fixée au réservoir.
    REMARQUE: Les moustiques affamés de manière appropriée se nourrissent généralement dans les 20 minutes. L’alimentation peut être prolongée au besoin pour augmenter la taille de l’échantillon dans les populations plus lentes, bien que cela ne devrait pas s’étendre au-delà de 60 minutes, car le titre viral (ZIKV) peut diminuer dans le chargeur après environ 60 minutes.
  5. À la fin de l’alimentation, retirez le réservoir et immergez-le dans de l’eau de Javel fraîchement préparée à 10%.
  6. Anesthésie à froid des moustiques par incubation pendant 30 s à -20 °C ou pendant 5 min au réfrigérateur.
  7. Dans la boîte à gants, versez les moustiques dans une boîte de Petri sur de la glace. Comptez et triez les femelles engorgées des moustiques non installés. Éliminer les moustiques non installés par immersion dans un tube conique de 50 mL rempli d’éthanol à 70 %. Pendant que les moustiques sont encore anesthésiés, remettez-les dans le carton de 0,5 L et recouvrez rapidement avec l’écran et le couvercle. Coupez l’excès de maille d’écran du carton et fixez la maille avec du ruban adhésif.
  8. Ajouter une boule de coton saturée de saccharose aqueux stérile filtré à 10% à l’écran de chaque carton. Placez tous les cartons anti-moustiques dans un grand récipient secondaire en plastique avec une éponge humide pour maintenir l’humidité.
  9. Placer le récipient secondaire contenant des cartons de moustiques dans un incubateur à une température de 27 ± 1 °C (ou, le cas échéant, pour simuler des conditions dans la région d’intérêt) avec une humidité relative de 80 % ± 10 % et un cycle lumière/obscurité de 16:8). Maintenir les moustiques avec un accès ad libitum à 10% de saccharose jusqu’à la fin des expériences.

5. Acquisition et traitement des échantillons

  1. Les jours spécifiés après l’alimentation, aspirer un nombre prédéterminé de moustiques des cartons appropriés à l’aide d’un aspirateur mécanique dans une boîte à gants. Coiffez le tube de collecte avec un rond de coton après l’acquisition du nombre requis de moustiques.
  2. Anesthésie à froid des moustiques par incubation pendant 30 secondes à -20 °C ou pendant 5 minutes à 4 °C.
  3. Dans la boîte à gants, versez les moustiques dans une boîte de Petri sur de la glace. À l’aide de deux paires de pinces, retirer les six pattes de chaque moustique et placer dans un tube de microcentrifuge à fond rond prémarqué de 2 mL contenant un roulement à billes en acier inoxydable stérilisé (7/32 po) et 500 μL de milieux de collecte de moustiques (MCM) composés de DMEM, de 2 % de FBS, de 1 % de pénicilline-streptomycine et de 2,5 μg/mL d’amphotéricine.
  4. Placez doucement le moustique sur une goutte d’huile minérale pour le retenir, en prenant soin de ne permettre aucun contact entre l’huile et la tête et la trompe du moustique.
  5. Insérez la trompe de moustique dans une pointe de pipette de 10 μL remplie de 10 μL de FBS inactivé par la chaleur.
    REMARQUE: Alternativement, la pipette peut être remplie de saccharose, de sang ou d’huile minérale. L’huile permet la visualisation directe des bulles de salive par microscopie optique.
  6. Laissez le moustique saliver pendant 30 min. Éjecter l’embout de la micropipette contenant fbS + salive dans un tube de microcentrifugation contenant 100 μL de MCM, puis placer la carcasse dans un tube de microcentrifugation à fond rond séparé de 2 mL contenant un roulement à billes en acier stérilisé et 500 μL de MCM. Assurez-vous que les tubes utilisés pour les corps, les jambes et la salive sont étiquetés de manière à ce qu’il soit clair que les trois échantillons proviennent du même moustique.
  7. Pendant que le ou les moustiques salivent, effectuez les étapes 5,3 à 5,5 sur les moustiques restants.
  8. Transporter les tubes contenant les corps et les jambes vers un dispositif d’homogénéisation tissulaire de broyage de billes contenu dans un ESB. Triturez tous les échantillons de corps et de jambes à 26 Hz pendant 5 minutes pour libérer les particules virales dans le surnageant. Clarifier tous les échantillons par centrifugation à 200 x g pendant 5 min pour granuler les débris cellulaires.
    REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être congelés à -80 ° C ou analysés immédiatement.

6. Détection du ZIKV par essai infectieux

  1. Dans un ESB, préparer 24 plaques de culture tissulaire de puits avec des cellules Vero(10 5 cellules par puits) 24 h avant le début du test infectieux. Étiquetez chaque puits avec l’identité d’un seul moustique/ échantillon.
  2. Si les échantillons ont été congelés à -80 °C, laisser décongeler.
  3. Retirez le média des plaques cellulaires Vero avant l’inoculation avec des échantillons une plaque à la fois.
  4. Pour les échantillons contenant des corps ou des jambes, aliquotez soigneusement 100 μL de surnageant clarifié dans chaque puits, en prenant soin de ne pas déranger les débris de cellules de moustiques de la pastille.
    REMARQUE: Les échantillons de salive peuvent être dilués 1: 1 (v / v) avec MCM avant l’inoculation sur les cellules pour conserver les échantillons pour un titrage ultérieur, si nécessaire.
  5. Déplacez les plaques dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et incubez pendant 1 h.
  6. Retournez les plaques à l’ESB et ajoutez environ 1 mL de superposition de méthylcellulose à chaque puits. Replacez les plaques superposées dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 et incubez pendant 3 à 7 jours (en fonction du virus ou de la souche).
  7. Effectuez la fixation et la visualisation comme décrit aux étapes 3.6 à 3.9.
  8. En ce qui concerne la notation via un test de mise au point, quantifiez les puits positifs par un examen au microscope optique. La détection de la coloration intracytoplasmique des cellules dans un puits indique la présence d’un virus. Les échantillons sont notés uniquement comme étant positifs ou négatifs.

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Representative Results

Trois populations d’Ae. aegypti des Amériques (Salvador, Brésil; République dominicaine; et la vallée du Rio Grande, TX, États-Unis) ont été exposées à une souche épidémique de ZIKV des Amériques (ZIKV Mex 1-7, État du Chiapas, Mexique, 2015) sur une gamme de titres de farine de sang (4, 5 et 6 log10 FFU / mL) présentés dans une farine de sang artificielle à base d’érythrocytes humains lavés. Aux jours 2, 4, 7, 10 et 14 après l’infection, des sous-ensembles de moustiques ont été traités pour déterminer les taux d’infection, de dissémination et de transmission potentielle.

À un titre de farine de sang de 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti de Salvador, au Brésil, ont été infectés à des taux de 12,5 % et 11,1 % après 4 et 14 jours d’incubation extrinsèque, respectivement, sans aucun signe d’infection disséminée observée dans les jambes dosées et aucun virus détecté dans la salive (Figure 1a). L’augmentation du titre à 5 log10 FFU/ mL a entraîné une augmentation marginale de l’infectiosité avec des taux de 22,2 %, 33,3 % et 22,2 % aux jours 4, 10 et 14 après l’infection, respectivement. Semblable à ce qui a été observé dans la cohorte exposée à 4 log10 FFU/mL, aucune infection disséminée ou compétence de transmission n’a été observée à aucun moment(Figure 1b). Au titre le plus élevé examiné (6 log10 FFU/mL), aucune infection n’a été identifiée après 2 jours d’incubation, mais des infections ont été observées à tous les autres moments, culminant à 88,9 % par 10 jours d’incubation extrinsèque. Le ZIKV a été détecté dans les pattes des moustiques examinés 10 et 14 jours après l’infection (22,2 % et 66,7 %, respectivement), ce qui indique que le ZIKV s’était disséminé dans l’hémocène, bien que le ZIKV infectieux ait été observé dans la salive à ces moments(Figure 1c).

La population d’Ae. aegypti de la République dominicaine s’est avérée la plus sensible à l’infection par le ZIKV et était compétente en matière de transmission après avoir été exposée à tous les titres de farine de sang testés. Un certain niveau d’infection a été observé à tous les moments aux trois doses testées, le taux le plus faible ayant été observé 2 jours après l’infection à 4 log10 FFU/mL (25 %)(figure 1d). Avec des titres de farine de sang de 5 log10 et 6 log10 FFU / mL conditions, les taux d’infection ont culminé à 100%, avec une infection de 100% observée dès 4 jours après l’infection dans la population de moustiques exposés à 6 log10 FFU / mL ZIKV (Figure 1e,f). Les moustiques nourris avec les trois doses ont démontré une dissémination de 7 jours après l’infection, culminant à 44,4 %(4 log 10 FFU/mL, 14 jours après l’infection), 88,9 %(5 log 10 FFU/mL, 1 et 14 jours après l’infection) et 100 % (6 log10 FFU/mL, 10 jours après l’infection). La compétence de transmission a été observée après les trois doses (11,1 %, 22,2 % et 22,2 % à 4, 5 et 6 log10 FFU/mL respectivement), mais seulement après une période d’incubation extrinsèque (EIP) de 14 jours(Figure 1d−f).

La population d’Ae. aegypti de la vallée du Rio Grande, au Texas, s’est avérée relativement réfractaire à l’infection par le ZIKV. Les moustiques exposés à des titres de farine de sang de 4 log10 FFU / mL, ont été infectés dès 4 jours après l’infection, avec des taux d’infection compris entre 22,2% et 44,4%. Avec ces conditions d’exposition, des infections disséminées ont été observées 14 jours après la désinfection à un taux de 11,1 %, et aucune compétence de transmission n’a été observée(figure 1g). Une multiplication par dix du titre de farine de sang a produit un résultat largement similaire, avec des infections observées à partir de 4 jours après l’exposition (33,3% et 44,4%), tandis que des infections disséminées ont été trouvées après 14 jours d’incubation extrinsèque à un taux de 22,2%(Figure 1h). Enfin, dans la cohorte exposée à une farine de sang de 6 log10 FFU / mL, l’infection a été observée à partir du point de temps post-infection de 2 jours (22,2%) et a atteint des pics à 4, 10 et 14 jours après l’infection (66,7%). Des infections disséminées dans cette condition ont commencé à être observées 7 jours après la désinfection (11,1%) et ont culminé à 44,4% à 14 jours après l’infection. On a observé qu’un seul moustique (11,1 %) était capable de transmettre 10 jours après l’infection(figure 1i).

Figure 1
Figure 1 : Données représentatives de la compétence vectorielle de diverses populations d’Ae. aegypti pour ZIKV Mex 1−7. (a−c) Compétence vectorielle d’Ae. aegypti de Salvador, Brésil (F2). (d−f) Compétence vectorielle d’Ae. aegypti de la République dominicaine (F6). (g−i) Compétence vectorielle d’Ae. aegypti de la vallée du Rio Grande, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti exposé à 4 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti exposé à 5 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti exposé à 6 log10 FFU/mL de ZIKV Mex 1-7. À chaque moment (2, 4, 7, 10 et 14 jours après l’infection), un sous-ensemble de moustiques a été prélevé et échantillonné. Les taux d’infection, de dissémination et de transmission sont présentés comme le nombre d’échantillons positifs de carcasses, de jambes et de salive par rapport au nombre de moustiques analysés à ce moment-là. L’infection représentée en bleu, les infections disséminées représentées en vert et le taux de transmission représenté en rouge. Les données de cette figure sont modifiées à partir de Roundy et Azar et al.32. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les méthodes décrites ici fournissent un flux de travail généralisé pour effectuer des analyses de compétences vectorielles. En tant que cadre général, bon nombre de ces méthodologies sont conservées dans toute la littérature. Cependant, il y a une marge de manœuvre substantielle pour des modifications (examinées dans Azar et Weaver1). On sait que les virus (p. ex., lignée virale, entreposage du virus de provocation, antécédents de passage viral), l’entomologie (p. ex., colonisation en laboratoire des populations de moustiques, immunité innée, microbiome ou virome des moustiques) et les variables expérimentales (p. ex., composition de la farine de sang, alimentation sanguine séquentielle et température d’incubation) ont tous une incidence sur la compétence des vecteurs. La variabilité méthodologique des études de compétence s’est avérée problématique dans le contexte de l’épidémie de ZIKV car elle a empêché des méta-analyses formelles1,33.

Dans cette méthodologie générale, l’importance de la famine appropriée des moustiques et de la composition de la farine de sang ne peut être surestimée. La déshydratation est connue pour conduire le comportement d’alimentation sanguine des moustiques dans les paradigmes de laboratoire34, soulignant la valeur de la privation de sucre et d’eau avant d’offrir une farine de sang infectieuse. Alors que la privation de sucre pendant 36 à 48 h et d’eau pendant 2 à 4 heures avant l’exposition à la farine de sang est bien tolérée par Ae. aegypti, il convient de noter que ces moustiques sont notoirement faciles à utiliser dans des conditions de laboratoire2. De tels régimes agressifs de famine peuvent ne pas être aussi bien tolérés par d’autres espèces de moustiques, ce qui nécessite un certain degré d’optimisation interne. De même, le contenu de la farine de sang peut être informé par la préférence de l’hôte. Par exemple, l’utilisation de sang humain pour préparer une farine de sang pour les moustiques anthropophiles comme Ae. aegypti est tout à fait appropriée, mais les farines de sang humaines faites pour des espèces ornithophiles telles que Culex quinquefasciatus peuvent s’avérer moins efficaces35. De plus, en ce qui concerne l’assemblage de la farine de sang, l’utilisation de produits sanguins relativement frais est fortement recommandée pour minimiser l’hémolyse des érythrocytes.

L’une des plus grandes limites de l’évaluation de la compétence vectorielle dans son ensemble et des procédures décrites ici est que ces études se limitent en grande partie à l’étude des virus utilisant des moustiques qui peuvent être maintenus dans des conditions de laboratoire. Ae. aegypti, bien qu’un vecteur très pertinent pour une multitude d’agents pathogènes d’importance clinique, se trouve également être l’un des moustiques les plus faciles à élever et à entretenir dans les colonies de laboratoire1,31,36,37. Sans surprise, la compétence des populations d’Ae. aegypti est donc souvent la mieux caractérisée parmi les moustiques vecteurs communs2. Ceci est particulièrement problématique dans le contexte des arbovirus qui maintiennent à la fois les cycles de transmission enzootique et urbaine38,39,40, car la compétence vectorielle n’est généralement menée que dans le contexte des moustiques urbains plus traitables.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le personnel du Centre mondial de référence pour les virus et arbovirus émergents (WRCEVA) : Dr Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr Kenneth Plante, Dr Jessica Plante, Dionna Scharton et Divya Mirchandani, pour leur travail inlassable dans la conservation et la fourniture de nombreuses souches virales utilisées pour nos expériences de compétence vectorielle et celles d’autres groupes. Le travail présenté a été financé par le McLaughlin Fellowship Fund (SRA) et les subventions des NIH AI120942 et AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

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Immunologie et infection Numéro 159 moustique compétence vectorielle Aedes Aedes aegypti arbovirus Zika
Analyses de compétence vectorielle sur <em>les moustiques Aedes aegypti</em> utilisant le virus Zika
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Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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