Summary
אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד של אנדוקקרודיאל ותאי הכליליים כלילית מלבבות חולדה באמצעות עיכול הרקמה הסדרתית במאגר העיכול, איסוף תא מחזורי צנטריפוגה חוזרים, וטיהור תאים באמצעות anti-rat CD31 microbeads.
Abstract
זה הוכח כי בתאי האנדוקטלחיוג (EECs) ותאי הכליליים (CECs) שונים במקור, פיתוח, סמנים, ופונקציות. כתוצאה מכך, שתי אוכלוסיות התאים הללו משחקות תפקידים ייחודיים במחלות לב. מחקרים נוכחיים הכרוכים בתאי האנדותל מבודדים לחקור אוכלוסיות תאים המורכב של EECs ו-CECs. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד באופן עצמאי שתי אוכלוסיות תאים אלה עבור אפיון ספציפי לתא. בעקבות האוסף של קיר חופשי שמאלי וימני, תאי האנדותל מהמשטח החיצוניים והמשטח הפנימי משתחררים בנפרד באמצעות פתרון מאגר העיכול. העיכול הרציף של המשטח החיצוני ושכבת האנדוקרדיאל הפנימית נשמרה בהפרדה בין שתי אוכלוסיות התאים האנדותל. הבידוד הנפרד של EECs ו-CECs מאומת באמצעות זיהוי סמנים ספציפיים לכל אוכלוסיה. בהתבסס על שפורסם בעבר בפרופיל RNA של תא יחיד בתוך לב העכבר, Npr3, Hapln1, ו Cdh11 ביטוי הגן הוא ייחודי eecs; בעוד Fabp4, mgll, ו Cd36 ביטוי הגנים הוא ייחודי ל-cecs. הנתונים qPCR חשף ביטוי מועשר של סמנים אופייניים אלה בדגימות שלהם, המציין EEC מוצלחת בידוד CEC, כמו גם תחזוקה של תא פנוטיפ, המאפשר ניתוח פונקציונלי נוסף לתא.
Introduction
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט (שונה מגלדיס ואח '1) עבור הניתוח ובידוד הבא של תאי האנדותל של אנדוקרקל (EECs) ותאי כלילית (cecs) מלבבות חולדה. היכולת לחקור את אוכלוסיות התאים הללו באופן עצמאי תאפשר חקירת מנגנונים ספציפיים לסוג תא שבבסיס מגוון מחלות לב שיכולות לשמש כמטרות טיפוליות פוטנציאליות. אולם, שיטה מוצלחת לאיסוף אוכלוסיות תאים אלה באופן עצמאי עדיין לא פורסמה.
Cecs שונים eecs לגבי מקורם, סמנים, פונקציות במהלך התפתחות הלב ומחלות1,2,3,4,5,6,7. ה-EECs נובע מפני השטח הגחוני. של העור המזושל הלבהשלישי הם נובעים Flk1+ בתאי הקדמון בתגובה של והוא איתות ויוצרים את השכבה הפנימית ביותר של שלושת האזורים הנפרדים של הלב המתפתח: אטריום, חדר החלל, ובסינוס וונסוס3,6. מעקב גנטי השושלת עולה כי התאים החזקים pluripotent לחייג של venosus סינוס לגזור תאים ורידים, אשר להגר ליצור את שכבת subepicardial3. לאחר מכן, שכבת subepicardial מבדיל לעורקים ורידים כליליים, כולל cecs, אשר להישאר על פני קיר ללא היקפי היקפית3,4. זה אנדוקרחיוג לשביל אנדותל מוסדר על ידי ווסתות, אלה/apj, ו SOX17 איתות3,4,6,8,9. של מחיצת המוח הבין-חדרית. במנגנון לא ידוע3 לאחר מכן, הבחנה מקומית בין eecs ו-cecs מוצעת על-ידי סמנים ספציפיים לשתי אוכלוסיות תאים אלה, כולל mgll, Fabp4 ו- Cd36 expression ב-cecs, או Npr3, Cdh11 וביטוי Hapln1 ב-eecs3,5,10.
EECs ו-CECs לשחק תפקידים שונים בתפקוד הלב. אנקרחיוג למעבר מסנצ'יאל, מערך שסתומים, התבגרות קאמרית, רגולציה של מערכת היצוא ופיתוח תעלות מידע מותנית ב-EECs6. לחילופין, CECs תורם לטונוס ולדלקות של עורקים כליליים11. סטיות אלה בפונקציה גורמות לתפקידים מסוימים בפיתוח מחלות4,12. למשל, הראיות מעידות כי EECs פגום עלול להוביל למחלות שסתום מולדות6, שריר הלב noncompaction6, אפקט sepccccceceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee.2,שרירי המוחהשמאלי, תסמונת לבשמאלhypoplasia13,12 באופן דומה, מחקרים מצאו כי CECs חריגים תורמים מחלת עורק כלילי14 ו פקקת11.
בידוד מוצלח של EECs ו-CECs יש צורך להשיג ידע מקיף של שתי אוכלוסיות תאים אלה, אשר יכול להיות מנוצל הן במחקר והן הגדרות קליניות. קביעת הצמיחה והבידול של אוכלוסיות תאים אלה תספק התייחסות לבידול של תת-סוגי משתנים מתאי גזע המושרה pluripotent (iPSCs). עוד, זיהוי מלא של השונויות בפיתוח, רגולציה, ותפקוד של EECs ו-CECs הוא חיוני להבנת הגורמים גנומית ואפיגנוקיים האחראים למחלות לב רבות באופן ספציפי סוג תא. מאמר זה מתאר צעדים לאוסף המוצלח של EECs ו-CECs באופן עצמאי, ומספק עדות להפרדה על-ידי הערכת רמות ביטוי הגנים של סמנים ספציפיים לסוג תא.
Protocol
כל ההליכים בעלי חיים אושרו על ידי פאנל מינהלי על טיפול בעלי חיים מעבדה (APLAC31608) באוניברסיטת סטנפורד.
1. הכנת מאגרים
- הכן את מאגר העיכול באמצעות הריאגנטים הרשום בטבלה 1.
- הכן את פתרון המניה DNase I: התמוססות DNase I ב-RNase-מים ללא תשלום עבור פתרון מניות של 2,000 יחידות/mL (1 מ"ג/mL). הורדה ואחסון של פתרון המניה ב-20 ° c.
- להכין את הפתרון ליבראז: לפזר liberase עם RNase-מים חינם עבור פתרון מניות של 5 מ"ג/mL. סובב אותו על הגדה הרים ב 4 ° c עבור 30 דקות. לאחסן את הפתרון מניות ב-20 ° c.
- הכן את מאגר המיון על ידי דילול 0.5 M ethylenediammiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiis חומצה (EDTA) ו 10% בסרום של שור (BSA) פתרון מניות עם מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS) עבור ריכוז סופי 0.5 של
2. אוסף לב
הערה: שישה חולדות של מג במשקל 50-100 גרם שימשו בפרוטוקול זה. שום הבדל מגדרי לא נצפתה.
- המתת החסד עם CO2 ומניחים אותו בעמדה פרקדן על פלטפורמת מבתר. להצמיד את הגפיים למטה לחטא הן את הבטן ואת החזה עם 70% אתנול.
- פתח את הבטן עם מספריים והכנס מחט G 21 לתוך החלק של קאווה המטה האחורי ממוקם מאחורי המעיים. משוך את המזרק בחזרה, לנתק את הדם מן הווריד עד הכבד נראה קל יותר בצבע ולא יותר דם יכול להיות מסוגר, המציין הסרת דם מספיק.
- באמצעות מספריים, לפתוח את החזה בזהירות כדי למנוע נזק לריאות וללב. הרם את קשת העורקים/אטריום עם מלקחיים ולחתוך את העורקים, עורק הריאות, ורידים ריאתי, ולבנה קאווה כדי לשחרר ולהסיר את הלב.
- לשטוף את הלב עם 50 mL של קר 1x הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) מאגר 3x כדי להסיר דם מוגזם.
- תחת מיקרוסקופ מיקרודיסקציה, הסר את הקיר הימני של החומה החופשית לצינור של 5 מ ל המכיל את מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) (איור 1A,B).
- הניחו את הלב על פניה האחוריים והפנים כדי לזהות את הצד השמאלי והימני.
- אתר את עורק הריאות, החלק הקדמי ביותר של הוורידים והעורקים הסתעפות מן החלק העליון של הלב לחתוך דרך עורק הריאתי מטה אל החדר הימני הנכון. על הפנים הקדמיות של הלב, חותכים לאורך המחיצה עד שהגיעו לפיסגה. המשך לחתוך מהפיסגה במעלה הצד האחורי של הלב לאורך המחיצה עד לעורק הריאתי ולנקודת המפגש הימני התאי (איור 1A).
- החל מעורק הריאתי ומנקודת הצומת הימנית, חותכים הן את הצד הקדמי והן האחורי של הלב הניצב לניתוח הקודם והרחק ממחיצת המחיצה, עד שהקיר הימני השמאלי משוחרר משאר הלב (איור 1B).
- תחת מיקרוסקופ מיקרודיסקציה, להסיר את הקיר השמאלי חדרית חינם לתוך צינור 5 מ ל המכיל DMEM (איור 1C,D).
- אתר את העורקים, הסתעפות מן החלק העליון של הלב מאחורי העורק הריאתי, ולחזור על השיטה המתוארת בשלב 2.5 לחתוך את הקיר השמאלי חדרית חינם.
3. העיכול EEC
- מניחים את שתי הרקמה הימנית והשמאלית של רקמות הקיר בצלחת התרבות 60 ס מ עם המשטח הפנימי השוכב בדירה, פונה כלפי מטה (איור 2).
הערה: המשטח הפנימי הוא הפנים הפנים של החדר מעוצב מעט בצורת כמוצג באיור 2A,C. - הוסיפו 0.5 – 1 מ ל של מאגר העיכול למנה, הצבת קצה הפיפטה ישירות מתחת לרקמה. המשך עד שרק המשטח הפנימי יהיה שקוע.
- מודחת הצלחת ב 5% CO2, 37 מעלות בחממה של ° c עבור 5 דקות.
- הוסף EC בינוני לצלחת התרבות כדי לעצור את העיכול.
הערה: שמור את כמות מאגר העיכול ל-EC בינונית כיחס 1:5. - השתמש בפיפטה 1 מ ל כדי לרוקן את המשטח הפנימי של החדרים עם EC בינוני ולהעביר את הנגר לתוך שפופרת אוסף 50 mL דרך מסננת 40 מ"מ (איור 2E). שמור את הקולקציות על קרח. בשביל טיהור במורד הזרם
4. העיכול ו-CEC
- חותכים לאורך המשטח החיצוני של החדר השמאלי ללא זיהום מהשכבה הפנימית (איור 2B,D) ומניחים כל אחד בצינור 5 מ ל נפרד המכיל 1 מ ל של מאגר העיכול.
הערה: החדר השמאלי ניתן לזהות כמו החדר העבה יותר, ואת המשטח החיצוני ניתן לקבוע כפנים החיצוני של החלל הקמור מעט. - באמצעות מספריים לחיתוך, האוהב את הקיר חדרית לתוך קטן, 1 מ"מ3 חתיכות.
- מודיית את הצינור באמבט 37 מעלות צלזיוס עבור כ 15 – 20 דקות. מערבולת כל 2 – 3 דקות.
- פיפטה 4 מ ל של EC בינוני לתוך צינור 5 מ ל כדי לסיים את העיכול.
- העבר את הפתרון עם צינורות 5 מ ל לתוך צינור 50 mL באמצעות מסננת 40 מ"מ (איור 2E). שמור את הקולקציות על קרח. בשביל טיהור במורד הזרם
5. אוסף תאים
- צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן מביסה את supernatant.
- אם הגלולה מופיעה אדומה, השהה מחדש את הגלולה ב-1 – 2 מ ל של 1 x תא דם אדום (RBC) מאגר ליסינג (איור 2F).
הערה: אם אין RBCs, המשך לשלב 6. - מודטה את הצינורות באמבט מים 37 ° c עבור 5 דקות.
- פיפטה 10 מ ל של PBS לתוך צינורות 50 mL להפסיק את הליזה.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן לבשל את הסופרנטאנט.
6. EC מיון
- הוסף 90 μL של מאגר מיון ו 10 μL של נוגדן anti-CD31 PE לתוך שפופרות 50 mL.
- מערבולת את הצינורות ולאחר מכן מודטים אותם 10 דקות במקרר 4 ° c.
- הוסף 10 מ ל של מאגר מיון לתוך הצינורות, לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב-RT.
- מרפה את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה ב-80 μL של מאגר מיון ו -20 μL של מיקרוחרוזי אנטי-PE.
- מערבולת את הצינורות ואת הדגירה ב 4 ° c עבור 15 דקות.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ ל של מאגר מיון לתוך הצינורות, לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה אותם ב 300 x g עבור 10 דקות ב RT.
- ולהשעות את הגלולה ב-500 μL. של מאגר מיון
- מקם עמודה המכילה כדורים על-חושיים למפריד מגנטי ושטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר מיון.
- לאחר העמודה הם "לעצור זרימה", פיפטה 500 μL של התא הבולם לתוך העמודות ולאחר מכן לשטוף את העמודות עם מאגר מיון. חזור על כביסה 3x, כל אחד עם 3 מ ל של מאגר מיון (איור 2G).
- הסר את העמודות מהמפריד והוצא אותן מעל צינור אוסף של 15 מ ל חדש.
- עם פיפטה, יש להוסיף 5 מ ל של EC בינוני לעמודות, ולהניע את הפתרון באמצעות בוכנה עמודה.
- צנטריפוגה את צינורות האוסף ב 300 x g עבור 10 דקות בשעה RT ולאחר מכן מרוב את הסופרנטאנט.
- לחלץ את RNA מן הגלולה התא של הדגימות EEC ו-CEC באמצעות ערכה, בעקבות הוראות היצרן. מינימום של 500 ng של RNA ניתן להשיג.
הערה: לאחר חילוץ RNA, המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 ° c. - הפוך תעתור 500 ng של RNA כדי לקבל cDNA באמצעות פריימר אקראי ערכת, בעקבות הוראות היצרן.
- לבצע PCR כמותי לאימות של אוכלוסיות אנדותל ושלל (איור 2H). רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2.
- הוסף 5 μL של EEC או CEC cDNA (1 ng/μL) לתוך הבארות של 384 qPCR לוחית. הוסף את EEC או CEC cDNA לתוך מספיק בארות כך שיש שלוש בארות למספר התחל.
- מערבבים 6 μL של מאגר הירוק 2x qPCR SYBR עם 0.5 μL של כל 10 μM פריימר, כולל התחל והפוך, ולהוסיף אותם לאחד היטב מתאים לכל גן מועמד.
- חותם את הצלחת עם הסרט פלסטיק וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 300 x g ב RT.
- מניחים את הצלחת לתוך מכונת qPCR ולאחר מכן להתחיל את התוכנית ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 95 ° צ' עבור 15 s, ולאחר מכן 55 ° צ' עבור 60 s. חזור על שני השלבים הבאים עבור מחזורי 45.
Representative Results
התהליך של בידוד EEC ו-CEC מתואר באיור 2. הבידוד המוצלח של EECs ו-CECs נקבע על ידי הערכת סמני תא פאן-אנדותל, כמו גם לאלה הנבדלים בשתי אוכלוסיות המשנה. כפי שחזוי, qPCR חשף כי ביחס β-actin, eecs ביטא רמות גבוהות יותר של סמנים אנדוקרחיוג Npr3, Hapln1, ו Cdh11 לעומת cecs (איור 3a). כמו כן, CECs הביע רמות גבוהות יותר של סמנים כליליים Fabp4, mgll, ו- Cd36 לעומת Eecs (איור 3b). בנוסף, הן EECs ו-CECs הביעו את גן סמן פאן-EC Cdh5, עם רמות גבוהות מעט ב-CEC (איור 3c).
איור 1: תרשים של ניתוח לב. (א) החיתוך הראשון נעשה כדי להפריד את קיר החדר הימני מתוך המחיצה. (ב) החתך השני נעשה כדי לשחרר את החדר הימני לחלוטין. (ג) החיתוך הראשון נעשה כדי להפריד את החדר השמאלי קיר בחינם מן המחיצה. (ד) החתך השני נעשה כדי לשחרר את החדר השמאלי לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיאגרמת הגדרת העיכול של ה-CECs ו-EECs והסידור הבא עבור מיון תאים. (A) הפנימי חינם הקיר החדרית (ב) החיצוני הקיר ללא הדופן היו (C) שקוע בחיץ העיכול או (ד) מתעכל מאגר העיכול בהתאמה. (ה) איסוף וסינון של פתרונות תאים ואחריו (F) הליזה תא דם אדום (rbc) לפירוק ו (G) מגנטי המופעל תא מיון (מקינטוש) באמצעות הנוגדן CD31. (ח) מטוהרים ecs עובדו לאימות גנים ביטוי באמצעות qpcr. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנתונים qPCR אימות בידוד של cecs ו-eecs. (א) רמות ביטוי גנים של סמני Eec Npr3, Cdh11 וHapln1 ב-eecs ו-CECS, כללו על-ידי PCR בזמן אמת. (ב) רמות ביטוי גנטי של הסמנים CEC mgll, Fabp4, ו Cd36 ב eecs ו-CECS היו כימות על ידי ה-PCR בזמן אמת. (ג) הסמן פאן-EC Cdh5 היה ככמת ב Eecs ו cecs על ידי ה-PCR בזמן אמת. (n = 3 בכל קבוצה). ברים מייצגים ממוצע ± SEM. * p < 0.05, * * p < 0.01 vs. EEC, לא מזווג t-test. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| . שולחן 1 מאגר העיכול (1.5 מ ל) | |||
| . מלאי קון | . ההונאה הסופית | אמצעי אחסון | |
| ליבראז TM | 5 מ"ג/ml | 0.5 מ"ג/ml | 150 |
| דיסה האני | 1 מ"ג/ml | 20 מ ל | מיכל שאול |
| מיכל ביטון | 1 מדיום | 10 ממ ' | מיכל בן 15 |
| מיכל הזיכרון | - | - | 1305 |
טבלה 1: מתכון למאגר העיכול.
| . שולחן 2 תחל רצפים | ||
| שם גן | קדימה | פוך |
| Npr3 | מיכל הכהן | GGAATCTTCCCGCAGCTCTC |
| Cdh11 | מיכאל שלמה | הגנה מפני הקובץ |
| Hapln1 | לינה ברקת | מוזיאון הקופים |
| מגסול | ליאת ברקת | לינה ברקת |
| Fabp4 | מיכל הכהן | מיכל ברקת |
| Cd36 | כמוסות מגניקסי | CCCGGTCACTTGGTTTCTGA |
| Cdh5 | CCATTGAGACAGACCCCGAC | מיכאל שלמה |
| ב-אקטין | TCTGTGTGGATTGGTGGCTC | מיכל ברקת |
שולחן 2: פריימר רצפים
Discussion
CECs ו-EECs שונים במקור, סמנים, פונקציות, ובכך יכול לשחק תפקידים ייחודיים בפיתוח ומחלות. פרוטוקולים קיימים עבור בידוד תא אנדותל מוגבלים רקמות macrovascular, מזניחה את האוסף של EECs, ובכך להגביל את המחקר של CEC-ו-EEC-פונקציות ספציפיות. חיוני לבודד ולחקור את שתי האוכלוסיות הללו באופן עצמאי, כפי שידע זה יספק התייחסות הבידול של iPSCs לתוך CECs ו-EECs למחקרים עתידיים ולהקל על בחינת אוכלוסיות תאים אלה עבור מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור מחלות לב שונות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של EECs מהמשטח הפנימי ו-CECs מן המשטח החיצוני של קיר חינם חדרית של חולדות מבוגרים.
חשוב לשלוט בתזמון עבור כל שלב בדיוק בפרוטוקול זה. בגלל מספר EECs מוגבל מאוד רקמת לב חולדה, מזלנו את זמן העיכול של השכבה הפנימית של הלב כדי למנוע נזק הסלולר וחשוב יותר, הזיהום CEC. תוספת מיידית של הפתרון הבינוני EC כדי לסיים את התגובה אנזימטית הוא גם חשוב מאוד לשמור על יכולת הקיום של תאים גבוהים. כדור אדום לאחר איסוף תאים מרמז על נוכחות של מספר רב של RBCs. בהתאם לכמות הזיהום RBC, 1 – 2 מ ל של מאגר הליזה RBC ניתן להוסיף כדי לבזות את RBCs. הדגירה חייבת להיות בקפידה מתוזמן כדי למנוע נזק משמעותי לתאים, ו-PBS התווסף מיד כדי לסיים את התגובה באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, הצלחנו לבודד10 eecs מ 6 לבבות חולדה. תאים אלה יכולים להיות שנזרע צלחת תרבות התא עבור הרחבה נוספת אפיון.
בעת הכנת הרקמה עבור אוסף הקיר בחינם, הלב נשטפה עם HBSS כדי להסיר את רוב RBCs. HBSS הוא המדיום המומלץ בשל המראה הברור שלה, אשר מאפשר הדמיה של כדוריות הדם, בניגוד DMED המכילה אדום פנול. הרכב מאגר העיכול מבטיח שחרור מספיק של תאי האנדותל, שבו אנזים העיכול ליברז רצועות את רקמת התאים החשופים, DNase אני מבטלת את ה-DNA מן התאים המתים כדי לקדם את הניתוק התא שעשוי להיות מעוכב על ידי איכות הדבק של ה-DNA, מאגר HEPES מאזן את ה-pH, ו DNASE הוא מדיום בסיס שונה עם ריכוז גבוה יותר של
על פי רצפי ה-RNA תא יחיד (scRNA-seq) המתקבל משני האנושיים15 ומלב העכבר10, מספר סמנים המיוחסים לאוכלוסיות EC ספציפיות דווחו. בחרנו כמה מן הגנים המועשרת ביותר כדי לבחון את הטוהר של EECs מבודדים (כלומר, Npr3, Cdh11, ו- Hapln1) ו-Eecs (כלומר, Mgll, Fabp4, ו- Cd36). ביחס ל- β-actin, Npr3, Cdh11ו- Hapln1 סמנים הפגינו הבעה מוגברת ב-eecs בהשוואה ל-cecs. באופן דומה, הביטוי של Mgll, Fabp4, ו Cd36 סמנים היה גדול יותר ב-cecs לעומת eecs. הסמנים המובטאים באופן ייחודי לכל מדגם הוא בהסכמה עם סמנים האופייניים ל-EECs ו-CECs בהתאמה, ומציינים בידוד מוצלח.
עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי אינו יכול לשלול זיהום בין שתי אוכלוסיות ה-EC במהלך הבידוד, אפילו עם מעכל רציפים בשליטה קפדנית. לכן, ניתן להחיל כמה סמני שטח תא לצורך טיהור נוסף. לדוגמה, NPR3 מתייג בדרך כלל את האנדוקרדיום10, ואילו apj יכול לעקוב אחר רוב ה-cecs16. מכיוון שני סמנים אלה מבוטא על פני השטח התא, הם יכולים לשמש מיון תא המופעל על ידי הזריחה (FACS), ונוגדנים המשמשים לטיהור נוסף של אוכלוסיות EC מובחנת. בנוסף, האדם15 ועכבר10 לב scRNA-seq יכול לאשר העשרה של Npr3 ב eecs, ו Cd36 ניתן להשתמש בפוטנציאל CEC טיהור.
לסיכום, הפרוטוקול המוצג מתאר את הבידוד העצמאי של EECs ו-CECs מלב החולדה. הזיהוי המקיף של המאפיינים הסלולריים, מופעל על ידי בידוד התא, יכול להיות מנוצל עבור יישומים משמעותיים במורד הזרם.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מעריכים מאוד את ד ר Lingli וואנג על עזרתה בפרוטוקול בעל החיים, והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת סטנפורד לתמיכה בתשתיות. עבודה זו נתמכת על ידי NIH/NHLBI K99 HL135258 (כדי מ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors - Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors - Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
