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Bioengineering

为高浓度单分子显微镜制造零模式波导

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

这里描述的是一种纳米球平板成像方法，用于平行制造零模式波导，这是金属包玻璃显微镜覆盖带中的纳米阵列，用于在纳米到微摩尔浓度的荧光素下进行单分子成像。该方法利用胶体晶体自组装创建波导模板。

Abstract

在单分子荧光酶学中，溶液中标记基材的背景荧光通常将荧光浓度限制在皮科至纳米摩尔范围内，其数量级小于许多生理配体浓度。称为零模式波导 （ZMWs） 的光学纳米结构，直径为 100 至 200 nm，由铝或金等薄导金属制造，通过将可见光激发限制在沸点有效体积中，从而允许在氟叶微摩尔浓度下对单个分子进行成像。然而，对昂贵和专门的纳米制造设备的需求已经排除了ZMW的广泛使用。 通常，ZMW等纳米结构是通过直接书写获得的，电子束光刻是连续的和缓慢的。在这里，胶体或纳米球，光刻学被用作替代策略，以创建纳米级的面罩，用于波导制造。本报告详细描述了该方法，并考虑到每个阶段的实际情况。该方法允许数千个铝或金ZMW并行制造，最终波导直径和深度为100-200纳米。只需要普通的实验室设备和用于金属沉积的热蒸发器。通过使ZMW更容易进入生化社区，这种方法可以促进细胞浓度和速率分子过程的研究。

Introduction

单分子荧光共振能量转移（smFRET）或单分子荧光相关光谱（FCS）等单分子技术是分子生物物理学的有力工具，能够研究单个生物分子在转录1、2、3、翻译4、5、6等过程中的动态运动、构象和相互作用。对于 smFRET 来说，总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜是一种常见方法，因为随着时间的推移，许多系绳分子可能会被跟踪，而 TIR 产生的消散波仅限于与盖唇8相邻的 100 至 200 nm 区域。然而，即使这种对激发体积的限制，感兴趣的荧光仍然需要稀释到pM或nM范围，以检测单分子信号以上的背景荧光9。由于细胞酶的Mi michaelis-Menten常数通常在μM到mM范围10之间，单分子研究中的生化反应通常比细胞中的生化反应慢得多。例如，蛋白质合成发生在大肠杆菌11，12中每秒15-20氨基酸，而大多数蛋白核糖体在smFRET实验中翻译为每秒0.1+1氨基酸每秒13。在蛋白质合成中，停滞核糖体上的晶体结构和smFRET显示，在tRNA-mRNA转移步骤14、15之前，转移RNA（tRNA）在"混合"和"经典"状态之间波动。然而，当迁移GTPase因子（EF-G）的生理浓度存在时，在smFRET6中观察到了混合状态和经典状态之间的不同构象。以与细胞中相似的速度和浓度研究动态分子过程很重要，但仍然是一项技术挑战。

提高荧光基板浓度的策略是使用金属基亚可见波长光圈（称为零模式波引（ZMWs））来生成密闭激发场，选择性地激发孔径内局部化的生物分子（图1）。光圈的直径一般为100~200纳米，深度为100~150纳米。在与井的大小和形状相关的截止波长以上（≈以水为介电介质18的圆形波导直径为 2.3 倍），波导不允许传播模式，因此称为"零模式波导"。然而，一个振荡的电磁场，称为消逝波，呈指数级衰减的强度仍然隧道短距离进入波导18，19。虽然与 TIR 消逝波类似，但 ZMW 消逝波的衰变常数较短，导致波导内的有效激发区域为 10~30 nm。在荧光标记配体的微摩尔浓度下，激发区域内同时存在一个或几个分子。这种对激发体积的限制以及随之而来的背景荧光减少，使单分子在生物学上相关的浓度下能够进行荧光成像。这已应用于许多系统20，包括FCS测量单一蛋白质扩散21，单分子FRET测量低亲和力配体蛋白22和蛋白质-蛋白质相互作用23，光谱电化学测量单分子周转事件24。

ZMW是使用离子束铣削25、26或电子束光刻（EBL）直接对金属层进行图案化而生产的，然后是等离子体蚀刻16、27。这些无面具光刻方法可创建系列波导，通常需要访问专门的纳米制造设施，从而阻止 ZMW 技术的广泛采用。另一种方法，紫外线纳米印花平版印刷升空28，使用石英滑动模具按反ZMW模板到电阻膜像邮票。虽然这种方法更精简，它仍然需要EBL来制造石英模具。本文介绍了一种简单且廉价的模板制造方法的协议，该方法不需要 EBL 或离子束铣削，并且基于纳米球的紧密包装，以形成平版面罩。

纳米球或"自然"光刻学于1982年由德克曼和邓斯缪尔29，30首次提出，使用单分散胶体粒子的自组装，从几十纳米到几十微米31，通过蚀刻和/或材料沉积创建表面图案的模板。二维（2D）或三维（3D）胶体粒子的扩展周期阵列，称为胶体晶体，其特点是散射和衍射32的明亮虹彩。虽然比电子束或光刻技术应用较少，但这种遮盖方法简单、成本低，而且很容易缩小，以创建低于 100 nm 的功能大小。

指导胶体粒子的自组装决定了使用胶体晶体作为表面图案的面具的成功。如果粒子的大小和形状是同质的，胶体粒子可以很容易地用六边形包装自行组装，由热带耗竭33驱动。滴涂后水蒸发是沉积胶体颗粒的有效途径，但其他方法包括浸涂34、旋转涂层35、电泳沉积36和空气-水界面37的巩固。下面提出的协议基于蒸发沉积方法，这是最简单的实现方法。紧密包装的聚苯乙烯珠之间的三角形间歇形成开口，在开口中镀一个牺牲金属，形成柱子（图2 和 补充图1）。在此步骤调整这些柱子的形状和直径之前，珠子的简短退火。删除珠子，在柱子周围沉积最后一层金属层，然后移除柱子。在两个金属沉积步骤进入胶体纳米瘤、移除中间柱子以及用于钝化和系绳的表面化学修改后，ZMW 阵列已准备好用于单分子成像。在制造后对ZMW光学特性的更广泛描述可以在附下的第38条中找到。除了用于金属蒸汽沉积的热蒸发器外，不需要专门的工具。

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Protocol

注：所有步骤都可以在一般实验室空间中完成。

1. 玻璃盖唇清洁

  1. 为了提供胶体颗粒蒸发沉积的清洁表面，将 24 x 30 mm 光学玻色硅酸盐玻璃盖片（0.16×0.19 毫米厚度）放置在 coplin 玻璃染色罐的凹槽插入件内进行清洁。
    注意：确保盖唇直立且分离良好，以便在清洁过程中所有表面都清晰暴露。
  2. 将足够的丙酮倒入染色罐中，以覆盖盖片、盖上盖子，并在 40 °C 下声波 10 分钟。
  3. 倒出丙酮，冲洗盖片，用蒸馏的H2O填充染色罐，倒出水。再重复 2 次。
  4. 再次重复丙酮声波（步骤 1.2 和 1.3）。
  5. 将足够的 200 mM KOH 倒入罐中，覆盖覆盖的覆盖唇和声波，在 40 °C 下浇灌 20 分钟。
    注：KOH 稍微蚀刻玻璃。
  6. 用蒸馏的 H2O 冲洗盖片 6 次。
  7. 添加乙醇覆盖盖片，添加盖子，并在40°C下声波10分钟。
  8. 用蒸馏的 H2O 冲洗盖片 3 次。
  9. 使用柔和的钳子在边缘拾取每个盖片，然后用 N2 气体干燥盖唇。只触摸盖片的边缘。将每个干燥、清洁的盖片放在单独清洁的 Petri 盘中。

2. 聚苯乙烯珠的蒸发沉积

  1. 要为 ZMW 阵列创建胶体晶体面膜，离心机 50 μL 直径为 1 μm，非功能化聚苯乙烯珠（水中为 2.5% w/v），15，000 x g，25 °C 5 分钟。
    注：在管道珠子之前，应短暂地将库存溶液旋涡，以防珠子沉入瓶底。
  2. 丢弃超高超，留下尽可能少的水。
    注：残留水可以改变乙醇再悬念39的蒸发特性，因此去除少量珠子以去除所有水是可以接受的。
  3. 从步骤 2.2 中重新使用 2.2 步骤中的珠子，50 μL 为 1：400 TritonX-100：乙醇溶剂。派佩特上下几次，彻底混合珠子与溶剂。
    注：TritonX-100：乙醇溶剂使用后应用石蜡薄膜密封，每月准备一次新鲜。珠子倾向于粘附在塑料容器的两侧，如微中心管，因此移液器沿两侧，以确保所有珠子被重新使用。
  4. 要设置一个湿度室进行沉积，将6个Petri菜肴（每个菜都有一个盖片）放在长凳上，内侧的盖子稍稍偏开。在每个菜中，将盖唇移到开放区域，以便在下一步增加湿度时，盖唇暴露在环境中。
  5. 放置一个卫生仪和一个小电风扇，以培养皿为中心。
  6. 记录实验室中的起始相对湿度 （RH）。将 200 mL 烧饼装满 150 至 200 mL 的 +75 °C 水，并放在风扇后面。
  7. 打开风扇，用翻倒的透明塑料存储容器（66 厘米 x 46 厘米 x 38 厘米）盖住 Petri 菜肴、风扇、烧甲和卫生表。
  8. 让腔室中的 RH 上升到 70+75%，这通常需要 5~10 分钟。
    注意：如果环境实验室 RH 较低（低于 +50%），请让腔室达到较高的 RH，但不超过 80%，以补偿沉积过程中的湿度损失（见下文）。
  9. 当 RH 达到 70+75% 时，记录 RH 并稍微抬起塑料存储容器，以快速将盖子放在 Petri 盘上，从而防止盖片过度湿润。
    注：由于加湿，室内温度将略高于室温，通常为 25°26 °C。如果在表盖上可见水分，则玻璃表面太湿。商业手套箱可能会简化协议的这一部分。
  10. 让室内的 RH 继续上升到 85% 。此时，在湿度室中记录 RH，将珠子悬架的移液器 5 μL 记录到每个盖片的中心。
  11. 每次沉积后关闭房间和培养皿，以尽量减少湿度损失。目标是在2分钟内完成所有6个证词。
  12. 证词后在腔室中记录 RH。
    注：沉积后的RH将有助于测量沉积过程中湿度损失的速度，这取决于环境实验室条件。对于典型的成功运行，腔室将在沉积前以 85% RH 开始，在沉积后以 70+75% RH 结束。
  13. 让珠子飞沫扩散干燥5分钟。
    注意：如果胶体晶体有许多孔或多层区域，则腔室可能分别太潮湿或干燥。调整相对湿度，以关闭培养皿并开始沉积（参见结果部分，以进一步讨论优化）。

3. 用于减少胶体晶体模板孔隙大小的珠子退火

  1. 为降低聚苯乙烯珠的退火温度，缩小珠间插座，并圆闭盘间角落，在标准陶瓷热板顶部放置一个扁平的磨铝板。
  2. 将热板温度设定为107°C，聚苯乙烯玻璃过渡温度为40°C。
    注：为了获得稳定和准确的温度，在铝板的2~3毫米宽和4~5毫米深的孔中举行了热电偶探针。
  3. 将包含珠子模板的盖片放在热铝板上，退火 20s（请参阅讨论部分，解释熔化时间）。
  4. 加热后，从铝板上取下盖片，并及时将其放置在另一室温铝表面冷却。
    注：将盖片稍微挂在板的边缘或将浅通道（参见所附视频）插入板中，以方便取回盖唇，这很有帮助。

4. 使用胶体晶体模板对铝零模式波导进行纳米制造

  1. 利用热束或电子束蒸发沉积，在胶体晶体模板上以2~s沉积300纳米铜，在珠子之间的隔板中产生柱子。
  2. 用胶带轻轻按压表面，去除珠子顶部多余的金属。慢慢剥去胶带，把金属拉下来。
    注意：胶带拉动后，可能会保留一些微小的反射多余金属斑块，这些斑块通常可以通过 N2 气体流去除。如果胶带拉动后仍保留大量反射多余的金属，请尝试将模板浸泡在甲苯中 2 小时，以部分溶解聚苯乙烯珠。用蒸馏水清洗盖唇，用N2干燥，并重复胶带拉。额外的浸泡不应完全溶解珠子，因为珠子有助于保护柱子在胶带拉扯过程中免受损坏。
  3. 要溶解聚苯乙烯珠，将珠子模板放入甲苯中，浸泡过夜。
    警告：甲苯烟雾可能是有毒的。在通风良好的罩下使用甲苯，并佩戴个人防护设备，包括手套、安全眼镜和实验室外套。甲苯应储存在指定用于易燃液体的通风柜中。
  4. 甲苯孵化后，用氯仿冲洗模板一次，用乙醇冲洗两次。此时小心处理盖片，因为精致的 200-300 nm 高金属柱现在已露出来。用 N2 干燥模板，在氧气等离子体清洁剂中去除残留聚合物和污染物 30 分钟。
    警告：氯仿烟雾可能有毒。在通风良好的罩下使用氯仿，并佩戴个人防护设备，包括手套、安全眼镜和实验室外套。氯仿应储存在通风柜中，远离其他易燃溶剂。
  5. 使用热束或电子束蒸发沉积，将钛粘附层的 3 纳米沉积在 1 +/s，然后以 4 +/s 左右和铜柱顶部的 100×150 nm 铝沉积。
    注：人们可以使用更厚的包层来获得更深的指导和更好的背景荧光衰减，但这也会降低下一步暴露和溶解帖子后的产量（参见讨论部分）。
  6. 要溶解金属柱，将盖片浸泡在铜等（柠檬酸基： 材料表）2 小时。
    警告：金属等损伤可导致皮肤灼伤。在通风良好的罩下处理等，并佩戴防护设备。处理后彻底洗手。金属等应储存在指定用于腐蚀性液体的通风柜中。
  7. 用蒸馏水冲洗盖片，用N2干燥，用透镜纸轻轻擦去金属包层的表面，露出任何仍然覆盖在包层中的柱子。将盖片放回铜等，再放2小时，然后用蒸馏水再次冲洗，用N2干燥。
    注意：ZMW 滑梯应存储在盖有盖、干净的培养皿中，以使其不含污染物。

5. 使用胶体晶体模板对金零模式波导进行纳米制造

注：本节提供了制造黄金ZMW的方法（补充图1），它反映了制造铝ZMW的协议。

  1. 使用热束或电子束蒸发沉积，将 3 纳米的钛粘附层沉积在 1 é/s，然后以 4 é/s 沉积 300 nm 铝。
  2. 用胶带轻轻按压表面，去除珠子顶部多余的金属。慢慢剥去胶带，把金属拉下来。
  3. 要溶解聚苯乙烯珠，将珠子模板放入甲苯中，浸泡过夜。
  4. 甲苯孵化后，用氯仿冲洗模板一次，用乙醇冲洗两次。用 N2 干燥模板，在氧气等离子体清洁剂中去除残留聚合物污染物 30 分钟。
  5. 使用热束或电子束蒸发沉积，在铝柱周围和顶部以 5 +/s 沉积 100×150 nm 的黄金。
  6. 要溶解金属柱，将盖片浸泡在铝等（磷酸基：磷酸基：磷酸基）中浸泡。 材料表）1 小时。
  7. 用蒸馏水冲洗盖片，用N2干燥，用透镜纸轻轻擦去金属包层的表面，露出任何仍然覆盖在包层中的柱子。将盖片放回铝等1小时，然后用蒸馏水再次冲洗，用N2干燥。
    注：ZMW 幻灯片应存储在盖有盖、干净的培养皿中。

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Representative Results

通过蒸发沉积（步骤 2.1+2.13）自组装聚苯乙烯胶体颗粒可以产生一系列结果，因为它需要控制溶剂蒸发率。但是，由于沉积速度很快（每轮 10-15 分钟），因此可以针对不同的环境实验室条件快速优化该过程。 图3A 显示沉积和蒸发后形成良好的胶体模板。从宏观上讲，珠子区域是圆形的，边界由不透明的多层珠环定义。图像中的半透明区域，但不是白色区域是所需的单层区域。 图 3B 显示了一个胶体模板，该模板在过于潮湿的环境中包装（当 Petri 菜肴关闭时为 80% RH）。这些模板往往没有干净的圆形边界，并且有向外延伸的多层肌腱。沉积是可以接受的，可用于后续阶段，但晶格中的孔减少了用于单分子成像的可使用 ZMW 阵列区域的数量。 图 3C 显示了一个胶体模板，该模板在过于干燥的环境中包装（当 Petri 菜肴关闭时为 65% RH）。与理想的、分布良好的模板相比，这些模板的直径通常较小。可以使用沉积，但多层白色区域向内条纹，减少了可用于成像的区域。因此，我们不建议一次进行超过 6 次沉积，因为当腔室打开和关闭时，过程接近尾声时的沉积会在较低的湿度下进行。 图3D 显示了聚苯乙烯晶体反射光衍射产生的彩虹图案。这种模式可以用来确认成功和质量的晶体包装的眼睛。 图3E、F 显示包装良好的胶体模板的原子力显微镜（AFM）图像。谷物之间的缺陷产生于蒸发沉积41期间的干扰，而不同的谷物可以以10倍的目标来观察。因此，使用低功耗光显微镜检查胶体沉积也可用于评估包装。

将铜沉积到退火胶体模板（第4.1步）后，彩虹衍射模式仍应通过珠子顶部的反射金属涂层（图4A、B）来可见和增强。模板在苏格兰胶带拉力（第 4.2 步）去除多余的铜（图 4C）后丢失了反射彩虹衍射模式。图4D、E显示金属沉积后典型的铜柱场的 AFM 图像。图3E中胶体晶体颗粒之间的缺陷在铜柱图像中可见，因为铜的区域较大。对AFM图像的分析表明，铜沉积厚度为300纳米，最终铜柱平均高度为255纳米（图4F），直径为121纳米（图4G）。

珠子所在的铝包层（第 4.5 步）和铜柱顶部的沉积，以及随后的柱子（步骤 4.6 和 4.7）的溶解，导致图 5A+C中显示的铝 ZMW。胶体晶体颗粒之间的缺陷可见于较大的开口（图5B）。图 5C中 ZMW 中心之间的平均距离为 559 nm， 与 1 μm 珠子的六边形封闭包装几何设置的间距一致（ Equation 1 使用 20s 退火的聚苯乙烯模板，结果波导的平均直径为 118 nm（图 5D、E），与柱直径一致，足够小，可切断可见光的传播。图 5D中波导的高度配置文件还显示其深度为 ±120 nm。

单分子FRET在ZMW中执行，以测试功能（图6A）。图 6B中显示了 ZMW 成像的典型字段，其中包含 40 x 80 μm 视野中的 3000 >波导。ZMW最初是使用先前描述的42，43的协议钝化的。简言之，铝ZMW被钝化为聚（苯磷酸），涂覆铝包层，然后用甲氧基终止聚乙烯乙二醇（PEG）掺杂生物素终止PEG，涂覆ZMW的玻璃底层。流室，+20 μL体积，然后构建为单分子成像44。单分子FRET成像的DNA复式执行如前所述38。简言之，100 pM+1 nM 的氰化物-3/氰化物-5 （Cy3/Cy5）、生物素化 DNA 复式（33 基对长度）在与链球菌素功能化的流动通道中孵育了 10 分钟（5 分钟孵育，0.5 毫克/mL 溶液）。标记大分子的浓度可以滴定，以实现+20%的波导加载与一个分子，导致<5%的波导加载多个分子，基于Poisson分布式加载（大多数波导，+75%，将没有分子）45。未绑定的DNA被冲走与无核酸酶复式缓冲器，然后照明缓冲器（0.3% [w/v] 葡萄糖， 300 微克/mL 葡萄糖氧化酶、120 μg/mL 目录和 1.5 mM Trolox [6-羟基-2，5，7，8-四甲基铬烷-2-卡西酸]）。非生物素化 Cy5 标记的 DNA 复式（33 基对长度）在照明缓冲区以 0、50、100 和 500 nM 作为解决方案中的背景荧光素存在。单分子FRET痕迹从固定的Cy3/Cy5复式DNA分子记录与定制的TIRF显微镜调整到表观荧光条件。影片以 1.48 数字光圈 （NA） 100 倍的油浸入目标录制，交替 532 nm 和 640 nm 激发（100 ms 曝光）和双视图光谱分离器，可在电子倍增电荷耦合设备 （EMCCD） 摄像机上同时记录 Cy3 和 Cy5 发射。在测试的环境 Cy5 的所有浓度（图 6C+F）中均可检测到带有 Cy5 通道单步漂白剂的单分子 FRET 痕迹。相比之下，单分子只能在 TIRF 照明中检测到 pM 到低 nM 溶液氟磷浓度46。

Figure 1
图1：零模式波导示意图。ZMW 阵列图，右侧为单 ZMW 的扩展横截面图。单荧光标记感兴趣的酶（棕色核糖体与红色圆表示荧光染料）化学固定（通过本示例中的 mRNA）到 ZMW 的玻璃底部（通常使用生物染色-PEG 功能化）可以用典型的基于激光的表观显微镜设置成像。532 nm 激发光（绿色箭头）在玻璃金属边界反射，因为光圈尺寸小（直径为 100-200 nm），但在 ZMW 内存在一个强度呈指数级衰减的非传播消散波。这会导致 10-30 nm 的有效照明深度（光圈中的绿色阴影）。在 nM 到 μM 浓度下添加单个荧光配体（蓝色 tRNA，绿色圆圈为荧光标签）。一个个体配体，扩散到光圈和与酶相互作用的图像没有令人望而却步的背景荧光。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：为制造铝ZMW阵列而开发的胶体模板方法示意图。 聚苯乙烯珠，直径1微米，沉积和自行组装在清洁的玻璃盖唇上，如协议第2节所述。然后对珠子进行退火，以减少孔径（第 3 节），然后是铜沉积和甲苯中的珠子溶解。铝沉积在铜柱周围和顶部，然后有选择地蚀刻，留下六边形的纳米冲剂阵列（第4节）。在最后三个步骤中，在计划视图的右侧提供横截面视图，以显示铜柱和铝 ZMW 的宽度和高度。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：胶体蒸发沉积的结果。 （A） 最佳胶体沉积示例。 （B） 可接受的胶体沉积示例，其中条件比理想条件下更潮湿（80% RH）。水晶单层的孔是明显的。 （C） 可接受的胶体沉积示例，其中条件比最佳条件干燥（65% RH）。单层区域略为半透明，而多层区域为白色和不透明（外围和向内条纹）。 （D） 用白光照亮的胶体晶体，以突出晶体的彩虹衍射。 （E） AFM 图像（在空气中敲击探头 AFM）来自成功的胶体沉积（比例杆 = 10 μm）的六角形包装聚苯乙烯珠的单层。（F） 扩展包装珠子的 AFM 图像（比例栏 = 2 μm）。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：铜沉积后ZMW模板的宏观和微观图像。（A）珠子模板顶部铜物理蒸发后滑梯的图片。（B）铜沉积后珠模板的彩虹衍射模式。（C）磁带拉动后模板的图片（右图）以去除多余的铜和胶带（左）。（D）胶带拉扯和聚苯乙烯珠完全溶解后铜柱的 AFM 图像（比例杆 = 5 μm）。（E）面板 D （刻度条 = 2 μm） 的更高放大倍率 AFM 图像。（F）铜柱高度的直方图（定义为每个柱内的最高高度测量），n = 534。（G）铜柱费雷特直径的直方图，n = 201。费雷特直径是两条平行线与后边界切线之间的最大距离（在 ImageJ47中量化）。为了识别用于分析的颗粒，使用了包层顶部和底部玻璃表面之间的阈值。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：铝ZMW的宏观和微观图像。（A）铜柱周围和顶部150纳米铝的物理蒸发沉积后滑梯的图片。（B）解体后铝 ZMW 的 AFM 图像（比例柱 = 5μm）。（C）面板 B 的更高放大图像（刻度条 = 0.2 μm）。（D）单个 ZMW 的典型深度配置文件，摘自 C 面板（E） ZMW Feret 直径的直方图（n = 240）中的绿线。费雷特直径的测量为图4。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：ZMW中的单分子FRET成像。（A） Cy3 的单分子 FRET 成像的示意图（不缩放），Cy5 标记的 DNA 复式在 ZMW 中，背景为 Cy5 标记复式。（B）白光照明下 ZMW 的示例字段（比例栏 = 10 μm）。（C+F）单分子FRET记录的DNA复式在ZMW中固定存在0（C），50（D），100（E），和500 nM（F）Cy5标签复式在溶液中。 对于每个浓度，顶部面板显示 532 nm 激光照明 （FRET 成像） 下的 Cy3（绿色）和 Cy5（红色）荧光强度，中间面板显示 640 nm 激光照明（直接接受器激发）下的 Cy5 荧光强度，最低面板显示 Equation 2 从原始 Cy3（ID）和 Cy5（IA）荧光强度计算的 FRET 效率 （） 。在成像过程中，激发波长每100 ms在532到640纳米之间交替。 请点击这里查看此图的较大版本。

补充图1：胶体模板方法的示意图，开发成金ZMW阵列。 制造黄金 ZMW 阵列的协议类似于制造铝 ZMW 阵列的协议（图 2）。铝不是将铜沉积在聚苯乙烯珠子上，而是沉积在聚苯乙烯珠子上。溶解甲苯珠后，黄金被沉积，而不是铝在柱子上。然后有选择地蚀刻铝柱，留下金色 ZMW 阵列。对于最后三个步骤，计划视图的右侧提供横截面视图，以显示铝柱和黄金 ZMW 的宽度和高度。 请单击此处下载此文件。

补充图2：ZMW电磁场传播的有限元素建模。（A+D）通过由未选中的模板（A，C）和退火模板（B，D）制成的波导，时间平均庞廷矢量 （W/m2）的横截面。线性极化电磁平面波（1 W 分布在滑梯区域）上，其波长（400 nm 或 1，000 nm）投影到底部表面，使用建模软件（材料表）计算最低（基本）模式，采用有限的元素方法解决 Maxwell 的方程和适当的边界条件。波导的边界被认为是完美的导电体，它是由铝或金墙很好地接近。从未选定波导模板的横截面是由直径为 1μm 圆的六边形包装确定的，由此产生的三角形形状的三角尖被剪切到 +60 nm 宽度，以模拟逼真的物理孔径。退火模板的横截面大约为直径为 130 nm 的圆。两个波导的深度均为 130 nm，类似于制造后的包层深度。（E，F）除了400纳米和1000纳米的激发波长外，这些模型还解决了100个激发波长均匀地间隔在400纳米到1000纳米之间的问题， 有效模式索引（定义为 Equation 3 ，kz是波导中的波数，由于横向平面的限制而减少，k是真空中的激发光波数）是针对三角形（E）和圆形（F）波导的激发波长绘制的。对于较短的波长，较高的模式是兴奋的，有效的模式索引增加（最大有效模式索引是1，这是电磁平面波在横向维度下不受限制的有限情况）。波导的有效截断波长估计为有效模式指数降至 0 的波长。请注意，从有限元素建模（F） 中截断= 221 nm的圆形指南与圆形波导的截止波长（[截断、分析= 1.7d = 221 nm，其中 d是波导直径）的理论预测一致。请点击这里下载此文件。

补充图 3： Au ZMW 制造的代表结果。（A）黄金 ZMW 阵列的宏观图片。（B+D）来自未退火（B）的珠子模板的铝柱的AFM图像，在107°C为20s（C）的退火模板，以及以107°C为25s（D）退火的模板。 （E）铝柱解散后黄金 ZMW 的 AFM 图像。（F）高放大度AFM图像面板 E.（G）黄金 ZMW 的典型深度轮廓。配置文件取自在面板 F 中绘制的绿线（比例栏 = B、C、D 和F中的 1 μm;E 中的 5 μm）。 请点击这里下载此文件。

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Discussion

对于胶体自组装（协议第2节），使用乙醇而不是水作为悬浮溶剂加速蒸发过程，使模板在沉积后2~3分钟准备好，而不是像以前的方法48，49那样在1~2小时。这里提出的蒸发沉降协议也比以前的沉降协议简单，需要控制悬浮层49、50、51以上的表面倾斜、温度和空气体积。本协议中使用的颗粒体积分数为2.4%，高于之前沉积方法48中使用的0.2+0.5%，该方法将胶体重新用于水甘油混合物的沉积时间尺度更长。然而，沉积的质量是强大的粒子体积分数的变化，与过去的研究发现，它可以在2-10%49，50，51之间变化。从本协议的成功沉积中获得的胶体晶体的颗粒大小为20~30μm宽，比以前沉积方法（通常为几百纳米宽）48，49的颗粒大。从宏观上，胶体单层直径约2厘米的区域也可与以前方法49产生的1厘米区域相媲美。此方法产生的胶体晶体模板体积大，也允许在每个 ZMW 幻灯片上制作 3+5 分离的流室44，每个流室宽约 3+4 mm。因此，可以在每个幻灯片上进行多个独立的单分子实验。

在自组装后对胶体珠模板（协议第 3 节）进行命名是一个简单但关键的步骤，可充分减少 ZMW 的背景荧光。正如 补充图 2 所示，波导与未选建模板的三角横截面的有效截断波长为 894 nm。相比之下，从退火模板中分离出直径为 130 nm 的圆形波导的有效截断波长为 221 nm，分析确定（是指南 18 直径的1.7倍）和数字。使用较小的珠子进行沉积也可以减少模板孔隙的大小，但波导的间隔将接近 200 nm，这大约是可见光的衍射极限。此外，波导在横截面中仍将保持三角形，从而通过波导（辅助图 2A+D）导致非对称功率传播。退火步骤的一个缺点是熔化时间的变异性会引入波导直径的波动，因此准确的定时有助于最大限度地减少批次之间的变化。隔间开始关闭在退火时间超过25s，和柱直径不会减少很多之间20-25s（补充图3B+D）。闭塞的快速测试是检查退火模板在用光线照明并以角度查看时是否仍会产生彩虹衍射模式。否则，大多数闭会间可能已经关闭。退火时间与典型毛孔直径的关系已提前38年提出。

在退火步骤中达到所需的孔径大小后，铜沉积（第 4.1 步）到模板上，以创建面膜的阴影。使用视线沉积很重要，金属尽可能垂直接近模板。因此，增加样品和金属来源之间的距离，并确保持有模板的板不会旋转，就像某些蒸汽沉积机自动完成的那样，将有助于最大限度地减少金属在聚苯乙烯基板上的横向沉积。然而，一些横向沉积是不可避免的，这减少了间隙孔的大小，因此后横截面作为更多的金属沉积52。这导致金字塔金属柱，而不是棱镜状结构52。

由于铜柱可能是金字塔形的，而不是棱镜形的，柱子顶部的铝沉积（第4.5步）也覆盖了部分倾斜的两侧，阻塞了部分柱子的铜等的可访问性。因此，镜头纸的吸气步骤（步骤 4.7 或 5.7） 在第一次浸泡等后添加，以机械地中断任何仍覆盖在铝的铜柱。沉积更多的铜来创建更高的柱子，也使柱子在透镜纸擦洗过程中更容易受到机械干扰。但是，不应沉积超过 500 nm 的铜，因为沉积的目标是在 1 μm 珠的 500 nm 中线投射间隙孔。

另一个潜在的困难是在透镜纸擦洗过程中意外去除铝包层（步骤 4.7 或 5.7）。研究发现，在添加退火步骤后，在吹气过程中铝包层的丢失变得更加频繁，可能是由于聚苯乙烯残留物增加，这可能会干扰铝对玻璃的粘合（协议第 3 节）。然而，在磁带拉下后，隔夜甲苯浸泡（步骤 4.3 或 5.3）解决了此问题。在 图4E中的AFM图像中，在柱子之间可以看到一些聚苯乙烯的残余环，但铝包层在第4.7步中仍然抵抗着多个爱好者。如果在隔夜甲苯浸泡后铝包层的丢失仍然是一个问题，则可以在步骤 4.4 或 5.4 中添加 RCA-1（标准清洁-1）洗涤、食人鱼洗涤或进一步氧气等离子体清洁。这些洗涤步骤也可以在最后蚀刻步骤（步骤 4.7 或 5.7）和钝化之前添加，以便进一步清洁 ZMW。

ZMW在单分子FRET实验中的表现与用EBL制造的ZMW相似。在先前的一项研究中，53在Cy3标记的单链DNA上执行单分子FRET，在溶液中标有Cy5标记的DNA螺旋酶装载机蛋白（与图6A中的供体-接受者排列相同），FRET事件在100 nM Cy5背景下清晰可见，在1微米处不太清晰（低接受者跟踪信号到噪声），在10微米处无法辨别。我们注意到，以前一项使用商用ZMW的研究报告了单分子FRET接收信号的背景浓度高达1mM54，高于我们和其他先前的研究42，53与内部制造的ZMW已经实现。贾米奥尔科夫斯基等人进一步讨论了ZMW之间的信号对背景性能。荧光样品与ZMW表面53的非特异性相互作用是限制获得更高浓度的常见挑战，特别是如果溶液中扩散的荧光物种是一个大分子。ZMW对复杂的生化系统（如翻译）的研究通常将自由荧光基板浓度限制在100~250 nM 55、56、57、58。无论 ZMW 的预定应用如何，为了保持高浓度噪声的可接受信号，可能需要优化不同系统的钝化方法。

总的来说，这里介绍的方法不需要专门的技能或设备，允许同时制造许多模板，并且可以适应在不同的金属中制造ZMW。在这项工作中，铜和铝分别被铝和金所取代，以制造黄金ZMW（补充图3）。这有利于使用黄金钝化方法而不是铝的实验室。此外，黄金ZMW已被证明可以增加在可见光谱红色区域吸收的氟的排放，而铝ZMW则能增加在绿色区域59中吸收的氟的排放。将来，使用这种方法制造的ZMW的荧光信号强度可以通过使用HF16、26、60蚀刻到ZMW金属包层下方的玻璃中来增强。这使得固定生物分子远离金属墙，可以淬火荧光61。此外，孔径入口下方的激发照明强度最大，这以前已被利用来增强单分子发射26，60。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家卫生研究院授予R01GM080376、R35GM118139和NSF工程机械生物学中心CMMI：15-48571至Y.E.G.的支持，以及国家艾滋病规划署博士前NRSA研究金F30AI114187对R.M.J.的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

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生物工程，第159期，零模式波导，纳米光圈，单分子荧光，纳米球光刻，胶体晶体，自组装

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

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Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

为高浓度单分子显微镜制造零模式波导
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