Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو رصد مستمر لديناميات عملية صيد الجزر البنكرياسية البشرية والبلدان المضيفة المساهمة مقابل الخلايا المانحة. ويتم ذلك عن طريق زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية للعين (ACE) من NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-المتلقي الماوس تليها تكرار 2-فوتون التصوير.
Abstract
تصوير خلايا بيتا هو خطوة رئيسية نحو فهم زرع جزيرة. على الرغم من أن منصات التصوير المختلفة لتسجيل بيولوجيا خلايا بيتا قد تم تطويرها واستخدامها في الجسم الحي، إلا أنها محدودة من حيث السماح بدقة الخلية الواحدة والتسجيلات الطولية المستمرة. بسبب شفافية القرنية ، فإن الغرفة الأمامية للعين (ACE) في الفئران مناسبة تمامًا لدراسة بيولوجيا خلايا البنكرياس في البنكرياس البشري والفأر. هنا هو وصف لكيفية هذا النهج يمكن استخدامها لأداء التسجيلات الطولية المستمرة من التطعيم وإعادة الزرع من الطعوم الجزيرة البشرية الفردية. يتم إدخال الطعوم الجزرية البشرية في ACE، وذلك باستخدام NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-الفئران كمستلمين. وهذا يسمح للتحقيق في توسيع الخلايا المتلقية مقابل المانحة ومساهمة الخلايا المتلقية في تعزيز تغليف الأوعية الدموية من الكسب غير المشروع. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد نهج خطوة بخطوة لتحليل الصور وتحديد كمية حجم جزيرة أو الأوعية الدموية مجزأة وكبسولات جزيرة تشكيل الخلايا المتلقية.
Introduction
يصف مرض السكري مجموعة من الأمراض الأيضية التي تتميز بمستويات مرتفعة من جلوكوز الدم كنتاج غير كافٍ للأنسولين من فقدان أو خلل في خلايا بيتا في البنكرياس، وغالبًا ما تكون مصحوبةً بمقاومة الأنسولين. النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D) هي الأمراض المعقدة التي الخلل التدريجي للخلايا بيتا يسبب تطور المرض. يتم تعجيل T1D من قبل هجوم المناعة الذاتية على خلايا بيتا، في حين يعتبر T2D أن تكون مدفوعة بعوامل التمثيل الغذائي، وإن كان مع أدلة متزايدة من التهاب النظامية منخفضة الدرجة1. زرع الجزر البشرية المانحة، وخاصة لمرضى T1D، ويوفر إمكانية لتوفير السيطرة الفسيولوجية نسبة السكر في الدم. ومع ذلك، فإن نقص المتبرعين بالأنسجة وضعف زراعة الجزر منعا من زراعة الجزر لتصبح خيارا علاجيا سائدة. يتم فقدان نسبة كبيرة من الكسب غير المشروع في جزيرة وظيفية في فترة ما بعد الزراعة مباشرة (24-48 ساعة) بسبب نقص الأكسجة، والتهابات، والبيئة المضيفة المناعية2،3. لتقييم كفاءة أساليب التدخل لتحسين بقاء الجزر، من الضروري الرصد المستمر لعمليات الزرع هذه.
في تقنيات الجسم الحي لتصوير وتتبع مصير الجزر البنكرياسية البشرية المزروعة بعد زرع لا يزال تحديا لأبحاث السكري4,5. حتى الآن، تقنيات التصوير غير الباضع، بما في ذلك التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) تظهر إمكانية القياس الكمي والتقييم الوظيفي الجزر المزروعة في الظروف التجريبية5. بيد أنه نظرا لصغر حجم الجزر، فإن القياسات الكمية التي تُقاس بتلك الطرائق لا تكفي. الغرفة الأمامية للعين (ACE) كموقع زرع للمراقبة هو حل التصوير غير الباضع الواعدة التي تقدم دقة مكانية أعلى بشكل فعال والرصد المتكرر على مدى فترات زمنية طويلة6. وقد تم استغلال هذه الطريقة بنجاح لدراسة علم الأحياء جزيرة الماوس (استعرضت في يانغ وآخرون7)،المناعة الذاتية الاستجاباتالمناعية 8، وكذلك الجزرة البشرية تطعيم9،10.
هنا يتم الجمع بين طريقة زرع ACE مع نهج التصوير 2-فوتون للتحقيق في ديناميات عملية engraftment جزر البنكرياس الإنسان عن طريق التسجيلات المستمرة والمكررة على الطعوم الجزيرة الفردية لمدة تصل إلى 10 أشهر بعد زرع. خصائص التصوير متعددة الصور من أعماق التصوير أكبر وخفض حجم التصوير الكلي وتلف الصورة التغلب على قيود التصوير من المجهرconfocal 11. وينطوي القياس الكمي للتصوير الفلوري على عدة مراحل، بما في ذلك إعداد عينة الجزر، وزرع الجزر، وحيازة الصور، وتصفية الصور لإزالة ضوضاء الجزر أو خلفيتها، والتجزئة، والتكديس الكمي، وتحليل البيانات. الخطوة الأكثر تحديا عادة تقسيم أو تقسيم صورة إلى أجزاء أو مناطق متعددة. ويمكن أن ينطوي ذلك على فصل الإشارة عن الضوضاء في الخلفية، أو تجميع المناطق من voxels على أساس أوجه التشابه في اللون أو الشكل للكشف عن وتسمية voxels من حجم 3D الذي يمثل الأوعية الدموية جزيرة، على سبيل المثال. بمجرد تقسيمها، إحصاءات مثل أحجام وحدة تخزين الكائن عادةً مباشرة لاستخراج. توفير طريقة لتكميم واستخراج بيانات التصوير، مثل تجزئة وتصور البيانات. ويولى اهتمام خاص لإزالة الفلورا في الجزر البشرية والتمييز بين الأوعية الدموية في جزيرة وكبسولات الجزر تشكيل الخلايا المتلقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت اللجنة الإقليمية للأخلاقيات في لوند، السويد، على الدراسة وفقاً لقانون الاستعراض الأخلاقي للبحوث التي تشمل البشر. أجريت التجارب على الحيوانات في توافق صارم مع أخلاقيات التجارب الحيوانية السويدية ووافقت عليها لجان الأخلاقيات في مالمو ولوند. 6 إلى 8 أسابيع من العمر إيماءة المناعة. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. روزا -الطماطم. Rag2-/-تم استخدام الفئران المتلقية كمستلمين لزرع الجزر البشرية10.
1- إعداد جزيرة جزيرة زرع
- الجزر البشرية ثقافة في CMRL 1066 تكملها 10 MM HEPES، 2 M L-الجلوتامين، 50 ميكروغرام/مل جينتامايسين، 0.25 ميكروغرام/مل اسيسون، 20 ميكروغرام/مل سيبروكسلوكساسين، 10 mM نيكوتيناميد (NIC)، و 10٪ مصل الإنسان المعطل للحرارة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ورطوبة الهواء حتى زرع، كما هو موضح سابقا12.
ملاحظة: يجب أن تكون الجزر خالية من الأنسجة الواثقة ولا تلمس بعضها البعض في الثقافة. تظهر أنسجة الإكروكرين شفافة. - في يوم زرع، نقل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الجزر إلى طبق بيتري جديد باستخدام تجميع أنبوب الpirator متصلة الشعرية الزجاجية المسحوبة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم ماصة 200 ميكرولتر. يساعد تلوين الجزء الخلفي من طبق بيتري على جعل الجزر أكثر سهولة يمكن تمييزها تحت المجهر الاستريو. - باستخدام مجهر ستيريو، واختيار ~ 20-40 الجزر في زرع ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. ملء أنبوب إلى الأعلى مع وسائل الإعلام الثقافة من الحاضنة.
- قم بختم الأنابيب باستخدام فيلم البارافين وتخزينها على الجليد حتى الزراعة. إعداد مبلغ مناسب لعدد عمليات الزرع التي أجريت.
- بدلاً من ذلك، تأكد من توفر حاضنة CO2 في غرفة الجراحة للحفاظ على الجزر في الثقافة واختيارها قبل كل عملية زرع مباشرة.
2. إعداد معدات زرع وطاولة الجراحة
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأدوات الجراحية autoclaved، وطاولة الجراحة والأدوات تطهيرها مع 70٪ الكحول.
- قم بتوصيل حامل رأس مجسم إلى التخدير عن طريق قناع الأنف وتشغيل وسادة التدفئة.
- ربط حقنة هاملتون الغازية إلى أنابيب البولي إيثيلين وقنية العين نهاية حادة.
ملاحظة: من المستحسن لملء كافة الأجزاء مع برنامج تلفزيوني قبل التجميع. تحقق من فقاعات الهواء المحاصرين وإزالة إذا كان موجودا. - إرفاق حقنة هاملتون بإحكام إلى الجدول (الشكل 1a) أو قاعدة منقولة (الشكل 1e) وإرفاق الأنابيب إلى المجهر الاستريو ، مع القنية المعلقة (أي موقف الانتظار).
ملاحظة: استخدم الشريط الجراحي، لأنه من السهل إزالته وإعادة ربطه. - إعداد حقنة 1 مل متصلة بإبرة 30 G مليئة بمحلول البوبرينورفين 0.1 ملغم/كغ.
- إعداد حقنة مع برنامج تلفزيوني عقيم. بدلا من ذلك، استخدمي ماصة.
- يُترك جانبًا قفصًا نظيفًا للاستيقاظ مع مصباح تدفئة.
3. التخدير وتحديد المواقع من الفئران المتلقية لعملية جراحية
ملاحظة: تم تربية جميع الحيوانات وصيانتها في بيئة خالية من مسببات الأمراض في مرافق الحيوانات في جامعة لوند.
- تخدير الماوس في غرفة مليئة 40٪ O2/60٪ N2/ 3٪ isoflurane ونقل الماوس تخدير إلى منصة حامل الرأس على وسادة التدفئة الدافئة (الشكل 1a). تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة.
ملاحظة: التخدير الأيزوفلوران هو الطريقة المفضلة للتخدير للشفاء السريع بعد الجراحة. يجب أن تكون غرفة المجهر تهوية بشكل صحيح لاستخدام ايزوفلوران. - ضع خطم الماوس في قناع التخدير المتصل بـ 40% O2/60% N2/0.9%-1.5% جهاز تخدير الأيزوفلوران. استخدام الإبهام والاصبع لرفع الرأس حتى قليلا وربطه باستخدام القطع المعدنية على الجانبين. تأكد من أن سماعات الأذن تصلح الرأس مباشرةً أسفل الأذنين. حقن 0.1 ملغ / كغ buprenorphine حل تحت الجلد على الجزء الخلفي من الماوس.
ملاحظة: يتم استخدام البوبرينورفين كمستد. - إمالة الرأس بحيث تكون العين التي سيتم إجراء عملية جراحية عليها تواجه صعوداً وتكون قريبة من الباحث.
- تراجع بلطف جفون العين ليتم زرعها باستخدام ملقط حادة، البوب العين، وإصلاح فضفاضة مع زوج من الملاقط. تأكد من أن يتم تغطية نصائح من ملاقط مع أنبوب البوليثين تعلق على منصة حامل الرأس(الشكل 1a، إدراج).
- دائما إبقاء العينين الرطب عن طريق تطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيم على العين.
- نقل الجزر البشرية من أنبوب مختوم 1.5 مل (القسم 1) إلى طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني معقمة والتأكد من أن الجزر قريبة من بعضها البعض لتقليل كمية وسائل الإعلام ثقافة الخلية المنقولة (الشكل 1c).
- التقاط ~ 20-30 الجزر في قنية العين متصلة عن طريق أنابيب البوليثين إلى حقنة هاملتون.
ملاحظة: تناول أقل قدر ممكن من السوائل مع الجزر. - شنق الأنابيب رأسا على عقب وإرفاق إلى المجهر ستيريو(الشكل 1d). الشريط الأنابيب بعناية للسماح الجزر بالوعة إلى نهاية الأنبوب نحو القنية.
4. إجراء الزرع
ملاحظة: تم وصف هذه الطريقة مسبقاً لزراعة الجزر الماوس6. يتم تقديم إجراء معدل قليلاً هنا.
- قرصة منصات على الساقين الخلفي للتأكد من أن الماوس هو نائم.
- تشديد ملقط تقييد العين دون تعطيل تدفق الدم وتطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيم على العين.
- باستخدام إبرة 25 G كمشرط، مشط الحواف إلى الأعلى، تخترق بعناية فقط نصف الطرف في القرنية وتجعل شقًا واحدًا من شقًا اتّميًا. جعل ثقب في زاوية أعلى؛ وسوف ختم ثقب بسهولة أكبر بعد عملية الزرع (الشكل 1F).
- رفع بعناية حتى القرنية مع كانية محملة مسبقا مع الجزر وطبق ببطء الجزر في العين. تجنب إدخال القنية في الغرفة الأمامية لمنع تلف القزحية ، ولكن بدلاً من ذلك ادفع بعناية ضد فتحة القرنية (الشكل 1g). تراجع ببطء القنية من ACE.
ملاحظة: الهدف للحصول على حجم حقن من 3-8 μL. إذا كان حجم كبير جدا، فإنه يعرض العين لضغط العين عالية دون داع، ويمكن أن يؤدي إلى ارتجاع الجزر حقن من الغرفة الأمامية. - عندما تواجه صعوبات مع إدخال الجزر بسبب زيادة الضغط في غرفة العين، تكبير موقع شق عن طريق تعزيز شق جانبي الموقع والجزر reapply.
ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن استخدام فقاعات الهواء المقدمة كأصحاب مساحة. - تطبيق جل العين على العين، وتخفيف ملقط العين التقييد وترك الماوس على isoflurane في نفس الموقف لمدة 8-10 دقيقة للسماح تعيين الجزر.
- اخلع الملبابات التي تحمل الجفن وارجع الجفن إلى وضعه الطبيعي.
- إزالة الماوس من حامل الرأس ونقله إلى قفص الاستيقاظ.
- عندما يكون الماوس مستيقظا وتتحرك، ونقلها مرة أخرى إلى القفص الأصلي والاحتفاظ بها في السكن الحيواني حتى المسح الضوئي (ينصح على الأقل 5 أيام).
5. التصوير من الجزر البشرية المزروعة عن طريق 2-فوتون المجهرية
ملاحظة: يوصى بأخذ صور عامة للعين باستخدام مجهر مجسم(الشكل 2a–c) بعد 4-5 أيام من الزرع قبل التصوير بـ 2 فوتون لتوطين الجزر ذات الأهمية. تجنب تقييد العين بإحكام شديد في هذا الوقت المبكر بعد الزرع. استخدام التصوير 2-فوتون 6-7 أيام بعد الزراعة.
- بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور (راجع جدول المواد). في"ليزر"القائمة تفعيل ماي تاي ليزر (السلطة "ON") وفي"ضوء المسار"القائمة تعيين الطول الموجي إلى 900 نانومتر وتطبيق الحد الأدنى من قوة الليزر انتقال بدءا من 5٪ - 10٪ قوة الليزر (استخدام المتزلجون).
ملاحظة: أثناء المسح الضوئي، قم بضبط طاقة الليزر حسب الحاجة. - تعيين القنوات الخضراء والبرتقالية والأحمر. جمع الضوء الانبعاثات في وقت واحد على ثلاثة كاشفات غير مُفرَض (NDD) باستخدام مرآة 11000(LBF 760) ومعلومات عن مرشح الانبعاثات على النحو التالي: Red/Angiosense 680, 690-730 نانومتر; الأخضر / الفلوروس، 500-550 نانومتر؛ والبرتقال / الطماطم، 565-610nm (الشكل 2d).
- ضع مسرح حامل الرأس على مرحلة المجهر الآلية وربط قناع الغاز بمواني أنابيب آلة التخدير والأنابيب المتصلة بنظام التهوية. تشغيل لوحة التدفئة.
- تخدير الماوس المتلقي، ونقل إلى منصة حامل الرأس، وكبح العين للتصوير، وإدارة حل البوبرينورفين كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3.1-3.5).
- ضبط أبخرة ايزوفلوران حسب الحاجة. يشير معدل التنفس من ~ 55-65 أنفاس في الدقيقة (bpm) إلى التخدير الأمثل. إذا كان التخدير عميقًا جدًا ، فسيكون المعدل < 50 bpm مع التنفس أو اللهاث؛ إذا كان خفيف جدا، فإن معدل يكون > 70 bpm مع التنفس سطحي. مراقبة الفئران بعناية أثناء التخدير عن طريق الفحص البصري كل 15 دقيقة.
ملاحظة: التخدير يختلف من الماوس إلى الفأرة، بين سلالات الماوس، وكما الوقت تحت التخدير تقدم13. - إدارة ما يكفي من هلام العين على العين كسائل الغمر بين القرنية والعدسة، مما يسمح لها لتتراكم ببطء (الشكل 2 و، إدراج). تجنب فقاعات الهواء.
ملاحظة: يوصى بالإضاءة الجانبية مع مصباح خرطوم معدني مرن لضبط التركيز وتوطين الطعوم الجزيرة. - لتصور الأوعية الدموية، وإدارة 100 ميكرولتر من عامل التصوير (على سبيل المثال، Angiosense 680) عن طريق الوريد في الوريد الذيل باستخدام حقنة الأنسولين المتاح 30 G.
- في "وضع الاكتساب" ضبط حجم الإطار إلى 512 × 512 وسرعة المسح الضوئي.
ملاحظة: إن عمليات المسح البطئ (أي زيادة وقت الإسهاب) سوف تحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء. - في"القنوات"القائمة ضبط كسب ماجستير لكل PMT في فولت لتضخيم إشارة حتى ينظر إلى صورة على الشاشة في وضع المسح الحي. كلما ارتفعت هذه القيمة، كلما أصبح الكاشف أكثر حساسية للإشارة والضوضاء.
ملاحظة: يفضل أن تبقى القيم بين 500-800 V. - في "Z - المكدس" القائمة تحديد بداية ونهاية z - المكدس عن طريق نقل التركيز يدويا إلى الجزء العلوي من الكسب غير المشروع في جزيرة. حفظ الموقف عن طريق تحديد"تعيين أولا". الانتقال إلى آخر مستوى أسفل التي يمكن أن تركز في الكسب غير المشروع جزيرة وحفظ الموقف عن طريق تحديد"تعيين الأخير". استخدام حجم خطوة ض 2 μm.
- جمع كومة الصورة النهائية عن طريق النقر على "بدء التجربة" علامة التبويب وحفظ ك 8 بت CZI (أي ، كارل زييس الشكل) الملف.
6. تصوير الجزر البشرية المزروعة عن طريق المجهر confocal
ملاحظة: يمكن تقييم الحجم الكلي، المورفولوجيا، ولدونة الجزر المزروعة من خلال مراقبة إشارة التشتت في الجسم الحي في مسح منفصل (أي مسار منفصل) عن طريق الكشف عن ضوء10بالليزر.
- إخراج تقسيم شعاع الرئيسي (أي، مرشح LBF) وفي"ضوء المسار"الحوار إعداد مسار منفصل للتصوير confocal. اختيار الليزر الأرجون مع الطول الموجي من 633 نانومتر والكشف في نفس الطول الموجي مثل ضوء الليزر. يتم الحصول على رصات Z بحجم خطوة 2-3 ميكرومتر للإشارة الضوئية المُتَرَسَّة.
- تعديل إعدادات المكدس z للتأكد من تسجيل جزيرة بأكملها (راجع الخطوة 5.10).
- الحصول على كومة الصورة وحفظ كملف CZI 8 بت.
7. تحليل الصور
ملاحظة: البرامج التجارية (انظر جدول المواد)تم استخدامها لهذه الخطوة.
- إزالة الفلوروس التلقائي جزيرة (الشكل 3b)
- في "معالجة الصورة" اختيار علامة التبويب " القناةالحسابية" ونوع "ch1-ch2". وهذا يخلق قناة جديدة 4 (ch 4); إعادة تسمية باسم"Vasculature".
ملاحظة: يتم طرح قناة Green/Autofluorescence من قناة Red/Angiosense. - كرر الخطوة السابقة واكتب"ch3-ch2"لإنشاء قناة جديدة (Ch 5); إعادة تسمية باسم "الطماطم (جميع)".
ملاحظة: يتم طرح قناة Green/Autofluscence من قناة Orange/Tomato.
- في "معالجة الصورة" اختيار علامة التبويب " القناةالحسابية" ونوع "ch1-ch2". وهذا يخلق قناة جديدة 4 (ch 4); إعادة تسمية باسم"Vasculature".
- تعريف قناع الجزر بواسطة الرسم اليدوي (الشكل 3c)
- إنشاء سطح جديد (رمز أزرق) وفي المعالج اختيار"تحرير يدويا". الحفاظ على المؤشر في "حدد" وضع وفي عرض 3D unclick "وحدة التخزين" (تحت المشهد)لتصور المقاطع.
- للحصول على تمييز أسهل على حدود الجزر، قم بتنشيط جميع القنوات، بما في ذلك ch 1-ch 3.
ملاحظة: قناة أورانج/طماطم مفيدة لتحديد حدود الجزر بواسطة إشارة كبسولة الطماطم. بدلا من ذلك، زيادة كثافة القناة لاستخدام متعددة القنوات جزيرة الفلورة التلقائية وإشارة خلفية كاشفة كتوجيه. - في "رسم" علامة التبويب اختيار "كفاف" وانقر فوق "رسم" لبدء رسم ملامح حول حدود جزيرة بدءًا من موضع الشريحة 1.
- الانتقال إلى موضع شريحة جديدة وتكرار رسم ملامح. الانتهاء مع الشريحة الأخيرة على الجزء العلوي من جزيرة ونهاية عن طريق النقر على "إنشاء سطح" علامة التبويب. عادة ما يكفي لرسم ملامح كل شريحة10.
- تجزئة "جزيرة الأوعية الدموية" و "الطماطم جزيرة" الفلورس باستخدام قناع جزيرة(الشكل 3d).
- اختيار المحدد سابقا "قناع جزيرة" الكائن ، انتقل إلى علامة التبويب التحرير ( رمز قلمرصاص) ، وانقر على "قناع كل" علامة التبويب ، الذي يفتح نافذة جديدة.
- اختيار قناة المسمى سابقا "Vasculature" (CH 4) في قائمة اختيار قناة القائمة المنسدلة وتفعيل الخيارات "قناة مكررة قبل تطبيق قناع", " ثابت داخل /خارج", وتعيين voxels خارج السطح إلى "0.000", مما يخلق قناة جديدة; إعادة تسمية باسم "جزيرة الأوعية الدموية"(ch 6).
- كرر الخطوات 7.3.1 و 7.3.2 واختر القناة التي تم إنشاؤها مسبقاً"الطماطم (الكل)"(ch 5) في القائمة المنسدلة لاختيار القناة لإنشاء قناة جديدة؛ إعادة تسمية باسم "طماطم جزيرة" (ch 7).
- عرض السطح من الأوعية الدموية جزيرة(الشكل 3e)
- إنشاء سطح جديد في "المشهد" القائمة وفي المعالج اختيار "إنشاء تلقائي".
- تعيين قناة المصدر إلى إنشاء سابق"جزيرة vasculature"(ch 6) واختيار الطرح الخلفية. ويمكن تعديل التقدير التلقائي للعتبة إذا لزم الأمر. مقارنة مع قناة الفلوريسنس المستجيبة (على سبيل المثال، عن طريق مزج داخل/خارج علامة التبويب السطحي المنشأة حديثًا). تابع في المعالج.
- اختياريا، استخدم المرشحات. على سبيل المثال، اختر"مستوى الصوت"ثم قم بضبط عامل التصفية (الأصفر) في النافذة، والذي يمكنه إزالة الكائنات السطحية المحددة. إنهاء المعالج وتسمية الكائن السطحي الجديد"جزيرة الأوعية الدموية".
- تجزئة "جزيرة الطماطم الأوعية الدموية" إشارة الفلورانس ( الشكل3f)
- في الكائن السطحي"أوعية جزيرة جزيرة" الذي تم إنشاؤه سابقًا، انتقل إلى علامة التحرير وانقر على علامة التبويب"قناع الكل"،الذي يفتح نافذة جديدة.
- اختيار قناة المسمى سابقا "الطماطم جزيرة" (CH 7) في اختيار قناة القائمة المنسدلة وتعيين voxels خارج السطح إلى "10.000", الذي يخلق قناة جديدة; إعادة تسمية باسم "جزيرة الطماطم vasculature" (ch 8).
- تجزئة "كبسولة الطماطم" إشارة الفلورسنس (الشكل 3g)
- اختيار "القناة الحسابية" في "معالجة الصورة" علامة التبويب ونوع "ch7 -ch8" ، إنشاء قناة جديدة ؛ إعادة تسمية باسم "كبسولة الطماطم" (ch 9).
ملاحظة: يتم طرح "جزيرةالطماطم vasculature"إشارة الفلوريسنس من مجموع "الطماطم جزيرة" إشارة الفلور.
- اختيار "القناة الحسابية" في "معالجة الصورة" علامة التبويب ونوع "ch7 -ch8" ، إنشاء قناة جديدة ؛ إعادة تسمية باسم "كبسولة الطماطم" (ch 9).
- عرض السطح من "جزيرة الطماطم vasculature" و "كبسولة الطماطم" (الشكل 3h)
- اتبع الخطوة 7.4، وفي المعالج اختيار القنوات المصدر "جزيرة الطماطم vasculature" (Ch 8) أو "كبسولة الطماطم" (ch 9) لإنشاء كائنات سطحية جديدة وفقا لذلك.
- سطح تقديم من سطح جزيرة مجموع (الشكل 3i)
- افتح ملف backscatter جزيرة ثم إنشاء سطح جديد.
- في المعالج، اختر"إنشاء تلقائي"وحدد"منطقة الاهتمام".
ملاحظة:"منطقة الاهتمام"يستخدم لفصل إشارات الجزر المتعددة وتحديد عمق الجزر التي سيتم تحليلها (على سبيل المثال، أعلى 75 ميكرومتر). - في "كثافة المطلقة" ضبط عتبة إذا لزم الأمر. يمكن النقر على الكائن السطحي أو إيقاف تشغيله للتحقق من شدة القناة المقابلة. أغلق المعالج.
- القياس الكمي (الشكل 3j)
- حدد كائن سطحي تم إنشاؤه في"المشهد"القائمة والذهاب إلى "إحصائيات" علامة التبويب .
- لاسترداد بيانات وحدة التخزين التفصيلية في الكائن السطحي المحدد اختر " علامة التبويبالمفصلةوحدد "قيم محددة" و "Volume" من القائمة المنسدلة. لاسترداد قيمة حجم إجمالي للكائن السطحي المحدد، انتقل إلى " علامة التبويبالتفصيليةواختر "متوسط القيم".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم زرع الجزر البشرية غير المسماة في ACE من NOD الإناث البالغ من العمر 8 أسابيع. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. روزا- الطماطم. Rag2−/−)فئران المتلقي. لمنع رفض الأنسجة البشرية ، تم اختيار الفئران Rag2 الضربة القاضية المناعية كمستلمين. في هذه الفئران المعدلة وراثيا، أعربت جميع الخلايا والأنسجة عن بروتين الفلورية الطماطم المستهدفة بالغشاء (mT) الذي يسمح بتحديد واضح للمتلقي والأنسجة المانحة. التصوير المتكرر لطعوم الجزر بواسطة المجهر عالي الدقة 2 فوتون يمكن أن يحدد خلايا mT+ المتلقية المشاركة في عملية التبغ ونمط الهجرة الديناميكي.
بشكل عام، كان إعداد زرع الجزر البشرية في ACE للفئران المتلقية(الشكل 1a)مشابهًا لعمليات زرع الماوس السينيجينية فيما يتعلق بشكل وحجم الجزر(الشكل 1b،ج). الشكل 1d،ه يظهر زرع نموذجي مع مخطط مفصل يبين موقع شق الجانبي (الشكل 1f) وتشتت الجزر في غرفة العين (الشكل 1g) والنتيجة التمثيلية من الجزر الماوس المحقونة (الشكل 1h) أو الجزر البشرية (الشكل 1i). وكان معدل تطعيم الجزر البشرية أقل عموما (~ 30 في المائة) من تلك الجزر الماوس (50-70٪). ومن الأسباب المحتملة لهذا التناقض أن توافر الجزر البشرية لا يمكن التنبؤ به، وعادة مع إشعار بيوم واحد فقط، وأيضا أن الجزر التي تم الحصول عليها تختلف في عمر المتبرع، مؤشر كتلة الجسم المانحة، النقاء (45٪-86٪)، ووقت ثقافة ما بعد الدوام (2-5 أيام). في المقابل، يمكن تخطيط عزل الجزر من الفئران بسهولة. تم عزل هذه الفئران من 6-8 أسابيع (أي، الشباب البالغين) مع نقاء عالية وقصيرة، أوقات الثقافة بين عشية وضحاها. وينبغي النظر في هذه التناقضات بين الماوس والطعوم البشرية الجزر عند تفسير النتائج.
في التصوير الفلوري في الجسم الحي تعرض لطعوم الجزر البشرية للخطر بسبب تداخل كبير من الأنسجة autofluorescence (الشكل 4). تم إعاقة التصور لعملية إعادة الزرع من الطعوم الجزرية البشرية زرع ACE بواسطة وكلاء التصوير باستخدام الأطوال الموجية التقليدية في الطيف المرئي من قبل انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء وارتفاع مستوى الفلورة الطبيعية الجزرية ، يتضح من صور من λ-scan في نطاق طيفي من 500-700 نانومتر(الشكل 4a)أو من قبل كاشف PMT غير لديها حساسية مع مرشح للكشف عن dextran TR (610-675 نانومتر) (الشكل 4b). لم يلاحظ هذه الخلفية العالية في الطعوم جزيرة الماوس (الشكل 4c). أظهر عامل التصوير الصادر عن NIR Angiosense 680 نسبة إشارة إلى خلفية أعلى بشكل واضح بسبب انخفاض الضوضاء في الخلفية في نطاق NIR 690-730 نانومتر (الشكل 4d، الشكل 3a). ويمكن استخدام التسجيل الإضافي لقناة "غير مستخدمة" (أي 500-550 نانومتر) في خطوة لاحقة لمعالجة الصور لإزالة الضوضاء الخلفية المتبقية الناجمة عن الفلورة التلقائية الطبيعية في الجزير. 2-photon/confocal التصوير الإعداد(الشكل 2D–و)مماثلة لتلك الموصوفة سابقا6، باستثناء لاستخدام 900 نانومتر 2- الفوتون الإثارة والكشف عن الفلورانس 680, autoflusorescence, وقنوات الطماطم مع PMTs غير القطاعات 1-3(الشكل 2d). فمن المستحسن لقياس قوة انتاج الليزر الوصول إلى عينة لكل إعداد المجهر(الشكل 2e). علاوة على ذلك ، يوصى في البداية صورة الجزر المطعمة مع تنظير مجسم(الشكل 2a–ج) ، والتي ستساعد على اختيار الجزر ذات الاهتمام وتجنب صور المجهر 2-photon لعملية زرع فاشلة.
وكان الغرض من استخلاص البيانات الكمية من العديد من الصور هو إزالة التحيز المحتمل في اختيار البيانات والحصول على القوة الإحصائية اللازمة للكشف عن تأثير مشروع عند مقارنة التجارب. وشمل القياس الكمي من التصوير الفلوري من الجزر البنكرياسية عدة خطوات, كل منها قد أثرت على النتائج في آخر. هنا، تم استخدام برامج التصوير التفاعلي. وهو يحتوي على ميزات تسمح بالتصور من حجم الصور والكائنات وتحديد الكائنات وفقا لMORPHOLOGY أو كثافة. يوضح الشكل 3 الخطوات المختلفة في تجزئة الصورة. إزالة autofluorescence عن طريق طرح قناة "autofluorescence" تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء (الشكل 3a،ب). تم تعريف حدود جزيرة تسمى "قناع الجزر"(الشكل 3c)والقنوات المقابلة(الشكل 3d)يدويا. تجزئة إشارة الطماطم في الأوعية الدموية جزيرة وكبسولة جزيرة (الشكل 3 و,ز) وتقديم السطح النهائي (الشكل 3e,ح,ط) تم استخدامها لاستخراج البيانات الكمية.
ويبين الشكل 5 جلسة تصوير طولية تمثيلية لنفس الطعم البشري في 2 أسابيع، وشهرين، و5 أشهر، و8 أشهر بعد الزراعة في أيس للإيماءة. روزا- الطماطم. Rag2-/- الماوس المتلقي. يتضح هي أقصى كثافة الإسقاطات (MIP) صور من البيانات الخام المسجلة أصلا(الشكل 5a)،الصور المعالجة بعد إزالة autofluorescence جزيرة(الشكل 5B-ه، و-ط) ، والكائنات جزيرة مجزأة بما في ذلك كبسولة(الشكل 5ي ، م) أو الأوعية الدموية جزيرة تشكيل mt+ الخلايا المتلقية (أحمر ، الشكل 5ن -س)ومجموع الأوعية في الجزر (الأخضر، الشكل 5n–q).
الشكل 1: زرع الجزر البنكرياسية في الغرفة الأمامية للعين.
(أ) إعداد الزرع يظهر الماوس المُجَدَّد مثبتًا في حامل الرأس المجسم والعين المكشوفة (inset) بجوار حقنة هاملتون المعدة الثابتة على الطاولة ومنظار الميكروكروسكوب المُستعد لاختيار الجزر الماوس (ب) أو الجزر البشرية (ج). (د)وضعية انتظار لقنية العين المحملة بال Islets. (ه) زرع في العملية، و (و) رسم تخطيطي لشق واحد الجانبي يستخدم لرفع بعناية حتى القرنية مع غيض من كانية العين والاستغناء الجزر في الغرفة الأمامية (ز). صورة العين مباشرة بعد حقن الجزر الماوس (ح) أو الجزر البشرية (i). شريط مقياس = 500 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير طعوم جزر البنكرياس المزروعة بـ ACE.
(أ) اختبارية الفلورسنت ستيريو المجهر التصوير الإعداد. Widefield (b) أو صورة الفلورسنت(ج) من B6. روزا-الطماطم الطعوم الجزيرة. (د)مخطط مبسط لمسار ضوء الانبعاثات. LBF: ليزر حجب مرشح (تقسيم شعاع الرئيسي)؛ ليرة لبنانية: تمريرة طويلة; BP: تمرير باند; PMT: Photomultiplier. (هـ)طاقة خرج الليزر تعتمد بقوة على الطول الموجي. الرسم البياني يظهر قوة الانتاج بالليزر الفعلية في واط (W) ذات الصلة لمستوى الطاقة من شعاع الليزر (٪)، وقياس لإعداد المجهر. الدائرة: 800 نانومتر، مربع: 900 نانومتر، مثلث: 1،000 نانومتر. (و)إعداد التصوير التجريبي الذي يظهر الماوس المتلقي مع الجزر المطعمة ACE (إدراج) التي شنت على المرحلة الآلية مجهر تجاري. شريط مقياس = 100 μm الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تجزئة صورة جزيرة بشرية مطعّمة في أيس من NOD. روزا- الطماطم. Rag2-/- الماوس المتلقي.
(أ) التسجيل الأصلي: يظهر عبارة عن عرض ثلاثي الأبعاد لكومة صور لـ Islet بشري مع قنوات مدمجة أو أقسام بصرية من القنوات المنقسمة Angiosense 680 (Ch 1) وororscence (ch 2) والطماطم (ch 3). (ب) تقديم 3D من كومة الصور مع القنوات المدمجة أو المقاطع البصرية مع قنوات الانقسام "Vasculature" (CH 4) و "الطماطم (جميع)" (Ch 5) بعد إزالة الفلوروس. (ج) قناع جزيرة (أصفر). (d) تقديم 3D من كومة الصور مع قنوات مدمجة أو انقسام "أوعية جزيرة" (Ch 6، أبيض)،"الطماطم جزيرة" (Ch 7، أحمر). (ه )الكائن السطحي "جزيرة الأوعية الدموية" التي تم إنشاؤها من ch 6. (و) تقديم 3D من كومة صورة مع قنوات مدمجة "جزيرة vasculature" (ch 6، الأخضر) و"طماطم طماطم الأوعية الدموية"(ch 8، أحمر). (g) تقديم ثلاثي الأبعاد من "كبسولة الطماطم" (Ch 9) بعد طرح القناة CH 7-ch 8 أو المقطع البصري مع القنوات المدمجة "كبسولة الطماطم" (Ch 9, White) ، و vasculature الطماطم جزيرة (CH 8, أحمر), و vasculature جزيرة (ch 6, أخضر). (ح) عرض سطح كبسولة الطماطم (التي تم إنشاؤها من ch 9) و vasculature الطماطم جزيرة (خلق من ch 8). (i)تجزئة الجزر من إشارة الجزر الخلفية البشرية التي تظهر اختيار "منطقة الاهتمام"(يسار) و الكائن السطحي المجزأ (الوسط) مقارنة بكثافة القناة (يمين). (ي)استرجاع البيانات من علامة التبويب الإحصاءات. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفلورة الذاتية من الجزر البشرية.
تم زرع الجزر البشرية (a،b،d) أو جزر الماوس B6 (ج) في ACE من NOD. Rag2-/- أو B6 الفئران المتلقي وحقنها مع دكستران TR(أ–ج) أو Angiosense 680 وكيل التصوير (د) لتصور الأوعية الدموية. (أ) λ-scan من الكسب غير المشروع في الجزر البشرية في نطاق من 500-700 نانومتر مع 2-photon الإثارة في 900 نانومتر. أقصى صورة إسقاط الصورة (MIP) صورة الإنسان (ب) أو الماوس جزيرة الكسب غير المشروع (ج) متحمس في 900 نانومتر وكشف مع مرشح TR (610-675 نانومتر) من NDD. (د) MIP من الكسب غير المشروع جزيرة بشرية متحمس في 900 نانومتر والكشف مع Angiosense 680 مرشح (690-730 نانومتر) من NDD. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الجزر البشرية المزروعة يتم إعادة تجميعها تدريجيا وتغليفها mT التعبير عن الخلايا من أصل المتلقي.
الجزر البشرية المزروعة في غرفة العين الأمامية من NOD. روزا- الطماطم. Rag2−/− فئران المتلقي، تم تصويرها مراراً وتكراراً لمدة تصل إلى 8 أشهر. تم حقن أنجيوسينس 680 لتصور الأوعية الدموية. (أ)أقصى إسقاطات الكثافة (MIP) من البيانات الأصلية المسجلة RAW من الانقسام (الأوعية الدموية، وffluorescence، mT) أو القنوات المدمجة وإشارة ضوء backscatter في 5 أشهر بعد الزراعة. MIPS من الأوعية الدموية الكلي وحده (ب–ه )أو دمجها مع الفلورسي الطماطم المستهدفة بالغشاء (mT) (f–i) بعد إزالة الفضان الذاتي في جزيرة (الأخضر، أ). الاداءات 3D من تجزئة طماطم كبسولة الجزر (ي–م) و طماطم طماطم الأوعية الدموية (أحمر) أو مجموع الأوعية الدموية في الجزير (الأخضر) (ن–س) في النقاط الزمنية المشار إليها بعد الزراعة. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تقديم طريقة لدراسة عملية تطعيم خلية البنكرياس في البنكرياس البشري من خلال مراقبة مشاركة الأنسجة المتلقية والمتبرعة. بعد عملية جراحية طفيفة التوغل زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية من العين الماوس المناعي، والماوس يتعافى بسرعة في غضون دقائق بعد الجراحة. يتم تنفيذ الإجراء على عين واحدة. عموما، من 5-7 أيام بعد الزرع فصاعدا يتم شفاء القرنية بما فيه الكفاية لأداء التصوير داخل الرحم.
في هذا البروتوكول، ونوعية الطعوم الجزر البشرية أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تختلف جودة الجزر البشرية وبالتالي نتيجة الزرع حسب عمر المتبرع ، مؤشر كتلة الجسم ، وعملية العزل ، وكذلك وقت ثقافة الجزر قبل وبعد الوصول. وقد استخدمت الجزر البشرية المعالجة من البنكرياس المتبرع بالأعضاء المعتمدة للزراعة السريرية وأغراض البحث بموافقة المتبرعين. تم الحصول عليها بعد عملية هضم البنكرياس وتنقية جزيرة وصفها في مكان آخر12. مماثلة ل جزر المورين المعزولة، هذه الجزر تخضع لعدد من الاعتداءات الخلوية مثل الإقفاري، والإجهاد الميكانيكي، وفقدان البروتينات الطابق السفلي، وتعطيل جزئي للخلايا البطانية داخل جزيرة (ECs) خلال عملية الهضم الأنزيميةخطوة 14،15. على الرغم من التحسن المستمر في ظروف الثقافة واستعادة أعداد كبيرة من الجزر البشرية عالية الجودة ، فإن وقت زرع لا يزال عاملا حاسما. خلال الأيام الأولى من الثقافة، والجزر البشرية تظهر خسارة كبيرة من ECs داخل الجزيرة وعلى ستة أيام من الثقافة يمكن الكشف عن الهياكل البطانية الصغيرة فقط في قلب جزيرة16. هذا فقدان داخل الجزر الخلايا البطانية يمكن أن تشكل عاملا حاسما في الحد من تطعيم الجزر البشرية، لأن المانحة ECs جزيرة هي اللاعبين المهمين في عملية revascularization17.
الحفاظ على العقم أثناء عملية الزرع أمر بالغ الأهمية لتجنب التهابات العين في NOD المناعية. روزا- الطماطم. Rag2-/- الفئران. عادة، يتم إجراء عمليات زرع تحت ظروف نظيفة باستخدام القفازات، ومعطف المختبر، غطاء الرأس، وقناع الفم، ولكن ليس داخل خزانة السلامة البيولوجية. جميع الحلول المستخدمة هي معقم تصفية، والمحاقن، cannula، أنابيب، والشاش يتم شطف في الإيثانول 70٪. أقفاص الاستيقاظ هي autoclaved. في حين لا يمكن ضمان العقم الكامل بسبب التعامل اليدوي مع الماوس أثناء الإجراء ، فإن تلوث الجزر أو التهابات العين لم تكن مشاكل مع هذا الإجراء.
التخدير المستقر والكافي هو عامل مهم وحاسم للحد من حركات العين والانجراف خلال انخفاض إطار الحصول على البيانات، ويمكن أن تختلف الفعالية بين مختلف وكلاء التخدير18. تحت الضوء، التخدير الأيزوفلوران العام، تتحرك العين أحيانا بطريقة بطيئة المتداول وزيادة عمق التخدير (من 1-2٪ ) يمكن أن تقلل عموما من حركات العين. الميزة الواضحة لاستخدام التخدير القابل للاستنشاق هي تأثيره السريع ووقت التعافي. تجدر الإشارة، ومع ذلك، أن استخدام isoflurane قد يغير إفراز الأنسولين19.
إن تحليل الصور وتجزئة الصور أو تقسيم صورة إلى مناطق متعددة، أمر صعب ويخضع للتحيز المحتمل في اختيار البيانات20. يهدف التقسيم إلى تحديد كائنات مثل "الأوعية الدموية في الجزر" لتحديد الكم. وهنا، طُبقت أساليب تستند إلى حد الكثافة على مناطق مختارة (أي "كثافة مطلقة") أو اختلافات في الكثافة للعثور على حواف (أي "طرح الخلفية"). حاليا، لا توجد حلول عالمية لتجزئة في المجهر الفلورسنت. ويتمثل أحد النهج في تجربة البرامجيات التجارية التي تدعم مجموعة من الطرق. إذا فشل العتبة بسبب تباين كثافة الخلفية، فإن التغييرات الصغيرة في إعدادات التقاط الصور قد تحسن نتائج التجزئة.
وهناك قيد على الطريقة يكمن في حقيقة أن الكسب غير المشروع البشري يتم استبداله بسرعة أكبر من قبل الخلايا المتلقية، وفي الواقع، إعادة تشكيلها تماما من قبل الخلايا البطانية المتلقي الماوس. وهذا من شأنه أن يمنع الدراسات من التفاعلات الخلوية البشرية إذا كان الهدف هو دراسة بالتبني نقل الخلايا المناعية البشرية المهاجرة إلى parenchyma جزيرة عبر التفاعلات مع الخلايا البطانية البشرية. ومع ذلك ، في كل من الماوس والطعوم الجزرية البشرية ، يحدث إعادة اصلق مماثل من المتلقي ويتبع خطة 3D التشريحية المختلفة المحددة للأنواع.
وقد استمرت معدلات نجاح العلاج بيتا استبدال الخلايا فيالتحسن. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات مختلفة في تقييم كفاءة تطعيم الجزر والبقاء على قيد الحياة في الجسم الحي دون حل بسبب عدم وجود تكنولوجيات التصوير المناسبة داخل الرحم. غرفة العين الأمامية هي موقع زرع مفيدة، ودعم المتكررة وطويلة الأجل في التصوير الجسمي للخلايا الجزيرة لدراسة مورفولوجيا الجزر، وأنماط الأوعية الدموية، وظيفة الخلية بيتا، وموت الخلايا بيتا في القرار الخلوي.
بروتوكول لدراسة عملية تطعيم زرع الجزر البشرية في موقع زرع ACE ذكرت هنا يسمح لرصد طولي من الطعوم الجزر البشرية مع دقة أعلى بكثير من تلك التي تم الحصول عليها مع منصات أخرى بديلة طولية مثل التصوير بالرنين المغناطيسي21,22, PET23, SPECT24, أو Bioluminescence25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد أيد هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث السويدية، منطقة البحوث الاستراتيجية Exodiab، Dnr 2009-1039، والمؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية Dnr IRC15-0067 إلى LUDC-IRC، والجمعية الملكية فيزيوغرافيا في لون، Diabetesförbundet وبارنديابيبيتسفروفوندي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al.
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
