Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ компетентности переносчиков комаров Aedes aegypti с использованием вируса Зика

Published: May 31, 2020 doi: 10.3791/61112
Automatic Translation
1,2, 1,3,4
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

Summary

Представленный протокол может определить векторную компетентность популяций комаров Aedes aegypti для данного вируса, такого как Зика, в условиях сдерживания.

Abstract

Представленные процедуры описывают обобщенную методологию заражения комаров Aedes aegypti вирусом Зика в лабораторных условиях для определения скорости инфицирования, диссеминированной инфекции и потенциальной передачи вируса в рассматриваемой популяции комаров. Эти процедуры широко используются с различными изменениями в оценках векторной компетентности во всем мире. Они важны для определения потенциальной роли, которую данный комар (т.е. вид, популяция, особь) может играть в передаче данного агента.

Introduction

Векторная компетентность определяется как способность на уровне вида, популяции и даже особи данного членистоногого, такого как комар, клещ или флеботоминовая песчаная муха, приобретать и передавать агент биологически с репликацией или развитием у членистоногих1,2. Что касается комаров и переносимых членистоногими вирусов (т.е. арбовирусов), то агент всасывается из виремированного хозяина самкой комара. После приема внутрь вирус должен продуктивно заразить одну из небольшой популяции эпителиальных клеток средней кишки3,преодолевая различные физиологические препятствия, такие как протеолитическая деградация пищеварительными ферментами, наличие микробиоты (барьер инфекции средней кишки, или MIB) и секретируемый перитрофический матрикс. Инфекция эпителия средней кишки должна сопровождаться репликацией вируса и возможным побегом из средней кишки в открытую кровеносную систему комара, или гемолимфу, которая представляет собой начало диссеминированной инфекции, преодолевающей барьер побега средней кишки (MEB). В этот момент вирус может установить инфекции вторичных тканей (например, нервов, мышц и жировых тел) и продолжать размножаться, хотя такая вторичная репликация может быть не строго необходима вирусу для заражения ацинарных клеток слюнных желез (преодоление инфекционного барьера слюнных желез). Выход из ацинарных клеток слюнной железы в их апикальные полости, а затем движение в слюнный проток позволяет инокуляцию вируса последующим хозяевам при укусе и завершает цикл передачи1,2,4,5,6,7.

Учитывая этот хорошо охарактеризованный и в целом законсервированный механизм распространения внутри комара-переносчика, лабораторные оценки компетентности переносчиков часто методологически схожи, хотя различия в протоколах существуют1,2. Как правило, после перорального воздействия вируса комары рассекаются таким образом, что отдельные ткани, такие как полная кишка, ноги, яичники или слюнные железы, могут быть проанализированы на вирусную инфекцию, диссеминированную инфекцию, диссеминированную инфекцию / потенциальную трансовариальную передачу и диссеминированную инфекцию / потенциальную способность передачи, соответственно8. Однако само присутствие вируса в слюнных железах не является окончательным доказательством способности к передаче, учитывая доказательства барьера выхода/выхода слюнной железы (SGEB) в некоторых комбинациях вектор/вирус1,2,4,5,7,9. Стандартным методом доказывания компетентности к передаче остается передача комарами восприимчивому животному10,11,12. Однако, учитывая, что для многих арбовирусов это требует использования иммунокомпрометированных мышиных моделей13,14,15,16,этот метод часто является непомерно дорогостоящим. Широко используемой альтернативой является сбор слюны комара, который может быть проанализирован с помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) или инфекционного анализа, чтобы продемонстрировать наличие вирусного генома или инфекционных частиц соответственно. Стоит отметить, что такие методы сбора слюны in vitro могут переоценивать12 или недооценивать17 количество вируса, депонированного во время кормления in vivo, что указывает на то, что такие данные следует интерпретировать с осторожностью. Тем не менее, метод in vitro очень ценен при анализе с точки зрения простого присутствия вируса в слюне, что указывает на потенциал передачи.

Существуют два основных подхода к определению роли комаров-переносчиков в вспышках арбовирусных заболеваний. Первый метод предполагает полевой эпиднадзор, при котором комары собираются в контексте активной передачи18,19,20,21,22,23,24. Однако, учитывая, что уровень инфицирования, как правило, довольно низок (например, по оценкам, уровень инфицирования комаров в 0,061% в районах активной циркуляции вируса Зика (ZIKV) в Соединенных Штатах21),инкриминирование потенциальных видов переносчиков может быть сильно смещено методологией отлова25,26 и случайностью (например, отбор проб одного инфицированного человека из 1 600 неинфицированных)21 . Принимая это во внимание, данное исследование может не приобрести достаточно комаров как в сыром количестве, так и в видовом разнообразии, чтобы точно отобрать комаров, участвующих в передаче. Напротив, анализ векторной компетентности проводится в лабораторных условиях, что позволяет строго контролировать такие параметры, как пероральная доза. Несмотря на то, что эти лабораторные оценки не в полной мере способны представить истинную сложность инфекции комаров и возможности ее передачи в полевых условиях, они остаются мощными инструментами в области арбовирусологии.

Основываясь на различных анализах векторной компетентности с помощью ZIKV у нескольких видов комаров, популяций и методов27,28,29,30,31,32,а также недавнего обзора оценок компетентности переносчиков1,мы описываем здесь несколько протоколов, связанных с типичным рабочим процессом векторной компетентности. В этих экспериментах три популяции Ae. aegypti из Северной и Южной Америки (город Сальвадор, Бразилия; Доминиканская Республика; и нижняя часть долины Рио-Гранде, штат Техас, США) подвергались воздействию одного штамма ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) при дозе 4, 5 или 6 log10 фокусообразующих единиц (FFU) / мл с помощью искусственных кровяных мук. Впоследствии они были проанализированы на наличие инфекции, диссеминированной инфекции и компетентности передачи после различных периодов внешней инкубации (2, 4, 7, 10 и 14 дней) с помощью рассечения и инфекционного анализа на основе клеточной культуры. Хотя нынешний рабочий процесс/протоколы оптимизированы для ZIKV, многие элементы непосредственно переводятся в другие переносимые комарами арбовирусы в содержании членистоногих и уровнях биобезопасности 2 и 3 (ACL/BSL2 или ACL/BSL3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, выполненные в этих протоколах, были выполнены в полном соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по биобезопасности и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне.

1. Усиление ZIKV в ячейках Vero

  1. Выращивайте клетки Vero (CCL-81 или VeroE6) в модификации Dulbecco минимальной незаменимой среды Eagle (DMEM), дополненной 10% v/v термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином (100 Ед/мл и 100 мкг/мл соответственно) в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 до 80−90% стечения в 150см2 тканевой культуральной колбе.
  2. В шкафу биобезопасности (BSC) удалите среду и утилизируйте либо 10% отбеливатель, либо рабочее разбавление двухчетвертичного аммония(Таблица материалов). Немедленно привить монослой 1 мл вирусного запаса, нацеливаясь на 0,1−1 инфекционную вирусную частицу на клетку. Немедленно перемешайте колбу так, чтобы инокулятор контактировал с монослоем целиком.
  3. Долить среду до объема 5 мл с помощью DMEM, дополненного 2% v/v термоинактивированным FBS и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином. Затем переместите колбу в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 в течение 60 мин.
  4. Извлеките колбу из инкубатора и принесите ее в BSC. Добавьте дополнительную среду к общему объему 15 мл с использованием DMEM, дополненного 2% v/v термоинактивированным FBS и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином. Переместите колбу в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2.
  5. Ежедневно осматривайте колбу под фазово-контрастной микроскопией на наличие цитопатических эффектов (CPE). Приступайте к сбору вируса (стадия 1.7), когда только приблизительно 40−50% клеток остаются в монослое, как правило, через 3−5 дней после заражения в зависимости от используемого штамма ZIKV.
  6. Аспирировать надосадочный и поместить в конический флакон объемом 50 мл. Осветление надосадочного вещества клеточного мусора методом центрифугирования (3 500 х г в течение 20 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько колб были инфицированы одинаково, супернатанты из нескольких колб могут быть объединены в конические трубки по 50 мл.
  7. Удалите супернатант из конической трубки объемом 50 мл в свежую, заботясь о том, чтобы не нарушить гранулу. Дополнить супернатант термоинактивированным FBS до конечной концентрации 30% (v/v). Аликвоцитировать эту смесь в отдельные завинчивающиеся колпачки трубок и замораживать при -80 °C до использования.

2. Приготовление искусственных кровяных мук

  1. В тот день, когда комары должны подвергаться воздействию инфекционных кровяных мук, включите источник питания(Таблица материалов)в средстве содержания членистоногих таким образом, чтобы кормовыеблоки (Таблица материалов)предварительно нагревались к тому времени, когда комары подготовлены к воздействию.
  2. Приготовьте искусственные кровохарки, используя один из методов, описанных ниже.
    1. Способ 1: Соединить свежесобранную (в течение недели) цитратированную или гепаринизированную кровь человека, приобретенную коммерчески 1:1 v/v, с вирусным запасом (приготовленным, как описано в разделе 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод зависит от отсутствия каких-либо антител к семейству вирусов/вирусов, присутствующих в крови.
    2. Если отсутствие антител не может быть подтверждено или источник крови, как известно, имеет предшествующее воздействие флавивируса, промывайте и вручную упаковывайте эритроциты.
      1. В BSC добавьте 30 мл цельной человеческой крови в коническую трубку объемом 50 мл и добавьте до 50 мл фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
      2. Центрифуга при 3 500 х г в течение 20 мин.
      3. Аспирируйте супернатант либо осторожно налив в поддон, содержащий либо 10% отбеливателя, либо рабочее разбавление двойного четвертичного аммония, заботясь о том, чтобы не выбросить гранулу эритроцитов.
      4. Добавьте 10 мл PBS и осторожно постучите дном конической трубки о дно BSC так, чтобы гранула эритроцитов была восстановлена. Доведите объем суспензии до 50 мл с PBS. Перемешать путем мягкой инверсии.
      5. Повторите этапы 2.2.2.1−2.2.2.4 в общей сложности 4−6x. Убедитесь, что супернатант прозрачный или только слегка розовый и больше не непрозрачный. Удалите весь супернатант с помощью серологической пипетки. Повторное суспендирование гранулы эритроцитов в 1−2 мл PBS.
      6. Соберите кровеносную муку: 350 мкл упакованных эритроцитов, 100 мкл 10% сахарозы, 200 мкл термоинактивированного FBS, 900 мкМ рекомбинантной АТФ и 2 мл соответствующим образом разбавленного вирусного вещества с использованием DMEM, дополненного 2% v/v термоинактивированного FBS, и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина.
  3. Наложите стандартный резервуар 3 мл(Таблица материалов)на кожу неинфицированной мыши (другие варианты включают парафиновую пленку, коллагеновые мембраны или колбасную оболочку).
  4. Поместите крытый резервуар на белые бумажные полотенца. Добавьте ~2 мл инфекционной кровяной муки в резервуар 1 мл за один раз. Осмотрите полотенце под кормушкой на наличие признаков утечки. Если утечки присутствуют, извлеките кровь из кормушек и выбросьте крышки. Запечатайте питатели заглушками. Еще раз подтвердите, что никаких утечек нет.

3. Обратный анализ смазывания кровяных мук/бляшек

  1. Используя оставшийся объем приготовленной кровяной муки, выполняют серию последовательного разведения 10x (т.е. 6 разведений, в диапазоне от разбавленных 10x до 1000 000x), используя DMEM, дополненный 2% v/v термоинактивированным FBS, и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицин.
  2. Аликвота 100 мкл разбавлений в скважины 24 или 12 плит скважин от наиболее разбавленных до наиболее концентрированных.
  3. Инкубировать в течение 1 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO2.
  4. В конце инкубационного периода 1 ч доведите пластины обратно в BSC и добавьте 1 мл или 2 мл наложения метилцеллюлозы на 24 лунки или 12 лунок соответственно.
  5. Поместите наложенные пластины обратно в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 3−7 дней (в зависимости от штамма вируса).
  6. После инкубации снимите пластины из инкубатора и внесите в БСК. Выбросьте наложение метилцеллюлозы в лоток, содержащий 10% отбеливателя или двойного четвертичного дезинфицирующего средства аммония.
  7. Вымойте каждую лунку 2 раза pBS, выбросив мойку в поддон, содержащий 10% отбеливателя или двойного четвертичного аммония.
  8. Добавьте ~1 мл метанола:ацетона (1:1 v:v) и дайте ячейкам закрепиться на пластине в течение не менее 30 мин в BSC при комнатной температуре (RT). Выброс метанола: ацетона в соответствии с институциональной политикой в отношении органических отходов.
  9. Визуализация ZIKV с помощью одного из двух методов, описанных ниже.
    1. После удаления метанола:ацетона окрашивают сразу кристаллическим фиолетовым раствором (0,25% мас./об.в 30% метанола) в течение 5 мин. Смойте 2x в водопроводной воде и оставьте сохнуть, затем непосредственно визуализируйте на глаз на наличие бляшек или разрушения монослоя.
    2. В качестве альтернативы, выполните анализ формирования фокуса.
      1. Дайте пластинам высохнуть на воздухе до тех пор, пока не останется органического фиксирующего средства.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно занять ~ 2-3 ч вне BSC, но может быть ускорено сушкой воздуха в BSC или химическом вытяжном вытяжке.
      2. Промывайте каждую скважину по 3 раза в течение 15 мин в нестерильных PBS (Mg2+ и Ca2+ свободно) на орбитальном пластинчатом коромысле. Удалите PBS и добавьте 1 мл блокирующего раствора (PBS + 3% FBS) в каждую скважину и породу в течение 15 мин при RT.
      3. Добавьте 100 мкл на лунку первичного антитела α-ZIKV или α-флавивируса (например, гибридомы группы флавивирусов D1-4G2-4-15 [4G2]) в разведении 1:2000 в блокирующем растворе. Инкубировать с раскачиванием в течение минимум 4 ч (предпочтительно на ночь, не более 18 ч) на РТ.
      4. Удалите первичное антитело и промывайте 3x в течение 15 мин каждый с PBS (Mg2+ и Ca2+ свободно) на орбитальной пластинчатой коромысле.
      5. Добавьте 100 мкл на лунку вторичного антитела (меченого HRP от козы α мыши), разбавленного 1:2000 в блокирующем буфере. Инкубировать с раскачиванием в течение 1 ч на РТ.
      6. Мойте 3x в течение 15 минут каждый с PBS (Mg2+ и Ca2+ свободно) на орбитальной пластинчатой коромысле.
      7. Аликвота 100 мкл реагента для развития субстрата(Таблица материалов)на скважину. Скальные плиты на RT в течение 15 мин.
      8. Остановите реакцию при развитии очагов/бляшек, удалив подложку и промыв пластины 2x водопроводной водой. Вылейте водопроводную воду и дайте пластинам высохнуть на воздухе перед количественной оценкой.
      9. Подсчитайте вирусные очаги для определения количества ФФУ, присутствующих в данном образце.

4. Введение кровожадных мук

  1. Используют Ae. aegypti комарам через 2−4 дня после эклозии. Отсортируйте самок комаров на картонные коробки объемом 0,5 л с экранированными крышками и лишите их сахара (обычно за 36−48 ч до инфекционной кровяной муки). Обеспечьте воду ad libitum с помощью насыщенных водой ватных шариков.
  2. Удалите насыщенные водой ватные шарики утром, когда комары будут подвергаться воздействию инфекционной кровяной муки.
  3. Прикрепите резервуары, содержащие искусственные смазывания крови, к проводам блока кормления в прозрачном пластиковом перчаточном ящике.
  4. Внутри перчаточного ящика поместите 0,5-литровую картонную коробку с экранированной крышкой, содержащую 50−100 голодающих комаров Ae. aegypti, под блоком кормления, прикрепленным к резервуару.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комары, подвергшиеся соответствующему голоду, как правило, питаются в течение 20 минут. Кормление может быть продлено по мере необходимости для увеличения размера выборки в более медленных популяциях, хотя это не должно продолжаться более 60 минут, потому что (ZIKV) вирусный титр может уменьшаться в кормушке через ~ 60 мин.
  5. По завершении кормления извлеките резервуар и погрузите в свежеприготовленный 10% отбеливатель.
  6. Холодное обезболивание комаров путем инкубации в течение 30 с при -20 °C или в течение 5 мин в холодильнике.
  7. В перчаточный ящик налейте комаров в чашку Петри на льду. Подсчитайте и сортируйте набухших самок от незанятых комаров. Утилизируйте незанятых комаров путем погружения в коническую трубку объемом 50 мл, заполненную 70% этанолом. Пока комары все еще обезболены, вылейте их обратно в картонную коробку объемом 0,5 л и быстро накройте экраном и крышкой. Обрежьте лишнюю сетку экрана от картонной коробки и закрепите сетку скотчем.
  8. Добавьте ватный тампон, насыщенный стерильной фильтрованной 10% водной сахарозой, в экран каждой коробки. Поместите все картонные коробки для комаров в большой пластиковый вторичный контейнер с влажной губкой для поддержания влажности.
  9. Поместите вторичный контейнер, содержащий коробки с комарами, в инкубатор с температурой 27 ± 1 °C (или, в зависимости от обстоятельств, для моделирования условий в интересующей области) с 80% ± 10% относительной влажностью и циклом 16:8 свет:темнота). Поддерживайте комаров с доступом ad libitum к 10% сахарозы до завершения экспериментов.

5. Сбор и обработка образцов

  1. В определенные дни после кормления аспирировать заранее определенное количество комаров из соответствующих картонных коробок с помощью механического аспиратора в перчаточном ящике. Закройте коллекционную трубку хлопковым кругом после того, как будет приобретено необходимое количество комаров.
  2. Холодный обезболивание комаров путем инкубации в течение 30 секунд при -20 °C или в течение 5 минут при 4 °C.
  3. В перчаточный ящик налейте комаров в чашку Петри на льду. Используя две пары щипцов, удалите все шесть ног каждого комара и поместите в предварительно маркированную микроцентрифугу объемом 2 мл с круглым дном, содержащую стерилизованный шарикоподшипник из нержавеющей стали (7/32") и 500 мкл среды для сбора комаров (MCM), состоящую из DMEM, 2% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 2,5 мкг / мл амфотерицина.
  4. Осторожно поместите комара на каплю минерального масла, чтобы сдержать его, заботясь о том, чтобы не допустить контакта между маслом и головой комара и хоботком.
  5. Вставьте хоботок комара в наконечник пипетки объемом 10 мкл, заполненный 10 мкл термоинактивированного FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, пипетка может быть заполнена сахарозой, кровью или минеральным маслом. Масло позволяет непосредственно визуализировать пузырьки слюны с помощью световой микроскопии.
  6. Дайте комару слюноотделение в течение 30 минут. Вытолкните наконечник микропипетки, содержащий FBS + слюну, в микроцентрифужную трубку, содержащую 100 мкл MCM, затем поместите каркас в отдельную трубку микроцентрифуги с круглым дном объемом 2 мл, содержащую шарикоподшипник из стерилизованной стали и 500 мкл MCM. Убедитесь, что трубки, используемые для тела, ног и слюны, помечены так, чтобы было ясно, что все три образца произошли от одного и того же комара.
  7. Пока комары пускают слюну, выполните шаги 5,3−5,5 на оставшихся комарах.
  8. Транспортируйте трубки, содержащие тела и ножки, к устройству гомогенизации шариковой фрезерной ткани, содержащейся в BSC. Тритурируйте все образцы тела и ног при 26 Гц в течение 5 минут, чтобы освободить вирусные частицы в супернатант. Осветите все образцы центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин до гранулированного клеточного мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут быть заморожены при -80 °C или немедленно проанализированы.

6. Обнаружение ЗИКВ методом инфекционного анализа

  1. В BSC подготовьте 24 пластины для посева тканей с клетками Vero(10 5 клеток на лунку) за 24 ч до начала инфекционного анализа. Маркировка каждой скважины с указанием идентичности одного комара/образца.
  2. Если образцы были заморожены при -80 °C, дайте оттаять.
  3. Извлекайте носитель из пластин клеток Vero перед посевом образцами по одной пластине за раз.
  4. Для образцов, содержащих тела или ноги, тщательно аликвотируйте 100 мкл осветленного супернатанта в каждую лунку, заботясь о том, чтобы не потревожить остатки клеток комара из гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы слюны могут быть разбавлены 1:1 (v/v) MCM перед посевом на клетки для сохранения образцов для последующего титрования, если это необходимо.
  5. Переместите пластины в инкубатор 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 1 ч.
  6. Верните пластины в BSC и добавьте ~1 мл наложения метилцеллюлозы на каждую лунку. Поместите наложенные пластины обратно в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 и инкубируйте в течение 3−7 дней (в зависимости от вируса /штамма).
  7. Выполните фиксацию и визуализацию, как описано в шагах 3.6−3.9.
  8. Что касается оценки с помощью фокусообразующего анализа, количественно оцените положительные скважины путем исследования под световым микроскопом. Обнаружение интрацитоплазматического окрашивания клеток в лунке свидетельствует о наличии вируса. Образцы оцениваются исключительно как фокус-положительные или -отрицательные.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Три популяции Ae. aegypti из Северной и Южной Америки (Сальвадор, Бразилия; Доминиканская Республика; и долина Рио-Гранде, штат Техас, США) подверглись воздействию штамма вспышки ZIKV из Северной и Южной Америки (ZIKV Mex 1-7, штат Чьяпас, Мексика, 2015) в диапазоне титров кровяной муки (4, 5 и 6 log10 FFU / mL), представленных в искусственной кровеносной муке на основе вымытых эритроцитов человека. В дни 2, 4, 7, 10 и 14 после заражения подгруппы комаров обрабатывались для определения инфекции, распространения и потенциальных скоростей передачи.

При титре муки крови 4 log10 FFU/mL ZIKV Mex 1−7, Ae. aegypti из Сальвадора, Бразилия, были инфицированы со скоростью 12,5% и 11,1% через 4 и 14 дней внешней инкубации, соответственно, без признаков диссеминированной инфекции, наблюдаемой в анализированных ногах, и без вируса, обнаруженного в слюне(рисунок 1a). Увеличение титра до 5 log10 FFU/мл привело к незначительному увеличению инфекционной активности со скоростью 22,2%, 33,3% и 22,2% на 4, 10 и 14 день после заражения соответственно. Подобно тому, что наблюдалось в когорте, подвергшейся воздействию4 log 10 FFU/mL, в любой момент времени не наблюдалось диссеминированных инфекций или компетентности передачи(рисунок 1b). При самом высоком исследованном титре (6 log10 FFU/mL) инфекции не были выявлены после 2 дней инкубации, но инфекции наблюдались во всех других временных точках, достигнув пика в 88,9% к 10 дням внешней инкубации. ZIKV был обнаружен в ногах комаров, обследованных через 10 и 14 дней после заражения (22,2% и 66,7% соответственно), что указывает на то, что ZIKV распространился в гемокоэль, хотя инфекционный ZIKV наблюдался в слюне в эти моментывремени (рисунок 1c).

Популяция Ae. aegypti из Доминиканской Республики оказалась наиболее восприимчивой к инфекции ZIKV и была компетентна к передаче после воздействия всех проверенных титров кровяной муки. Некоторый уровень инфекции наблюдался во все моменты времени во всех трех тестируемых дозах, причем самая низкая частота наблюдалась через 2 дня после заражения при 4log 10 FFU/mL (25%)(рисунок 1d). При титрах муки крови 5 log10 и 6 log10 FFU/mL уровень инфицирования достигал максимума на уровне 100%, при этом 100% инфекция наблюдалась уже через 4 дня после заражения в популяции комаров, подвергшихся воздействию 6 log10 FFU/mL ZIKV(рисунок 1e,f). Комары, которых кормили всеми тремя дозами, продемонстрировали диссеминацию через 7 дней после заражения, достигнув максимума в 44,4%(4 log 10 FFU/mL, 14 дней после заражения), 88,9% (5 log10 FFU/mL, 1 и 14 дней после заражения) и 100% (6 log10 FFU/mL, 10 дней после заражения). Трансмиссионная компетентность наблюдалась после всех трех доз (11,1%, 22,2% и 22,2% при 4, 5 и 6 log10 FFU/mL соответственно), но только после 14-дневного внешнего инкубационного периода (EIP)(рисунок 1d−f).

Популяция Ae. aegypti из долины Рио-Гранде, штат Техас, оказалась относительно невосприимчивой к инфекции ZIKV. Комары, подвергшиеся воздействию титров 4 log10 FFU /mL, были инфицированы уже через 4 дня после заражения, при этом уровень инфицирования составлял от 22,2% до 44,4%. При этих условиях воздействия диссеминированные инфекции наблюдались через 14 дней после инфекции со скоростью 11,1%, и не наблюдалось компетентности передачи(рисунок 1g). Десятикратное увеличение титра артериальной муки дало в значительной степени аналогичный результат, причем инфекции наблюдались начиная с 4 дней после вскрытия (33,3% и 44,4%), в то время как диссеминированные инфекции были обнаружены после 14 дней внешней инкубации со скоростью 22,2%(рисунок 1 ч). Наконец, в когорте, подвергшейся воздействию6 log 10 FFU /mL кровеносной муки, инфекция наблюдалась начиная со 2-дневного времени после инфекции (22,2%) и достигала пиков через 4, 10 и 14 дней после заражения (66,7%). Диссеминированные инфекции в этом состоянии начали наблюдаться через 7 дней после инфекции (11,1%) и достигли пика в 44,4% через 14 дней после инфекции. Было отмечено, что только один комар (11,1%) способен к передаче через 10 дней после заражения(рисунок 1i).

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные векторные данные компетентности различных популяций Ae. aegypti для ZIKV Mex 1−7. (a−c) Векторная компетенция Ae. aegypti из Сальвадора, Бразилия (F2). (d−f) Векторная компетенция Ae. aegypti из Доминиканской Республики (F6). (g−i) Векторная компетенция Ae. aegypti из долины Рио-Гранде, Техас (F4). (a,d,g) Ae. aegypti подвергается воздействию 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti подвергается воздействию 5 log10 FFU/mL ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti подвергается воздействию 6 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. В каждый момент времени (2, 4, 7, 10 и 14 дней после заражения) подгруппа комаров собиралась и отбиралась проба. Скорость инфицирования, распространения и передачи представлена как количество положительных образцов туши / ноги / слюны по сравнению с количеством комаров, проанализированных в этот момент времени. Инфекция представлена синим цветом, диссеминированные инфекции - зеленым, а скорость передачи - красным. Данные на этом рисунке изменены из Roundy and Azar et al.32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные здесь, обеспечивают обобщенный рабочий процесс для проведения векторного анализа компетенций. В качестве общей основы многие из этих методологий сохраняются во всей литературе. Тем не менее, есть существенные возможности для модификаций (рассмотренных в Azar and Weaver1). Известно, что вирус (например, вирусная линия, хранение вируса вызова, история вирусного пассажа), энтомология (например, лабораторная колонизация популяций комаров, врожденный иммунитет, микробиом/виром комара) и экспериментальные переменные (например, состав муки крови, последовательное питание кровью и температура инкубации) влияют на компетентность переносчиков. Методологическая изменчивость в исследованиях компетентности оказалась проблематичной в контексте вспышки ZIKV, поскольку она исключила формальные мета-анализы1,33.

В рамках этой общей методологии невозможно переоценить важность надлежащего голодания комаров и состава кровяной муки. Обезвоживание, как известно, управляет пищевым поведением комаров в лабораторных парадигмах34,подчеркивая ценность сахарного и водного голодания перед предложением инфекционной кровной муки. В то время как лишение сахара в течение 36-48 ч и воды в течение 2-4 ч до воздействия кровяной муки хорошо переносится Ae. aegypti,стоит отметить, что с этими комарами, как известно, легко работать в лабораторных условиях2. Такие агрессивные режимы голодания могут не так хорошо переноситься другими видами комаров, что требует некоторой степени внутренней оптимизации. Аналогичным образом, содержание кровяной муки может быть сообщено предпочтениями хозяина. Например, использование человеческой крови для приготовления кровавой муки для антропофильных комаров, таких как Ae. aegypti, вполне уместно, но человеческие кровоматериалы, изготовленные для орнитофильных видов, таких как Culex quinquefasciatus, могут оказаться менее эффективными35. Кроме того, что касается сборки кровеносной муки, использование относительно свежих продуктов крови очень целесообразно для минимизации гемолиза эритроцитов.

Одним из самых больших ограничений оценки компетентности переносчиков в целом и процедур, описанных в настоящем документе, является то, что эти исследования в значительной степени ограничены изучением вирусов с использованием комаров, которые могут поддерживаться в лабораторных условиях. Ae. aegypti,хотя и является очень важным переносчиком для множества патогенов, имеющих клиническое значение, также является одним из самых простых комаров для выращивания и поддержания в лабораторных колониях1,31,36,37. Неудивительно, что компетентность популяций Ae. aegypti часто лучше всего характеризуется среди распространенных комаров-переносчиков2. Это особенно проблематично в контексте арбовирусов, которые поддерживают как энзоотические, так и городские циклы передачи38,39,40,поскольку компетентность переносчиков, как правило, осуществляется только в контексте более сговорчивых городских комаров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы выражаем признательность сотрудникам Всемирного референс-центра по новым вирусам и арбовирусам (WRCEVA): д-ру Роберту Тешу, Хильде Гусман, д-ру Кеннету Планте, д-ру Джессике Планте, Дионне Шартон и Дивье Мирчандани, за их неустанную работу по курированию и предоставлению многих вирусных штаммов, используемых для экспериментов по векторной компетентности наших и других групп. Представленная работа финансировалась Фондом стипендий Маклафлина (SRA) и грантами NIH AI120942 и AI121452.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 159 комары компетенция переносчиков Aedes Aedes aegypti арбовирус Зика
Анализ компетентности переносчиков комаров <em>Aedes aegypti</em> с использованием вируса Зика
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector… More

Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter