Summary
Текущий протокол демонстрирует простой метод отслеживания проекций глутамата вентральной тегментальной области (VTA) к гиппокампу. Фотостимуляция нейронов глутамата VTA была объединена с записью CA1, чтобы продемонстрировать, как клеммы глутамата VTA модулируют предполагаемое пирамидальное время срабатывания CA1 in vivo.
Abstract
Оптогенетическая модуляция субпопуляций нейронов в мозге позволила исследователям препарировать нейронные цепи in vivo и ex vivo. Это дает предпосылку для определения роли типов нейронов в нейронной цепи и их значения в кодировании информации по отношению к обучению. Аналогичным образом, метод может быть использован для проверки физиологического значения двух или более связанных областей мозга у бодрствующих и анестезируемых животных. Текущее исследование демонстрирует, как нейроны глутамата VTA модулируют скорость срабатывания мистических пирамидальных нейронов в CA1 (гиппокампе) анестезированных мышей. Этот протокол использует аденоассиоциированную вирусную (AAV)-зависимую маркировку нейронов глутамата VTA для отслеживания пресинаптических клемм Глутамата VTA в слоях гиппокампа. Экспрессия контролируемого светом опсина (канальногородопсина; hChR2) и флуоресцентного белка (eYFP), затаенный вектором AAV, позволяла антероградную трассировку клемм Глутамата VTA и фотостимуляцию тел клеток глутамата VTA (в VTA). Высокоимпедантные острые кремниевые электроды были размещены в CA1 для обнаружения многоблестровых и одноблестровых реакций на фотостимуляцию VTA in vivo. Результаты этого исследования демонстрируют слоисто-зависимое распределение пресинаптических терминалей Глутамата VTA в гиппокампе (CA1, CA3 и DG). Кроме того, фотостимуляция нейронов глутамата VTA увеличивала скорость срабатывания и разрыва предполагаемой пирамидальной единицы CA1 in vivo.
Introduction
В последнее десятилетие был разработан массив генетических инструментов для повышения специфичности модуляции нейронного типа и картирования сложных нейронных сетей1. Примечательно, что нейротропные вирусы с присущей им способностью заражать и реплицироваться в нейронных клетках были развернуты для экспрессии или абляции специфических белков в подполах нейронов. При получении флуоресцентных белков или генетически закодированных индикаторов синаптической активности трансфекция векторов AAV маркируют и очерчают нейронные сети по областям мозга2,3. Выбор промотора в конструкции AAV направляет экспрессию вектора в типах нейронов с некоторым уровнем специфичности(промотор-зависимая экспрессия). Однако благодаря рекомбинации Cre-lox конструкции AAV развертываются с большей специфичностью для маркировки нейронов4,5,6,7. Следует отметить, что фотоактивированные микробные опсины и флуоресцентные белки, упакованные в векторы AAV, могут быть экспрессированы в различных подтипах нейронов8и идеально подходят для визуализации, трассировки цепей нейронного типа и фотомодуляции9,10.
AAVs конструирует стереотаксически введенные в область мозга (или ядро), управляет экспрессией репортерного белка в терминалах сомы, дендрита и аксонов. Нейронная экспрессия AAV с репортерным геном (eYFP) облегчает маркировку тел нейронных клеток и анатомическую трассировку проекций в и из других областей мозга11,12,13,14. Конструкции AAV-eYFP, несущие управляемый светом опсин (например, hChR2), могут быть развернуты в качестве инструмента для визуализации6,15 и физиологического отслеживания нейронных проекций на целевые области мозга in vivo16. В зависимости от серотипа AAV направление маркировки нейронов может быть антероградным или ретроградным11,12. Предыдущие исследования установили, что AAV5 путешествует антероградно в нейронах12. Таким образом, фотостимуляция клеточных тел, экспрессирующих hChR2, производит пресинаптические эффекты в других частях мозга(мишень) 17.
Здесь AAV (серотип 5) с промотором CaMKIIα использовался для экспрессии eYFP (репортер) и hChR2 (опсин) в нейронах глутамата VTA и аксональных проекциях. Результаты этого исследования демонстрируют слоисто-зависимое распределение пресинаптических терминалей VTA-глутамата в областях гиппокампа CA1, CA3 и DG. Кроме того, фотостимуляция нейронов глутамата VTA увеличивала скорость срабатывания CA1 in vivo по сравнению с базовыми значениями. Этот протокол использует доступные инструменты и коммерчески доступное программное обеспечение, которое может повысить качество данных, полученных в результате экспериментов по отслеживанию нейронных цепей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры и процедуры обращения с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Школы ветеринарной медицины Университета штата Луизиана.
1. Подопытное животное
- Используйте мышей 5-6 недель.
- В доме 3–5 животных в клетке при стандартных условиях 12 ч чередующегося светового и темного цикла. Пища и вода должны быть предоставлены ad libitum.
2. Краниотомия и подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются пред- и периоперационные процедуры для черепно-мышей. Используйте стандартный стереотаксический аппарат и соответствующие координаты (переднезадний: AP, медиолатеральный: ML и дорсовентральный: DV). Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы определить координаты интересуемой области мозга.
- Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного кетамина (100 мг/кг)/ксилазина (10 мг/кг) коктейльной инъекции. Выполните тест на защемление нога, чтобы убедиться в отсутствии чувствительности до начала операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, изофлурановая анестезия с соответствующей камерой носа также может быть использована для этого этапа. - Аккуратно зафиксируйте голову животного на стереотаксическом аппарате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно обращаться с животными с осторожностью во время этого процесса. Кроме того, проверьте частоту дыхания и другие жизненно важные вещества, прежде чем приступать к операции. Дайте животному отдохнуть ~ 7 мин, чтобы уменьшить стресс.- Поместите грелку на стереотаксическую рамку так, чтобы на ней лежало тело животного. Это поможет поддерживать температуру тела и держать животное в тепле во время процедуры. Сохраните грелку для послеоперационного ухода и восстановления.
- Используйте клипсатор для удаления волос на коже головы и очистки кожи раствором йода.
- Применяйте местное применение лидокаина, чтобы блокировать чувствительность на коже головы.
- Используйте скальпель, чтобы сделать разрез средней линии кожи головы, простирающийся от лобной до затылочной области.
- Очистите область разреза раствором йода, затем обнажите кальварию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество 3% раствора перекиси водорода может быть применено для удаления позвоницы из кальварии. Это повысит видимость ориентиров (брегма и лямбда) и швов. - Используя стереотаксический атлас мозга мыши, определите координаты AP и ML относительно брегмы.
- Для инъекции VTA поместите ультратонкий игольчатый шприц с тупой точкой (например, шприц Neuros) в точке ap: -3,08 мм/ ML: 0,5 мм относительно брегмы.
- Используйте сверлильный инструмент для сверления отверстия диаметром 1 мм (краниотомия) в черепе по обозначенной координате AP/ML.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует значительного уровня осторожности. Во время сверления следует прикладывать минимальное давление, чтобы предотвратить раздавливание сверлом мозговой ткани. В текущем исследовании сверло составляло 0,8 мм, а скорость сверла была установлена на 15 000 оборотов в минуту.
ВНИМАНИЕ: Если перекись водорода использовалась при очистке разреза или кальварии, обеспечьте полное удаление раствора или допустите полную сухость перед сверлением.
3. Инъекция коктейля AAV
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается процесс инъекции AAV в VTA взрослых мышей C57BL/6 (23–27 г). Описанный способ может быть использован для инъекции ААВ в любую область мозга с использованием стандартного стереотаксического аппарата и соответствующих координат. Чтобы продемонстрировать этот протокол, eYFP и hChR2 экспрессировали в нейронах Глутамата VTA с использованием AAV5-опосредооченной трансфекции под промотором CaMKIIα(рисунок 1). Рекомбинация Cre-lox также может быть использована для этого этапа.
- Установите шприц со сверхтонкой тупоточечной иглой (емкость 32 г; емкость 5 мкл с точностью 100 нЛ) на инжектор. Закрепите держатель шприца на микроманипуляторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры использовался ручной держатель шприца с калибровкой 1,6 нЛ. Также можно использовать автоматизированный инжектор. - Наполните шприц двойной дистиллированной водой для очистки и проверки потока жидкости.
- Разморозить аликвоты коктейля AAV (серотип 5) на льду. AAV лучше всего хранить при -80 ° C для поддержания вирусного титра для хорошей экспрессии.
- Наполните установленный шприц 1000 нл раствора AAV (10 мМ в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), рН 7,4). Дозировать 10 нл раствора AAV для подтверждения потока жидкости перед опускание иглы в место инъекции.
- Используйте микроманипулятор, чтобы опустить иглу стереотаксически на нужную глубину (координата DV). После опускания иглы на нужную глубину дайте шприцу оставаться на месте в течение 10 мин перед инъекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры игла была опущена в VTA на глубине (DV) 4,5 мм от поверхности мозга. Для других областей мозга используйте соответствующую дорсовентральную координату (см. атлас мозга мыши). - Впрыскиваем 600–800 нЛ AAV в VTA. Объем инъекции может регулироваться в зависимости от размера целевого участка.
- Доставляют раствор AAV со скоростью 60 нл/мин (интервал 3 мин).
- Для экспрессии eYFP и hChR2 в нейронах и проекциях глутамата VTA вводят AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод рекомбинации Cre-lox также может быть использован в зависимости от цели эксперимента. - Дайте игле оставаться на месте в течение 15 минут после инъекции AAV. Это уменьшит диффузию и обратный поток.
- Выньте шприцевую иглу, а затем зашивайте разрез, чтобы закрыть рану.
- Назначать антибиотики и анальгезию как часть послеоперационного ухода. Поместите мышь на теплые мягкие платформы и следите за животным до пробуждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 недель инъекции экспрессия AAV может наблюдаться путем флуоресцентного обнаружения репортерного белка (eYFP) в отделах мозга мыши. Также эксперименты по фотостимуляции могут быть выполнены через 3 недели(рисунок 2).
4. Настройка для нейронных записей in vivo с оптогенетикой
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются этапы острой нейронной записи с оптогенетической трассировкой мозговой цепи (проекция глутамата нейрона VTA на CA1). При необходимости проверьте систему (усилитель и соединения) на наличие электрического шума и проблем с заземлением, прежде чем приступать к этому шагу. Выполнение этого шага в клетке Фарадея может помочь устранить электрический шум в записи.
- Через 3 недели после инъекции AAV обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией уретана (0,2 мг/кг).
ВНИМАНИЕ: Уретан является канцерогенным и с ним следует обращаться осторожно при ношении защитного снаряжения. Кроме того, введение уретановой анестезии в этой концентрации не является выживаемым. - Прикрепите голову животного к стереотаксической рамке, как описано ранее (шаг 2.2, рисунок 3А). Выполните краниотомию, чтобы обнажить дурную оболочку(рисунок 3А). Используйте сверлильный инструмент (размер долота: 0,8 мм, скорость: 15 000 об/мин) для удаления части теменной кости.
- Черепиотомия должна быть шириной около 3 мм х 4 мм. Нанесите капли искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) на эту область, чтобы предотвратить сухость.
- Под рассеченным (цифровым) микроскопом используйте изогнутый наконечник иглы (27 Г) для иссечения обнаженной твердой мозговой оболочки. Будьте осторожны, чтобы не раздвинуть нежное покрытие пиала и кортикальные ткани в этой области.
- Отверстие в затылочной кости (размер долота: 0,8 мм, скорость: 10 000 об/мин) для удержания заземляемого винта (винт Филлипса с головкой поддона; M0.6 x 2.0 мм).
- Подключите заземляющий провод из нержавеющей стали.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы проводов также могут быть использованы(рисунок 3b). - Для комбинированной фотостимуляции (VTA) и нейронной записи (CA1) используйте многорельсовый стереотаксический аппарат, оснащенный ультратонкими (10 мкм или 1 мкм) микроманипуляторами. Установите оптическое волокно и регистрирующий нейронный зонд на микроманипуляторе 10 мкм и 1 мкм диапазона соответственно.
- При необходимости используйте адаптер головки ступенчатого зонда(рисунок 3c).
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем протоколе 32-канальная головная ступень была оснащена адаптером для удержания 4-канального записывающего электрода(рисунок 3d). Провод заземления из нержавеющей стали был припаянным к порту заземления адаптера.
- При необходимости используйте адаптер головки ступенчатого зонда(рисунок 3c).
- При координатах AP: -3,08 мм ML: 0,5 мм, опуньте оптическое волокно диаметром 400 мкм в VTA.
- Перед опускание оптического волокна подключите наконечник к оптоволоконной кабели (с наконечником из нержавеющей стали или керамики), связанным с волоконно-связанным светодиодным источником.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интенсивность света и фокус установлены по желанию. Выбор светодиодного источника света должен соответствовать целевым опсинам. Здесь для фотоактивации hChR2 использовался светодиодный драйвер 470 нм (синий свет)(рисунок 4a). - Для синхронизации светового импульса с нейронной записью подключите светодиодный драйвер и цифровой IN-порт регистрируемого контроллера к импульсу транзисторно-транзисторной логики (TTL)(рисунок 4b). Это может быть достигнуто с помощью разветвителя BNC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пульса TTL обеспечивает гибкость цифровой установки желаемой частоты и продолжительности импульсного поезда. В текущем протоколе световые импульсы 10 мс запускались при 50 Гц18. Для управления TTL светодиодным драйвером переключите драйвер на «триггер». В этом режиме интенсивность света можно регулировать, поворачивая «ручку». Частота стимуляции может быть отрегулирована для учета экспериментальных переменных и может варьироваться от 1 до 100 Гц. Для трассировки нейронных цепей рекомендуется частота стимуляции >20 Гц. - Отрегулируйте ручку, чтобы определить эффективную интенсивность, которая может генерировать отклик без создания фотоэлектрических артефактов. При необходимости перепозиционировать оптическое волокно для устранения артефактов19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодный драйвер, используемый для текущего протокола, производит световую мощность ~ 21,8 мВт.
- Перед опускание оптического волокна подключите наконечник к оптоволоконной кабели (с наконечником из нержавеющей стали или керамики), связанным с волоконно-связанным светодиодным источником.
5. Нейронная запись
- Используйте острый нейронный зонд с хвостовиком толщиной 15–50 мкм, длиной не менее 5 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись из глубоких структур мозга потребует нейронных зондов с более длинным хвостовиком. В текущем исследовании использовался зонд длиной хвостовика 20 мм. - Подключите головной каскад предусилителя к контроллеру записи с помощью кабеля последовательного периферийного интерфейса (SPI). Проверьте цветную подсветку светодиодов на портах контроллера записи. Зеленые и желтые светодиоды указывают на правильное напряжение на подключенной плате усилителя. Красный светодиод указывает на работающее программно-головное управление ступенями(рисунок 5b).
- Используя микро-манипулятор, расположите места контакта электрода в пирамидальном слое ячейки CA1 (AP: -1,94 мм, ML: +1,0 мм, DV: от +1,1 до 1,2 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое волокно и электрод могут быть расположены в других желаемых областях мозга для фотостимуляции и записи.
6. Настройки усилителя и фильтра
- Подключите систему усилителя контроллера записи к компьютеру через порт USB 3.0. Подключите головной каскад к усилителю с помощью кабеля SPI. Запустите программное обеспечение контроллера. Если подключение не установлено должным образом, система отобразит сообщение «Устройство не найдено».
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы просмотреть действия на каналах. Каждая форма сигнала отображается как напряжение (ось y) против времени (ось x). В зависимости от интересующей области отрегулируйте шкалы напряжения и времени, чтобы настроить дисплей формы сигнала.
- Если активны только несколько каналов, отключите неиспользуемые каналы, чтобы уменьшить размер файла на диске хранилища.
- Установите частоту дискретизации и частоты срезания, отредактировав параметры полосы пропускания в программном обеспечении для сбора данных. Для одноблоковой записи установите верхнюю и нижнюю частоты среза на 300 Гц и 5000 Гц соответственно. Измените частоту дискретизации усилителя на 30 кС/с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор высокой частоты дискретизации приведет к большему размеру файла. - Перед записью проверьте целостность электродных каналов, измерив импеданс при 1000 Гц. Это можно сделать, запустив функцию в пользовательском интерфейсе (программное обеспечение контроллера). Рабочий канал должен иметь значение импеданса в диапазоне от 0,1 до 5 МОм.
- Если аудиовыход (динамик) подключен к порту ANALOG OUT, отрегулируйте коэффициент усиления и глушитель для оптимального пикового звука.
- Чтобы отобразить маркер пульсового поезда TTL в записи шипов, включите отображение маркера DIGITAL IN. Чтобы записать отметку времени импульсного поезда, включите отображение канала DIGITAL IN перед основным экспериментом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно существует более одного канала "DIGITAL IN" (1 или 2). Убедитесь, что кабель BNC от пульсера TTL подключен к порту «DIGITAL IN», выбранному для отображения в программном обеспечении контроллера записи. - Для просмотра формы сигнала шипа в режиме реального времени откройте окно области шипов и установите пороговое значение щелчком мыши.
- Проверьте уровень шума, отслеживая среднеквадратичное значение (RMS в мкВ). Для чистой записи шипов предпочтительно, чтобы порог нейронного всплеска был не менее 5x RMS.
- После завершения установки выберите формат вывода файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь нейронный всплеск CA1 был записан в формате .rhd. Другие форматы файлов (.rhs и .dat) также могут быть выбраны в соответствии с форматами файлов, допустимыми программным обеспечением для анализа.
7. Оптогенетическая запись и настройки in vivo
- Откройте программное обеспечение для управления импульсами (TTL), которое отображает различные регулируемые параметры импульса. Выберите соответствующий COM-порт в программном обеспечении. Задайте параметры импульса, настроив параметры Train и Group.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние импульса должно определяться с учетом экспериментальных переменных и конструкции. - В программном обеспечении контроллера усилителя нажмите кнопку Выполнить, чтобы обнаружить нейронные всплески в гиппокампе или нужной области мозга. При необходимости отрегулируйте глубину электрода для обнаружения жизнеспособных и активных нейронов.
- Как только активность внеклеточного напряжения обнаружена, наблюдайте за базовыми всплесками в течение 15 минут и контролируйте жизненные силы животного. Кроме того, протестируйте световой импульс для обнаружения чувствительных нейронов в ПРЕДЕЛАХ CA1 или желаемой анатомической целевой области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте наличие фотоэлектрических артефактов и устраните их, регулируя интенсивность света или положение оптического волокна. - Запишите базовую активность в течение ~10 мин, прежде чем запустить световой импульс на желаемой частоте(рисунок 5a,b). Это позволит сравнивать скорости стрельбы или очереди с подсветкой и без нее.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании базовая активность регистрировалась в течение 10 мин без освещения, с последующим освещением при 50 Гц(фильм 1).
8. Анализ
- Преобразуйте файл .rhd в выходной формат Nex5.
- Имя файла процесса. Файл Nex5 в автономном сортировщике для обнаружения одиночных растровых поездов и форм сигналов(рисунок 5a–b).
- Выберите нужный канал из выпадающего окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно записанные данные о всплесках можно просмотреть в отдельном окне OFSS. Шкала времени также может быть скорректирована. Если используется тетрод, OFSS может быть настроен на сортировку 4 каналов как тетрода. - Установите уровень напряжения для извлечения сигнала порогового пересечения.
ВНИМАНИЕ: Используйте не менее 5x RMS для правильного обнаружения шипов. - Обнаружение осциллограмм, а затем выполнение сортировки шипов с использованием метода поиска долин (автоматический) или K-средний (полуавтоматический). При необходимости объедините блоки, которые занимают аналогичные области пространства 3D-анализа главных компонентов (PCA).
- Экспорт отсортирован . Файлы Nex5 для дальнейшего анализа(рисунок 5c–d).
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа интервала между ударами, скорострельной скорости и скорости разрыва могут быть экспортированы в другие аналитические платформы.
- Выберите нужный канал из выпадающего окна.
9. Флуоресцентное обнаружение экспрессии AAV
- После записи усыплите животное в изофлурановой камере.
- Выполняют транскардиальную перфузию с 10 мМ PBS (~10 мл), а затем 4% фосфат-буферным параформальдегидом (PB-PFA, ~10 мл).
- Удалите весь мозг неповрежденным и зафиксируйте его в 4% PB-PFA в течение 48 ч.
- Переведите неподвижный мозг в 4% PB-PFA, содержащий 30% сахарозы для криоконсервации при 4 °C. Через 72 ч разделите мозг в криостате и установите ломтики на слайд, покрытый желатином.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем протоколе были выбраны участки, содержащие закрытую часть гиппокампа (ростраль), для демонстрации терминалов, меченых AAV, в DG, CA3 и CA1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Антероградная трассировка
Экспрессия AAV была подтверждена иммунофлуоресцентной визуализацией репортерного белка (eYFP) у мышей VTA C57BL/6 через 21 день после инъекции(рисунок 2). Успешная антероградная маркировка пресинаптических проекций глутамата VTA в гиппокампе также была подтверждена обнаружением eYFP в слоях DG, CA3 и CA1(рисунок 6a–d; Фильмы 2 и 3).
Проекции глутамата VTA на гиппокамп модулируют активность CA1
Фотостимуляция нейронов глутамата VTA повышала активность мтуативных пирамидальных нейронов CA1. Это проявляется в увеличении пиков во время фазы включенного света(фильм 1)по сравнению с фазой выключения света(рисунок 5a–b). Чтобы поддержать этот результат, статистическое сравнение скорости срабатывания сети CA1 до (свет ВЫКЛ; исходный уровень) и после (свет ВКЛ) фотостимуляции выявило значительное увеличение для постстимуляционного периода(рисунок 7a;p = 0,0002). Последующий анализ растрового поезда для обнаружения всплесков (2-4 всплеска в <16 мс) также демонстрирует повышенную скорость всплеска для предполагаемой пирамидальных нейронов CA1 после фотостимуляции глутамата VTA(рисунок 7b;p = 0,0025). Статистический (Student's t-test)анализ проводился с помощью стандартного программного обеспечения. Здесь базовая (свет OFF) частота стрельбы или очереди сравнивалась со значениями light ON (фотостимуляция).
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация инъекции AAV-CaMKII-ChR2-eYFP в VTA мыши C57BL/6.
Антероградная маркировка нейронов VTA и аксональных проекций на гиппокамп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Флуоресцентные изображения, показывающие экспрессию AAV-CaMKII-ChR2-eYFP в VTA и оптическую волоконную дорожку.
Dk: ядро Darkschewitsch, scp: верхний мозжечковой цветонос, VTA: вентральная тегментальная область и RM: ретромамиллярное ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Демонстрация краниотомии, размещения электродов и размещения оптического волокна.
(A) Разрез средней линии, обнажающий череп (b: брегма, oc: затылочная кость). (B)Размещение заземляющий винт (gs) в затылочной кости и соединяющаяся проволока из нержавеющей стали (gw). (C)Стереотаксическое позиционирование канюли из оптического волокна (foc: волоконно-оптический кабель). (D) Стереотаксическое позиционирование канюли из оптического волокна и хвостовика нервного зонда (foc: волоконно-оптический кабель, adp: адаптер, ms: брачный рукав, prs: хвостовик зонда, hs: головная стадия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Разделение соединения BNC для комбинированных световых пульсаций и временных меток усилителя (триггера).
(A) Демонстрация излучения светодиодного света от кончика канюли из оптического волокна. (B)Импульс TTL через разделенный адаптер BNC для управления записью светодиодов и усилителей времени (ampl). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Непрерывно регистрируемая скобоевая передача (необработанные данные) с обнаружением одного блока.
(A) Скриншот сырой записи из гиппокампа анестезированной мыши. (B)TTL-управляемое фотоосвещение VTA в необработанной записи. Светло-синие линии демонстрируют временные метки для периодов Light ON (λ = 470 нм) и частоту стимуляции. (С–Д) Непрерывно регистрируемые пиковый поезд и нейронные единицы, полученные путем сортировки шипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные флуоресцентные изображения, демонстрирующие экспрессию AAV-CaMKII-ChR2-eYFP в гиппокампе.
(A) DG (GCL: гранулированный клеточный слой, hil: хилус). (B) Часть CA3 близка к DG (SL: слой лакуносум, пир: пирамидальный клеточный слой). (C) Собственно CA3. (D) CA1 (со: слой oriens, pyr: пирамидальный клеточный слой, rad: stratum radiculata). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Статистическое сравнение скорострельности до и после фотостимуляции.
(A)Гистограмма, демонстрирующая повышенную среднюю скорость срабатывания (Гц) для мнимых пирамидальных нейронных единиц в CA1 (***p = 0,0002) после фотоосвещения. (B)Гистограмма, демонстрирующая повышенную скорость всплеска для мнимых нейронов CA1 после фотоосвещения (**p = 0,0025). Панель ошибок: стандартная погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Фильм 1: Запись на экран контроллера усилителя и программного обеспечения импульса. Фильм демонстрирует базовую запись (свет ВЫКЛ), за которой следует фотостимуляция (свет ВКЛ, λ = 470 нм), которая обозначена синими метками времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Фильм 2 и Фильм 3: 3D-иллюстрация клемм Глутамата VTA в DG мыши. DAPI-синий: ядерная метка в гранулированном клеточном слое (GCL); eYFP-Green: терминалы С маркировкой AAV VTA в DG hilus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За последнее десятилетие проектирование конструкций AAV значительно продвинулось вперед. Таким образом, более нейрон-специфические промоторы были включены в массив серотипов AAV для улучшения специфичности трансфекции14. Комбинируя гены флуоресцентных белков, транспортеров, рецепторов и ионных каналов, библиотеки AAV теперь существуют для визуализации, нейромодуляции и обнаружения синаптической активности. В коммерчески доступных AAV-конструкциях комбинация генетически закодированного флуорофора и ионных каналов (опсин) позволяет комбинировать нейроанатомическое и электрофизиологическое прослеживание нейронныхцепей 14,18,19. Аналогичным образом, выбор промотора (или метода рекомбинации cre-lox) может позволить отслеживать специфические для типа нейрона проекции в цепи. В текущем исследовании этот протокол был развернут для анатомической и электрофизиологической оценки нейронных проекций глутамата VTA в гиппокамп (область CA1).
Нейронная цепь VTA-Гиппокампа
VTA является частью мезокортиколимбического пути среднего мозгового пути. Проекции VTA на области мозга, участвующие в обучении вознаграждению и отвращению, были широкопродемонстрированы 20,21,22,23,24,25. В то время как VTA содержит нейроны дофамина, глутамата и ГАМК, популяция дофаминовых нейронов анатомически доминирует. Основная функция VTA в отвращении и обучении вознаграждению приписывается надежной проекции дофамина VTA к прилежачему ядру и дорсальному ядру рафе22,24,25,26,27,28. Хотя нейроны дофамина и глутамата VTA проецируются на гиппокамп, функция анатомически доминантных терминалей Глутамата VTA менее изучена по сравнению с VTA дофаминовых терминалами в гиппокампе29,30.
Текущий протокол описывает использование конструкции AAV5, вмещающей флуорофор (eYFP) и легкий управляемый опсин (hChR2) для отображения CaMKIIα-экспрессирующих VTA (глутаматных) терминалов в гиппокампе. Предыдущие исследования установили, что клеммы глутамата VTA анатомически доминируют в гиппокампе по сравнению с VTA дофаминовые терминалы29. Для демонстрации пресинаптических терминалей Глутамата VTA в гиппокампе AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP трансфектировался в тела нейрональных клеток VTA. Это пометило клеточные тела нейронов Глутамата VTA (в VTA) и очертит клеммы глутамата VTA в слоях гиппокампа.
Хотя пресинаптические терминалы Глутамата VTA иннервируют DG, CA3 и CA1, результаты показывают зависящие от слоя вариации для этих трех областей(рисунок 6a–d). В DG меченные AAV клеммы Глутамата VTA анатомически доминируют в хилусе по сравнению с гранулярным клеточным слоем. В CA3 клеммы глутамата VTA относительно распространены в слое лакуносума по сравнению с пирамидальным клеточным слоем и слоем ориенса. В то время как в CA1 клеммы глутамата VTA значительно иннервируют дендритные слои (stratum oriens и radiatum) по сравнению с пирамидальным клеточным слоем. Результаты этого исследования также демонстрируют, что фотостимуляция тел нейрональных клеток Глутамата VTA модулирует активность нейронной сети CA1 in vivo. Фотостимуляция нейронов глутамата VTA привела к значительному увеличению скорости срабатывания CA1 и скорости всплеска в эпоху фотостимуляции(рисунок 7a–b). Это согласуется с анатомическим распределением клемм Глутамата VTA в дендритных слоях CA1(рисунок 6d),где он может оказывать влияние на кодирование информации гиппокампа. В поддержку этого наблюдения другие исследования показали, что VTA является основным детерминантом кодирования рабочей памяти гиппокампа и регулирует отбор информации, которая будет храниться в долговременной памяти через петлю VTA-гиппокампа22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Технические соображения
Для успешной реализации этого протокола выбор конструкций AAV должен определяться на основе типа нейрона, на который будет нацелен. Исследователь должен идентифицировать подходящий промотор (генный продукт), который уникален для типа нейрона, на который нацелены. В текущем исследовании промотор CaMKIIα использовался для управления экспрессией eYFP и hChR2 в CaMKIIα-экспрессирующих нейронах. Тем не менее, метод рекомбинации cre-lox также может быть использован. В этом случае двойной флоксированный AAV5 может быть экспрессирован в VTA мышей CaMKIIα-Cre. Методы экспрессии на основе промотора и кре-локса также применимы к другим типам нейронов35,36,37.
Система должна быть проверена на электрический шум. Это можно сделать, оценив RMS в области пиков во время пробного сеанса записи. При необходимости система и стереотаксический аппарат должны быть размещены в клетке Фарадея, при этом заземление усилителя подключено к клетке. Места контакта электродов могут быть расположены линейно или тетродом. Выбор конструкции зонда должен определяться исходя из цели эксперимента. Линейный массив обнаруживает нейроны в нескольких слоях. Датчики с различными характеристиками интервала (в микронах) также коммерчески доступны. Длина хвостовика и расстояние между местами контакта зонда должны учитываться во время процедуры регистрации и анализа. Когда настройка завершена, световой импульс необходимо проверить во время пробной записи, чтобы устранить фотоэлектрические артефакты. Это также может быть оптимизировано путем регулировки положения электрода относительно глубины и местоположения оптического волокна.
Ограничения
Хотя CaMKIIα экспрессируется в основном в нейронах, высвобождающих глутамат, белок также присутствует в некоторых популяциях дофаминовых нейронов, которые совместно высвобождают глутамат. Таким образом, использование AAV5-CaMKIIα будет в основном маркировать глутаматные нейроны и некоторые дофаминовые нейроны, которые экспрессируют CaMKIIα. Светодиодные протоколы фотостимуляции доступны по цене и могут быть легко собраны. Однако важно отметить, что протокол фотостимуляции с лазерным управлением более эффективен38,39,40. Раствор AAV, вводимый в одну и ту же область мозга для разных животных, дает различные пороги экспрессии. Тем не менее, ожидание в течение 3 недель или более после инъекции может уменьшить такие вариации, обеспечивая оптимальную трансфекцию. Раствор AAV, вводимый в область мозга, может также диффундировать в окружающие области мозга. Соблюдение периода ожидания после того, как игла была опущена, и в перерывах между болюсными инъекциями может уменьшить диффузию раствора AAV из места инъекции.
Таким образом, этот метод может быть использован для отслеживания нейронных цепей в мозге грызунов. Хотя текущий протокол описывает отслеживание нейронной цепи in vivo у анестезируемых мышей, процедура также может быть развернута для хронической записи у бодрствующих мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется грантом CBS Bridging Grant, присужденным OOM. OOM, PAA и AS разработали исследование и провели эксперименты. AS и PAA проанализировали результаты. OOM и PAA подготовили рукопись. Мы благодарим д-ра Карла Диссерота (Стэнфордский университет) за то, что он сделал AAV доступным для нашего использования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
References
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
- Kuypers, H., Ugolini, G.
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
- Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
- Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
- Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
- Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
- Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
- Hu, H.
- Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
- Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
- Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
- Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
- Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
- Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
- Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
- Funahashi, S.
- Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
- McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
- McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
- Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
- Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V.
