Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kombinert in Vivo anatomisk og funksjonell sporing av ventrale tegmental område glutamatterminaler i Hippocampus

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61282
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

Den nåværende protokollen demonstrerer en enkel metode for sporing av ventral tegmental område (VTA) glutamat projeksjoner til hippocampus. Fototimulering av VTA glutamat nevroner ble kombinert med CA1-opptak for å demonstrere hvordan VTA glutamatterminaler modulerer CA1 putativ pyramidal avfyringshastighet in vivo.

Abstract

Optogenetisk modulering av nevron subpopulasjoner i hjernen har tillatt forskere å dissekere nevrale kretser in vivo og ex vivo. Dette gir et premiss for å bestemme rollen til nevrontyper i en nevral krets, og deres betydning i informasjonskoding i forhold til læring. På samme måte kan metoden brukes til å teste den fysiologiske betydningen av to eller flere tilkoblede hjerneregioner hos våken og bedøvet dyr. Den nåværende studien demonstrerer hvordan VTA glutamat nevroner modulerer avfyringshastigheten til putative pyramidale nevroner i CA1 (hippocampus) av bedøvede mus. Denne protokollen bruker adeno-assosiert virus (AAV)-avhengig merking av VTA glutamat nevroner for sporing av VTA presynaptiske glutamat terminaler i lagene i hippocampus. Uttrykk for lyskontrollert opsin (channelrhodopsin; hChR2) og fluorescensprotein (eYFP) som ligger i AAV-vektoren tillot anterogradsporing av VTA-glutamatterminaler, og fototimulering av VTA glutamat neuroncellelegemer (i VTA). Akutte silisiumelektroder med høy impedans ble plassert i CA1 for å oppdage multienhets- og enkeltenhetsresponser på VTA-fototimulering in vivo. Resultatene av denne studien viser den lagavhengige fordelingen av presynaptiske VTA-glutamatterminaler i hippocampus (CA1, CA3 og DG). Også fototimuleringen av VTA glutamat nevroner økte avfyrings- og bristehastigheten til putative CA1 pyramidale enheter in vivo.

Introduction

I det siste tiåret ble en rekke genetiske verktøy utviklet for å øke spesifisiteten til nevron-type modulasjon, og kartlegging av komplekse nevrale nettverk1. Spesielt har nevrotrope virus med en iboende evne til å infisere og replikere i nevronceller blitt utplassert for å uttrykke eller fyre av spesifikke proteiner i nevronundertyper. Når du har fluorescensproteiner eller genetisk kodede synaptiske aktivitetsindikatorer, transfected AAV vektorer etikett og avgrense nevrale nettverk på tvers avhjerneregioner 2,3. Valget av en promotor i AAV-konstruksjonen styrer uttrykket av vektoren i nevrontyper med et visst nivå av spesifisitet(promotoravhengig uttrykk). Gjennom Cre-lox-rekombinasjon distribueres imidlertid AAV-konstruksjoner med større spesifisitet for neuronmerking4,5,6,7. Vær oppmerksom på at fotoaktiverte mikrobielle opsiner og fluorescensproteiner pakket i AAV-vektorer kan uttrykkes i forskjellige neuron-undertyper8, og er ideelle for avbildning, sporing av nevronkrets og fotomodulering9,10.

AAVer konstruerer stereotaktisk injisert i en hjerneregion (eller kjerne) driver uttrykket av reporterproteinet i soma-, dendrite- og axonsterminalene. Nevralt uttrykk for AAV som skjuler et reportergen (eYFP) letter merkingen av nevroncellelegemer og anatomisk sporing av projeksjoner til og fra andre hjerneregioner11,12,13,14. AAV-eYFP-konstruksjoner som bærer lysstyrt opsin (f.eks. hChR2), kan distribueres som et verktøy for avbildning6,15 og stimuleringsbasert fysiologisk sporing av nevrale projeksjoner for å målrette hjerneområder in vivo16. Avhengig av AAV-serotypen kan retningen av neuronmerking være anterograd eller retrograd11,12. Tidligere studier har fastslått at AAV5 reiser anterogradely i nevroner12. Dermed gir fototimulering av cellelegemer som uttrykker hChR2 presynaptiske effekter andre steder i hjernen (målet)17.

Her ble AAV (serotype 5) med en CaMKIIα-promotor brukt til å uttrykke eYFP (reporter) og hChR2 (opsin) i VTA glutamat nevroner og axonale projeksjoner. Resultater fra denne studien viser den lagavhengige distribusjonen av VTA-glutamat presynaptiske terminaler i CA1-, CA3- og DG-hippocampal-regionene. Også fototimulering av VTA glutamat nevroner økte CA1 multi-enhet og single-unit avfyringshastigheter in vivo sammenlignet med baseline verdier. Denne protokollen benytter rimelige verktøy og kommersielt tilgjengelig programvare som kan øke kvaliteten på data hentet fra nevrale kretssporingseksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle og dyrehåndteringsprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Louisiana State University School of Veterinary Medicine.

1. Eksperimentelt dyr

  1. Bruk 5-6 uker gamle mus.
  2. Hus 3-5 dyr per bur under standardforhold på 12 timer vekslende lys og mørk syklus. Mat og vann bør gis ad libitum.

2. Kraniotomi og dyreforberedelse

MERK: Denne delen beskriver pre- og peri-operative prosedyrer for muskraniotomi. Bruk standard stereotaktisk apparat og passende koordinater (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML og Dorsoventral: DV). Se et musehjerneatlas for å bestemme koordinatene for hjerneregionen av interesse.

  1. Bedøv mus ved intraperitoneal ketamin (100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) cocktailinjeksjon. Utfør en tå klype test for å sikre fravær av følelse før oppstart av kirurgi.
    MERK: Alternativt kan Isofluran anestesi med et passende nesekammer også brukes til dette trinnet.
  2. Fest forsiktig dyrets hode på det stereotaktiske apparatet.
    MERK: Det er viktig å håndtere dyr med forsiktighet under denne prosessen. Kontroller også pustefrekvensen og andre vitale før du fortsetter med operasjonen. La dyret hvile i ~ 7 min for å redusere stress.
    1. Plasser en varmepute på den stereotaktiske rammen slik at dyrets kropp ligger på den. Dette vil bidra til å opprettholde kroppstemperaturen og holde dyret varmt gjennom prosedyren. Behold varmeputen for postoperativ pleie og gjenoppretting.
  3. Bruk en klipper til å fjerne hår over hodebunnen og rengjør huden med en jodoppløsning.
    1. Påfør aktuell lidokain for å blokkere følelse i hodebunnen.
    2. Bruk en skalpell for å gjøre en midtlinje hodebunn snitt som strekker seg fra frontal til occipital regionen.
    3. Rengjør snittområdet med jodoppløsning, og utsett deretter calvaria.
      MERK: En liten mengde 3% hydrogenperoksidoppløsning kan påføres for å fjerne periosteum fra calvaria. Dette vil øke synligheten av landemerker (bregma og lambda) og suturer.
    4. Bruk en mus hjerne stereotaktisk atlas, bestemme AP og ML koordinater i forhold til bregma.
    5. For VTA-injeksjon plasserer du en ultrafin sløv nålesprøyte (f.eks. neurosprøyte) ved koordinatene AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm i forhold til bregmaen.
    6. Bruk et boreverktøy til å bore et 1 mm hull (kraniotomi) i skallen ved den merkede AP/ML-koordinaten.
      MERK: Dette trinnet krever en betydelig grad av forsiktighet. Minimalt trykk bør påføres under boring for å forhindre at boret knuser hjernevevet. I den nåværende studien var boret 0,8 mm og borehastigheten ble satt til 15.000 rpm.
      FORSIKTIG: Hvis hydrogenperoksid ble brukt til rengjøring av snittet eller calvaria, må du sørge for total fjerning av oppløsningen eller tillate fullstendig tørrhet før boring.

3. AAV cocktail injeksjon

MERK: Denne delen beskriver prosessen for AAV-injeksjon i VTA hos voksne C57BL/6-mus (23–27 g). Den beskrevne metoden kan brukes til AAV-injeksjon i alle hjerneregioner ved hjelp av standard stereotaktisk apparat og passende koordinater. For å demonstrere denne protokollen ble eYFP og hChR2 uttrykt i VTA glutamat nevroner ved hjelp av AAV5-mediert transfeksjon under en CaMKIIα-promotor (figur 1). Cre-lox rekombinasjon kan også brukes til dette trinnet.

  1. Monter en sprøyte med ultrafin sløv nål (32 G; 5 μL kapasitet med 100 nL nøyaktighet) på en injektor. Fest sprøyteholderen på en mikromanipulator.
    MERK: I denne prosedyren ble det brukt en manuell sprøyteholder med 1,6 ml kalibrering. En automatisert injektor kan også brukes.
  2. Fyll sprøyten med dobbelt destillert vann for å rengjøre og teste væskestrømmen.
  3. Tin aliquots av AAV (serotype 5) cocktail på is. AAVer lagres best ved -80 °C for å opprettholde viral titer for godt uttrykk.
  4. Fyll den monterte sprøyten med 1000 nL AAV-oppløsning (10 mM i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4). Dispenser 10 nL av AAV-oppløsningen for å bekrefte væskestrømmen før du senker kanylen ned på et injeksjonssted.
  5. Bruk en mikromanipulator til å senke nålen stereotaktisk inn i ønsket dybde (DV-koordinat). Etter å ha senket kanylen til ønsket dybde, la sprøyten forbli på plass i 10 minutter før injeksjon.
    MERK: For denne prosedyren ble nålen senket ned i VTA på en dybde (DV) på 4,5 mm fra hjernens pialoverflate. For andre hjerneområder, bruk riktig dorsoventral koordinat (se musen hjerneatlas).
  6. Injiser 600–800 nL AAV i VTA. Injeksjonsvolumet kan justeres avhengig av størrelsen på målstedet.
    1. Lever AAV-løsningen med en hastighet på 60 nL/min (3 min intervall).
    2. For å uttrykke eYFP og hChR2 i VTA glutamat nevroner og projeksjoner, injiser AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      MERK: Cre-lox rekombinasjonsmetode kan også brukes avhengig av målet med eksperimentet.
    3. La kanylen forbli på plass i 15 minutter etter AAV-injeksjon. Dette vil redusere diffusjon og tilbakestrømning.
  7. Trekk ut sprøytenålen, og suturer deretter snittet for å lukke såret.
  8. Administrer antibiotika og analgesi som en del av postoperativ omsorg. Plasser musen på en varm polstret plattform og overvåk dyret til våken.
    MERK: Etter 3 ukers injeksjon kan AAV-uttrykk observeres ved fluorescensdeteksjon av reporterprotein (eYFP) i musehjernesseksjoner. Fototimuleringseksperimenter kan også utføres etter 3 uker (figur 2).

4. Sett opp for in vivo nevrale opptak med optogenetikk

MERK: Denne delen beskriver trinnene for akutt nevral registrering med optogenetisk sporing av en hjernekrets (VTA glutamat neuron projeksjon til CA1). Kontroller om nødvendig systemet (forsterker og tilkoblinger) for elektriske støy- og jordingsproblemer før du begynner på dette trinnet. Å utføre dette trinnet i et Faraday-bur kan bidra til å eliminere elektrisk støy i opptaket.

  1. Ved 3 uker etter AAV injeksjon, bedøvelse mus ved intraperitoneal uretan injeksjon (0,2 mg/kg).
    FORSIKTIG: Uretan er kreftfremkallende og må håndteres forsiktig mens du bruker beskyttelsesutstyr. Også administrering av uretanbedøvelse ved denne konsentrasjonen er ikke-overlevelse.
  2. Fest dyrets hode på en stereotaktisk ramme som beskrevet tidligere (trinn 2.2, figur 3A). Utfør en kraniotomi for å eksponere dura (figur 3A). Bruk et boreverktøy (bitstørrelse: 0,8 mm, hastighet: 15 000 o/min) for å fjerne en del av parietalbenet.
    1. Kraniotomien skal være ca. 3 mm x 4 mm bred. Påfør dråper kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) over dette området for å forhindre tørrhet.
  3. Under et disseksjonsmikroskop bruker du en bøyd nålespiss (27 G) til å skille ut den eksponerte duraen. Vær forsiktig så du ikke trekker fra hverandre det delikate pialbelegget og kortikale vev i dette området.
  4. Bor et hull i oksipitalbenet (bitstørrelse: 0,8 mm, hastighet: 10 000 o/min) for å holde jordskruen (panhode Phillips skrue; M0,6 x 2,0 mm).
  5. Koble til en jordledning i rustfritt stål.
    MERK: Andre typer ledninger kan også brukes (Figur 3b).
  6. For kombinert fototimulering (VTA) og nevral opptak (CA1), bruk et multi-rail stereotaxic apparat utstyrt med ultra-fine (10 μm eller 1 μm) mikromanipulatorer. Monter henholdsvis den optiske fiber- og opptaks-nevrale sonden på henholdsvis 10 μm-rekkevidde og 1 μm-områdemikromanipulator.
    1. Bruk eventuelt en adapter for hodetrinnsonde (figur 3c).
      MERK: I gjeldende protokoll ble et 32-kanals hodetrinn utstyrt med en adapter for å holde en 4-kanals opptakselektrode (figur 3d). Jordledningen i rustfritt stål ble loddet til adapterens jordforbindelsesport.
  7. Ved koordinater AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, senk den optiske fiberen med 400 μm diameter inn i VTA.
    1. Før du senker den optiske fiberen, koble ferrule til en fiberoptisk kabel (med rustfritt stål eller keramisk ferrule) koblet til en fiberkoblet LED-kilde.
      MERK: Sørg for at lysintensiteten og fokuset er stilt inn etter ønske. Valget av LED-lyskilde skal samsvare med opsinene som målrettes. Her ble en 470 nm (blått lys) LED-driver brukt til hChR2 fotoaktivering (Figur 4a).
    2. Hvis du vil synkronisere lyspulsen med nevralopptaket, kobler du LED-driveren og den digitale IN-porten for opptakskontrolleren til en pulser for transistortransistorlogikk (TTL) (figur 4b). Dette kan oppnås ved hjelp av en BNC-splitter.
      MERK: Bruken av en TTL-pulser gir fleksibiliteten til å stille inn ønsket pulstogfrekvens og varighet digitalt. I gjeldende protokoll ble 10 ms lyspulser utløst ved 50 Hz18. For TTL-kontroll av LED-driveren, sett driveren til "trigger". I denne modusen kan lysintensiteten reguleres ved å dreie på "knotten". Stimuleringsfrekvensen kan justeres for å imøtekomme eksperimentelle variabler og kan variere fra 1 til 100 Hz. For sporing av nevrale kretser anbefales en stimuleringsfrekvens på >20 Hz.
    3. Juster knotten for å bestemme den effektive intensiteten som kan generere et svar uten å produsere fotoelektriske artefakter. Om nødvendig omplassere den optiske fiberen for å eliminere artefakter19.
      MERK: LED-driveren som brukes til den gjeldende protokollen, produserer lyseffekt på ~ 21,8 mW.

5. Nevral innspilling

  1. Bruk en akutt nevral sonde med en 15-50 μm tykk skaft, som måler minst 5 mm i lengde.
    MERK: Opptak fra dype hjernestrukturer vil kreve nevrale sonder med en lengre skaft. I den nåværende studien ble det brukt en sonde med 20 mm skaftlengde.
  2. Koble forforsterkerhodetrinnet til opptakskontrolleren via en SPI-kabel (Serial Peripheral Interface). Kontroller lysdiodenes fargebelysning på opptakskontrollportene. Grønne og gule lysdioder indikerer riktig spenning på det tilkoblede forsterkerkortet. Rød LED indikerer en fungerende programvarehodetrinnkontroll (Figur 5b).
  3. Bruk en mikromanipulator til å plassere elektrodekontaktstedene i pyramidecellelaget til CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 til 1,2 mm).
    MERK: Den optiske fiberen og elektroden kan plasseres i andre ønskede hjerneregioner for fototimulering og opptak.

6. Forsterker- og filterinnstillinger

  1. Koble forsterkersystemet for opptakskontrolleren til en datamaskin via en USB 3.0-port. Koble hodetrinnet til forsterkeren ved hjelp av SPI-kabelen. Start kontrollerprogramvaren. Hvis den ikke er riktig tilkoblet, vil systemet vise en melding om at enheten ikke ble funnet.
  2. Klikk Kjør for å vise aktivitet på kanalene. Hver bølgeform plottes inn som spenningen (y-aksen) kontra tiden (x-aksen). Avhengig av interesseområdet justerer du spenningen og tidsskalaene for å justere bølgeformdisplayet.
  3. Hvis bare noen få kanaler er aktive, deaktiverer du ubrukte kanaler for å redusere filstørrelsen på lagringsdisken.
  4. Angi samplingsfrekvens og avskjæringsfrekvenser ved å redigere båndbreddeparametere på anskaffelsesprogramvaren. For opptak med én enhet setter du de øvre og nedre avskjæringsfrekvensene til henholdsvis 300 Hz og 5000 Hz. Endre amplifierprøvetakingshastigheten til 30 kS/s.
    MERK: Hvis du velger en høy samplingsfrekvens, får du en større filstørrelse.
  5. Før du tar opp, kontroller integriteten til elektrodekanalene ved å måle impedans ved 1000 Hz. Dette kan gjøres ved å starte funksjonen i brukergrensesnittet (kontrollerprogramvare). En arbeidskanal bør ha en impedansverdi som varierer fra 0,1 til 5 MΩ.
  6. Hvis en lydutgang (høyttaler) er koblet til ANALOG OUT-port, justerer du forsterkning og lyddemper for optimal topplyd.
  7. Hvis du vil vise TTL-pulsmåleren i spikeropptaket, aktiverer du displayet for DIGITAL IN-markøren. Hvis du vil registrere tidsangivelsen for pulstoget, aktiverer du DIGITAL IN-kanaldisplayet før hovedeksperimentet.
    MERK: Det er vanligvis mer enn én "DIGITAL IN"-kanal (1 eller 2). Kontroller at BNC-kabelen fra TTL-pulseren er koblet til "DIGITAL IN"-porten som er valgt for visning i opptakskontrollerprogramvaren.
  8. Hvis du vil vise bølgeformen i sanntid, åpner du vinduet for spikeromfang og angir terskelverdi ved hjelp av museklikket.
  9. Inspiser støynivået ved å overvåke rotgjennomsnittsplassen (RMS i μV). For ren spike opptak, er det foretrukket at neural spike terskelen er minst 5x RMS.
  10. Når installasjonen er fullført, velger du utdataformatet for filen.
    MERK: Her ble CA1 nevral spike registrert i .rhd format. Andre filformater (.rhs og .dat) kan også velges for å matche filformatene som er tillatt av analyseprogramvaren.

7. In vivo optogenetisk opptak og innstillinger

  1. Åpne pulsstyringsprogramvaren (TTL) som viser forskjellige justerbare pulsparametere. Velg riktig COM-port på programvaren. Angi pulsparametere ved å justere innstillingene for Tog og gruppe.
    MERK: Pulstilstanden bør bestemmes ved å vurdere eksperimentelle variabler og design.
  2. På forsterkerkontrollerprogramvaren klikker du på Kjør for å oppdage nevrale pigger i hippocampus eller ønsket hjerneområde. Juster om nødvendig elektrodedybden for å oppdage levedyktige og aktive nevroner.
  3. Når ekstracellulær spenningsaktivitet er oppdaget, observere baseline pigger i 15 min og overvåke dyrets vitale forhold. Test også lyspulsen for å oppdage responsive nevroner i CA1 eller ønsket anatomisk målregion.
    MERK: Se etter fotoelektriske artefakter og eliminer ved å justere lysintensitet eller optisk fiberposisjon.
  4. Registrer grunnlinjeaktiviteten i ~10 minutter før du utløser lyspulsen ved ønsket frekvens (Figur 5a,b). Dette vil tillate sammenligning av avfyrings- eller bristehastigheter med og uten belysning.
    MERK: I den nåværende studien ble basisaktivitet registrert i 10 minutter uten belysning, etterfulgt av belysning ved 50 Hz (Film 1).

8. Analyse

  1. Konverter RHD-filen til utdataformatet Nex5.
  2. Behandle filnavn. Nex5-fil i en frakoblet sorteringsprogramvare for å oppdage rastertog og bølgeformer for én enhet (Figur 5a–b).
    1. Velg ønsket kanal fra rullegardinlisten.
      MERK: De kontinuerlig registrerte piggdataene kan vises i et eget vindu i OFSS. Tidsskalaen kan også justeres. Hvis en tetrode brukes, kan OFSS settes til å sortere de 4 kanalene som en tetrode.
    2. Still inn spenningsnivået for terskeloverskridende bølgeformutvinning.
      FORSIKTIG: Bruk minst 5x RMS for riktig spikeregistrering.
    3. Oppdag bølgeformer, og utfør deretter spike sortering ved hjelp av valley-seeking (automatisk) eller K-midler (halvautomatisk) metode. Om nødvendig slår du sammen enheter som opptar lignende områder i PCA-området (3D-Principal Component Analysis).
    4. Eksporter sortert . Nex5-filer for videre analyse (Figur 5c–d).
      MERK: Analyseresultater for intervallet, avfyringshastigheten og sprengningshastigheten kan eksporteres til andre analyseplattformer.

9. Fluorescensdeteksjon av AAV-uttrykk

  1. Etter opptaket avstøter du dyret i et isoflurankammer.
  2. Utfør transkardial perfusjon med 10 mM PBS (~10 ml), etterfulgt av 4 % fosfatbufret paraformaldehyd (PB-PFA, ~10 ml).
  3. Fjern hele hjernen intakt og fikse den i 4% PB-PFA i 48 timer.
  4. Overfør den faste hjernen til 4% PB-PFA som inneholder 30% sukrose for kryopreservering ved 4 °C. Etter 72 timer, del hjernen i en kryostat og monter skiver på en gelatinbelagt lysbilde.
    MERK: I gjeldende protokoll ble seksjoner som inneholder den lukkede delen av hippocampus (rostral) valgt for å demonstrere AAV-merkede terminaler i DG, CA3 og CA1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anterograde sporing

AAV-uttrykk ble verifisert ved immunfluorescensavbildning av reporterprotein (eYFP) i VTA av C57BL/6 mus 21 dager etter injeksjon (Figur 2). Vellykket anterogradmerking av presynaptiske VTA-glutamatprojeksjoner i hippocampus ble også verifisert ved eYFP-deteksjon i lagene i DG, CA3 og CA1 (Figur 6a–d; Film 2 og 3).

VTA glutamat projeksjoner til hippocampus modulere CA1 aktivitet

Fototimulering av VTA glutamat nevroner økte aktiviteten til putative pyramidale CA1 nevroner. Dette er tydelig som en økning i spiking hendelser under lys PÅ fase (Film 1) sammenlignet med lys OFF fase (Figur 5a–b). For å støtte dette resultatet viste statistisk sammenligning av CA1-nettverksavfyringshastighetene før (lys AV; grunnlinje) og etter (lys PÅ) fototimlering en betydelig økning for etterstimuleringsperioden (Figur 7a; p = 0,0002). Etterfølgende analyse av rastertoget for å oppdage eksplosjoner (2-4 pigger i <16 ms) viser også en økt bristehastighet for CA1 putative pyramidale nevroner etter VTA glutamat fototimulation (Figur 7b; p = 0,0025). Statistisk (Student t -test) analyse ble utført med standard programvare. Her ble grunnlinjen (lys AV) avfyrings- eller sprengningshastigheten sammenlignet med lys på (fototimulering) verdier.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-injeksjon i VTA for C57BL/6-mus.
Anterograd merking av VTA nevroner og axonal projeksjoner til hippocampus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensbilder som viser AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-uttrykk i VTA og optisk fiberspor.
Dk: kjernen i Darkschewitsch, scp: overlegen cerebellar peduncle, VTA: ventral tegmental område, og RM: retromamillary kjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Demonstrasjon av kraniotomi, elektrodeplassering og optisk fiberplassering.
(A) Midtlinje snitt som eksponerer kraniet (b: bregma, oc: occipital bein). (B) Plassering av jordskruen (gs) i oksipitale bein og tilkoblet rustfritt stål jordet ledning (gw). (C) Stereotaktisk posisjonering av optisk fiberkanyle (foc: fiberoptisk kabel). (D) Stereotaktisk posisjonering av optisk fiberkanyle og nevral sondeskaft (foc: fiberoptisk kabel, adp: adapter, ms: parringshylse, prs: sondeskaft, hs: hodetrinn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: BNC delt tilkobling for kombinerte lyspulserende og forsterker (trigger) tidsstempler.
(A) Demonstrasjon av LED-lysutslipp fra spissen av en optisk fiberkanyle. (B) TTL-puls gjennom en BNC delt adapter for å kontrollere LED- og tidsstempelforsterkeropptak (ampulleopptak). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kontinuerlig registrert spikertog (rådata) med enkeltenhetsdeteksjon.
(A) Screengrab av rå opptak fra hippocampus av en bedøvet mus. (B) TTL-drevet fotobelysning av VTA i råopptaket. Lyseblå linjer viser tidsstemplene for lys PÅ (λ = 470 nm) perioder og stimuleringsfrekvens. (C–D) Kontinuerlig registrert spike tog og neuron enheter avledet av spike sortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representative fluorescensbilder som demonstrerer uttrykket av AAV-CaMKII-ChR2-eYFP i hippocampus.
(A) DG (GCL: granulært cellelag, hil: hilus). (B) En del av CA3 nær DG (SL: stratum lacunosum, pyr: pyramidecellelag). (C) CA3 riktig. (D) CA1 (så: stratum oriens, pyr: pyramidal cellelag, rad: stratum radiculata). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Statistisk sammenligning av avfyringshastigheten før og etter fototimulering.
(A) Stolpediagram som viser en økt gjennomsnittlig avfyringshastighet (Hz) for putative pyramidale nevronenheter i CA1 (***p = 0,0002) etter fotobelysning. (B) Bar graf som viser en økt burst rate for putative CA1 nevroner etter fotobelysning (** p = 0,0025). Feilfelt: Standardfeil av middelverdi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: Screengrab-opptak av forsterkerkontrolleren og pulserprogramvaren. Filmen demonstrerer basisopptak (lys AV) etterfulgt av fototimulering (lys PÅ, λ = 470 nm) som er indikert med blå tidsstempler. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Film 2 og Film 3: 3D-illustrasjon av VTA-glutamatterminaler i musens DG. DAPI-blå: kjernefysisk etikett i det granulære cellelaget (GCL); eYFP-Grønn: AAV-merkede VTA-terminaler i DG-hilus. Klikk her for å laste ned disse videoene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løpet av det siste tiåret har utformingen av AAV-konstruksjoner utviklet seg betydelig. Som sådan har mer nevronspesifikke promotorer blitt innlemmet i en rekke AAV-serotyper for forbedret transfeksjonsspesifikkitet14. Ved å kombinere gener for fluorescensproteiner, transportører, reseptorer og ionkanaler, eksisterer det nå biblioteker av AAV for avbildning, nevromodulering og synaptisk aktivitetsdeteksjon. I kommersielt tilgjengelige AAV-konstruksjoner gir en kombinasjon av en genetisk kodet fluorofor og ionkanaler (opsin) en kombinert nevroanatomisk og elektrofysiologisk sporing av nevrale kretser14,18,19. På samme måte kan valget av en promotor (eller cre-lox rekombinasjonsmetode) tillate sporing av en nevrontypespesifikk projeksjon i en krets. I den nåværende studien ble denne protokollen utplassert for anatomisk og elektrofysiologisk vurdering av VTA glutamat nevrale projeksjoner til hippocampus (CA1-regionen).

VTA-Hippocampus nevral krets

VTA er en del av midbrain mesocorticolimbic banen. VTA-projeksjoner til hjerneområder involvert i belønnings- og aversjonslæring har blitt demonstrert omfattende20,21,22,23,24,25. Mens VTA inneholder dopamin, glutamat og GABA-nevroner, er dopamin neuronpopulasjonen anatomisk dominerende. En viktig funksjon av VTA i aversjon og belønning læring tilskrives en robust VTA dopamin projeksjon til kjernen accumbens og dorsal raphe kjernen22,24,25,26,27,28. Selv om VTA dopamin og glutamat nevroner projiserer til hippocampus, er funksjonen til de anatomisk dominerende VTA-glutamatterminalene mindre studert sammenlignet med VTA-dopaminterminaler i hippocampus29,30.

Den nåværende protokollen beskriver bruken av en AAV5-konstruksjon som huser en fluorofor (eYFP) og lyskontrollert opsin (hChR2) for kartlegging av CaMKIIα-uttrykkende VTA-terminaler (glutamat) i hippocampus. Tidligere studier har fastslått at VTA glutamat terminaler er anatomisk dominerende i hippocampus sammenlignet med VTA dopamin terminaler29. For å demonstrere VTA glutamat presynaptiske terminaler i hippocampus, AAV (5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP ble transfektert til VTA nevronale cellelegemer. Dette merket cellelegemene VTA glutamat nevroner (innenfor VTA) og skisserte VTA glutamat terminaler innenfor lagene i hippocampus.

Selv om VTA-glutamat presynaptiske terminaler innervate DG, CA3 og CA1, viser resultatene lagavhengige variasjoner for disse tre regionene (figur 6a–d). I DG er AAV-merkede VTA-glutamatterminaler anatomisk dominerende i hilus sammenlignet med det granulære cellelaget. I CA3 er VTA-glutamatterminalene relativt rikelig i stratum lacunosum sammenlignet med pyramidalcellelaget og stratum oriens. Mens I CA1, VTA glutamat terminaler betydelig innervate dendritic lag (stratum oriens og radiatum) sammenlignet med pyramidecellelaget. Utfallet av denne studien viser også at fototimulering av VTA glutamat nevroncellelegemer modulerer aktiviteten til CA1 nevrale nettverk in vivo. Fototimulering av VTA-glutamat-nevroner førte til en betydelig økning i CA1-avfyringshastighet og sprengningshastighet under fototimuleringseokjen (Figur 7a–b). Dette er enig med den anatomiske fordelingen av VTA-glutamatterminaler i de dendrittiske lagene i CA1 (figur 6d) der den kan utøve effekter på hippocampal informasjonskoding. Til støtte for denne observasjonen har andre studier vist at VTA er en primær determinant for hippocampal arbeidsminnekoding, og regulerer valg av informasjon som skal lagres i langtidsminnet gjennom VTA-hippocampus loop22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.

Tekniske hensyn

For å kunne implementere denne protokollen, bør valget av AAV-konstruksjoner bestemmes basert på nevrontypen som skal målrettes. Forskeren må identifisere en passende promotor (et genprodukt) som er unikt for nevrontypen som skal målrettes. I den nåværende studien ble en CaMKIIα-promotor brukt til å drive uttrykket av eYFP og hChR2 i CaMKIIα som uttrykte nevroner. Imidlertid kan en cre-lox rekombinasjonsmetode også brukes. I dette tilfellet kan en dobbel floxed AAV5 uttrykkes i VTA av CaMKIIα-Cre mus. De promotor- og cre-lox-baserte uttrykksmetodene gjelder også for andre nevrontyper35,36,37.

Systemet bør kontrolleres for elektrisk støy. Dette kan gjøres ved å evaluere RMS i spike scope under en prøveopptaksøkt. Om nødvendig bør systemet og stereotaktisk apparat plasseres i et Faraday-bur, mens forsterkerjordet er koblet til buret. Elektrodekontaktsteder kan ordnes lineært eller en tetrode. Valget av sondedesign bør bestemmes basert på eksperimentets mål. En lineær matrise oppdager nevroner på tvers av flere lag. Sonder med ulike avstandsspesifikasjoner (i mikron) er også kommersielt tilgjengelige. Skaftlengden og avstanden mellom sondekontaktstedene bør vurderes under opptaksprosedyren og for analysen. Når oppsettet er fullført, må lyspulsen kontrolleres under en prøveopptak for å eliminere fotoelektriske artefakter. Dette kan også optimaliseres ved å justere elektrodens posisjon i forhold til optisk fiberdybde og plassering.

Begrensninger

Selv om CaMKIIα først og fremst uttrykkes i glutamatfrigjørende nevroner, er proteinet også tilstede i noen populasjoner av dopamin nevroner som co-release glutamat. Dermed vil bruk av AAV5-CaMKIIα for det meste merke glutamat nevroner og noen dopamin nevroner som uttrykker CaMKIIα. LED-drevne fototimuleringsprotokoller er rimelige og kan enkelt monteres. Det er imidlertid viktig å merke seg at en laserdrevet fototimuleringsprotokoll er mer effektiv38,39,40. AAV-løsning injisert i samme hjerneregion for forskjellige dyr gir varierende uttrykksterskler. Men å vente i 3 uker eller mer etter injeksjonen kan redusere slik variasjon ved å tillate optimal transfeksjon. AAV-oppløsning injisert i en hjerneregion kan også spre seg til omkringliggende hjerneområder. Å observere ventetiden etter at nålen er senket, og mellom bolusinjeksjoner kan redusere diffusjonen av AAV-løsningen fra injeksjonsstedet.

Oppsummert kan denne metoden brukes til å spore nevrale kretser i gnagernes hjerner. Selv om den nåværende protokollen beskriver in vivo nevral kretssporing hos bedøvede mus, kan prosedyren også brukes til kronisk opptak hos våken oppførende mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er finansiert av CBS Bridging Grant tildelt OOM. OOM, PAA og AS designet studien og utførte eksperimentene. AS og PAA analyserte resultatene. OOM og PAA utarbeidet manuskriptet. Vi takker Dr. Karl Disseroth (Stanford University) for å gjøre AAV tilgjengelig for vår bruk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism GraphPad Software version 8
Intan Recording Controller Intantech version 2.07
Neuroexplorer Nex Technologies version 5.215
Plexon Offline Spike Sorter Plexon Inc version 4.5
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 163 krets optogenetikk AAV avfyringshastighet in vivo opptak
Kombinert in Vivo anatomisk og funksjonell sporing av ventrale tegmental område glutamatterminaler i Hippocampus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, A., Adeniyi, P. A.,… More

Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter