精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。
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摘要
摘要
鉴定基因组上特定的蛋白质-DNA 相互作用对于理解基因调控至关重要。染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）被广泛用于鉴定DNA结合蛋白在全基因组范围内的结合位点。然而，ChIP-seq 方法受限于超声处理后DNA片段长度的异质性以及非特异性背景DNA，导致作图分辨率较低且DNA结合位点存在不确定性。为克服这些局限，染色质免疫沉淀联合外切酶消化（ChIP-exo）技术利用5’至3’外切酶消化，将长度不均一的免疫沉淀DNA修剪至蛋白质-DNA交联位点。外切酶处理还可消除非特异性背景DNA。经文库制备和外切酶消化后的DNA可送至高通量测序。ChIP-exo 方法可实现接近单碱基对的作图分辨率，具有更高的检测灵敏度和更低的背景信号。以下描述了一种针对哺乳动物细胞和下一代测序优化的 ChIP-exo 实验方案。
引言
蛋白质与DNA相互作用的位置可揭示基因调控的机制。染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）已被用于研究活细胞中全基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用长达十年之久1,2。然而，ChIP-seq方法受限于DNA片段化不均一以及未结合DNA的污染，导致定位分辨率低、假阳性结果、漏检以及非特异性背景信号。将ChIP与外切酶消化相结合（ChIP-exo）可改进ChIP-seq方法，通过将ChIP获得的DNA修剪至蛋白质-DNA交联位点，实现接近单碱基对的分辨率并显著降低背景信号3,4,5。ChIP-exo所提供的高分辨率定位和低背景信号使得全基因组范围内蛋白质-DNA结合位点的精确且全面的鉴定成为可能。ChIP-exo能够揭示功能上不同的DNA结合基序、转录因子（TF）之间的协同相互作用，以及特定基因组结合位点内的多个蛋白质-DNA交联位点， 这些是其他基因组定位方法无法检测到的3,4,6,
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方案
注意：配制缓冲液和反应主混合液时，建议使用经高压灭菌的蒸馏去离子水（ddH2O）。第1−4节描述细胞裂解和超声处理，第5−7节描述染色质免疫沉淀（ChIP），第8−11节描述磁珠上的酶促反应，第12和13节描述ChIP洗脱和DNA纯化，第14−19节描述文库构建。
1. 细胞的收获与交联
- 将小鼠胚胎干细胞分化为终末期神经元后，向收获的细胞中加入11%的甲醛，使其终浓度达到1%（v/v）。在室温（RT，25 °C）下于摇床（摇动平台、振荡器或旋转器）上轻轻摇动细胞15分钟。
注意：根据目标蛋白交联的需求，可采用较低浓度的甲醛交联（例如终浓度为0.5%），或使用二琥珀酰亚胺基戊二酸酯（DSG）进行双重交联。 - 加入2.5 M甘氨酸，使其终浓度为150 mM，以终止交联反应。在室温下于摇床上轻轻摇动细胞5分钟。
- 将交联后的细胞在15 mL圆锥形离心管中，于室温下以1,350 × g 离心6分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
注意：交联后的细胞沉淀可在液氮中速冻后于-80 °C保存。
2. 细胞裂解
注意：本方案中的以下步骤适用于....
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结果
图2A展示了从小鼠胚胎干细胞分化而来的运动神经元细胞在裂解及不同超声循环处理后的超声结果。最佳超声循环次数（例如，图2A中的12个循环）可在100−400 bp的DNA片段中产生较强的DNA条带强度。高质量的ChIP-exo文库依赖于染色质DNA片段的大小和产量。因此，在开展ChIP-exo实验前，建议针对每种细胞类型及每批细胞优化超声条件。
图2B 显示了通过18−21个PCR循环扩增的ChIP-exo DNA样本的连接介导PCR（LM-PCR）产物。LM-PCR可扩增与DNA接头连接的ChIP-exo DNA片段，用于下一代测序。PCR引物是DNA接头序列的一部分。超声处理后的DNA片段大小约为100−400 bp（图2A）。经λ外切核酸酶消化后，DNA片段大小约为起始材料的一半（50−200 bp）。约125 bp的DNA接头被连接到ChI.......
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讨论
在本实验方案中，采用染色质免疫沉淀（ChIP）后接核酸外切酶消化的方法，以获得用于在超高定位分辨率下鉴定哺乳动物细胞中蛋白质-DNA相互作用的DNA文库。多个变量会影响ChIP-exo实验的质量。关键实验参数包括抗体的质量、超声破碎条件的优化以及LM-PCR循环次数。这些关键实验参数同样也是限制ChIP-exo实验效果的主要因素，将在下文中详细讨论。 如下所述。
在任何ChIP实验方案中，抗体质量都是最重要的考虑因素之一。建议在ChIP-exo实验中使用经过ChIP验证的抗体。在开展ChIP-exo实验前，可预先检测抗体质量。可通过ChIP-seq或ChIP-qPCR验证抗体是否适用于ChIP实验，方法是确认目标蛋白在DNA上的特异性结合位点。随后，优化添加至磁珠的抗体浓度，以确保蛋白-DNA复合物能够被有效免疫沉淀22,23。
染色质超声处理是ChIP-exo实验方案中的另一个关键步骤。超声处理对于.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Rhee实验室成员分享未发表的数据和进行富有价值的讨论。本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金RGPIN-2018-06404（H.R.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖，超纯级 | Invitrogen | 16500 | 染色质超声检测（第4.3.6节）和LM-PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.1节） |
| 牛血清白蛋白（BSA），无蛋白酶，热激分离，纯度≥98% | BioShop | ALB003 | 封闭溶液 |
| 抗Isl1抗体 | DSHB | 39.3F7 | 抗体与磁珠孵育（第5.6节） |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | 染色质超声处理（第3.3节） |
| 牛血清白蛋白（BSA），分子生物学级 | New England BioLabs | B9000S | 磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.2节） |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | 染色质超声处理（第3.5节），超声效果检测（第4.3.1、4.3.3和4.3.4节） |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | 细胞收集、交联与冷冻（第1.3节），细胞裂解（第2.2和2.3节），染色质超声处理（第3.1节） |
| cOmplete Mini 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693159001 | 添加至所有缓冲液中，蛋白酶K缓冲液和ChIP洗脱缓冲液除外 |
| dATP溶液 | New England BioLabs | N0440S | dA加尾反应（第15.1节） |
| 脱氧胆酸钠盐 | fisher scientific | BP349 | 裂解缓冲液3、高盐洗涤缓冲液和LiCl洗涤缓冲液 |
| dNTP混合物，分子生物学级 | Thermo Scientific | R0192 | 磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.2节） |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | 连接介导PCR（第18.1节） |
| EDTA，0.5 M，无菌溶液，pH 8.0 | BioShop | EDT111 | 裂解缓冲液1-3、超声效果检测（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液 |
| 无水乙醇，100% | Commercial alcohols | P006EAAN | 超声效果检测（第4.3.3节） |
| 甲醛，36.5-38%，含10-15%甲醇 | Sigma | F8775 | 细胞收集、交联与冷冻（第1.1节） |
| 甘油，试剂级，纯度≥99.5% | BioShop | GLY002 | 裂解缓冲液1 |
| 甘氨酸，生物技术级，纯度≥99% | BioShop | GLN001 | 细胞收集、交联与冷冻（第1.2节） |
| 糖原，RNA级 | Thermo Scientific | R0551 | 超声效果检测（第4.3.3节） |
| HEPES，1 M无菌过滤溶液，pH 7.3 | BioShop | HEP003 | 裂解缓冲液1、高盐洗涤缓冲液 |
| Klenow片段（3->5外切酶缺陷型） | New England BioLabs | M0212S | dA加尾反应（第15.1节） |
| λ外切酶 | New England BioLabs | M0262S | 磁珠上的λ外切酶消化（第11.2节） |
| 连接酶增强剂 | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒：磁珠上接头连接（第9.1节）和通用接头连接（第16.1节） |
| 连接酶主混合液 | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒：磁珠上接头连接（第9.1节）和通用接头连接（第16.1节） |
| 氯化锂（LiCl），试剂级 | Bioshop | LIT704 | LiCl洗涤缓冲液 |
| 用于ChIP的磁珠（Dynabeads Protein G） | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | 抗体与磁珠孵育（第5节） |
| 用于DNA纯化的磁珠（AMPure XP Beads） | Beckman Coulter | A63880 | DNA提取（第13.3节）和DNA纯化（第17.1节） |
| 磁力架（DynaMag-2 Magnet） | Invitrogen | 12321D | 用于第5–11节和第13节中的多个步骤 |
| MinElute凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28604 | PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.2节） |
| N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液，30%水溶液，≥97.0%（HPLC） | Sigma | 61747 | 裂解缓冲液3 |
| 辛基苯基聚氧乙烯醚（IGEPAL CA630） | BioShop | NON999 | 裂解缓冲液1和LiCl洗涤缓冲液 |
| 苯酚:氯仿:异戊醇，生物技术级（25:24:1） | BioShop | PHE512 | 超声效果检测（第4.3.1节） |
| phi29 DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0269L | 磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.3和14.4节） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1x | Corning | 21040CV | 细胞收集、交联与冷冻（第1.3节）、染色质超声处理（第3.1节）、抗体与磁珠孵育（第5.1节） |
| PowerPac Basic电源 | BioRad | 1645050 | 超声效果检测（第4.3.6节）和LM-PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.1节） |
| ProFlex PCR系统 | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | 用于第14.2、14.4、15.2、16.2和18.2节 |
| Protein LoBind管，2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | 抗体与磁珠孵育（第5.2节）和染色质免疫沉淀（第6.3节） |
| 蛋白酶K溶液，RNA级 | Invitrogen | 25530049 | 超声效果检测（第4.2节）和洗脱及逆转交联（第12.3节） |
| Qubit 4.0荧光计 | Invitrogen | Q33226 | PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.3节） |
| Qubit dsDNA BR检测试剂盒 | Invitrogen | Q32853 | PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.3节） |
| RNase A，无DNase和蛋白酶 | Thermo Scientific | EN0531 | 超声效果检测（第4.3.2节）和DNA提取（第13.2节） |
| 氯化钠（NaCl），BioReagent级 | Sigma | S5886 | 裂解缓冲液1-3、高盐洗涤缓冲液 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS），电泳级 | BioShop | SDS001 | 超声效果检测（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液 |
| 超声破碎珠和15 mL Bioruptor管 | Diagenode | C01020031 | 染色质超声处理（第3.1和3.2节） |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | 第4.2、4.3.2、4.3.5、8.2、9.2、10.3、11.2、12.2、12.3、13.2和16.2节 |
| Trizma盐酸溶液（Tris-HCl），BioPerformance认证，1 M，pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl缓冲液 |
| Trizma盐酸溶液（Tris-HCl），BioPerformance认证，1 M，pH 8.0 | Sigma | T2694 | 裂解缓冲液2、裂解缓冲液3、超声效果检测（第4.1节）、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液 |
| Ultra II末端修复/dA加尾模块（24次反应 -> 120次反应） | New England BioLabs | E7546S | 末端修复反应混合液和末端修复酶混合液：磁珠上的末端修复和dA加尾反应（第8.2节） |
| VWR迷你管式摇床，可调速 | VWR | 10159-752 | 用于第1、2、5、6和7节中的多个步骤 |
| 2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇，Triton X-100，试剂级 | BioShop | TRX506 | 裂解缓冲液1、染色质超声处理（第3.4节）和高盐洗涤缓冲液 |
参考文献
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).
- S....
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