Summary
Bu protokol, farelerde aterosklerotik yükü analiz etmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü farklı hayvanlardaki aterosklerotik lezyonların bolluğunu, yerini ve boyutunu karşılaştırmak için kullanabilirler.
Abstract
Apolipoprotein E (Apoe) veya düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan hiperlipidemik fareler, ateroskleroz araştırması için en sık kullanılan iki modeldir. Çeşitli genetik faktörlerin ve farklı hücre tiplerinin aterosklerotik lezyon oluşumu üzerindeki etkisini incelemek ve yeni tedavilerin gelişimini test etmek için kullanılırlar. Tüm aortun izolasyonu, eksizyonu ve Yağ Kırmızı O boyalı aterosklerotik lezyonların miktarının belirlenmesi aterosklerotik yükü değerlendirmek için kullanılan temel morfometrik yöntemlerdir . Bu protokolün amacı, Oil Red O ile fare aortlarındaki aterosklerotik lezyonları diseke etmek, perfüzyon-fix, izole etmek, boyamak, görüntülemek ve analiz etmek için optimize edilmiş, adım adım cerrahi bir yöntemi tanımlamaktır. Aterosklerotik lezyonlar tüm aort ağacının herhangi bir yerinde oluşabildiğinden, tüm bu aort Yağı Kırmızı O boyama yöntemi, tüm aorttaki lipit yüklü plakları ve tüm dalları tek bir farede değerlendirme avantajına sahiptir. Yağ Kırmızı O boyamasına ek olarak, taze izole edilmiş bütün aortlar çeşitli in vitro ve in vivo deneyler ve hücre izolasyonları için kullanılabilir.
Introduction
ABD'de önde gelen bir mortalite nedeni olan koroner arter hastalığına genellikle arteriyel duvarların içinde plak birikmesine yol açan bir süreç olan ateroskleroz neden olur1. Hiperlipidemiye eğilimli Apee ve Ldlr eksikliği olan fareler, ateroskleroz ve komplikasyonlarının araştırılmasında ve tedavilerin geliştirilmesinde merkezidir2,3,4,5. Aterosklerotik lezyonların en face aorttan nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde genetik manipülasyonun etkisini değerlendirmek için önemli bir son nokta analizidir. Ayrıca, aterosklerotik hastalığın başlamasını, ilerlemesini ve regresyonunu etkilemek için tasarlanmış yeni tedavilerin incelenmesine yardımcı olur. Aterosklerotik lezyonlar aort ve dallarının herhangi bir yerinde oluşabilir (yani, göğüsteki brakiyosefalik, karotis ve subklaviyen arterlerin yanı sıra diyaframın altındaki böbrek, yaygın iliak ve femoral arterler)6. Ateroskleroz yükünün kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesi ve uygun tedavi, farklı yerlerdeki hastalık yükünün değerlendirilmesini gerektirir ve bu da genellikle göz ardı edilen bir zorluktur.
Bu protokol, açılmamış bir bütün aort ile başlayıp yüz hazırlığına kadar ilerleyen aterosklerotik lezyonların kapsamlı bir analizinin tek bir farede nasıl yapılacağını açıklar. Açılmamış bütün aort Yağı Kırmızı O boyaması, tüm aort ve dallarındaki lipit yüklü plakların hızlı, kalitatif bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, en yüz hazırlığı fare aortundaki aterosklerotik lezyon dağılımının nicel bir değerlendirmesini sağlar.
Teknik, Apoe-/- hiperlipidemik arka plan üzerinde düz kas hücresine özgü TGFβR2 delesyonuna sahip 8 haftalık fareleri kullanır (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; bundan böyle TGFβR2iSMC-Apoe fareleri olarak anılacaktır) ve çöp arkadaşı Apoe-/- kontrolleri (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; bundan böyle Apoe-/- fareler olarak anılacaktır). Hayvanlar, çalışma materyalleri olarak yüksek kolesterollü yüksek yağlı bir diyette (HCHFD) 16 hafta boyunca tutulur7. Çalışma sonlandırma sırasında, açılmamış bütün aortlar, lipid yüklü plakların kalitatif değerlendirmesi için Yağ Kırmızı O ile boyanır ve görüntülenir (tüm ana dallar dahil). Aortlar en yüz hazırlığı ile kesilir ve tüm aterosklerotik lezyonlar görüntülenir ve ölçülür. Bu protokol, Apoe-/- veya Ldlr-/- hiperlipidemi fare modellerinde aterosklerotik lezyon gelişimini incelemek için kullanılabilir ve genel aortla ilişkili vasküler biyoloji uygulamalarına genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
mT/mG (stok no. 007676) ve Apoe-/- (stok no. 002052) fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı. Myh11-CreERT2 fareleri Stefan Offermanns'ın bir hediyesiydi (Jackson Laboratuvarı'ndan stok numarası 019079 olarak temin edilebilir). Tgfbr2fl/fl fareleri Harold L. Moses'tan (Vanderbilt Üniversitesi) elde edildi. Tüm hayvan prosedürleri, Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak gerçekleştirildi.
1. Fareler
- MYH11-CreERT2; mT / mGf / f üretin; Apoe-/- ve MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- daha önce tarif edildiği gibi fareler7. Mutant suşları C57BL/6J arka planına on nesilden fazla bir süredir yetiştirin.
NOT: Myh11-CreERT2 Cre fare hattı, düz kas hücrelerinin vasküler homeostaz ve vasküler patolojideki rolünü incelemek için güçlü bir araç sağlar. Cre aleli Y kromozomuna yerleştirilir; Bu nedenle, dişi fareler bu yapıyı ifade etmez.
2. Fare genotipleme, tamoksifen indüksiyonu ve yüksek kolesterol yüksek yağlı diyet beslenmesi
- Fare kulağı DNA ve PCR analizini kullanarak fare genotiplemesi gerçekleştirin. Fare kulağı DNA'sı, üreticinin talimatlarına göre kan ve doku DNA izolasyon kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak izole edilmelidir. PCR primerleri Tablo 1'de listelenmiştir.
- 6 haftalık MYH11-CreERT2;mT/mGf/f'de 5 gün boyunca tamoksifen enjeksiyonu ile Cre-Lox rekombinasyonunu 1 mg/gün i.p.'de indükleyin; Apoe-/- ve MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- erkek fareler.
- 8 haftalık erkek fareleri (tamoksifen tedavisinden 2 hafta sonra) 16 hafta boyunca HCHF diyetine (% 40 kcal yağı,% 1.25 kolesterol,% 0 kolik asit) yerleştirerek aterosklerozu indükleyin.
3. Reaktifler ve diseksiyon aleti hazırlama
- Stok Yağı Kırmızı O çözeltisi preparatı: 100 mL izopropil alkol içinde 1 g Yağ Kırmızı O çözün.
- Çalışma Yağı Kırmızı O çözeltisi hazırlama: 24 mL stok Yağ Kırmızı O çözeltisini 16 mL dH2O ile karıştırın. seyreltilmiş Yağ Kırmızı O'yu 0,45 μm steril şırınga filtreleri ile filtreleyin (çözelti sadece 1-2 saat boyunca iyidir).
- % 60 izopropil alkol preparatı: 60 mL izopropil alkolü 40 mL dH2O ile karıştırın.
- 1x DPBS preparatında% 4 formaldehit: 30 mL 1x DPBS'de 10 mL% 16 formaldehit seyreltin.
- Tüm diseksiyon aletlerini %70 etanol ile temizleyin (Şekil 1).
4. Ötenazi (Şekil 2A)
- Ötanaziden önce farenin ağırlığını ölçün.
- İntraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile fareyi ötenazi yapın (her mililitre 10 mg / mL ketamin ve 2 mg / mL ksilazin içerir).
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin (göbek tarafı yukarı bakacak şekilde).
5. Göğüs ve karın boşluğunun açılması ve kalp perfüzyonu (Şekil 2B)
- 10 mL 1x DPBS ile 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. 25 G iğneli kapak. Şırınga kalbi yıkamak için kullanılacaktır.
- Cildi cımbızla tutun (Stil 5) ve karın tabanından boynun üstüne kadar ince makasla kesin.
- Göğüs kafesinin altındaki karın duvarını açın.
- Sternumu cımbızla kaldırın (Stil 5) ve diyaframı kesin, ardından göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.
- Kalbin sağ atriyumunda küçük bir kesi yapın.
- Apikal sol ventrikül ponksiyonundan yavaşça 10 mL 1x DPBS enjekte ederek perfüze edin. İyice perfüze edildikten sonra, karaciğer ve böbrek açık kahverengi renkte olur.
- Malzemeyi emmek için dokunmamış bir sünger kullanarak yabancı kan ve sıvının göğüs boşluğunu temizleyin.
6. Aort ve dalların izolasyonu (Şekil 2C)
- Organları (yani akciğer, karaciğer, dalak ve gastrointestinal ve üreme organları) çıkarın ve kalp, böbrek ve aortu yerinde sağlam bırakırken cımbız (Stil 5) ve ince makas kullanarak klavikulayı kesin.
NOT: Kalbi veya herhangi bir büyük kan damarını yırtmadığınızdan emin olun. - Fareyi bir stereomikroskop altına yerleştirin.
- Brakiyosefalik arter, karotis arterler, subklavian arterler, renal arterler, ortak iliak arterler ve femoral arterleri içeren aort ve aort dallarını cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak disseke eder.
NOT: Aort dallarını parçalara ayırırken dehidrasyonu önlemek için aortu ıslak, dokunmamış bir süngerle örtün. - Aort ve aort dallarının etrafındaki adventitial yağ ve bağ dokusunu cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak dikkatlice disseke edin ve çıkarın.
NOT: Anevrizma hiperlipidemi faresinde inflamasyon belirgin olduğundan, adventitiyi çıkarmak zordur. Aort ve aort dallarını yırtmamaya veya kesmemeye dikkat edin. Bu adım pratik ve sabır gerektirir.
7. Kalp ve aortun sabitlenmesi (Şekil 2D,E)
- DPBS'nin 1 katında 10 mL% 4 formaldehit içeren 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın. 25 G iğneli kapak.
DİKKAT: Formaldehit tehlikelidir. Bu kimyasalla çalışmadan önce MSDS'yi okuyun. Eldiven ve güvenlik gözlüğü takın ve seyreltme çözümlerini bir duman başlığı içinde üretin.
NOT: %4 formaldehit çözeltisi zamanla bozulur. Fiksasyon için taze yapılmış% 4 formaldehit kullanmak önemlidir. - Vasküler ağacı apikal sol ventrikül ponksiyonu yoluyla yavaşça 10 mL% 4 formaldehit enjekte ederek sabitleyin.
NOT: Formaldehit fiksasyonu, hücre kültürü, FACS analizi ve tek hücreli RNA dizileme analizi gibi çeşitli aşağı akış uygulamalarına müdahale eder. Aort bu uygulamalardan herhangi biri için kullanılacaksa bu adımı atlayın. - Malzemeyi emmek için herhangi bir yabancı sıvının göğüs boşluğunu dokunmamış bir süngerle temizleyin.
- Kalbi cımbızla tutarak (Stil 4) ve mikro diseksiyon yay makası kullanarak kalbi aorttan ayırın.
NOT: Bu adımdan sonra en face Oil Red O boyama işlemini gerçekleştirmek için aortun ex vivo yerine in situ olarak kesilmesi ve bölüm 8'e geçilmesi önerilir. Bu, en yüz aortunun düz durmasını kolaylaştırır. - Aortu ve majörünü karotis arterin 1 mm üstünden femoral arterin sonuna kadar cımbız (Stil 4) ve yay makası kullanarak izole edin ve eksize edin.
- Kabı bir balmumu Petri kabına veya 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
8. Yağ Kırmızı O boyama ve açılmamış bütün aortun görüntülenmesi (Şekil 3)
- Minutien pimleri kullanarak kabı bir balmumu Petri kabına sabitleyin (Şekil 3A).
- Gemiyi 1x DPBS ile bir kez durulayın.
- Petri kabına 25 mL taze Yağ Kırmızı O çözeltisi dökün (Şekil 3B).
NOT: (1) İzopropanol tehlikeli ve yanıcı bir sıvıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. (2) Yağ Kırmızı O çözeltisi kolayca çökelebilir. Çökelmiş parçacıklar sonraki boyamaya müdahale edebilir. Kullanmadan önce Yağ Kırmızısı O çözeltisini 0,45 μm'lik bir filtreden filtreleyerek çökeltiyi çıkarmak önemlidir. (3) Taze Yağ Kırmızı O çözeltisi hazırlamak ve kullanılmayan herhangi bir çözeltiyi atmak en iyisidir. (4) Kırmızı O Yağına ek olarak, Sudan IV, lipitlerin, trigliseritlerin ve lipoproteinlerin boyanması için kullanılan başka bir kimyasal bileşiktir. Bununla birlikte, Yağ Kırmızı O yavaş yavaş Sudan IV'ün yerini almıştır, çünkü Yağ Kırmızı O tarafından üretilen kırmızı renk daha yoğundur ve bu nedenle yağın görülmesini çok daha kolay hale getirebilir. - Aortu oda sıcaklığında (RT) 60 dakika bekletin. Yağ Kırmızı O, lipit bakımından zengin plak kırmızısını boyar ve plak içermeyen diğer alanları soluk renkte bırakır.
- RT'de% 60 izopropanol ile 20 dakika boyunca bir kez yıkayın.
NOT: Aşırı durulama plağı lekeleyebilir. - İzopropanolü çıkarmak için aortu 3x dH2O ile 5 dakika durulayın.
- Bir stereomikroskop altında, cımbız (Stil 4) ve yay makası (Şekil 3C, D) kullanarak aort çevresindeki tüm perivasküler yağ dokusunu nazikçe temizleyin.
NOT: Boyama sonrası aort ve dallarının etrafındaki tüm perivasküler yağ dokusunun temizlenmesi önemlidir, çünkü Yağ Kırmızısı O boyalı perivasküler yağ dokusu yanlış arka plan oluşturabilir ve plak morfometrisine ve plak alanı miktarına müdahale edebilir. Aort duvarının bir kısmını çıkarmadığınızdan emin olun. Balmumu kabını, temizlik sırasında lekeli aortu kaplayana kadar dH2O ile doldurun. Bu adım pratik ve sabır gerektirir. - Gemiyi temiz, cam mikroskop slaytına aktarın.
- Işık mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak dijital mikrograflar edinin. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri, tercihen etiketli görüntü dosyası biçiminde (TIFF) kaydedin (Şekil 3E).
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Aortun kurumasını önlemek için, kabı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun. 4 °C'de saklayın.
9. En yüze aort montajı (Şekil 4, Şekil 5)
- Gemiyi bir balmumu Petri kabına aktarın ve aortu kaplayana kadar 1x DPBS ile doldurun.
- Bifurkasyonlardan 1-2 mm sonra abdominal aorttaki karotis, aort arkının subklaviyen arterlerini ve iliak arterleri ayırın. Renal arterleri keser. (Şekil 4A)
- Aort preparatını iç eğrilik boyunca (Şekil 4B1) ve tek başına iliak arterleri (Şekil 4B2) mikro diseksiyonlu yay makası ile uzunlamasına keserek açın.
- Aort kemerinin üç dalını (yani manominat, sol ortak karotid, sol subklaviyen arter) daha büyük eğrilik boyunca, mikro diseksiyonlu yay makası ile iç eğriliğin taban seviyesine (x-mark) (Şekil 4B3-B8) kadar kesin.
- Aortu düz (lümen tarafı yukarı bakacak şekilde) minütien pimli bir balmumu kabına sabitleyin ve kurumasını önlemek için aortu kaplayana kadar 1x DPBS uygulayın (Şekil 4C).
NOT: (1) Yuvarlanmış aortu düz yapmak ve gerilmeden yüzüne sabitlemek önemlidir. Bu adım aterosklerozun ciddiyetine bağlı olarak birkaç gün sürecektir. (2) Apoe-/- veya Ldlr-/- hayvanlarından gelen aortlar için, aort düzlüğünün 24 saat boyunca sabitlenmesi önerilir. (3) Protokol burada duraklatılabilir. - Cam mikroskop slaytlarını %70 etanol ve hassas görev silecekleri ile temizleyin (Şekil 5A).
- Aortu temiz bir cam mikroskop slaydına aktarın ve başka bir temiz cam mikroskop slaydına 15 damla optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği koyun (Şekil 5B).
- OCT bileşiği olan cam mikroskop slaytını aort üzerine dikkatlice yerleştirin ve slaytta hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin (Şekil 5C).
- Slaytları örnek adlarla etiketleyin (Şekil 5D).
NOT: Monte edilmiş en yüz aort kızakları, nem odasında 4 °C'de birkaç ay boyunca saklanabilir.
10. En face aortun görüntülenmesi ve lezyon miktarının belirlenmesi (Şekil 6)
- Işık mikroskobuna bağlı bir kamera kullanarak dijital mikrograflar edinin. Yüksek çözünürlüklü görüntüleri, tercihen etiketli görüntü dosyası biçiminde (TIFF) kaydedin (Şekil 6A).
- En yüzün boyanmış tüm aortunun görüntülerini ImageJ yazılımı ile donatılmış bir bilgisayara aktarın.
- ImageJ'de, "Serbest seçim" aracını seçin ve "Alt" tuşuna (Windows PC için) veya "Shift" tuşuna (Mac için) basarken tüm Yağ Kırmızısı O lekeli plağı manuel olarak (yoğun kırmızı noktalar) daire içine alın. Ardından, sonuç penceresinde lezyon alanlarını görüntülemek için "Analiz Et" menüsünde "Ölç" ü tıklayın (Şekil 6B solda).
NOT: Aterosklerotik lezyonların nicelleştirilmesinde birkaç tuzak vardır: (1) adım 8.7'den itibaren aort bağlı kalan herhangi bir küçük lekeli adventitial yağ parçası yanlış arka plan verebilir ve plak nicelemesine müdahale edebilir; (2) aort duvarının bir kısmının çıkarılması veya aortun 6.4 ve 8.7. adımlardan zarar görmesi plak miktarının ölçülmesine müdahale edebilir; (3) montajdan sonra aortta oluşan kabarcıklar ve kıvrımlar (adım 9.8) plak miktarına müdahale edebilir; ve (4) aterosklerotik plak bir 3D fenomendir ve 2D düzlemde yapılan ölçümler plağın gerçek boyutunu yansıtmayabilir. En yüz aort plak alanının analizine ek olarak, aort kökündeki, brakiyosefalik arterdeki, yükselen aorttaki ve abdominal aorttaki plak boyutunun ayrı ayrı analiz edilmesi önerilir8. - Aortun dış kenarlık çizgisini daire içine alın ve sonuç penceresinde aort alanını görüntülemek için "Analiz" menüsünde "Ölç" ü tıklayın (Şekil 6B sağda).
- Tüm ölçümleri bir Excel dosyasına aktarın.
- Plak alanının toplam aort alanından oranını hesaplayın ve değeri toplam Yağ Kırmızı O yüzey alanının yüzdesi olarak normalleştirin.
- 8–10 Apoe-/- ve 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe farelerinde plak alanı oranını hesaplayın. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun (Şekil 6C).
- Plak alanı verilerinin başka bir fare grubuna kıyasla oranının istatistiksel analizi için eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi gerçekleştirin. Ortalama değerlerdeki farklılıkları p < 0.05'te anlamlı olarak düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, TGFβR2iSMC-Apoe farelerdeki aterosklerotik lezyonlar HCHF diyetinde 4 ay sonra analiz edildi7. Yaygın ateroskleroza ek olarak, bu fareler daha önce bildirildiği gibi hem torasik hem de abdominal aort anevrizmaları geliştirdi. Apoe-/- farelerle karşılaştırıldığında, TGFβR2iSMC-Apoe farelerinin aort duvarları ciddi ateroskleroz göstererek lezyonların diseksiyonunu zorlaştırdı (Şekil 2C, D, E). Ek olarak, anevrizmalar özellikle ileri insan aort anevrizmalarını anımsatan suprarenal aortun altında geniştir.
HCHFD beslemeli TGFβR2iSMC-Apoe fareden temsili açılmamış bir aort Yağı Kırmızı O boyama görüntüsü Şekil 3E'de gösterilmiştir. Görüntü, hem yükselen hem de abdominal aort anevrizması geliştiren bir TGFβR2iSMC-Apoe faresini göstermektedir ve aort dallarında (burada, brakiyosefalik arter, karotis arter, subklaviyen arterler, iliak arterler, femoral arterler ve renal arterler) hızlandırılmış aterosklerotik lezyon oluşumunu göstermektedir.
Şekil 6A, Apoe-/- ve TGFβR2iSMC-Apoe farelerinin en yüzündeki Oil Red O boyama görüntüsünü göstermektedir. Apoe-/- grubuyla karşılaştırıldığında, TGFβR2iSMC-Apoe fareleri şiddetli anevrizma genişlemesi ve tüm aortun belirgin uzamasını sergiledi.
Şekil 1: Protokolde kullanılan diseksiyon araçları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HCHF diyetinde fareden aort eksizyonu için adım adım protokol.
Bu, yüksek kolesterollü yüksek yağ (HCHF) diyetinde 4 ay boyunca beslenen 24 haftalık bir TGFβR2iSMC-Apoe faresindendir. (A) Ketamin / ksilen anestezisi altında fare. Kesikli çizgiler cildin nerede kesileceğini gösterir. (B) Torasik ve abdominal boşlukları ortaya çıkarmak için farenin diseksiyonu. (C) İç organların (yani akciğer, karaciğer, dalak ve gastrointestinal ve üreme organlarının) dikkatli bir şekilde çıkarılması ve ardından fare aortunun diseksiyon mikroskobu altında maruz bırakılması. (D) Aort boyunca bağ dokularının mümkün olduğunca temiz bir şekilde dikkatli bir şekilde çıkarılması. (E) İzole edilmiş bütün aortun dallarla görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Açılmamış aort yağı kırmızı o boyama ve görüntüleme için adım adım protokol.
(A) Bütün aortun dallarla balmumu Petri kabı üzerine sabitlenmesi. (B) Aortun Yağ Kırmızısı O boyama çözeltisi ile kaplanması. (C) Yağ Kırmızı O boyamasından sonra tüm aortun illüstrasyonu. (D) Temizlikten sonra Yağ Kırmızısı O lekeli bütün aortun illüstrasyonu. (E) HCHF diyetinde 4 ay sonra TGFβR2iSMC-Apoe farelerinin Yağ Kırmızı O lekeli bütün aortunun temsili fotomikrografları. (a') (a)'dan yükselen aortun yüksek büyütmeli görüntüsü ve (b') abdominal aortun (b)' den yüksek büyütmeli görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: En face aort hazırlığı için adım adım protokol.
(A,B) Yağ Kırmızı O ile boyanmış arteriyel ağaç, görüntüleme için aortu düzleştirmek için uzunlamasına açılır. Gemi duvarı boyunca noktalı çizgiler ve sayılar, gemileri açmak için yapılan sıralı kesimleri gösterir. (C) Boyuna bölünür ve bütün aortu Y şeklinde bir balmumu Petri kabına sabitler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: En yüz aort montajı için adım adım protokol.
(A) Cam mikroskop slaytlarının %70 etanol ile nazikçe temizlenmesi ve temiz laboratuvar mendilleri ile kurutulması. (B) OCT bileşiğinin bir cam mikroskop slaytının yüzeyine uygulanması, daha sonra en face aort düzlüğünün diğer cam mikroskop slaytına yayılması. (C) Cam mikroskop slaytının en face aort numunesinin üzerine OCT bileşiği ile nazikçe yerleştirilmesi. (D) Slaytın örnek adıyla etiketlenmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: En face aort görüntüleme ve aterosklerotik lezyon ölçümü için adım adım protokol.
(A) HCHF diyetinde 4 ay sonra Apoe-/- ve TGFβR2iSMC-Apoe farelerinden en yüz aortlarının mikrofotografları ve Yağ Kırmızı O ile boyanmış (B) Aterosklerotik lezyonların bilgisayar destekli nicelleştirilmesi sürecini gösteren görüntüler. (C) Lezyon alanı miktarı: % lezyon alanı, toplam aort yüzeyinin % 'si olarak Yağ Kırmızı O-boyalı anlamına gelir. Ortalama olarak gösterilen tüm veriler ± SEM (***p < 0.001; eşlenmemiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi; Apoe-/- fareler için n = 9 ve TGFβR2iSMC-Apoe fareleri için n = 9). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| MYH11-CreERT2 | 5'-TGA CCC CAT CTC TTC ACT CC-3' | |
| 5'-AAC TCC ACG ACC ACC TCA TC-3' | ||
| 5'-AGT CCC TCA CAT CCT CAG GTT-3' | ||
| Tgfbr2fl/fl | 5'-TAA ACA AGG TCC GGA GCC CA-3' | |
| 5'-ACT TCT GCA AGA GGT CCC CT-3' | ||
| Arjantin | 5'-GCC ETIKETI CCG AGG GAG AGC CG-3' | |
| 5'-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3' | ||
| 5'-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3' | ||
Tablo 1: Genotipleme primerleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apolipoprotein E (Apoe) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (Ldlr) eksikliği olan fareler, aterosklerozun gelişimini ve tedavisini incelemek için yararlıdır. Araştırmacılar, genetik ve terapötik manipülasyonların, tüm aortun Yağ Kırmızı O boyamasını kullanarak aterosklerozla ilişkili hastalıkların başlaması, ilerlemesi ve regresyonu üzerindeki etkisini değerlendirebilirler9. Aort Yağı Kırmızı O boyama ve lezyon miktarının belirlenmesi ateroskleroz araştırmalarında altın standart son noktadır. Bu teknik ucuzdur ve özel ekipman gerektirmez10. Bununla birlikte, yüksek kaliteli Yağ Kırmızı O lekeli doku elde etmek kolay değildir. Önceki deneyimlere dayanarak, bu protokolde üç kritik adım vardır ve tüm prosedür pratik ve sabır gerektirir. İlk kritik adım, Yağ Kırmızı O boyamasından önce ve sonra aort ve dalları etrafındaki tüm perivasküler yağ dokusunu diseke etme, çıkarma ve temizleme yeteneğidir (Şekil 2D, Şekil 3C, D). İkinci önemli adım, taze yapılmış ve filtrelenmiş Yağ Kırmızı O çözeltisinin hazırlanmasıdır. Son olarak, cam mikroskop slaytlarına monte edilmeden önce en yüzlü aortun bir balmumu kabı üzerinde düz durması önemlidir (Şekil 4C, Şekil 5B, C).
Diğer Oil Red O boyama protokolleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem açılmamış aort ve en face aorttaki lipit yüklü plakların tek bir fareden kalitatif ve kantitatif değerlendirmelerini sağlar. Açılmamış Yağ Kırmızı O boyamasının ilk kalitatif değerlendirmesi, aorttaki plak dağılımı ve plak boyutunun yanı sıra en face aortun nicelleştirilmesinden önceki tüm dallar hakkında genel bir fikir vermektedir. Çalışmanın sınırlamaları, (1) 3D aterosklerotik plakların 2D karşılaştırılması ve analizinin aterosklerotik plak hacimlerinin gerçek boyutunu yansıtmaması, (2) aterosklerotik lezyon miktarının zaman alıcı olması ve (3) hayvan kurban edilmesini gerektirmesidir.
Aort başarılı bir şekilde izole edildikten sonra, moleküler çalışmalar için çok çeşitli tahliller için kullanılabilir. Örneğin, reginal aort morfolojisini karakterize etmek için biyomekanik çalışmalar ve histolojik analizler için kullanılabilir11. Ek olarak, kullanıcılar endotel hücrelerini ve düz kas hücrelerini hücre kültürü, FACS analizi ve tek hücreli RNA dizileme analizi için taze izole edilmiş bütün aorttan izole edebilirler. Özetle, bu protokol farelerde aterosklerotik yükü analiz etmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü hayvanlar arasındaki aterosklerotik lezyon bolluğunu, yerini ve boyutunu karşılaştırmak için kullanabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, kısmen, NIH hibesi P30AR070253 (P.-Y.C.) ve HL135582 (MS) kapsamında sağlanan Ortak Biyoloji Konsorsiyumu Microgrant tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan fareleri korudukları için R. Webber ve L. Coon'a minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | DENVILLE | C2170 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 16% Formaldehyde | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% ethanol | VWR | RC2546.70-5 | To clean the dissection tools |
| Black dissection wax | CR Scientific | C3541 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | Solvent for Tamoxifen |
| DNeasy Blood & Tissue kit | QIAGEN | 69506 | To isolate DNA from mouse ear |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | |
| High cholesterol high fat diet | Research Diets | D12108 | To induce atherosclerosis |
| Imaging software | National Institutes of Health | Image J | Aortic lesion quantification |
| Isopropanol | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | To clean the glass microscope slides |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | ROBOZ | RS-5602 | To separate the heart and the aorta and to cut open the aorta and aorta branches |
| Microscope control software | Olympus | DP Controller | For aorta imaging |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Needle-25G | BD | 305124 | |
| NonWoven Sponge | McKesson | 94442000 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | To stain the atherosclerosis lesions |
| Pall Acrodisc Sterile Syringe Filters with Super Membrane | VWR | 28143-312 | To filter working Oil Red O solution |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15021-15 | To dissect and clean the aorta |
| Statistical software | GraphPad | Prism 8 | Statical analysis |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | For aorta dissection |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | For aorta imaging |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | To induce Cre-loxP recombination |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tweezer Style 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | To cut the mouse skin and open the ribcage |
| Tweezer Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 0302-5-PO | To dissect and clean the aorta |
References
- Lusis, A. J.
- Emini Veseli, B., et al.
- Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71, 343-353 (1992).
- Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258, 468-471 (1992).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92, 883-893 (1993).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis Thrombosis. 14, 133-140 (1994).
- Chen, P. Y., et al. Smooth muscle cell reprogramming in aortic aneurysms. Cell Stem Cell. 26, 542-557 (2020).
- Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root. Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).
- Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences. Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).
