Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang af Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61288
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology, Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Denne protokol er udviklet til at studere dimer-dodecamer overgang af TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på det strukturelle niveau. Det er en enkel rørledning, der starter fra proteinrensning til røntgendatabehandling. Crystallogenesis, datasæt indeksering, og molekylær udskiftning er blevet understreget gennem et studie, TmPep1050H60A H307A variant.

Abstract

Den M42 aminopeptidases form funktionelt aktive komplekser lavet af 12 underenheder. Deres samling proces synes at være reguleret af deres metal ion cofaktorer udløser en dimer-dodecamer overgang. Ved metalionbinding sker der flere strukturelle ændringer på det aktive sted og ved interaktionsgrænsefladen, der former dæmninger for at fremme selvsamlingen. For at observere sådanne ændringer skal stabile oligomerer isoleres forud for strukturundersøgelsen. Rapporteret her er en metode, der tillader rensning af stabile dodecamers og dimers af TmPep1050, en M42 aminopeptidase af T. maritima, og deres struktur bestemmelse ved X-ray krystallografi. Dimers blev fremstillet af dodecamers ved at fjerne metalioner med et chelaterende middel. Uden deres cofactor blev dodecamers mindre stabile og blev fuldt adskilt ved opvarmning. De oligomeriske strukturer blev løst ved hjælp af den enkle molekylære udskiftningsmetode. For at illustrere metoden præsenteres strukturen af en TmPep1050-variant, der er fuldstændig svækket i metalionbinding, og som ikke viser nogen yderligere opdeling af dimers til monomerer.

Introduction

Oligomerization er en fremherskende proces, der dikterer de biologiske funktioner af mange proteiner. I Escherichia colianslås det, at kun 35 % af proteinerne er monomeriske1. Nogle proteiner, kaldet morfeeeiner, kan endda vedtage flere oligomeriske tilstande med underenheder med særskilt struktur i hver oligomeric tilstand2. Overgangen mellem deres oligomeriske tilstande er ofte et middel til at regulere protein aktivitet som hver oligomeric tilstand kan have en anden specifik aktivitet eller funktion. Flere eksempler på morfeseiner er veldokumenteret i litteraturen, navnlig porphobilinogensyntase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, laktat dehydrogenase6, glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase7, pyruvatkinase8, citratsyntetase9og ribonuclease A10. For nylig har vi beskrevet M42 aminopeptidase TmPep1050, et andet eksempel på enzym med morfemein-lignende adfærd, hvis aktivitet afhænger af dens oligomeric stater11. Overgangen mellem dens oligomeriske tilstande er medieret af dens metalliske cofaktorer, som fremkalder flere strukturelle ændringer af underenheder.

Den M42 aminopeptidase familien tilhører MH klan12,13, og er udbredt blandt bakterier og Archaea14. M42 aminopeptidases er ægte dinuclear enzymer nedbrydende peptider op til 35 aminosyre rester i længde15. De vedtager en ejendommelig tetrahedron-formet struktur lavet af 12 underenheder med deres aktive steder orienteret mod en indre hulrum. Et sådant arrangement beskrives ofte som en nanoopdelte aktivitet for at undgå ukontrolleret proteolyse. Den fysiologiske funktion af M42 aminopeptidases kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge af proteinnedbrydning 16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidases, hver præsenterer forskellige, men komplementærespecificiteter 18,19,20,21. Ental, heterocomplexes lavet af to forskellige typer af underenheder er blevet beskrevet i P. horikoshii, hvilket tyder på eksistensen af peptidasome komplekser22,23.

Flere strukturer af M42 aminopeptidaser er blevet beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheden består af to forskellige domæner, et katalytisk domæne og et dimeriseringsdomæne. Den katalytiske domæne vedtager en fælles α/ β fold bevaret i hele MH klan, den arketypiske katalytiske domæne er aminopeptidase Ap1 af Vibrio proteolyticus27. Den dimerization domæne vedtager en PDZ-lignende fold16 og kan have, ud over sin rolle i oligomerization, en rolle i at kontrollere substrat adgang og bindende i det indre hulrum11. Da den grundlæggende byggesten er en dimer, dodecamer er ofte beskrevet som sammenslutningen af seks dimers, hver dimer er placeret på hver kant af tetrahedron16. Den oligomerization af M42 aminopeptidases bygger på tilgængeligheden af sine metal cofaktorer. Divalente metalioner, ofte Zn2+ og Co2+,er katalytisk involveret i peptidbindingen og hydrolyse. De findes i to forskellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 sites. De to metalioner også køre og finjustere oligomerization som påvist for PhTET2, PhTET3, PfTET3, og TmPep105011,24,28,29. Når metal cofaktorer er opbrugt, dodecamer demonterer i dimers, ligesom i PhTET2, PhTET3, og TmPep105011,16,28, eller endda monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.

Præsenteret her er en protokol, der anvendes til at studere strukturerne i TmPep1050 oligomers. Denne protokol er et sæt af almindelige metoder, herunder proteinrensning, proteolytisk aktivitet screening, krystallisering, X-ray diffraktion, og molekylær udskiftning. Finesser iboende beskæftiger sig med metalloenzymer, protein oligomerisering, protein krystallisering og molekylær udskiftning understreges. Et studieeksemier præsenteres også for at vise, om TmPep1050 dodecamers yderligere kan dissociate i monomerer eller ej. For at løse dette spørgsmål, en TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, er blevet undersøgt, hvis metal bindingssteder er svækket ved at mutere His-60 (M2 site) og His-307 (M1 site) til Ala rester. Denne protokol kan indkvarteres til at studere andre M42 aminopeptidases eller metalloenzymer med morfem-lignende adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion og rensning af rekombinant TmPep1050

BEMÆRK: Herefter beskrives kloningsproceduren og rensningen af vildtypen TmPep1050 tilpasset fra en tidligere undersøgelse11. Alternativt kan kloning gøres ved hjælp af et syntetisk gen. For at generere TmPep1050 varianter, site rettet mutagenesis kan udføres efter, for eksempel, single-primer reaktioner i parallel protokol (SPRINP) metode30. Renselsesprotokollen kan bruges til TmPep1050 varianter. Brugen af Hans-tag bør undgås, da det forstyrrer metal ion binding.

  1. Udtryksvektordesign
    1. Anskiv genomisk DNA af Thermotoga maritima MSB8 (ATCC 43589) eller TmCD00089984 (Joint Center for Structural Genomics).
    2. Forstærke TM_1050 åben læseramme (ORF) ved hjælp af enten genomisk DNA eller skabelonplasmid, en high-fidelity DNA polymerase, og følgende primere: ocej419 (5'- TTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGAAGGAACTGATCAGAAAGCTG) og ocej420 (5'- ATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGAGAGAGAGAGTACCCCCAGATACCTGATGATGAG). Screening af polymerasekædereaktionen (PCR) i henhold til følgende ordning: 5 min ved 95 °C, 30 cyklusser af 3 trin (30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 90 s ved 72 °C) og 10 min. ved 72 °C som det sidste trin.
    3. Clone PCR-fragmentet til en egnet ekspressionsvektor (Materialetabel) ved homolog rekombination (Figur 1) i E. coli i henhold til SLiCE-protokol31. Til 50 ng lineariseret vektor, tilføje PCR fragment i en 10:1 kindtand forholdet mellem fragment til vektor, 1 μL PPY-stammeekstrakt, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2,10 mM ATP og 10 mM dithiothreitol (DTT) for et reaktionsvolumen på 10 μL. Inkubat i 1 time ved 37 °C.
    4. Transformer kemisk kompetent E. coli XL1 blå stamme (eller en eventuel recA- passende stamme) med 1 μL rekombinationsreaktion. Cellerne på LB-mediet, der indeholder 100 μg/ml ampicillin. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
    5. Pluk kolonier på friske LB plader med 100 μg/mL ampicillin. Pladerne inkuberes ved 37 °C i mindst 8 timer.
    6. Skærm for positive kandidater ved koloni PCR ved hjælp af passende primer par (5'- ATGCCATAGCATTTTTATCC og 5'- ATTTAATCTGTATCAGGC, hvis du bruger den anbefalede vektor, der er anført i Tabel over Materialer). Med en mikrotipende ridses en plukket koloni, og cellerne overføres til 20 μL reaktionsblanding indeholdende 0,5 μM af hver primer og 10 μL af en kommerciel Taq DNA polymeraseblanding.
    7. PCR-screeningen køres i henhold til følgende skema: 5 min ved 95 °C som denatureringstrin, 30 cyklusser på 3 trin (30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 90 s ved 72 °C) og 10 min. ved 72 °C som det sidste trin.
      BEMÆRK: PCR-reaktionerne kan opbevares natten over i PCR-maskinen ved 12 °C.
    8. Der indlæses 10 μL af hver PCR-reaktion på en 0,8% agarosegel fremstillet i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer. Kør elektroforese i 25 min ved 100 V.
      BEMÆRK: Der forventes en 1,1 kbp amplicon.
    9. Uddrag plasmider fra kandidater ved hjælp af en kommerciel kit (Tabel over Materialer) og sekvens dem ved hjælp af samme primer par, der anvendes i trin 1.1.6.
  2. Cellekultur
    BEMÆRK: Når en egnet kandidat er blevet identificeret ved sekvensering, kan klonen bruges direkte som udtryk, hvis du bruger den anbefalede vektor (Tabel over Materialer). I så fald styres udtrykket af den arabinose-inducerende PBAD promotor32.
    1. Inokuler 10 ml LB-medium, der indeholder 100 μg/ml ampicillin, med kandidaten, og inkuber prækulturen natten over ved 37 °C under orbital rystelser. Der tilsættes 5 ml prækultur til 1 L LB-medium med 100 μg/mL ampicillin. Sind til at respektere en luft til væske forhold på 3.
    2. Lad cellerne vokse ved 37 °C under orbital rystelser. Den optiske massen overvåges ved 660 nm (OD660).
    3. Når OD660 har nået 0,5−0,6, skal kulturen hurtigt afkøles i 5 minutter på is og overføres til en kuvøse indstillet til 18 °C.
    4. Der tilsættes 0,2 g/L arabinose for at fremkalde genekspression og inkuberes i 12−18 timer ved 18 °C.
    5. Høst celler ved centrifugering af kulturen ved 6.000 x g i 30 min. ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes med 100 ml 0,9 % (w/v) NaCl.
    6. Centrifuge igen ved 6.000 x g i 15 minutter ved 4 °C og kassér supernatanten.
      BEMÆRK: Cellepiller kan anvendes direkte til proteinekstraktion eller opbevares ved -80 °C.
  3. Rensning af proteiner
    1. Resuspend cell pellets i 40 ml 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2. Der tilsættes 1 μL 25 U/μL DNA/RNA endonuclease og en tablet proteasehæmmercocktail, som ikke indeholder EDTA. Sonikere suspensionen i pulstilstand under afkøling i 30 min.
    2. Centrifuge rå ekstrakt ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C. Opsaml supernatanten, og varm den op i et vandbad ved 70 °C i 10 min.
    3. Centrifuge denaturerede celleekstrakt ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C og opsaml supernatanten til rensning.
    4. Brug egnet anionbytter harpiks (Tabel over Materialer) pakket i en kolonne på ~ 15 ml volumen. Se producentens anbefalinger for driftsflowet og kolonnetrykgrænsen. Ligevægt harpiksen med 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7.2.
    5. Indlæs den superbredet, der er indsamlet fra trin 1.3.3, i kolonnen. Absorbansen af eluatet ved 280 nm. Når den har nået basislinjen, skal du fortsætte til eluering.
    6. Anvend en gradient fra 0 til 0,5 M NaCl i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 for 5 kolonnemængder (CV). Vent, indtil ledningsevnen er stabiliseret, og absorbansen har nået basislinjen.
    7. Anvend en endelig gradient fra 0,5 til 1 M NaCl i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 for 1 CV.
    8. Analysere nogle fraktioner (se Figur 2A for vejledning) ved natrium dodecylisulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE).
      BEMÆRK: TmPep1050 fremstår som et 36 kDa-bånd efter Coomassie-farvning. Alternativt kan tilstedeværelsen af TmPep1050 bekræftes ved aktivitetsanalyse (se p. 2.1). Ved dette trin kan brøker opbevares ved 4 °C natten over.
    9. De fraktioner, der indeholder TmPep1050, sammenføjs, og der tilsættes fintmalet pulver (NH4)2SO4 for at opnå en koncentration på 1,5 M (NH4)2SO4. Bland forsigtigt ved at vende røret på hovedet indtil fuldstændig opløsning.
    10. Brug hydrofobisk interaktions harpiks (Materialetabel) pakket i en kolonne på ~30 ml volumen. Se producentens anbefalinger for driftsflowet og kolonnetrykgrænsen. Ligevægt harpiks med 50 mM MOPS, 1,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2, pH 7,2.
    11. Prøven anbringes på kolonnen, og eluatets absorbans skal bæres ved 280 nm. Når absorbansen har nået basislinjen, eluterede proteiner ved at anvende en gradient fra 1,5 M til 0 M (NH4)2SO4 i 50 mM MOPS, 1 mM CoCl2, pH 7,2 for 5 CV.
    12. Analysér nogle brøker (se Figur 2B for vejledning) efter SDS-PAGE.
      BEMÆRK: TmPep1050 fremstår som et 36 kDa-bånd efter Coomassie-farvning. Alternativt kan tilstedeværelsen af TmPep1050 bekræftes ved aktivitetsanalyse (se p. 2.1). Ved dette trin kan brøker opbevares ved 4 °C natten over.
    13. Pool de fraktioner, der indeholder TmPep1050, og koncentrat til 2 ml ved hjælp af ultrafiltreringsenheder med 30 kDa cutoff (Materialetabel). Fortsæt til punkt 1.4 for at bestemme molekylvægten.
  4. Størrelse udelukkelse kromatografi
    1. Brug størrelse ekskluderings harpiks (Materialetabel) pakket i en kolonne med ~120 ml volumen. Se producentens anbefalinger for driftsflowet og kolonnetrykgrænsen. Ligevægt harpiks med 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2, pH 7,2.
    2. Prøven anbringes på kolonnen, og eluatets absorbans skal bæres ved 280 nm. Fraktioneret fra kolonnen døde volumen (~ 0,33 CV) indtil udgangen af elution (1 CV).
    3. Mål elutionsvolumenet for hver observeret top.
      BEMÆRK: For vejledning, dodecameric TmPep1050 elutes på ~ 82 ml (Figur 3A) under de nuværende eksperimentelle forhold, mens dimeric TmPep1050, såsom TmPep1050H60A H307A variant, elutes på ~ 95 ml (Figur 3B). Nogle TmPep1050 kan vedtage både oligomeriske former, såsom TmPep1050H60A (Figur 3C).
    4. Analysér brøker, der svarer til maksime og haler af observerede toppe ved hjælp af SDS-PAGE.
      BEMÆRK: TmPep1050 fremstår som et 36 kDa-bånd efter Coomassie-farvning.
    5. Fraktioner af hver top og koncentrat ved hjælp af ultrafiltreringsenheder med 30 kDa cutoff (Tabel over Materialer) for at opnå en koncentration på ~300 μM.
    6. Absorbansen måles ved 280 nm på et nanovolumenspektrofotometer, og koncentrationen beregnes ved hjælp af den molekylære udryddelseskoefficient på 18.910 M-1 cm-1.
    7. Det rensede protein opbevares ved -18 °C.
    8. For at bestemme molekylvægten skal du kalibrere kolonnen for ekskludering af størrelsesudelukkekromatografi (SEC) ved hjælp af molekylvægtstandarder (Materialetabel). Analysér standarderne ved hjælp af 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4,1 mM CoCl2 pH 7,2 som løbebuffer.

2. Aktivitetsanalyse og apo-enzympræparat

BEMÆRK: Oprindeligt blev apo-enzymet fremstillet ved at fortynde 1 volumen af TmPep1050 i 10 volumener af 2,1 M æblesyre pH 7.0 og koncentrere sig tilbage til 1 volumen før dialyse11. Nedenfor præsenteres en alternativ procedure ved hjælp af 1,10-phenanthrolin, en metal ion chelator. Denne procedure reducerer proteintab og giver de samme resultater end den tidligere offentliggjorte metode.

  1. Aktivitetsanalyse
    1. Der klargøres en lageropløsning på 100 mM L-Leucine-p-nitroanilid (Materialetabel) i methanol.
    2. Der tilsættes 25 μL 100 mM L-Leucin-p-nitroanilid i 965 μL på 50 mM MOPS, 250 μM CoCl2, pH 7,2, 10% methanol. Reaktionsblandingen blandes på forhånd ved 75 °C i et tørt bad.
    3. Enzymet fortyndes i 50 mM MOPS pH 7,2 til en koncentration på 1 μM. Tilsæt 10 μL til reaktionsblandingen, vortex og inkuber ved 75 °C, enten indtil den er blevet gullig eller i 1 time.
    4. Stop reaktionen ved at tilsætte 1 ml 20% eddikesyre. Vortex godt og lad det køle ned til stuetemperatur.
    5. Reaktionsblandingen overføres i en spektrofotometercelle. Absorbansen ved 410 nm aflæses mod en negativ kontrol (inkuberet reaktionsblanding uden enzym).
  2. Apo-enzympræparat
    1. Forbered en lageropløsning på 1 M 1,10-phenanthrolin i ethanol. Der tilsættes 10 μL 1,10-fænokronisk lageropløsning til 890 μL på 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Der tilsættes 100 μL renset TmPep1050 (300 μM−1 mM koncentration).
    2. Kontrollér aktivitetstabet ved hjælp af den aktivitetsanalyse, der er beskrevet i punkt 2.1, uden at tilsætte CoCl2 i reaktionsblandingen.
    3. Prøven overføres i et dialyserør. Dialyze mod 200 ml 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2 ved 4 °C. Byt tre gange dialysate med frisk buffer i løbet af 48 h dialyse.
    4. Prøven udtages af dialyserøret, og koncentratet tilbage til 100 μL ved hjælp af ultrafiltreringsenheder med 30 kDa cutoff (Materialetabel). Koncentrationen kontrolleres ved at aflæsning af absorbansen ved 280 nm ved hjælp af et nanovolumenspektrofotometer.
  3. Dimer forberedelse
    1. Apo-enzymet fortyndes med en koncentration på 1 μM i 50 mM MOPS, 0,5 M (NH4)2SO4, pH 7,2. Inkuber i 2 timer ved 75 °C i et tørt bad, og lad prøven køle af til stuetemperatur.
    2. Prøven koncentreres med en enzymkoncentrat på mindst 50 μM. Kontroller molekylvægten efter SEC (se punkt 1.4). Elution-toppen skal skifte fra ~ 82 ml til ~ 95 ml (under de nuværende forsøgsforhold).

3. TmPep1050 krystallisering

BEMÆRK: Proteinkrystisering er fortsat en empirisk videnskab, da det er et multifaktorielt fænomen33. Mens nogle parametre kan identificeres og kontrolleres (såsom temperatur, pH, nedbørsstof koncentration), andre kan påvirke undvigende krystallisering (såsom protein og kemisk renhed, proteolyse, prøve historie). I dag bekæmpes proteinkrystisering på en rationel og systematisk måde takket være en flok kommercielle krystalliseringsscreeningsbetingelser og automatisering. Optimering af en krystallisering tilstand, dog, er mest afhængig af en trial-and-error tilgang. Herefter er beskrevet en plan for krystallisering proteiner og flere tips til optimering af krystallisering betingelser.

  1. Krystallisering screening
    BEMÆRK: Ved hjælp af kommerciel krystalliseringssæt er krystaller af dodecameric TmPep1050 opnået i 2,2 M DL-æblesyre pH 7,0, 0,1 M Bis-Tris propan pH 7,0 og 0,18 M tri-ammoniumcitrat, 20% polyethylengogencolly (PEG) 3350. Krystaller af dimeric TmPep1050 er opnået i 0,1 M natriumcitrat pH 5,6, 0,2 M ammoniumacetat, 30% PEG4000. Krystaller af dodecamers vises inden for en uge og nå deres fulde størrelse i en måned. Krystaller af dimers vises normalt inden for 24 timer og vokse til fuld størrelse i en uge.
    1. Erhverve flere kommercielle krystallisering kits (se Tabel over materialer for eksempler).
    2. Konfigurer krystalliseringsplader (Materialetabel )til den hængende dråbemetode. Fyld brøndene med 500 μL af hver opløsning af et krystalliseringsscreeningssæt.
    3. For hver brønd, oprette en krystallisering støtte. På støtten deponeres en 1 μL dråbe renset protein (normalt ~10 mg/ml).
    4. Straks pipet 1 μL krystalliseringsopløsning fra brønden. Tilsæt det forsigtigt til protein dråbe og bland forsigtigt ved pipetting på hovedet tre gange. Dråben skal forblive semisfærisk uden bobler.
    5. Skru støtten oven på den tilsvarende brønd. Gentag handlingen for hele sættet.
    6. Efter opsætning af pladerne, observere hver dråbe med en kikkert. Se brugsvejledningen til krystalliseringssættet for fortolkning (klar dråbe, faseadskillelse, bundfald, nåle osv.).
    7. Indkuvning pladerne ved 20 °C. Kontroller pladerne én gang om dagen i løbet af den første uge og en gang om ugen bagefter.
    8. Score hver godt ved hjælp af score ark og brugervejledningen leveres med krystallisering kits.
  2. Optimering af krystallisering
    BEMÆRK: De indledende krystalliseringsbetingelser for dodecameric TmPep1050 er optimeret til 2,1 M DL-æblesyre pH 6,75 og 0,18 M tri-ammoniumcitrat pH 7,5, 40% (w/v) PEG3350, mens krystalliseringstilstanden for dimeric TmPep1050 er blevet flyttet til 0,1 M natriumcitrat pH 6,0, 10% (w/v) PEG3350. En cyklus af såning har været nødvendigt at forbedre krystallinitet. Herefter er beskrevet, hvordan krystallisering af TmPep1050H60A H307A variant er blevet optimeret.
    1. Forbered lageropløsninger på 0,5 M natriumcitratbuffer ved forskellige pH-zoner (4,5, 5,2 og 6,0) og 50 % (w/v) PEG3350-opløsning.
    2. Opret en krystalliseringsplade som en matrix af pH vs. udfældningsmiddel (se figur 4A).
    3. Pladen inkuberes ved 20 °C. Overhold hver brønd med en kikkert en gang om dagen i løbet af en uge.
    4. Score hver godt i henhold til krystal størrelse og form. Vælg en tilstand, der giver krystaller på mindst 50 μm. Fortsæt til mikroseeding.
  3. Mikroseeding
    BEMÆRK: Microseeding er en kraftfuld metode til at forbedre formen, størrelsen og krystalliniteten af proteinkrystaller34. En hurtigere såning tilgang er streak såning ved hjælp af en kat whisker. Se figur 4 som et eksempel på, hvordan krystalliseringsoptimering og mikroindseelse har forbedret krystalformen og -størrelsen for TmPep1050H60A H307A.
    1. Forbered frøene ved hjælp af den valgte brønd i trin 3.2.4.
    2. Forøg volumen af en dråbe indeholdende krystaller til 10 μL ved at tilføje krystalliseringsopløsning fra brønden. Pipet dråben og tilsæt 90 μL krystalliseringsopløsning fra brønden. Vortex grundigt og holde frøene på is.
    3. Forbered flere fortyndinger af frøene: 1x, 10x, 25x og 100x. Vortex godt frøene før pipettering. Hold fortyndingerne på is.
    4. For hver frøfortynding skal der opstilles en krystalliseringsplade som matrix af pH vs. udfældningsmiddel (se figur 4B). Brug de lagerløsninger, der er udarbejdet i trin 3.2.1.
    5. Når dråben laves, tilsættes 0,2 μL frø til en 2 μL dråbe. Pladen inkuberes ved 20 °C. Overhold hver brønd med en kikkert en gang om dagen i løbet af en uge.
      BEMÆRK: Krystalstørrelsesfordeling og -form skal forbedres, se Figur 4C som et eksempel på TmPep1050H60A H307A. Til yderligere anvendelse kan frø opbevares ved -20 °C.

4. Røntgendiffraktion

  1. Krystal plukning
    BEMÆRK: Prøveforberedelsen afhænger af røntgenkildefaciliteten (hjemmefacilitet vs. synkrotron). Brug lagerenheder (hætteglas og hætteglassekurv) i overensstemmelse hermed. Tilsætning af kryobeskyttelsesmiddel (såsom glycerol) kan være nødvendig afhængigt af salt/udfældningsmiddel koncentration. For TmPep1050 krystaller er en kryobeskyttende ikke nødvendig, da PEG- eller bufferkoncentrationen er høj nok til at undgå vandkrystaller.
    1. Forbered et bad fyldt med flydende nitrogen, eventuelle hætteglas eller kurv, der anvendes til prøvehåndtering.
    2. Opsæt prøveplukningssløjfe i forskellige størrelser: 100, 150 og 200 μm (Materialetabel). Vælg størrelserne i henhold til krystalstørrelsen.
    3. Ved hjælp af en kikkert, kontrollere dråben indeholder krystaller og stedet isolerede krystaller (den nemmeste at vælge). Med en løkke skal du forsigtigt vælge en krystal fra bunden. Sløjfe i flydende nitrogen kastes straks i et egnet hætteglas.
  2. Dataindsamling
    BEMÆRK: Dataindsamlingen kan variere meget afhængigt af røntgenkilden (hjemmefacilitet vs. synkrotron) og detektorfølsomhed. Indsamlingsstrategien kan også variere meget fra en prøve til en anden, afhængigt af opløsningen, spotintensiteten, rumgruppen osv. Emnet er blevet grundigt gennemgået af Dauter35.
    1. Monter løkken med krystallen på joniometerhovedet af diffractometeret.
    2. Stil goniometerhovedet langs XYZ-akserne for at justere krystallen med røntgenstrålestien.
    3. Indstil bølgelængden til 0,98 Å og flyt detektoren for at få 2 Å opløsning.
    4. Start en kort dataindsamling ved at erhverve billeder i mindst to forskellige krystalretninger. Tag 10 billeder (1 billede pr. 0,1°) ved 0° og 90°.
    5. Tjek de indsamlede billeder med passende software (f.eks ADXV, XDS-Viewer eller Albula Viewer). Bestemme staffagefarveintensiteten og den højeste opløsning, hvor pletter ses. Kontroller også monokrystallinitet og spot adskillelse.
    6. Til sidst gentages trin 4.2.3−4.2.5 ved at ændre detektorpositionen for højere eller lavere opløsning og eksponeringstiden i overensstemmelse med observationen.
    7. Start dataindsamling omkring 360° med 1 billede taget pr. 0,1°. Husk at indstille detektorens position og eksponeringstiden optimalt.

5. Indeksering, molekylær udskiftning og modelbygning

  1. Indeksering
    BEMÆRK: Indeksering er en metode til måling af diffraktionspletters intensitet, hvilket giver amplituder afstrukturfaktorerne 36. Fire softwarepakker bruges ofte til behandling af indsamlede billeder: Mosflm37, HKL200038, DIALS39og XDS40. Sidstnævnte er blevet anvendt til indeksering af datasæt fra TmPep1050 krystal diffraktion.
    1. Installer XDS-pakken og XDSME41. Hvis behandling HDF5 filer, installere XDS Neggia plugin (tilgængelig på Dectris hjemmeside). Du kan finde flere oplysninger på XDS wiki-https://strucbio.biologie.uni-konstanz.de/xdswiki/index.php/Main_Page og XDSME-https://github.com/legrandp/xdsme.
    2. Før du behandler data, skal du oprette en mappe, hvorfra XDS skal køres. Find stien til billederne.
    3. Hvis du vil køre XDSME, skal du skrive xdsme /path_to_images/image.extension i et terminalvindue.
    4. Når XDS har afsluttet jobbet, skal du kontrollere korrekt. LP-fil. Bemærk sandsynligheden for pladsgruppebestemmelse, data fuldstændighed, den højeste opløsning, krystalmosaik og datakvalitet. Kontroller også XDS_pointless.log for at opnå sandsynligheden for pladsgrupper.
      BEMÆRK: Se figur 5 som et eksempel på output.
    5. Kør XDSME igen med forskellige rumgruppeløsninger, der foreslås af XDS i separat mappe for at undgå at overskrænker den forrige proces. Skriv xdsme -s space_group_name -c "unit_cell_parameters" /path_to_images/image.extension (f.eks. xdsme -s P21 -c "43.295 137.812 61.118 90.000 110.716 90.000).
    6. Kontroller KORREKT. LP filer og vælge den bedste løsning baseret på data statistik.
    7. Kør XSCALE ved at xscale.py XDS_ASCII. HKL. Kør XDSCONV ved at xdsconv.py XSCALE. HKL ccp4.
      BEMÆRK: I nogle tilfælde identificerer XDSME ikke mellemrumsgruppen eller skærer ikke opløsningsområdet korrekt eller genererer underlige datastatistikker. Hvis et sådant problem opstår, er det værd at køre XDS indbygget. Der skal indføres flere parametre i XDS. INP-initieringsfil (se XDS wiki-side). Når du bruger XDS, kan sandsynligheden for mulige mellemrumsgrupper kontrolleres ved hjælp af Pointless, en del af CCP4 pakke42. Hvis du vil klippe datasætopløsningen,accepteres R meas < 60 % og I/σ ~2 almindeligvis for at bestemme den højesteopløsning 43. Den molekylære udskiftning og modelfinering kan dog forbedres ved at udvide opløsningen til I/σ ~0,5−1,5 og CC1/2 ned til 0,2−0,444.
  2. Molekylær udskiftning
    BEMÆRK: Eksperimentelle data giver adgang til amplitude af strukturelle faktorer, men uden at kende fasen, de er ubrugelige. Fasen kan bestemmes eksperimentelt ved forskellige metoder, der er baseret på et unormalt signal (fra et tungt atom, for eksempel)45. Molekylær udskiftning er en anden metode til bestemmelse af fasen uden et unormalt spredende atom46,47. Denne metode bruger koordinaterne for et relateret molekyle til at finde og forbedre fasen iterativt. Vi bruger Phaser48 i Phenix GUI49 til molekylær udskiftning.
    1. Forbered startmodellen til molekylær udskiftning ved hjælp af 4P6Y-koordinater. Fra pdb-filen skal du udtrække monomer A og afkorte dens aminosyrer i alanin ved hjælp af PDB-fileditoren i Phenix (under fanen Modelværktøjer).
    2. Kør Xtriage i Phenix (under fanen Dataanalyse) med refleksionsfilen genereret af XDSCONV (5.1.9) og sekvensen som input.
    3. Kontroller logfilen fra Xtriage. Bemærk fuldstændigheden, antallet af underenheder i den asymmetriske enhed, anisotropi, tilstedeværelsen af isringe og venskabsbyforekomst.
    4. Kør Phaser-MR i Phenix (under fanen Molekylær erstatning) for molekylær erstatning ved hjælp af refleksionsfilen, sekvensen og start 4P6Y-modellen afkortet i polyyrin (trin 5.2.1).
    5. Ved afslutningen skal du kontrollere, om der er fundet en model, og scoren for den molekylære udskiftning. En oversættelsesfaktor Z-score (TFZ) på mindst 8 angiver, at løsningen er endeligt korrekt.
  3. Modelbygning
    BEMÆRK: Når fasen er bestemmet ved molekylær udskiftning, skal modellen bygges og raffineres. Denne protokol bruger Phenix GUI49 til automatisk bygning og iterative forbedringer og Coot50 til manuel strukturbygning og raffinement.
    1. Efter molekylær udskiftning ved hjælp af Fase-MR i Phenix, skal du vælge Kør Autobuild. Alle de nødvendige filer vil automatisk blive tilføjet. Du skal blot trykke på Kør for at starte autobuild.
    2. Når du er færdig, skal du kontrollere modellen i Coot. Byg og forfine modellen manuelt i henhold til elektrontæthedskortet i Coot.
    3. Afgræns den manuelt kuraterede model i Phenix (under fanen Forfinelse) ved hjælp af modellen, sekvensen og diffraktionsdataene som input. Se Phenix hjælp til at vælge den rigtige strategi.
    4. Efter raffinement, kontrollere resultaterne: Rfri og Rarbejde skal falde, Molprobity51 indikatorer skal overholdes, og outliers med lav real-space korrelation skal begrænses.
    5. Gentag trin 5.3.2−5.3.4, indtil den bedste raffinerede model er genereret.
    6. Kør Molprobity på serveren: http://molprobity.biochem.duke.edu/. Tjek eventuelle outliers identificeret af Molprobity.
    7. Til sidst gentage trin 5.3.2−5.3.6 indtil den bedste raffinerede model er opnået.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at studere en mulig dodecamer dissociation i monomerer i TmPep1050, hans-60 og Hans-307 codons blev erstattet af alanin codon ved hjælp af et syntetisk gen. Dette gen blev derefter klonet i pBAD vektor for udtryk og rensning af den tilsvarende TmPep1050 variant efterfølgende opkaldt TmPep1050H60A H307A. Størrelseseksklusivekromatografi (Figur 3B) viste, at det rensede protein havde en tilsyneladende molekylvægt på 56 kDa (molekylvægt af monomeren er 36,0 kDa). En lignende tilsyneladende molekylvægt, 52 kDa, er blevet rapporteret for TmPep1050 dimer11. Derfor kan den oligomeriske tilstand af TmPep1050H60A H307A udledes som dimeric. Med hensyn til sin specifikke aktivitet var TmPep1050H60A H307A fuldstændig inaktiv på L-Leu-pNA som substrat, selv i nærværelse af koboltioner. Dette resultat tyder stærkt på, at varianterne ikke kan binde nogen metalioner.

Krystalliseringsbetingelsen for TmPep1050H60A H307A blev optimeret ved varierende pH vs. PEG-koncentration (Figur 4) omkring dimerens tilstand (dvs. 0,1 M natriumcitrat pH 6,0 10% PEG3350). De bedste krystaller af TmPep1050H60A H307A blev opnået i 0,1 M natriumcitrat pH 5,2 20% PEG3350 med en cyklus af microseeding for at forbedre monokrystallinitet. Et komplet datasæt blev indsamlet på Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) ved en opløsning 2.36 Å (Tabel 1). Dataindeksering viste, at rumgruppen af TmPep1050H60A H307A krystal er C2221, men XDS foreslået en anden løsning, mP rumgruppen (se figur 5). Ifølge Pointless var sandsynligheden for, at der var 0,711 og 0,149 C22 1- og P21-rumgrupper. Ifølge datakvalitetsanalysen findes der to monomerer i den asymmetriske enhed. Xtriages analyse viste , at datasættet sandsynligvis er venskabsby, men venskabsbysamarbejde i C2221-rumgruppen er usandsynlig52. Twinning skyldes krystalvækstomamala, hvor flere bestemte domæner har nogle af deres gitterretninger parallelt med hinanden53. Twinning kan også skyldes en højere krystalsymmetri, hvilket indikerer en fejlagtig dataindeksering. Derfor kan en pseudo-merohedral tvilling eksistere, således at en P21 krystal gitter ligner en C2221. Datasættet blev efterfølgende indekseret i rumgruppe P2 1 ogtestet i molekylær udskiftning. Xtriage analyse af datasættet indekseret i P21 afslørede en pseudo-merohedral tvilling efter en dobbelt lov h, -k, -h-l.

Ved hjælp af koordinaterne for en monomer fra dodecameric TmPep1050 (PDB kode 4P6Y) blev der fundet en molekylær erstatningsløsning for datasættet, der kun er indekseret i P21, med en TFZ-score på 28,9. Derfor blev diffraktionsdataene behandlet som et sammentødret datasæt til modelbygning. For at minimere bias af molekylær udskiftning, en første model blev bygget ved hjælp af phenix.autobuild54,55. Strukturen af TmPep1050H60A H307A blev afsluttet efter flere cyklusser af automatiseret og manuel raffinement i Phenix og Coot (Tabel 1 og Figur 6A). Strukturen bekræftede oligomeric tilstand med en grænseflade overflade på 1.710 Å2 mellem både monomerer og en Δ i Gpå-16,2 kcal mol-1 som beregnet af PDBe Pisa56. Til sammenligning er grænsefladefladenogΔ i G af dimeric TmPep10502-mer henholdsvis 1.673 Å2 og -16,7 kcal mol-1.

Strukturen af TmPep1050H60A H307A er meget lig den vilde type dimer struktur med RMS på 0,774 Å ved justering. Det er vigtigt, at de samme strukturelle ændringer observeres i begge strukturer: høj fleksibilitet i α8 og α10 helices, uordnet aktiv sted Gln-196-Val-202, og fordrivelse af Lys-229-Ala-235 og Lys-247-Ser 254. Disse ændringer var tidligere korreleret med dodecamerdannelsens hindringer i mangel af metalfabrikant11. De to mutationer af Hans-60 og Hans-307, havde dog en lille effekt på sidekæderne af Asp-168 og Asp-62. De syntes at være låst i en kropsbygning forskellig fra wild-type dimer (Figur 6B). Asp-168 carboxylate roteres med 40° på grund af fraværet af Hans-60 og Hans-307. Derfor er begge histidinrester vigtige for at placere Asp-168 carboxylate korrekt for at bygge bro over de to metalioner. Asp-62 sidekæden er orienteret mod Glu-18 carboxylate, uden for katalytisk site. Asp-62 kan have en vigtig rolle i katalyse, da det antages at modulere pKa af His-60 og dermed påvirke metalionbindingen i M2-anlægget. Desuden kunne det være impliceret strukturelt i stabiliseringen af katalysatoren site på metal ion bindende, favorisere dannelsen af dodecamer.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af TM_1050 ORF-kloning i pBAD-vektor ved homolog rekombination.
ORF er flankeret af to 30 bp sekvenser homolog til initiativtageren BAD ende og sekvensen opstrøms PmeI begrænsning site. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kroatogrammer af rensning af TmPep1050.
a) Anionbytterkromatografi. B) Hydrofobisk interaktionkromatografi. Absorbansen (Abs), udtrykt i milliunits af absorbans (mUA), er vist i almindelig linje. Ledningsevnen, udtrykt i mS cm-1,vises i stiplet linje. Den grå boks angiver, hvor TmPep1050 eluates på kromatogrammer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Størrelsesudelukkekromatografi af (A) TmPep1050 dodecamer, (B) TmPep1050H60A H307Aog (C) TmPep1050H60A.
Prøver blev analyseret ved hjælp af SEC harpiks pakket i en 120 ml kolonne. Absorbans (Abs) udtrykkes i milliunits af absorbans (mUA). D )Kalibreringaf SEC-kolonnen ved hjælp af thyroglobulin (T), ferritin (F), aldolase (Ald), conalbumin (C) og albumin (Alb) som standard. Korrelationen mellem logaritmen for den relative masse og elueringsvolumenet er lineær med en R2 på 0,91. Konfidensintervallerne på 95 % repræsenteres som prikker. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Optimering af TmPep1050H60A H307A krystallisering.
(A) Den første optimeringsstrategi består af varierende pH (mellem 4,5 og 6,0) vs. PEG3350-koncentrationen (mellem 5 % og 25 %). Krystalliseringspladen er schematiseret, og brøndene er farvekodede: rød for bundfald, gul til polykrystaller og grøn til monokrystaller. (B) Den anden optimeringsstrategi omfatter brugen af frø fortyndet 25x med en smallere variation af pH vs PEG3350. (C) Krystal form og størrelse før (øverste billede) og efter (lavere billede) krystallisering optimering og mikroseeding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Uddrag fra logudgangen CORRECT. LP af TmPep1050H60A H307A data indeksering af XDS.
Øvre panel, de mulige Bravais gitter, den mest sandsynlige er mC, mP, og oC. Middle panel, samlede statistikker over data indekseret i C2221 rumgruppe. Lavere panel, overordnede statistikker over data indekseret i P21 rumgruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Strukturen af TmPep1050H60A H307A.
a) Strukturel tilpasning af en TmPep1050H60A H307A-underenhed (rød, PDB-kode 5NE9) i forhold til en dodecamer-underenhed (hvid, PDB-kode 6NW5) og en dimerunderenhed (blå, PDB-kode 5NE6). Pile angiver de strukturelle forskelle mellem dodecamers og dimers. (B) Nær-up af TmPep1050H60A H307A aktive sted (rød) i forhold til det aktive sted for TmPep1050 dimer (blå) og dodecamer (hvid). Klik her for at se en større version af dette tal.

TmPep1050H60A H307A
Dataindsamling
Temperatur (K) 100
Strålekilde SOLEIL Proxima 2
Bølgelængde (Å) 0.9801
Detektor Dectris Eiger X 9M
Oscillation område (°) 0.1
Eksponeringstid (er) 0.025
Mellemrumsgruppe P 1 21 1
Parametre for enhedscelle
α, β, γ (°) 90.00, 110.69, 90.00
a, b, c (Å) 43.24, 137.79, 61.11
Opløsning 43.99 – 2.37 (2.52-2.37)
Unikke refleksioner 26.902
Rmerge (%) 0.14
Redundans 6,815
8.64 (2.12)
Fuldstændighed (%) 99.6 (97.9)
CC1/2 (%) 99.2 (84.1)
Raffinement
Opløsning 43.99 – 2.37
Refleksioner 26.9
R-frit sæt testantal 1345
Rarbejde/ Rgratis 0.206/0.234
Proteinmolekyler pr. ASU 2
VM (Å3/Da) 2.37
Indhold af opløsningsmidler (%) 49.0
Protein-/opløsningsmiddelatomer 4,559/96
r.m.s.d. obligationslængder (Å) 0.31
r.m.s.d. bindingsvinkler (°) 0.51
Gennemsnitlige B-faktorer (Å2) 57.0
Begunstiget/ikke tilladt Ramachandran φ/ψ (%) 95.02 / 0.17
Dobbelt lov h, -k, -h-l
PDB-kode kr.

Tabel 1: Dataindsamlings- og finjusteringsstatistikker. Værdierne i parenteser er for skallen med den højeste opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet heri, gør det muligt at forstå overgangen til dimer-dodecamer af TmPep1050 på det strukturelle niveau. Metoden blev tidligere oplevet til bestemmelse af strukturen af både TmPep1050 oligomers11. Det mest udfordrende skridt var at finde betingelser, der fremmer dissociation af dodecamers i stabile dimers. Sådanne forhold måtte være milde nok til at gøre det muligt at reassociere dimers til dodecamers, når metal ion cofactor blev tilføjet. Adskillelsen af oligomerer var også et kritisk skridt, da det betingelser de strukturelle undersøgelser og yderligere biokemisk karakterisering (f.eks studere dodecamer reassociation i forskellige doser af Co2 +). Den molekylære udskiftning, en gennemprøvet metode til fasebestemmelse, blev brugt til at løse strukturerne i TmPep1050 oligomers og dens varianter. Den foreslåede protokol kan tilpasses til at studere andre metallo-enzymer, hvis oligomerisering stater afhænger af tilgængeligheden af deres metal cofaktorer.

For at illustrere protokollen, et studie tilfælde blev præsenteret, TmPep1050H60A H307A hvis metal bindende steder blev svækket ved at mutere His-60 og Hans-307 til alanin. Disse restkoncentrationer binder Co2+ på M2- og M1-lokaliteterne. Interferens i metalbinding kunne have forstyrret oligomeriseringstilstanden og ført til en fuldstændig dissociation til monomerer. Der er rapporteret dokumentation for et sådant fænomen for PhTET2 og PfTET3, to M42 aminopeptidaser fra henholdsvis P. horikoshii og P. furiosus,24,29. TmPep1050H60A H307A opførte sig ikke som forventet, da denne variant kun dannede dimers. Dens struktur viste de samme ændringer som wild-type dimer, men med to små undtagelser. Faktisk syntes sidekæderne i Asp-168 og Asp-62 at være låst fast i en utraditionel orientering, der forhindrede stabilisering af det aktive sted. Deres orientering syntes at være pålagt af Hans-60 og Hans-307 som sådanne ændringer ikke blev observeret i enkeltpunkt mutation varianter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Martine Roovers for korrekturlæsning af dette papir og med konstruktive kommentarer. Adgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var inden for Blokallokeringsgrupper 20151139.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , Jan 26, 2018. Zenodo (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

Biokemi protein oligomerisering M42 aminopeptidase oligomeric tilstand overgang metalloenzym proteinrensning protein krystallisering X-ray krystallografi databehandling molekylær udskiftning
X-Ray krystallografi at studere oligomeric stat Overgang <em>af Thermotoga maritima</em> M42 Aminopeptidase TmPep1050
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder,… More

Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter