Summary
该协议已经开发，以研究TmPep1050的二丁二代过渡，一种M42氨基肽，在结构层面。从蛋白质纯化到 X 射线数据处理，这是一条简单的管道。通过一个案例研究，TmPep1050H60A H307A 变种强调了晶体生成、数据集索引和分子 替代。
Abstract
M42氨基肽形成由12个亚单位构成的功能活性复合物。他们的装配过程似乎由其金属离子辅助因子调节，从而触发了二丁体转换。金属离子结合时，在有源位点和相互作用界面上发生几次结构修改，形成二丁体，促进自组装。为了观察这种修改，在结构研究之前必须分离稳定的寡聚物。这里报道的方法，允许纯化稳定的多德卡派和二甲，TmPep1050，一个M42氨基肽 的T.马里蒂玛，并由X射线晶体学的结构测定。迪姆斯是由多德卡人用溷合剂去除金属离子从多德卡人那里准备的。没有他们的辅助因素，多德卡器变得不那么稳定，在加热时完全分离。通过直接的分子替代方法解决了寡聚结构问题。为了说明该方法，TmPep1050变种的结构，在金属离子结合中完全受损，显示没有进一步分解的二元体到单体。
Introduction
寡聚化是决定许多蛋白质生物功能的主要过程。在大肠杆菌中，估计只有35%的蛋白质是单体1。一些蛋白质，称为形态素，甚至可以采用几种寡聚态，亚基在每个寡聚态2中具有不同的结构。它们的寡聚状态之间的过渡通常是调节蛋白质活性的一种意义，因为每种寡聚状态可能有不同的特定活性或功能。几个例子的形态素已被文献记载，特别是磷脂蛋白原合成酶3，HPr激酶/磷酸酶4，隆蛋白酶5，乳酸脱氢酶6，甘油醛-3-磷酸脱氢酶7，丙酮酸盐激酶8，柠檬酸合成酶9，和核糖酶A10。最近，我们描述了M42氨基肽TmPep1050，另一个酶的例子与形态素样的行为，其活性取决于其寡聚状态11。其寡聚状态之间的过渡由其金属辅助因子进行调解，从而引起亚单位的几次结构修饰。
M42氨基肽家族属于MH氏族12，13，并广泛分布于细菌和阿奇亚14。M42氨基肽是正宗的二核酶，降解肽的长度为35个氨基酸残留物15。他们采用一种奇特的四角体状结构，由12个亚单位形成，其活性位点面向内腔。这种安排通常被描述为对活性的纳米分形，以避免不受控制的蛋白解。M42氨基肽的生理功能可能与蛋白质降解引起的蛋白酶体、水解肽16、17有关。热球菌霍里科希拥有四个M42氨基肽，每个呈现不同但互补的特异性18，19，20，21。单说，由两种不同类型的亚单位制造的异质复杂体在P.horikoshii中描述，暗示了22、23中肽复合物的存在。
文献中对M42氨基肽的几个结构已经描述了11、16、18、19、20、24、25、26。子单元由两个不同的域组成，一个催化域和一个二化域。催化域采用一种共同的α/β折叠保存于整个MH族中，原型催化域为Vibrio蛋白酶27的氨基肽Ap1。二聚化域采用PDZ形折叠16，除了在寡聚化中的作用外，还具有控制内腔11中基板访问和结合的作用。由于基本构建基块是一个二角板，多德卡默通常被描述为六个二角的关联，每个二丁体被放置在四边板16的每一边缘。M42 氨基肽的寡聚化取决于其金属辅助因子的可用性。二氧化二离子，通常为Zn2+和Co2+，在肽结合和水解中催化参与。它们存在于两个不同的绑定站点中，即 M1 和 M2 站点。两个金属离子也驱动和微调寡聚化，如PhTET2，PhTET3，PfTET3和TmPep105011，24，28，29。当金属辅助因子耗尽时，多德卡默分解成二元，如 PhTET2、PhTET3 和 TmPep1050 11、16、28，甚至单体，如 PhTET2和 PfTET324、29。
此处介绍的是用于研究 TmPep1050 寡聚物结构的协议。该协议是一套常见的方法，包括蛋白质纯化、蛋白解活性筛选、结晶、X射线衍射和分子替代。强调了处理金属糖酶、蛋白质寡聚化、蛋白质结晶和分子替代所固有的微妙之处。还提出了一个研究案例，以表明TmPep1050多卡默是否可以进一步分离成单体。为了解决这个问题，TMPep1050变种TmPep1050H60A H307A已经研究过其金属结合位点通过将 His-60（M2位点）和 His-307（M1位点）变异到阿拉残留物而受损。该协议可以容纳研究其他M42氨基肽或任何金属糖酶与形态素一样的行为。
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Protocol
1. 重组TmPep1050的生产和纯化
注：下面描述了克隆过程和纯化野生型TmPep1050改编自以前的研究11。或者，克隆可以使用合成基因进行。为了生成 TmPep1050 变种，可以按照以下方法 30 执行站点定向突变，例如，并行协议 （SPRINP） 方法30中的单底反应。纯化协议可用于 TmPep1050 变种。应避免使用 His-tag，因为它干扰金属离子结合。
- 表达式向量设计
- 获取热 素玛利蒂玛 MSB8（ATCC 43589）或TmCD00089984（结构基因组联合中心）的基因组DNA。
- 使用基因组DNA或模板质粒、高保真DNA聚合酶和以下底注放大TM_1050开放读取框（ORF），使用：ocej419（5'-TTTAACTTAAGAGAGAGATAGATACGAGAACTGATGAGATAGTG）和ocej420（5'-ATCCCCCACCCAGGGGGGATACTCCTGG）。根据以下方案进行聚合酶链反应（PCR）筛选：95°C时5分钟，3步30个周期（95°C时30秒，55°C时30秒，72°C时90秒），72°C下10分钟作为最后步骤。
- 根据SLiCE协议31，通过大肠杆菌中的同源重组（图1）将PCR片段克隆成合适的表达载体（材料表）。要 50 ng 的线性化矢量，添加 PCR 片段在 10：1 摩尔的片段与矢量的比率， 1 μL的PPY菌株提取物，50 mM Tris-HCl pH 7.5，100 mM MgCl2，10mM ATP 和 10 mM 二核石醇 （DTT），反应体积为 10 μL。在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 通过1μL的重组反应，转化具有化学能力大肠杆菌XL1蓝色菌株（或任何 rec A-合适的菌株）。将含有100μg/mL安西林的LB介质上的细胞板。在37°C下孵育板。
- 在新鲜 LB 板上选取带 100 μg/mL 安皮西林的菌落。在37°C下孵育板至少8小时。
- 使用合适的底像对（5'-ATGCCATAGATATCTCC 和 5' - ATTAATCTGTATCAGGC，如果使用材料表中列出的推荐矢量），按殖民地 PCR 筛选 正候选号。使用微尖端，划伤采摘的聚群体，将细胞转移到含有每个底转 0.5 μM 和 10 μL 的商业 Taq DNA 聚合酶混合物的反应混合物的 20 μL。
- 根据以下方案运行 PCR 筛选：95 °C 时 5 分钟作为变性步骤，30 个周期为 3 步（95 °C 时为 30 秒，55 °C 为 30 秒，72°C 为 90 秒），72°C 为 10 分钟作为最后步骤。
注：PCR反应可以在12°C的PCR机器中过夜。 - 在三醋酸-EDTA（TAE）缓冲液中制备的0.8%的阿加罗斯凝胶上，加载每个PCR反应的10μL。在 100 V 下运行电泳 25 分钟。
注：预期为 1.1 kbp 安培。 - 使用商业套件（材料表）从候选者中提取质粒，并使用步骤1.1.6中使用的同一底材对对质粒进行测序。
- 细胞培养
注：当通过排序确定合适的候选项时，如果使用推荐的矢量（材料表），克隆可以直接用作表达式。在这种情况下，表达式由阿拉伯致用P BAD启动子32控制。- 接种含有100微克/mL安西林的10 mL介质，并在轨道震动下在37°C下孵育预培养。将 5 mL 的预培养添加到 1 L 的 LB 介质中，用 100 μg/mL 安西林。请注意，要遵守 3 的空液比。
- 让细胞在轨道震动下在37°C生长。在 660 nm （OD660 ） 中监控光学密度。
- 当OD660 达到0.5±0.6时，在冰上快速冷却培养物5分钟，并转移到设定为18°C的培养箱。
- 加入0.2克/L阿拉伯糖诱导基因表达，并在18°C下孵育12~18小时。
- 在 4 °C 下，在 6，000 x g 下离 心 培养细胞，30 分钟收获细胞。 丢弃上一液和洗涤细胞与100 mL的0.9%（w/v）NaCl。
- 在 4 °C 下以 6，000 x g 再次离心 15 分钟，然后丢弃上一代。
注：细胞颗粒可直接用于蛋白质提取或储存在-80°C。
- 蛋白质纯化
- 将细胞颗粒在 40 mL 的 50 mM MOPS 中重新发送，1 mM CoCl2，pH7.2。加入1 μL的25 U/μL DNA/RNA内核糖酶和一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在冷却下脉冲模式下对悬架进行声波化 30 分钟。
- 在 4 °C 下以 20，000 x g 离心原油提取物，30 分钟。 收集上一液，在70°C的水浴中加热10分钟。
- 在 4 °C 下以 20，000 x g 将变性 细胞 提取物离心 30 分钟，并收集上一代进行纯化。
- 使用合适的洋葱交换树脂 （材料表） 包装在 ±15 mL 的体积列中.有关工作流速和柱压力限制，请参阅制造商的建议。将树脂与 50 mM MOPS、1 mM CoCl2、pH7.2 等值。
- 将从步骤 1.3.3 收集的上一液加载到列中。在 280 nm 时监控水分的吸光。当它达到基线时，继续执行洗脱。
- 在 50 mM MOPS 中应用从 0 到 0.5 M NaCl 的梯度，在 5 列卷 （CV） 中应用1mM CoCl 2，pH 7.2 表示 5 列卷 （CV）。等到电导率稳定，吸收率达到基线。
- 在 50 mM MOPS 中应用 0.5 至 1 M NaCl 的最终梯度，1 mM CoCl2，pH7.2 表示 1 CV。
- 分析硫酸钠硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的一些分数（参见图 2A 指导）。
注： TmPep1050 在库马西染色后显示为 36 kda 波段。或者，TmPep1050 的存在可以通过活动测定来确认（参见第 2.1 节）。在此步骤中，分数可以一夜之间储存在 4 °C。 - 将含有TmPep1050的馏分，并加入精细的地面粉末（NH4）2SO4，以获得浓度为1.5 M （NH4）2SO4。通过倒置管轻轻混合，直到完全溶解。
- 使用疏水相互作用树脂 （材料表） 包装在 ±30 mL 的体积列中.有关工作流速和柱压力限制，请参阅制造商的建议。用 50 mM MOPS、1.5 M （NH4）2 SO4、1mM CoCl2、pH7.2 等对树脂进行平衡。
- 将样品加载到柱子上，并在 280 nm 时监控吸水器的吸光。当吸收度达到基线时，通过应用从1.5 M到0 M （NH4）的梯度来吸收结合蛋白，在50 m M MOPS中应用2SO4，1 mM CoCl2，pH7.2表示5CV。
- 通过 SDS-PAGE 分析一些分数（参见图 2B 了解指导）。
注： TmPep1050 在库马西染色后显示为 36 kda 波段。或者，TmPep1050 的存在可以通过活动测定来确认（参见第 2.1 节）。在此步骤中，分数可以一夜之间储存在 4 °C。 - 将含有 TmPep1050 的馏分，使用具有 30 kDa 截止的超滤装置浓缩至 2 mL（材料表）。继续第 1.4 节以确定分子量。
- 大小排除色谱
- 使用大小排除树脂（材料表） 包装在 ±120 mL 的体积列.有关工作流速和柱压力限制，请参阅制造商的建议。用 50 mM MOPS、0.5 M （NH4）2 SO4、1mM CoCl2、pH7.2 等对平衡树脂。
- 将样品加载到柱子上，并在 280 nm 时监控吸水器的吸光。从柱死卷 （±0.33 CV） 的分数，直到洗脱结束 （1 CV）。
- 测量每个观测到的峰值的洗脱体积。
注：为指导，在目前实验条件下，在±82 mL（图3A）下，多卡皮克TmPep1050，如TmPep1050H60A H307A变型，在+95 mL（图3B）的利特。某些 TmPep1050 可能采用两种寡聚形式，如 TmPep1050H60A（图 3C）。 - 使用 SDS-PAGE 分析与观测峰值最大值和尾部对应的分数。
注： TmPep1050 在库马西染色后显示为 36 kda 波段。 - 使用具有 30 kDa 截止（材料表）的超滤装置将每个峰的分数集中并浓缩，以获得 ±300 μM 的浓度。
- 在纳米体积分光光度计上测量280纳米的吸光度，并使用分子消光系数18，910M-1 cm-1计算浓度。
- 将纯化蛋白质储存在-18°C。
- 要确定分子量，请使用分子量标准（材料表）校准大小排除色谱（SEC） 列。使用 50 mM MOPS、0.5 M （NH4）2SO4、1mM CoCl2 pH 7.2 作为运行缓冲器来分析标准。
2. 活性测定和酶制剂
注：最初，Apo酶是通过将1卷TmPep1050稀释为10卷2.1M苹果酸pH7.0，并在透析11之前浓缩回1卷来准备的。下面介绍了使用1，10-苯丙胺（金属离子溷合器）的替代程序。此过程可减少蛋白质流失，并给出与之前发布的方法相同的结果。
- 活动测定
- 在甲醇中准备100 mML-Leucine-p-硝基尼利化物（材料表）的库存溶液。
- 在 965 μL 中加入 25 μL 100 mML-Leucine-p-硝基苯甲酸酯，加入 50 mM MOPS，250 μM CoCl2，pH7.2，10% 甲醇。在干浴中，在 75°C 下预孵化反应混合物。
- 将50 mM MOPS pH 7.2中的酶稀释至1 μM的浓度。在75°C的反应混合物中加入10μL，并在75°C下孵育，直至其变黄或1小时。
- 加入20%醋酸1 mL，停止反应。漩涡好，让它冷却到室温。
- 在分光光度计细胞中转移反应混合物。读取 410 nm 的吸光度，对负对进行（不带酶的孵化反应混合物）。
- Apo酶制剂
- 准备在乙醇中准备1 M 1，10-phenanthroline的库存溶液。加入 10 μL 的 1，10-phenanthroline 库存溶液到 890 μL 的 50 mM MOPS， 0.5 M （NH4）2SO4，pH 7.2.加入100μL的纯化TmPep1050（300μM±1 mM浓度）。
- 使用第 2.1 节中描述的活动测定检查活动损失，而不在反应组合中添加 CoCl2。
- 将样品转移到透析管中。对 200 mL 的 50 mM MOPS， 0.5 M （NH4）2 SO4，pH 7.2 在 4 °C. 的拨号。 在 48 h 透析期间，用新鲜缓冲液交换三次透析。
- 从透析管中收集样品，并使用具有 30 kDa 截止的超滤装置将样品浓缩回 100 μL（材料表）。使用纳米体积分光光度计读取 280 nm 的吸光度来检查浓度。
- 迪默准备
- 将阿波酶稀释至浓度为 50 mM MOPS 中的 1 μM，0.5 M （NH4）2SO4，pH7.2。在干浴中，在75°C下孵育2小时，然后让样品冷却至室温。
- 将样品浓缩到至少50μM的酶浓度。通过SEC检查分子量（见第1.4节）。洗脱峰必须从+82 mL转移到+95 mL（在目前实验条件下）。
3. TmPep1050 结晶
注：蛋白质结晶仍然是一个经验科学，因为它是一个多因素现象33。虽然一些参数可以识别和控制（如温度、pH值、沉淀剂浓度），但其他参数可能难以难以捉摸地影响结晶（如蛋白质和化学纯度、蛋白酶、样品历史）。如今，由于一系列商业结晶筛选条件和自动化，蛋白质结晶以合理、系统的方式处理。然而，结晶条件的优化主要依赖于试错方法。下面描述了蛋白质结晶的蓝图和优化结晶条件的几个技巧。
- 结晶筛选
注：使用商用结晶试剂盒，在2.2M DL-苹果酸pH 7.0、0.1 M Bis-Tris丙烷pH7.0和0.18M三铵柠檬酸、20%聚乙烯乙二醇（PEG）3350中获得了多面体TmPep1050晶体。一毛钱TmPep1050晶体在0.1M柠檬酸钠pH5.6，0.2M醋酸铵，30%PEG4000中得到。水晶的多德卡器出现在一个星期内，并在一个月内达到其全尺寸。二丁石晶体通常在24小时内出现，并在一周内长到全尺寸。- 获取多个商用结晶套件（ 参见材料表 示例）。
- 为悬挂落法设置结晶板（材料表）。用结晶筛分套件每个溶液的 500 μL 填充油井。
- 对于每一个井，设置一个结晶支持。在支撑上，沉积1μL滴纯化蛋白（通常±10mg/mL）。
- 立即从井中移出1μL的结晶溶液。小心地将其添加到蛋白质滴中，然后通过倒放三次轻轻混合。掉落必须保持半球形，没有任何气泡。
- 将支撑拧在相应井的顶部。对整个套件重复操作。
- 设置板后，用双筒望远镜观察每一滴。有关解释（透明滴、相分离、沉淀、针头等），请参阅结晶套件用户指南。
- 在20°C下孵育板。 在第一周每天检查一次盘子，之后每周检查一次。
- 使用分数表和提供结晶套件的用户指南对每个评分进行评分。
- 结晶优化
注：多卡米基TmPep1050的初始结晶条件已优化为2.1 M DL-苹果酸pH 6.75和0.18M三铵柠檬酸pH7.5， 40%（w/v）PEG3350，而一毛钱TmPep1050的结晶条件已转移到0.1M柠檬酸钠pH 6.0，10%（w/v）PEG3350。为了提高结晶度，必须进行一个循环的播种。下面介绍了 TmPep1050H60A H307A 变 型的结晶是如何优化的。- 以不同的pH（4.5、5.2和6.0）和50%（w/v）PEG3350溶液准备0.5M柠檬酸钠缓冲液的库存溶液。
- 将结晶板设置为 pH 与沉淀剂的矩阵（参见 图 4A）。
- 在20°C下孵育板。 在一周内，每天用双筒望远镜观察每一个井一次。
- 根据晶体大小和形状对每个评分良好。选择至少 50 μm 的晶体条件。继续微种子。
- 微种子
注：微种子是提高蛋白质晶体的形状、尺寸和结晶度的有力方法。更快的播种方法是使用猫须进行条纹播种。参见 图 4 作为结晶优化和微种子如何改进 TmPep1050H60A H307A 的晶体形状和尺寸的示例。- 在步骤 3.2.4 中使用所选的井准备种子。
- 通过从井中加入结晶溶液，将含有晶体的滴量提高至10 μL。从井中滴液，加入90μL的结晶溶液。漩涡彻底，保持种子在冰上。
- 准备种子的几种稀释：1x、10x、25x和100x。在移液前将种子做好涡流。将稀释液放在冰上。
- 对于每个种子稀释，设置一个结晶板作为pH值与沉淀剂的矩阵（参见 图4B）。使用步骤 3.2.1 中准备的库存解决方案。
- 滴当时，加入0.2μL的种子，使2μL滴。在20°C下孵育板。 在一周内，每天用双筒望远镜观察每一个井一次。
注：晶体尺寸分布和形状必须改进，请 参见图4C 作为 TmPep1050H60A H307A 的示例。为进一步使用，种子可以储存在-20°C。
4. X射线衍射
- 水晶采摘
注：样品制备取决于X射线源设施（家庭设施与同步加速器）。相应地使用存储设备（小瓶和小瓶支架篮）。根据盐/沉淀剂浓度，可能需要添加低温保护剂（如甘油）。对于 TmPep1050 晶体，由于 PEG 或缓冲液浓度足够高，可以避免水晶体，因此不需要低温保护剂。- 准备一个装满液氮的浴缸，将用于样品处理的任何小瓶或篮子都跳。
- 设置不同尺寸的样品拾取循环：100、150 和 200 μm（材料表）。根据晶体尺寸选择尺寸。
- 使用双筒望远镜检查含有晶体和斑点分离晶体的掉落（最容易挑选）。使用循环，轻轻地从底部拾取晶体。立即将循环跳在液氮中，将环放在合适的小瓶中。
- 数据采集
注：数据收集可能因 X 射线源（家庭设施与同步加速器）和探测器灵敏度的不同而有很大差异。收集策略可能因样本而异，具体取决于分辨率、点强度、空间组等。这个话题已经由道特35进行了广泛的审查。- 将晶体的循环安装在衍射仪的磁度计头上。
- 沿 XYZ 轴调整磁度计头，使晶体与 X 射线束路径对齐。
- 将波长设置为 0.98 1 ，然后移动探测器以获得 2 + 的分辨率。
- 通过获取至少两种不同晶体方向的图像，开始短期数据收集。在 0° 和 90° 下拍摄 10 张图像（每 0.1° 1 张图像）。
- 使用合适的软件（例如 ADXV、XDS 查看器或 Albula 查看器）检查收集的图像。确定点强度和看到斑点的最高分辨率。还要检查单晶和点分离。
- 最终，根据观测结果改变探测器位置以实现更高或更低的分辨率和曝光时间，重复步骤 4.2.3–4.2.5。
- 在 360° 左右开始数据收集，每 0.1° 拍摄 1 张图像。请记住以最佳方式设置探测器位置和曝光时间。
5. 索引、分子替换和模型构建
- 指数
注：指数化是一种测量衍射点强度的方法，给出结构因子的振幅36。四个软件包通常用于处理收集的图像：Mosflm 37，HKL200038，DIALS39和XS40。后者已用于对从 TmPep1050 晶体衍射中获得的数据集进行索引。- 安装 XDS 包和 XDSME41。如果处理 HDF5 文件，请安装 XDS Neggia 插件（可在 Dectris 网站上找到）。有关详细信息，请访问 XDS wiki 网页https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page XDSME 网页https://github.com/legrandp/xdsme。
- 在处理数据之前，请创建一个文件夹，从其中运行 XDS。找到图像的路径。
- 若要运行 XDSME，请键入 path_to_images/图像 /扩展。
- XDS 结束作业后，请检查正确。LP 文件。注意空间组确定、数据完整性、最高分辨率、晶体镶嵌度和数据质量的概率。检查XDS_pointless.log获取空间组的可能性。
注： 参见图 5 作为输出示例。 - 在单独的文件夹中使用 XDS 建议的不同空间组解决方案重新运行 XDSME，以避免覆盖上一个进程。类型 xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.扩展 （例如， xdsme -s P21 -c"43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000）.
- 检查正确。LP 文件，并选择基于数据统计信息的最佳解决方案。
- 通过键入命令运行 XSCALE xscale.py XDS_ASCII。HKL.通过键入 XSCALE 来 运行 xdsconv.py xdsconv。HKL ccp4.
注意：在某些情况下，XDSME 无法识别空间组，或者无法正确剪切分辨率范围或生成奇怪的数据统计信息。如果遇到这样的问题，值得在本机运行 XDS。XDS 中必须引入多个参数。INP 启动文件（请参阅 XDS wiki 页面）。使用 XDS 时，可以使用 CCP4 包 42 的一部分"无意义"来检查可能的空间组的可能性。为了降低数据集分辨率，通常接受 Rmeas < 60% 和 I/σ +2 来确定最高分辨率43。但是，通过将分辨率扩展到 I/σ±0.5±1.5 和 CC1+2 到 0.2±0.444，可以改进分子替换和模型改进。
- 分子替代
注：实验数据允许访问结构因子的振幅，但是，在不知道相位的情况下，它们毫无用处。相位可以通过基于异常信号（例如重原子）的不同方法进行实验确定。分子替换是确定没有异常散射原子46，47的相位的另一种方法。该方法使用相关分子的坐标以迭代方式查找和改进相位。我们使用凤凰桂49中的相 位器48进行 分子替代。- 使用 4P6Y 坐标准备分子替换的起始模型。从 pdb 文件中，提取单体 A，并使用 Phenix 中的 PDB 文件编辑器（在模型工具选项卡下）截断其丙 氨酸中的氨基酸 。
- 使用 XDSCONV （5.1.9） 生成的反射文件和序列作为输入在 Phenix 中运行 Xtriage。
- 检查 Xtriage 的日志文件。注意完整性、非对称单元中的亚单位数量、各向异性、冰环的存在和结对发生。
- 运行相位器-MR在Phenix（在分子替换选项卡下）分子替换使用反射文件，序列和启动4P6Y模型截断在聚丙氨酸（步骤5.2.1）。
- 完成后，检查是否找到模型和分子替换的分数。至少 8 的转换系数 Z 得分 （TFZ） 表示解决方案明确正确。
- 模型建筑
注：通过分子替代确定相位后，必须构建和完善模型。该协议使用 Phenix GUI49 进行自动构建和迭代优化，使用 Coot50 进行手动结构构建和优化。- 分子替换后使用相位 MR 在 Phenix， 选择运行自动构建。将自动添加所有必需的文件。只需 按" 运行"即可开始自动构建。
- 完成后，检查 Coot 中的模型。根据库特的电子密度图手动构建和优化模型。
- 使用模型、序列和衍射数据作为 输入，在 Phenix（在优化选项卡中）中优化手动策划的模型。请参阅 Phenix 帮助选择正确的策略。
- 细化后，检查结果：R自由 工作和R 工作必须减少，Molprobity51 指标必须遵守，并且必须限制实际空间相关性较低的异常值。
- 重复步骤 5.3.2±5.3.4，直到生成最佳精炼模型。
- 在服务器上运行 Molprobity：http://molprobity.biochem.duke.edu/。检查由 Molprobity 识别的任何异常值。
- 最终重复步骤 5.3.2±5.3.6，直到获得最佳精制模型。
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Representative Results
为了研究在TmPep1050中可能分离成单体的单体，His-60和Sss-307的编码子被使用合成基因的丙氨酸codon所取代。该基因随后在pBAD载体中克隆，用于表达和纯化相应的TmPep1050变种，随后命名为TmPep1050H60A H307A。大小排除色谱（图3B）显示，纯化蛋白质的表观分子量为56kDa（单体分子量为36.0kDa）。据报道，TmPep1050二暗器11的类似明显分子量为52kDa。因此，TmPep1050H60A H307A 的寡聚状态可以推断为一毛钱。关于其特定活性，TmPep1050H60A H307A 在 L-Leu-pNA上作为基质完全不活跃，即使在钴离子存在的情况下。这一结果有力地表明，这些变种不能束缚任何金属离子。
TmPep1050H60A H607A 的结晶条件通过围绕二元组条件（即 0.1 M 柠檬酸钠 pH 6.0 10% PEG3350）进行不同的 pH 与 PEG 浓度（图4）优化。TmPep1050H60A H307A的最佳晶体以0.1M柠檬酸钠pH 5.2 20% PEG3350获得，用一个周期的微种子提高单晶度。在 Proxima 2 光束线 （SOLEIL 同步加速器） 上以分辨率 2.36 1 （表 1 ）收集了完整的数据集。数据索引显示，TmPep1050H60A H307A晶体的空间组为C2221，但XDS提出了另一种解决方案，mP空间组（见图5）。根据无意义，C2221和P2 1空间组的可能性分别是0.711和0.149。根据数据质量分析，在非对称单元中发现两个单体。Xtriage的分析显示，数据集可能是孪生的，但在C2221空间组中，双胞胎不太可能是52。结对的结果来自晶体生长异常，其中几个明确的域有一些其晶格方向平行于对方53。结对也可能由较高的晶体对称性导致，表示数据索引错误。因此，一个伪美罗非的双胞胎可能存在，使P21晶体晶格看起来像一个C2221。该数据集随后在空间组P21中编制索引，并在分子替换中进行测试。对P21中索引的数据集的Xtriage分析显示，一个伪美罗耶德拉尔双胞胎遵循双法h，-k，-h-l。
使用多卡得利TmPep1050（PDB代码4P6Y）的单体坐标，仅对P21中索引的数据集找到分子替换解决方案，TFZ得分为28.9。因此，衍射数据被视为模型构建的孪生数据集。为了尽量减少分子替换的偏差，使用phenix.autobuild54，55建立了第一个模型。TmPep1050H60A H307A 的结构在Phenix和Coot中经过几个周期的自动和手动改进后完成（表1和图6A）。该结构确认了寡聚状态，单体之间的界面表面为1，710=2，而由PDBe Pisa 56计算的=iG为-16.2 kcalmol-1。 相比之下，二毛TmPep10502-mer的界面表面和+iG分别是1，673=2和-16.7千卡摩尔-1。
TmPep1050H60A H307A 的结构 与对齐时 RMS 为 0.774 的野生型二分型结构非常相似。重要的是，在两种结构中观察到相同的结构修改：+8和±10螺旋的高灵活性，无序活性位点Gln-196+Val-202，以及Lys-229+Ala-235和Lys-247+Ser 254的位移。这些修改以前与多德卡默形成的障碍，在没有其金属辅助因子11。然而，His-60和Sss-307的两个突变对Asp-168和Asp-62的侧链有轻微的影响。他们似乎被锁在与野生型二丁车不同的构象中（图6B）。由于没有 His-60 和 His-307，Asp-168 碳氧酸盐旋转 40°。因此，两种基丁残留物对于正确定位 Asp-168 碳氧酸盐以连接两个金属离子非常重要。Asp-62 侧链面向催化基点外的 Glu-18 碳酸盐。Asp-62可能在催化中发挥重要作用，因为它被假定为调节 His-60 的 pKa， 从而影响 M2 站点中的金属离子结合。此外，它可能在结构上与金属离子结合后催化场址的稳定有关，有利于多德卡默的形成。
图1：通过同源重组TM_1050的 ORF 克隆到 pBAD 向量的原理图表示。
ORF 的侧翼由两个 30 bp 序列同源到启动子 BAD 端和序列上游 PmeI 限制站点。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：TmPep1050纯化的色谱图。
（A） Anion 交换色谱.（B） 疏水相互作用色谱.吸收度 （Abs）， 以吸收度毫单位 （mUA） 表示，以普通线显示。电导率，以 mScm-1 表示，以虚线显示。灰色框指示 TmPep1050 在色谱图上分离的地点。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：尺寸排除色谱（A）TmPep1050多德卡默，（B）TmPep1050H60A H307A和（C）TmPep1050H60A。
使用包装在 120 mL 柱中的 SEC 树脂对样品进行分析。吸收度 （Abs） 以吸收度 （mUA） 的毫单位表示。（D） 以胸腺素 （T）、铁蛋白 （F）、阿尔多酶 （阿尔德）、康纳尔布明 （C） 和白蛋白 （Alb） 作为标准的 SEC 列的校准。相对质量的对数与洗脱体积的相关性是线性的，R2 为 0.91。95% 置信区间表示为点。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：TmPep1050H60A H307A 结晶优化。
（A） 第一个优化策略包括不同的pH值（介于4.5和6.0之间）与PEG3350浓度（介于5%至25%）之间。结晶板被设计，油井的颜色编码：红色表示沉淀，黄色表示多晶，绿色表示单晶。（B） 第二个优化策略包括使用稀释25倍的种子，pH值与PEG3350的更窄变化。（C） 晶体形状和大小之前（上图）和后（下图）结晶优化和微种子。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5：日志输出更正的摘录。由XS编制的TmPep1050H60A H307A 数据索引的LP。
上面板，可能的布拉瓦斯格子，最有可能是 m C，mP， 和oC.中间面板，在C2221 空间组索引的数据的整体统计。下面板，P21 空间组中索引数据的总体统计数据。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：TmPep1050H60A H307A的结构。
（A） TmPep1050H60A H307A 子单元（红色，PDB 代码 5NE9）与 dodecamer 子单元（白色、PDB 代码 6NW5）和二元子单元（蓝色、PDB 代码 5NE6）的结构对齐。箭头表示多德卡及其二把之间的结构差异。（B） TmPep1050H60A H307A 活动位点（红色）与 TmPep1050 二丁车（蓝色）和多德卡器（白色）的活动位点相比的特写。 请单击此处查看此图的较大版本。
| TmPep1050H60A H307A | |
| 数据采集 | |
| 温度 （K） | 100 |
| 辐射源 | 太阳前 2 |
| 波长 （+） | 0.9801 |
| 探测器 | 德特里斯 · 艾格 X 9 米 |
| 振荡范围 （+） | 0.1 |
| 曝光时间 | 0.025 |
| 空间组 | P 1 21 1 |
| 单位单元格参数 | |
| α, β, γ (°) | 90.00, 110.69, 90.00 |
| a、 b 、 c （*） | 43.24, 137.79, 61.11 |
| 分辨率 | 43.99 – 2.37 (2.52-2.37) |
| 独特的反射 | 26.902 |
| Rmerge （%） | 0.14 |
| 冗余 | 6,815 |
| 8.64 (2.12) | |
| 完整性（%） | 99.6 (97.9) |
| CC1/2 （%） | 99.2 (84.1) |
| 细化 | |
| 分辨率 | 43.99 – 2.37 |
| 思考 | 26.9 |
| R自由 设置测试计数 | 1345 |
| R工作/R免费 | 0.206/0.234 |
| 每个 ASU 的蛋白质分子 | 2 |
| VM （+3/Da） | 2.37 |
| 溶剂含量（%） | 49.0 |
| 蛋白质/溶剂原子 | 4,559/96 |
| r.m.s.d. 债券长度 （+） | 0.31 |
| r.m.s.d. 键角 （*） | 0.51 |
| 平均 B 因子 （+2） | 57.0 |
| 偏爱/不允许的拉马φ兰ψ（%） | 95.02 / 0.17 |
| 双法 | h， - k， - h - l |
| PDB 代码 | 5NE9 |
表1：数据收集和优化统计信息。 括号中的值用于最高分辨率的 shell。
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Discussion
此处描述的协议允许在结构层面上理解 TmPep1050 的二代多卡默过渡。该方法之前是用于确定两个TmPep1050寡聚物11的结构的经验。最具挑战性的一步是找到条件，促进多德卡人分离成稳定的暗化器。当添加金属离子辅助因子时，这些条件必须足够温和，才能将二丁二暗器重新关联到多德卡器中。寡聚物的分离也是关键的一步，因为它为结构研究和进一步的生化特性（例如，研究不同剂量的Co2+的多德卡默再关联）。分子替代是一种经过验证的相位测定方法，用于解决TmPep1050寡聚物的结构及其变异。拟议的协议可以适应研究其他金属酶，其寡聚化状态取决于其金属辅助因子的可用性。
为了说明该协议，提出了一个研究案例，TmPep1050H60A H307A，其金属结合位点因将 His-60和 His-307 变异到丙氨酸而受损。这些残留物分别结合M2和M1站点的Co 2+。金属结合的干扰会干扰寡聚化状态，并导致完全分离成单体。据报道，PhTET2和PFTET3存在这种现象的证据，其中两种M42氨基肽分别来自P.horikoshii和P.furiosus，分别是24、29。TmPep1050H60A H307A的行为没有预期，因为此变种仅形成二元。其结构显示与野生类型二元调器相同的修改，但有两个小例外。事实上，Asp-168和Satp-62的侧链似乎被锁在一个非常规的方向，以防止活动地点的稳定。它们的方向似乎是由 His-60 和 His-307 强加的，因为在单点突变变异中未观察到这种修改。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢马丁·罗弗斯对本文件进行校对，并提出建设性意见。访问 Proxima 2 光束线 （SOLEIL 同步加速器） 是在块分配组 20151139。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma-Aldrich | 13, 137-7 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC503096 | |
| Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Benzonase Nuclease | Merck Millipore | 70664-3 | |
| CCP4 | N/A | visit http://www.ccp4.ac.uk/ | |
| cOmplete EDTA-free | Roche | 5056489001 | |
| Coot | N/A | visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| Crystal Screen I | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen II | Hampton Research | HR2-112 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1082 | |
| EasyXtal 15-well tool | NeXtal | 132007 | |
| Escherichia coli PPY strain | N/A | see reference 31 | |
| Escherichia coli XL1 blue strain | Agilent | 200249 | |
| Gel Filtration Calibration Kit HMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-42 | |
| Gel Filtration Calibration Kit LMW | GE Healthcare Life Sciences | 28-4038-41 | |
| Gel Filtration Standard | Biorad | 1511901 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | K0503 | |
| Index | Hampton Research | HR2-144 | |
| Litholoops | Molecular Dimensions | ||
| L-leucine-p-nitroanilide | Bachem AG | 40010720025 | |
| Natrix 1 | Hampton Research | HR2-116 | |
| Natrix 2 | Hampton Research | HR2-117 | |
| Neggia plugin | Dectris | N/A | visit https://www.dectris.com/ |
| NeXtal Tubes JCSG Core Suite I | NeXtal | 130724 | |
| NeXtal Tubes JCSG Core Suite II | NeXtal | 130725 | |
| NeXtal Tubes JCSG Core Suite III | NeXtal | 130726 | |
| NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV | NeXtal | 130727 | |
| pBAD-TOPO | ThermoFisher Scientific | K430001 | |
| Phenix | N/A | visit https://www.phenix-online.org/ | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | ThermoFisher Scientific | F-530L | |
| Salt RX 1 | Hampton Research | HR2-107 | |
| Salt RX 2 | Hampton Research | HR2-109 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO | ThermoFisher Scientific | 88242 | |
| Source 15Phe | GE Healthcare Life Sciences | 17014702 | |
| Source 15Q | GE Healthcare Life Sciences | 17094705 | |
| Superdex 200 prep grade | GE Healthcare Life Sciences | 17104301 | |
| Thermotoga maritima MSB8 strain | American Type Culture Collection | ATCC 43589 | |
| TmCD00089984 | DNASU Plasmid Repository | N/A | |
| XDS | N/A | visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/ | |
| xdsme | N/A | visit https://github.com/legrandp/xdsme |
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