Summary
Denne protokollen beskriver et dynamisk kultursystem for å produsere kontrollerte størrelsesaggregater av menneskelige pluripotente stamceller og ytterligere stimulere differensiering i lillehjernen organoider under kjemisk definerte og materfrie forhold ved hjelp av en engangsbioreaktor.
Abstract
Lillehjernen spiller en kritisk rolle i vedlikehold av balanse og motorisk koordinering, og en funksjonell defekt i forskjellige lillehjernen nevroner kan utløse lillehjernen dysfunksjon. Mesteparten av dagens kunnskap om sykdomsrelaterte nevronale fenotyper er basert på postmortemvev, noe som gjør forståelsen av sykdomsprogresjon og utvikling vanskelig. Dyremodeller og udødelige cellelinjer har også blitt brukt som modeller for nevrodegenerative lidelser. Imidlertid gjenoppretter de ikke helt menneskelig sykdom. Humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har stort potensial for sykdomsmodellering og gir en verdifull kilde til regenerative tilnærminger. I de senere årene har genereringen av cerebrale organoider fra pasientavledede iPSCer forbedret utsiktene for neurodegenerativ sykdomsmodellering. Imidlertid mangler protokoller som produserer et stort antall organoider og et høyt utbytte av modne nevroner i 3D-kultursystemer. Protokollen som presenteres er en ny tilnærming for reproduserbar og skalerbar generasjon av menneskelige iPSC-avledede organoider under kjemisk definerte forhold ved hjelp av skalerbare engangsbioreaktorer, der organoider får lillehjernens identitet. De genererte organoidene er preget av uttrykk for spesifikke markører på både mRNA og proteinnivå. Analysen av spesifikke grupper av proteiner tillater påvisning av forskjellige lillehjernecellepopulasjoner, hvis lokalisering er viktig for evaluering av organoid struktur. Organoid kryoseksjon og ytterligere immunstaining av organoidskiver brukes til å evaluere tilstedeværelsen av spesifikke lillehjernencellepopulasjoner og deres romlige organisasjon.
Introduction
Fremveksten av menneskelige pluripotente stamceller (PSCer) representerer et utmerket verktøy for regenerativ medisin og sykdomsmodellering, fordi disse cellene kan differensieres i de fleste cellelinjer i menneskekroppen1,2. Siden oppdagelsen har PSC differensiering ved hjelp av ulike tilnærminger blitt rapportert å modellere ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerativelidelser 3,4,5,6.
Nylig har det vært rapporter om 3D-kulturer avledet fra PSCer som ligner menneskelige hjernestrukturer; disse kalles hjerneorganoider3,7,8. Genereringen av disse strukturene fra både sunne og pasientspesifikke PSCer gir en verdifull mulighet til å modellere menneskelig utvikling og nevroutviklingsforstyrrelser. Metodene som brukes til å generere disse velorganiserte hjernestrukturene, er imidlertid vanskelige å søke om deres store produksjon. For å produsere strukturer som er store nok til å rekafulere vevmorfogenese uten nekrose inne i organoidene, er protokoller avhengige av den første nevrale forpliktelsen i statiske forhold, etterfulgt av innkapsling i hydrogeler og påfølgende kultur i dynamiske systemer3. Slike tilnærminger kan imidlertid begrense den potensielle oppskalering av organoidproduksjon. Selv om det er gjort forsøk på å lede PSC differensiering til bestemte regioner i sentralnervesystemet, inkludert kortikale, striatal, midbrain, og ryggmargsnevroner9,,10,,11,12, er genereringen av spesifikke hjerneregioner under dynamiske forhold fortsatt en utfordring. Spesielt har generasjonen modne cerebellar nevroner i 3D-strukturer ennå ikke blitt beskrevet. Muguruma et al. pionerer generasjonen av kulturforhold som rekafulerer tidlig cerebellar utvikling13 og nylig rapportert en protokoll som gjør det mulig for menneskelige embryonale stamceller å generere en polarisert struktur som minner om første trimester lillehjernen7. Modningen av cerebellar nevroner i de rapporterte studiene krever imidlertid dissosiasjon av organoider, sortering av cerebellar stamfarer og kokultur med materceller i et monolayer kultursystem7,14,15,16. Derfor er den reproduserbare generasjonen av de ønskede lillehjernen organoider for sykdomsmodellering under definerte forhold fortsatt en utfordring forbundet med kultur og materkildevariabilitet.
Denne protokollen presenterer optimale kulturforhold for 3D-utvidelse og effektiv differensiering av menneskelige PSCer i cerebellar nevroner ved hjelp av engangs vertikale hjul bioreaktorer (se Table of Materials for spesifikasjoner), heretter kalt bioreaktorer. Bioreaktorer er utstyrt med et stort vertikalt løpehjul, som i kombinasjon med en U-formet bunn gir en mer homogen skjærfordeling inne i fartøyet, slik at mild, jevn blanding og partikkelsuspensjon med reduserte agitasjonshastigheter17. Med dette systemet kan form og størrelseskontrollerte celleaggregater oppnås, noe som er viktig for en mer homogen og effektiv differensiering. Videre kan et større antall iPSC-avledede organoider genereres på en mindre arbeidskrevende måte.
Hovedtrekket i organoidene, som er 3D flercellede strukturer som vanligvis dannes fra stamceller, er selvorganiserende av forskjellige celletyper som danner bestemte former som de som er sett i menneskelig morfogenese18,19,20. Derfor er organoid morfologi et viktig kriterium som skal evalueres under differensieringsprosessen. Kryoseksjon av organoider og ytterligere immunstaining av organoidskiver med et bestemt sett med antistoffer tillater romlig visualisering av molekylære markører for å analysere cellespredning, differensiering, cellepopulasjonsidentitet og apoptose. Med denne protokollen, ved å immunstaining organoide kryoseksjoner, observeres en innledende effektiv neural forpliktelse avden 7. Under differensiering observeres flere cellepopulasjoner med lillehjernens identitet. Etter 35 dager i dette dynamiske systemet organiserer cerebellar neuroepithelium langs en apicobasal akse, med et apisk lag av voksende forfedre og basalt plassert postmitotiske nevroner. Under modningsprosessen, fra dag 35-90 av differensiering, kan distinkte typer cerebellar nevroner ses, inkludert Purkinje celler (Calbindin+), granulceller (PAX6+/ MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolar børsteceller (TBR2+), og dype lillehjernen kjerner projeksjon nevroner (TBR+). Også en ubetydelig mengde celledød observeres i de genererte lillehjernen organoider etter 90 dager i kultur.
I dette systemet modnes menneskelige iPSC-avledede organoider til forskjellige lillehjernennevroner og overlever i opptil 3 måneder uten behov for dissosiasjon og materkokultur, noe som gir en kilde til menneskelige lillehjernernevroner for sykdomsmodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Passaging og vedlikehold av menneskelige iPSCer i monolayer kultur
- Utarbeidelse av plater
- Tin kjellermembranmatrisen (se Materialtabell)ved 4 °C og klargjør 60 μL aliquots. Frys aliquots ved -20 °C.
- For å belegge brønnene på en 6 brønnplate, tin en aliquot av kjelleren membran matrise på is. Når tinet tilsett 60 μL til 6 ml DMEM-F12. Forsiktig resuspend ved pipettering opp og ned.
- Tilsett 1 ml fortynnet kjellermembranmatriseløsning til hver brønn av en 6 brønnplate og inkuber ved RT i minst 1 time før passaging eller oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Passaging av iPSC kolonier med EDTA
- Oppretthold iPSC-er i monolayerkulturen i 6 brønnplater i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
MERK: I denne protokollen ble tre forskjellige menneskelige iPSC-linjer brukt: F002.1A.1321, human episomal iPSC-linje (iPSC6.2)22, og kommersielt innhentet iPS-DF6-9-9T.B (se Materialtabell). - Før passaging, inkuber de lagrede platene (trinn 1.1) ved romtemperatur (RT) i 15 min og klargjør mTesR1 medium (tabell 1).
- Aspirer oppløsningen fra platen ved hjelp av en serologisk pipette og tilsett umiddelbart 0,5 ml mTeSR1 medium til hver brønn.
- Aspirer brukt medium fra brønnen som inneholder iPSCer og vask en gang ved hjelp av 1 ml på 0,5 mM EDTA per brønn.
- Tilsett 1 ml 0,5 mM EDTA i hver brønn og inkuber ved RT i 5 min.
- Aspirer EDTA og fjern cellene fra brønnene ved å forsiktig tilsette mTeSR1 medium og pipettere koloniene ved hjelp av en P1000 mikropipette. Samle cellene i et konisk rør.
MERK: Ikke pipetteceller opp og ned mer enn 3x. - Tilsett 1 ml cellesuspensjon (fortynnet 1:4) i hver brønn slik at hver brønn inneholder 1,5 ml medium etter at cellesuspensjonen er lagt til. Returner celler til inkubatoren ved 5 % CO2,37 °C.
- Erstatt brukt medium daglig og passasje hver 3 dager når 75%-80% samløpet oppnås.
- Oppretthold iPSC-er i monolayerkulturen i 6 brønnplater i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
2. Seeding av menneskelige iPSCer i bioreaktoren
- Inkuber iPSC dyrket som monolayers i mTeSR1 supplert med 10 μM ROCK-hemmer Y-27632 (ROCKi). Tilsett 1 ml supplert medium til hver brønn fra en 6 brønnvevskulturplate og inkuber i 1 time ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
MERK: ROCKi brukes til å beskytte dissosierte iPSCer mot apoptose23. - Etter 1 time inkubasjon, aspirer brukt medium fra hver brønn og vask 1x med 1 ml 1× PBS per brønn.
- Tilsett 1 ml celleavløsningsmedium (se Materialtabell) i hver brønn på en 6 brønnplate og inkuber ved 37 °C i 7 min til cellene løsner lett fra brønnene med skånsom risting.
- Pipette celleavløsningsmediet opp og ned med en P1000 mikropipette til cellene løsner og dissosierer i enkeltceller. Tilsett 2 ml komplett cellekulturmedium til hver brønn for å inaktivere enzymatisk fordøyelse og pipette cellene forsiktig inn i et sterilt konisk rør.
- Sentrifuge ved 210 × g i 3 min og fjern supernatanten.
- Resuspend cellepellet i kulturmedium (det vil vil vil at mTeSR1 supplert med 10 μM ROCKi) og telle iPSCene med et hemocytometer ved hjelp av trypan blå fargestoff.
- Frø 15 × 106 enkeltceller i bioreaktoren (maksimalt volum på 100 ml) med 60 ml mTeSR1 supplert med 10 μM ROCKi med en endelig celletetthet på 250.000 celler/ml.
- Sett inn fartøyet som inneholder iPSCene i den universelle baseenheten som er plassert i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
MERK: Bioreaktorrøringen opprettholdes i 24 timer ved å sette den universelle baseenhetskontrollen til 27 o/min for å fremme iPSC-aggregering.
3. Differensiering og modning av humane iPSC-avledede aggregater i cerebellar organoider
- Definer dagen for enkeltcellesåing som dag 0.
- På dag 1 samler du 1 ml av iPSC-aggregater prøven ved hjelp av en serologisk pipette. Oppretthold bioreaktoren under agitasjon som før ved å plassere den universelle baseenheten med bioreaktoren som inneholder aggregatene i en steril strømføring før prøven samles opp. Plate celle suspensjon i en ultra-lav vedlegg 24 godt plate. Kontroller at iPSC-avledede aggregater dannes.
- Hent bilder med et optisk mikroskop ved hjelp av en total forstørrelse på 40x eller 100x for å måle aggregert diameter.
- Mål området for aggregatene i hvert bilde ved hjelp av FIJI-programvare.
- Velg "Analyser | Sett Målinger" fra menylinjen og klikk på "Area" og "OK".
- Velg "Fil | Åpne" fra menylinjen for å åpne en lagret bildefil. Velg linjevalgverktøyet som presenteres på verktøylinjen, og opprett en rett linje over skalalinjen som vises i bildet. Velg "Analyser | Angi skala" fra menylinjen.
- I "Kjent avstand"legg til vidden av bildets skalalinje i μm. Definer "Lengdeenhet" som μm. Klikk på "Global" for å opprettholde innstillingene og "OK". Velg Ovalt valg på verktøylinjen.
- For hver mengde avgrense området med det ovale verktøyet. Velg "Analyser | Mål". Beregn diameteren basert på målt område, med tanke på at aggregater er omtrent sfæriske ved hjelp av
med A som arealet av aggregatet.
- Når den gjennomsnittlige diameteren på aggregatene er 100 μm, må du erstatte 80 % av det brukte mediet med frisk mTeSR1 uten ROCKi. Når aggregater når 200–250 μm i diameter, må du erstatte alle brukte medier med gfCDM (tabell 1), slik at organoidene legger seg på bunnen av bioreaktoren.
MERK: Hvis den gjennomsnittlige mengdediameteren overstiger 350 μm, ikke start differensieringsprotokollen. Gjenta såingen av enkeltceller. Vanligvis tar det rundt 1 dag for aggregatet å nå en gjennomsnittlig diameter på 100 μm. - Sett inn bioreaktoren som inneholder aggregatene i den universelle baseenheten som er plassert i inkubatoren ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
- Reduser bioreaktoragitasjonen til 25 o/min.
- På dag 2 gjentar du trinn 3.2, 3.3 og 3.4 for å evaluere den samlede diameteren. Tilsett 30 μL FGF2 (endelig konsentrasjon, 50 ng/ml) og 60 μL SB431542 (endelig konsentrasjon, 10 μM) til 60 ml gfCDM differensieringsmedium (tabell 1). Erstatt alle brukte medium fra bioreaktor med den supplerte gfCDM. Gjenta trinn 3.6.
MERK: SB431542 er avgjørende for å hemme mesendodermisk differensiering, indusere neural differensiering24. FGF2 brukes til å fremme caudalization av neuroepithelial vev25. - Gjenta trinn 3.2, 3.3, 3.4 og 3.8 på dag 5.
MERK: Samlet størrelse skal øke under differensieringsprotokollen. Diameteren er imidlertid bare kritisk når differensieringen starter, fordi denne parameteren kan påvirke effekten av differensiering. - Gjenta trinn 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 7. Fortynn FGF2 og SB431542 til 2/3: Tilsett 20 μL FGF2 og 40 μL SB431542 til 60 ml gfCDM differensieringsmedium. Erstatt alle brukte medium fra bioreaktor med supplert gfCDM. Gjenta trinn 3.6 og øk bioreaktoragitasjonen til 30 o/min.
- Gjenta trinn 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 14. Tilsett 60 μL FGF19 (endelig konsentrasjon, 100 ng/ml) til 60 ml gfCDM differensieringsmedium. Erstatt alle brukte medium fra bioreaktor med gfCDM supplert med FGF19. Gjenta trinn 3.6.
MERK: FGF19 brukes til å fremme polarisering av mid-hindbrain strukturer26. - Gjenta trinn 3.2, 3.3, 3.4 og 3.11 på dag 18.
- Gjenta trinn 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 21. Erstatt alt brukt medium fra bioreaktoren med komplett neurobasal medium (tabell 1). Gjenta trinn 3.6.
MERK: Neurobasal medium er et basalmedium som brukes til å opprettholde den nevronale cellepopulasjonen i organoid7. - Gjenta trinn 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 28. Tilsett 180 μL SDF1 (endelig konsentrasjon, 300 ng/ml) til 60 ml komplett neurobasal medium. Erstatt alt brukt medium fra bioreaktoren med komplett neurobasal medium supplert med SDF1. Gjenta trinn 3.6.
MERK: SDF1 brukes til å lette organiseringen av forskjellige cellelag27. - Gjenta trinn 3.2, 3.3 og 3.4 på dag 35. Erstatt alle brukte medium fra bioreaktoren med komplett BrainPhys medium (Tabell 1). Gjenta trinn 3.6.
MERK: BrainPhys er et nevronalt medium som støtter synaptisk aktive nevroner28. - Erstatt 1/3 av det totale volumet hver tredje dag med komplett BrainPhys medium til dag 90 differensiering.
4. Tilberedning av organoider for kryoseksjon og immunohistochemistry
- Innsamling av organoider for immunstaining
- Samle 1 ml prøve av medium som inneholder organoider med en serologisk pipette fra bioreaktoren til et konisk rør på 15 ml.
MERK: Organoider bør samles inn på forskjellige tidspunkter for å evaluere effekten av differensiering, inkludert dag 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 og 90. - Fjern supernatanten og vask én gang med 1 ml 1× PBS.
MERK: Ikke sentrifuger organoidene. La organoidene bosette seg på bunnen av røret ved tyngdekraften. - Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 4 % paraformaldehyd (PFA). Inkuber ved 4 °C i 30 min. Fjern den brukte PFA og legg til 1 ml 1× PBS.
- Oppbevar organoidene i 1 ml 1× PBS ved 4 °C til behandling for kryoseksjon.
MERK: Oppbevar organoidene i 1x PBS i ikke mer enn 1 uke etter fiksering.
- Samle 1 ml prøve av medium som inneholder organoider med en serologisk pipette fra bioreaktoren til et konisk rør på 15 ml.
- Fremstilling av organoider for kryoseksjon
- Fjern supernatant fra de lagrede organoidene. Tilsett 1 ml 15 % sukrose (m/v, fortynnet i 1× PBS), bland godt ved skånsom virvlende, og inkuber over natten ved 4 °C.
- Forbered en oppløsning på 15 % sukrose/7,5 % gelatin (tabell 2) og oppretthold ved 37 °C under tilberedning for å unngå gelatin for å stivne.
- Fjern 15% sukroseløsning, tilsett 1 ml 15% sukrose/ 7,5% gelatin til organoidene, og bland raskt ved mild virvlende. Inkuber ved 37 °C i 1 time.
- Tilsett 15% sukrose/ 7,5% gelatinoppløsning til en plastbeholder opptil halvparten av volumet. Vent på størkning ved RT.
- Etter en 1 t inkubasjon, legg forsiktig en sukrose / gelatindråpe som inneholder organoidene på størknet gelatin med en Pasteur pipette. La det stivne ved RT i ca 15 min. Pass på å unngå bobledannelse.
- Plasser 15% sukrose/ 7,5% gelatin på toppen av organoidene til beholderen er fylt. Vent på fullstendig størkning ved RT.
- Etter størkning inkuberer du 20 min ved 4 °C.
- Skjær gelatinen i en kube som inneholder organoidene i midten og fest gelatinkuben på et stykke papp med en dråpe O.C.T. sammensatt.
- Legg 250 ml isopentan i en 500 ml kopp og fyll en passende beholder med flytende nitrogen. Bruk tang og tykke hansker, legg forsiktig koppen som inneholder isopentan på overflaten av flytende nitrogen og avkjøl isopentanen til -80 °C.
- Når -80 °C er nådd, plasser gelatinkuben i koppen som inneholder isopentan til den fryser, og holder temperaturen ved -80 °C. Avhengig av størrelsen på kuben, kan det ta 1-2 min.
MERK: Unngå temperaturer under -80 °C eller for høy frysetid, fordi det kan føre til sprekkdannelse i kuben. - Når den er frosset, oppbevarer du gelatinkuben raskt ved -80 °C og oppbevares til kryoseksjon.
- Kryoseksjon av organoider
- Slå på kryostaten og definer både prøvetemperaturer (OT) og kryokammeret (CT) ved -25 °C.
- Når begge temperaturene stabiliserer seg, må du fikse gelatinkuben som inneholder organoidene på prøven ved hjelp av O.C.T. sammensatt.
- Definer snitttykkelsen ved 12 μm.
- Klipp ut kuben og samle 3–4 skiver på vedheftsmikroskoplysbildene (se Materialtabell).
- Oppbevares ved -20 °C til bruk.
- Immunstaining av organoider skiver
- Plasser mikroskopskliene som inneholder organoide seksjoner i en copling krukke med 50 ml forhåndswarmed 1x PBS, holder opptil 10 lysbilder rygg mot rygg.
MERK: Alle organoide seksjoner skal senkes ned med væske. - Inkuber i 45 min ved 37 °C for å degelatinisere lysbilder.
- Vask 1x med 50 ml 1× PBS i 5 min ved RT: Overfør lysbildene til en copling krukke som inneholder frisk 1× PBS.
- Overfør lysbildene til en copling krukke som inneholder 50 ml nylaget glycin (Tabell 2) og inkuber i 10 min ved RT.
- Overfør lysbildene til en copling krukke som inneholder 50 ml på 0,1% triton (tabell 2) og permeabilize i 10 min ved RT.
- Vask med 1× PBS i 5 min 2x.
- Forbered immunstainingsfatet med 3 mm papir gjennomvåt i 1× PBS. Tørre lysbilder med et vev rundt skivene og legg dem på 3 mm papir. Med en Pasteur pipette, dekk hele overflaten av lysbildene med blokkerende løsning (Tabell 2) med ~ 0,5 ml per lysbilde. Inkuber i 30 min ved RT.
- Fjern overflødig blokkeringsløsning og tørk lysbildene med et vev rundt skivene. Plasser 50 μL av det primære antistoffet (tabell 3) fortynnet i blokkeringsløsning over seksjonene og dekk med dekkslips. Legg skivene i en tidligere tilberedt immunstainingsfat. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Overfør lysbildene til en copling krukke med 50 ml TBST (Tabell 2),la dekkglassene falle, og vask med TBST i 5 min 3x.
- Plasser 50 μL av det sekundære antistoffet fortynnet i blokkeringsløsning over seksjonene og dekk med dekkglassene. Legg skivene i den tidligere tilberedte immunstainingsfatet. Inkuber i 30 min ved RT, beskyttet mot lys.
- Overfør lysbildene til en copling krukke igjen og vask med 50 ml TBST i 5 min 3x.
- Tørk lysbildene med et vev rundt skivene og legg skivene i en tidligere forberedt immunstainingsfat. Tilsett 0,5 ml DAPI-løsning over hele overflaten av lysbildene med en Pasteur pipette. Inkuber i 5 min ved RT.
- Gjenta trinn 4.4.9.
- Tørk forsiktig lysbildene med et vev. Tilsett 50 μL monteringsmedium dråpe for å slippe langs lysbildet og senk deretter forsiktig en dekkslip på hvert lysbilde, litt bøy den for å unngå bobler.
- Plasser mikroskopskliene som inneholder organoide seksjoner i en copling krukke med 50 ml forhåndswarmed 1x PBS, holder opptil 10 lysbilder rygg mot rygg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen ble initiert ved å fremme celleaggregasjon ved hjelp av 0,1 L bioreaktorer (figur 1A). Encelle inokulasjon av iPSCene ble utført, med 250 000 celler/ml seeded i 60 ml medium med en agitasjonshastighet på 27 o/min. Dette ble definert som dag 0. Etter 24 timer dannet cellene effektivt spheroidformede aggregater (dag 1, figur 1B), og morfologien ble godt vedlikeholdt til dag 5, med en gradvis økning i størrelse, noe som viste en høy grad av homogenitet i aggregert morfologi og størrelse over tid. (Figur 1B). En kvantitativ analyse av mikroskopi viste også normal fordeling av aggregerte størrelser etter dag 1 (figur 1C). Den samlede størrelsen er en viktig fysisk parameter som kan be cellene om å differensiere mot forskjelligelinjelengder 29,,30. Av denne grunn, basert på den samlede størrelsen rapportert i tidligere studier for å indusere en effektiv neural31,,32 og cerebellar forpliktelse21,ble de genererte aggregatene opprettholdt i mTeSR1 medium ved 25 rpm til de nådde ønsket diameter før de startet differensiering (~ 200 μm). Ved dag 2 var den gjennomsnittlige diameteren 221,0 ± 54,4 μm (gjennomsnittlig ± SD) for F002.1A.13 cellelinjen og 212,1 ± 42,1 μm for iPSC6.2 cellelinjen. Som sådan oppnådde begge cellelinjene den optimale aggregerte størrelsen på dette tidspunktet (figur 1C).
Definere dagen da seeding av iPSCs ble utført som dag 0, på dag 2, etter å ha oppnådd ønsket aggregert diameter, neural forpliktelse ble indusert ved samtidig å bruke SB431542, FGF2, og insulin, fremme neuroectodermal differensiering, samt en moderat caudalization nødvendig for mid-hindbrain mønster. Etterpå ble FGF19 og SDF1 lagt til kulturen på henholdsvis dag 14 og 28 for å fremme genereringen av forskjellige cerebellar stamfarer. For de første dagene av nevrale induksjon ble det brukt en rotasjonshastighet på 25 o/min, som ble økt til 30 o/min etter 7 dager for å unngå akkumulering og klumping av større aggregater (figur 2A). Under differensiering viste organoider en mer uttalt epitelisering som ligner på nevrale rørlignende strukturer med luminalplass (figur 2B). I tillegg viste evalueringen av organoid diameterfordeling en homogen størrelsesfordeling under den første lillehjernen til dag 14 (figur 2B).
Immunofluorescence analyse støtter at en effektiv neural forpliktelse av iPSC-avledede organoider er allerede oppnådd ved dag 7 av differensiering etter å ha lagt FGF2 og SB431542. Organoidenes kryoseksjoner avslørte mange strukturer som minner om nevralrørsfargingen for PAX6 og NESTIN, med de fleste celler i organoidene som uttrykker stamcellemarkør NESTIN på dag 7 og 14 av differensiering (figur 2C). Etterpå fremmet FGF19 og SDF1 genereringen av kontinuerlig voksende stamcellelag (PAX6+) og en effektiv nevronal differensiering ble oppnådd, som demonstrert ved uttrykk for TUJ1, neuron-spesifikk klasse III beta-tubulin, etter dag 21 og 35 (figur 2C). I tillegg ble det også observert en effektiv lillehjernen differensiering etter 21 dager i 0,1 L VW bioreaktorer, demonstrert ved tilstedeværelse av to forskjellige cellepopulasjoner: granulcellestamfarer (BARLH1+ celler, figur 3A)og Purkinje cellestamfar (OLIG2+ celler, figur 3B). Etter 35 dager i kultur syntes forskjellige cellepopulasjoner i organoidene å være organisert i forskjellige lag. Ulike flat-ovale strukturer i organoider ble observert med BARHL1+ dorsal cerebellar stamfar som et kontinuerlig lag på den overfladiske siden av organoid (Figur 3C,D) og SOX2+ i luminal regionen av disse ovale strukturer (Figur 3D). I tillegg syntes TUJ1+ nyfødte nevroner å migrere mot overflaten, gjenopprette radial justering på den ytre overflaten av organoid (figur 3E).
Etter generering av cerebellar stamfar, ytterligere modning ble fremmet ved hjelp av BrainPhys medium28 supplert med nevrotrofiske faktorer BDNF og GDNF. Immunofluorescence farging av organoide kryoseksjoner ble brukt til å oppdage distinkte undertyper av lillehjernen nevroner. Purkinje-celler, GABAergiske nevroner som uttrykker kalsiumbindende proteinkalbindin (CALB, figur 3F),ble påvist i lillehjernen organoider etter modningsprotokollen. I tillegg ble en annen stor lillehjernen nevronal type, granulceller, identifisert som et delsett av celler som samtidig med coexpressing PAX6 og MAP2 (Figur 3G). Interessant, et basseng av PAX6+ stamfar som ikke uttrykker MAP2 ble opprettholdt før 80 dager med differensiering. Andre typer cerebellar nevroner ble også oppdaget, inkludert unipolar børsteceller som uttrykker TBR2 (figur 3H), og dype lillehjernen kjerner kjerner projeksjon nevroner uttrykker TBR1 (Figur 3I). I tillegg til effektiv cerebellar differensiering og modning, tillot dette 3D dynamiske kultursystemet ved hjelp av PBS 0,1 L VW bioreaktorer organoider å forbli levedyktige i opptil 90 dager, uten signifikant celledød og nekrose (figur 3J).
Figur 1: Generering av størrelseskontrollerte aggregater ved hjelp av skalerbare bioreaktorer. (A) Design funksjoner av bioreaktor. (B)Brightfield fotomikrograf som viser aggregater fra to forskjellige iPSC-linjer på dag 1, 2 og 5. Vektstangen = 100 μm. (C)Størrelsesfordelingen av flytende aggregater fra forskjellige iPSC-linjer i bioreaktorene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generasjon av humane iPSC-avledede organoider ved hjelp av 0,1 l bioreaktorer. (A)Skjematisk representasjon av kulturprosedyren for å indusere differensiering av iPSCer til cerebellar organoider. Celler ble seeded med en tetthet på 250.000 celler / ml og en agitasjonshastighet på 27 rpm ble brukt til å fremme celleaggregasjon. I løpet av de første dagene av differensiering ble aggregater opprettholdt med en agitasjonshastighet på 25 rpm. Etterpå, for å unngå akkumulering av større aggregater, ble agitasjonshastigheten økt til 30 o/min. (B)Karakterisering av organoid form og størrelse. Brightfield fotomikrografer som viser iPSC-avledede organoider under cerebellar differensiering i 0,1 L VW bioreaktorer. Vektstangen = 100 μm. Fordelingen av organoiddiametre viser at kulturen opprettholdt homogene organoider størrelser langs differensieringsprotokollen. (C) Effektiv nevrale induksjon i iPSC-avledede organoider. Immunofluorescence for NESTIN, PAX6 og TUJ1 under cerebellar differensiering. Vektstangen = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effektiv lillehjern differensiering og modning i humane iPSC-avledede organoider. (A-E) Effektiv cerebellar forpliktelse. Immunstaining analyse for BARHL1, SOX2, OLIG2, NCAD, og TUJ1 markører på angitte tidspunkter av cerebellar differensiering protokollen. (F-I) Effektiv modning av humane iPSC-avledede cerebellar organoider. Immunofluorescence viser ulike typer cerebellar nevroner, inkludert Purkinje celler (CALB, F), granulceller (PAX6 og MAP2, G), unipolar børsteceller (TBR2), og dype lillehjernen kjerner projeksjoner nevroner (TBR1). (J)Høy celle levedyktighet etter lillehjernen modning. Levende/døde (calcein-AM, grønn og propidiumjodid, rød) farging av organoider viste høy cellelevelighet og ingen tegn på nekrotiske områder etter 80 dager i bioreaktorene. Vektstangen = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Klargjøring av medier |
1999– 2019: 100 Endelig volum: 500 ml |
1. Tin mTeSR1 5× tillegg ved romtemperatur (RT) eller ved 4 °C over natten og bland med basal medium 2. Oppbevar hele mTeSR1 medium ved 4 °C i opptil 2 uker eller klargjør 40 ml aliquots og oppbevares ved -20 °C 3. Forvarm komplett mTeSR1 ved RT før bruk |
|
gfCDM (vekstfaktorfri kjemisk definert medium) Endelig volum: 60 ml |
30 ml Ham's F12 30 ml IMDM 600 μL kjemisk definert lipidkonsentrat (1 % v/v) 2,4 μL monotyoglykerol (450 μM) 30 μL apo-transferrin (lageroppløsning ved 30 mg/ml i vann, endelig konsentrasjon: 15 μg/ml) 300 mg krystalliseringsrenset BSA (5 mg/ml) 42 μL insulin (lagerkonsentrasjon ved 10 mg/ml, endelig konsentrasjon: 7 μg/ml) 300 μL P/S (0,5 % v/v, 50 E/ml penicillin/50 μg/ml streptomycin) |
|
|
Nevrobasal Endelig volum: 60 ml |
60 ml neurobasal medium 600 μL N2 supplement 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
|
|
Komplett BrainPhys Endelig volum: 60 ml |
60ml av BrainPhys 1,2 ml neurocult SM1 neuronal supplement 600 μL N2 Supplement 12 μL BDNF (endelig konsentrasjon: 20 ng/ml) 12 μL GDNF (endelig konsentrasjon: 20 ng/ml) 300 μL Dibutyryl-cAMP (lagerkonsentrasjon: 100 mg/ml i vann, endelig konsentrasjon: 1 mM) 42 μL askorbinsyre (lagerkonsentrasjon: 50 μg/ml i vann, endelig konsentrasjon: 200 nM) |
|
| Lagerløsninger av vekstfaktorer og små molekyler |
Grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF/FGF2) Lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml |
1. Rekonstituert i 5 mM Tris, pH 7,6, med en konsentrasjon på 10 mg/ml 2. Fortynn med 0,1 % BSA i PBS (v/v) til en endelig lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml |
|
Stromal celleavledet faktor 1 (SDF1) Lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml |
1. Rekonstituer i vann med en konsentrasjon på 10 mg/ml 2. Fortynn med 0,1 % BSA (v/v) i PBS til en endelig lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml. |
|
|
Hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) Lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml |
||
|
Glialcelleavledet nevrotrofisk faktor (GDNF) Lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml |
||
|
Fibroblast vekstfaktor 19 (FGF19) Lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml |
1. Rekonstituert i 5 mM natriumfosfat, pH 7,4, med en konsentrasjon på 10 mg/ml 2. Fortynn med 0,1 % BSA i PBS (v/v) til en endelig lagerkonsentrasjon på 100 μg/ml |
|
|
ROCK-hemmer Y-27632 Lagerkonsentrasjon: 10mM |
Rekonstituer i DMSO med en konsentrasjon på 10 mM. | |
|
SB431542 Lagerkonsentrasjon: 10mM |
||
|
Insulin Lagerkonsentrasjon: 10 mg/ml |
1. Rekonstituer 10 mg insulin i 300 μL på 10 mM NaOH 2. Tilsett forsiktig 1 M NaOH til oppløsningen blir klar gjennomsiktig 3. Fyll til 1 ml med sterilt vann. |
Tabell 1: Lagerløsninger og medieforberedelse. Oppført er alle komponentene og volumene som brukes til å forberede medier for iPSCs vedlikeholds- og differensieringsprotokoll, samt lagerløsninger av vekstfaktorer og små molekyler. For lagerløsninger er all lagerkonsentrasjon og protokoller for rekonstituering oppført.
|
Gelatin/Sukrose Endelig konsentrasjon: 7,5%/15% m/w |
1. Vei 15 g sukrose og 7,5 g gelatin i en steril Schott GlassFlaske og bland godt 2. Forvarm PBS 1× ved 65 °C 3. Tilsett forhåndsoppvarmet PBS 1× til en endelig vekt på 100 g og bland godt 4. Legg Schott GlassFlasken i en varmeplate ved 65 °C og rist til gelatinen smelter 5. Inkuber ved 37 °C til oppløsningen stabiliserer seg |
|
Glysin Endelig konsentrasjon: 0,1 M |
Tilsett 0,37 g g glycin til 50 ml nylaget PBS 1×. |
|
Triton løsning Endelig konsentrasjon: 0,1 % m/v |
1. Forbered en 10 % Triton X-100 lager: 5 g Triton X-100 i 50 ml PBS 1× 2. Tilsett 0,5 ml Triton X-100 lager til 50 ml PBS 1×. |
|
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05 % w/v Tween-20 |
20 ml Tris 1 M 30 ml NaCl 5 M 5 ml Tween-20 (10 % lager: 5 g Tween-20 i 50 ml vann) Fyll til 1 L med vann. |
| Blokkeringsløsning | Tilsett 5 ml føtal storfeserum (FBS, endelig konsentrasjon: 10 % v/v) til 50 ml TBST. |
| DAPI-løsning | Tilsett 15 μL DAPI-lageroppløsning (1 mg/ml) til 10 ml av destilert vann |
| Mowiol | 1. Tilsett 2,4 g Mowiol til 6 g glyserol og rist i 1 time i en forvarmet plate ved 50 °C 2. Tilsett 6 ml destillert vann og rist i 2 timer 3. Tilsett 12 ml Tris 200 mM (pH 8,5) og rist i 10 min 4. Sentrifuge ved 5000 × g i 15 min 5. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. |
Tabell 2: Løsninger for fremstilling av organoider for kryoseksjon og immunstaining. Oppført er alle komponentene og volumene som brukes til å forberede løsningene som brukes til fremstilling av organoider for kryoseksjon og immunstaining.
| Antistoff | Vertsarter | Fortynning |
| Barhl1 Inn | Kanin | 1/500 |
| CALBINDIN INN | Kanin | 1/500 |
| KART2 | mus | 1/1000 |
| N-CADHERIN | mus | 1/1000 |
| NESTIN INN | mus | 1/400 |
| 2000-000 | Kanin | 1/500 |
| PAX6 GJESTGIVERI | Kanin | 1/400 |
| Sox 2 | mus | 1/200 |
| TBR1 | Kanin | 1/200 |
| TBR2 | Kanin | 1/200 |
| TUJ1 | mus | 1/1000 |
Tabell 3: Primære antistoffer. De primære antistoffene, klone og optimaliserte fortynninger som brukes til immunstaining er oppført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behovet for store celletall samt definerte kulturforhold for å generere spesifikke celletyper for narkotikascreening og regenerative medisinapplikasjoner har drivt utviklingen av skalerbare kultursystemer. I de senere årene har flere grupper rapportert den skalerbare generasjonen av nevrale stamfar og funksjonelle nevroner32,33,34, noe som gir betydelige fremskritt i utviklingen av nye modeller for nevrodegenerative lidelser. Likevel mangler oppsummeringen av noen kritiske hendelser av embryonisk utvikling fortsatt, og vedlikeholdet av de genererte funksjonelle nevronene i suspensjon i lange perioder er ennå ikke oppnådd34. Presentert her er et dynamisk 3D kultursystem i stand til å generere iPSC-avledede nevrale organoider med lillehjernen identitet, og for å ytterligere fremme modning i funksjonelle cerebellar nevroner under kjemisk definerte og mater-frie forhold i dynamisk kultur.
Før du starter cerebellar differensiering, er det viktig å opprettholde kvaliteten på de menneskelige iPSCene. For ikke å gå på akkord med differensieringen, bør det derfor ikke utføres mer enn tre passasjer av iPSCer fra tining til bioreaktorinokulasjon. Et viktig trinn i differensieringsprotokollen er å evaluere den samlede størrelsen. Den samlede størrelsen har en kritisk rolle i å indusere differensiering mot en bestemt cellelinje29. Dessuten er det en minimumsstørrelsesterskel som ser ut til å favorisere differensiering35. Som allerede rapportert, den optimale iPSC-avledet samlet diameter for å fremme en effektiv neural forpliktelse31,,32 og lillehjernen differensiering21 er en ~ 200 μm diameter.
I tillegg, i denne dynamiske protokollen, er agitasjonshastigheten som brukes i de første dagene av kulturen avgjørende for å kontrollere den samlede diameteren og nevrale induksjon. Kulturen startet på 27 rpm, som er tilstrekkelig til å fremme iPSCs aggregering og for å unngå dannelse av større aggregater (diametre over 350 μm bør unngås). Agitasjonen som brukes til å fremme celleaggregasjon etter encellesåing kan økes til 30 rpm uten å påvirke celle levedyktigheten; Det forventes imidlertid at høyere agitasjonshastigheter vil produsere mindre aggregater. Avhengig av iPSC-linjen, 24 timer etter cellesåing ved hjelp av 27 rpm, forventes to forskjellige scenarier: aggregatene som dannes, presenterer mindre diametre (<200 μm) eller har nådd en rekke størrelser mellom 200–300 μm. Hvis aggregater er større enn 350 μm ved 24 timer etter cellesåing, bør differensiering ikke utføres, og cellesåingen bør gjentas, fordi effektiviteten av differensieringen vil være svært lav. Hvis aggregater er mindre enn 200 μm, bør det brukte mediet erstattes med iPSC vedlikeholdsmedium, og agitasjonshastigheten reduseres til 25 o/min. Med denne justeringen forventes samlet diameter å øke fra dag 1 til dag 2, sannsynligvis på grunn av sammenslåing av individuelle aggregater fremmet av reduksjonen i agitasjonshastigheten. Ved aggregater med størrelser mellom 200–300 μm, bør brukt medium erstattes med differensieringsmedium, og neural induksjon med FGF2 bør startes etter 2 dager i kultur. På dette punktet bør agitasjonshastigheten også reduseres litt for å forhindre overdreven celledød, fordi cellene er mer følsomme for skjærstress i nærvær av differensieringsmedium. I tillegg kan populasjonshomogeniteten analyseres ved hjelp av variasjonskoeffisienten (CV), som måler variasjonen ved å korrelere standardavvik med gjennomsnittet av aggregerte diametre, i henhold til ligningen
der δ representerer standardavviket for den samlede diameteren og μ er den gjennomsnittlige diameteren. I dette dynamiske systemet var den observerte gjennomsnittlige CVen 12,5 ± 3,3 % (gjennomsnittlig ± SD) for F002.1A.13-cellelinjen og 19,0 ± 0,37 % for iPSC6.2-cellelinjen på dag 2. I dette systemet bør derfor en homogen størrelsespopulasjon med en CV under 0,2 (< 20 % av variasjonen) forventes. Etter 7 dager med differensiering varierte den gjennomsnittlige samlede diameteren fra 300–360 μm, og agitasjonshastigheten ble økt til 30 o/min for å hindre at aggregater kunne slå seg ned på bunnen av 0,1 L VW bioreaktor.
Differensieringen av lillehjernen organoider til dag 35 og analysen av samlet størrelse under statiske forhold ble nylig rapportert21. Forfatterne viste at 3D-aggregater dannet og vedlikeholdt i plater (f.eks Aggrewell) til dag 7 av differensiering var homogene i størrelse og form21. Men etter å ha overført aggregatene til ultra-lav vedlegg 6 brønnkulturplater, begynte aggregatene å variere i størrelse og morfologi21. På dag 35 i statiske forhold nådde noen av 3D-aggregatene 1000 μm for forskjellige cellelinjer, noe som begrenset spredningen av næringsstoffer og oksygen. Ved hjelp av våre dynamiske forhold nådde aggregater derimot ikke mer enn 800 μm i diameter etter dag 35, med forbedret masseoverføring på grunn av den konstante agitasjonen av mediet fremmet av det vertikale hjulet. Videre ble de samlede størrelsene opprettholdt til slutten av modningsprosessen, som viser en samlet diameter på 646,6 ± 104,2 μm etter dag 90, den lengste kulturen utført i 0,1 L VW bioreaktorer.
Effektiv cerebellar induksjon ble indusert ved sekvensiell tillegg av SB431542, FGF2, FGF19, og SDF1 i dette 3D dynamisk system. Protokollen starter med kombinasjonen av SB431542, som er en transformerende vekstfaktor beta (TGF-ß)-reseptor blokkering som hemmer mesendodermal differensiering, og FGF2, som har en stor effekt i caudalization av neuroepithelial vev25. Derfor er tillegg av disse to molekylene i løpet av de første dagene av kulturen avgjørende for å fremme cellediensiasjonen til midten av bakbrain, territoriet som gir opphav til lillehjernenvevet. Etter innledende induksjon til mid-hindbrain vev, er det nødvendig å legge til FGF19 for å fremme spontan generasjon av mid-hindbrain strukturer med dorsal-ventral polaritet, samt generering av forskjellige cerebellar stamfar36,26. SDF1 forenkler organiseringen av distinkte lag av cerebellar stamfar, sett på utviklingsstadiet der lillehjernen nevrogenese oppstår27. Frem til dag 35 kan disse molekylene fremme organiseringen av lillehjernen organoider som kan rekapulere menneskelig cerebellar utvikling, noe som tilsvarer første trimester lillehjernen. Etter organisering av cerebellar stamfar i forskjellige lag, ble et definert nevronalt medium brukt til å fremme modningen28. Andre medier som brukes til å opprettholde nevronale celler kan også testes, men lavere effektivitet forventes. Dermed, i denne protokollen, BrainPhys ble brukt til å fremme differensiering av cerebellar-engasjerte celler i lillehjernen nevroner, fordi det har blitt rapportert å bedre etterligne det sunne nevronale miljøet og for å støtte nevrofysiologiske aktiviteten til de generertenevronene 28.
Ved hjelp av disse dynamiske forholdene kan en mer effektiv diffusjon av næringsstoffer, oksygen og vekstfaktorer oppnås. Noen begrensninger er imidlertid knyttet til agitasjonen som brukes i differensieringsprotokollen. Noen skjærstress kan innføres av agitasjonsprosessen, noe som kan påvirke overlevelse, spredning og differensiering av celler. Derfor, under modningstrinnet, der cellene er mer følsomme, må kulturen overvåkes nøye.
Differensieringen av lillehjernen organoider som minner om human embryonale lillehjernen utvikling har allerede blitt rapportert7. Imidlertid er ytterligere modning av disse embryonale lillehjernen organoider til lillehjernen nevroner ved hjelp av 3D-kulturer fortsatt en utfordring. Genereringen av funksjonelle lillehjernen nevroner ble bare oppnådd ved å koculturing med granulceller fra ulikekilder 4,,7,,15. Denne protokollen vellykket oppskalert cerebellar forpliktelse av menneskelige iPSCer; I tillegg er dette den første protokollen for differensiering av forskjellige cerebellar nevroner i et 3D-kultursystem uten å koculturing med materceller. Spesielt kan følgende celletyper produseres i vårt dynamiske kultursystem: Purkinje-celler (Calbindin+), granulceller (PAX6+/MAP2+), unipolar børsteceller (TBR2+) og dype lillehjernekjerner projeksjonsnevroner (TBR1+), som ble opprettholdt i suspensjon så lenge som 3 måneder.
Den skalerbare generasjonen av lillehjernen organoider representerer et verdifullt verktøy for å studere den embryonale utviklingen av lillehjernen og de patologiske banene som er involvert i degenerasjonen av dette organet. Videre kan høy gjennomstrømningsscreening for molekyler som gjenoppretter lillehjernen funksjon utføres ved hjelp av organoider oppnådd med dette skalerbare systemet. Samlet sett tilfredsstiller denne metoden et udekket behov for en skalerbar protokoll for generering av høykvalitets lillehjernen organoider som kan være viktige for en rekke biomedisinske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne YH og SJ er ansatte i PBS Biotech. Forfatteren BL er administrerende direktør og medgrunnlegger av PBS Biotech, Inc. Disse samarbeidende forfatterne deltok i utviklingen av bioreaktorene som ble brukt i manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes overholdelse av alle retningslinjene i journalen om deling av data og materiale. Alle andre forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 gjennom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 til T.P.S og PD/BD/128376/2017 til D.E.S.N.), prosjekter finansiert av FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) og FCT gjennom tilskudd PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 og CEREBEX Generasjon av Cerebellar Organoids for Ataxia Research stipend LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Det ble også mottatt midler fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme, i henhold til tilskuddsavtalen nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Ishida, Y., et al. Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs. Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).
- Liu, Y., Zhang, S. C. Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).
- Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162 (2), 375-390 (2015).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Aubry, L., et al. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).
- Gunhanlar, N., et al. A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).
- Hu, B. Y., Zhang, S. C. Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells. Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Muguruma, K., et al. Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells. Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).
- Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells. The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Science Reports. 5, 9232 (2015).
- Tao, O., et al. Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).
- Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies. Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144 (6), 976-985 (2017).
- Lou, Y. R., Leung, A. W. Next generation organoids for biomedical research and applications. Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).
- Silva, T. P., et al. Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering. Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
- Yaguchi, Y., et al. Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development. Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).
- Fischer, T., et al. Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis. Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).
- Bagri, A., et al. The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells. Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).
- Bardy, C., et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).
- Bauwens, C. L., et al. Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Miranda, C. C., et al. Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment. Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells. Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).
- Bardy, J., et al. Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells. Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).
- Rigamonti, A., et al. Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System. Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).
- Arora, N., et al. A process engineering approach to increase organoid yield. Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).
- Gimeno, L., Martinez, S. Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh. Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).
