Summary
As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.
Abstract
Anestésicos influenciam a consciência em parte através de suas ações em circuitos thalamocortical. No entanto, ainda não está claro até que ponto os anestésicos voláteis afetam componentes celulares e de rede distintos desses circuitos. As fatias cerebrais ex vivo fornecem um meio pelo qual os pesquisadores podem sondar componentes discretos de redes complexas e desembaraçar mecanismos potenciais subjacentes aos efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas. Para isolar potenciais efeitos de células e efeitos de drogas específicas em fatias cerebrais, os pesquisadores devem ser capazes de ativar independentemente vias de fibras diferentes, identificar populações não sobrepostas de células e aplicar anestésicos voláteis ao tecido em solução aquosa. Neste protocolo, são descritos métodos para medir respostas optogeneticamente evocadas a dois caminhos independentes a diferentes para o neocórtex em fatias cerebrais ex vivo. Respostas extracelulares são registradas para avaliar a atividade da rede e gravações de grampos de remendo de células inteiras direcionadas são realizadas em interneurônios somatostatina e parvalbumin-positivos. Descreve-se a entrega de concentrações fisiologicamente relevantes de isoflurane através de fluido espinhal cerebral artificial para modular as respostas celulares e de rede.
Introduction
Anestésicos voláteis têm sido usados onipresentemente em uma variedade de ambientes clínicos e acadêmicos por mais de um século. Classes distintas de anestésicos têm alvos moleculares únicos, muitas vezes não sobrepostos 1,2,3, mas quase todos eles produzem inconsciência. Embora seus efeitos comportamentais sejam bastante previsíveis, os mecanismos pelos quais os anestésicos induzem a perda de consciência são amplamente desconhecidos. Os anestésicos podem, em última análise, influenciar tanto o nível quanto o conteúdo da consciência através de ações em circuitos corticotalâmicos, interrompendo a integração da informação em toda a hierarquia cortical 4,5,6,7,8,9. De forma mais ampla, a modulação de circuitos corticotalâmicos pode desempenhar um papel experimentalmente10 ou farmacologicamente11 estados alterados de consciência, e também pode ser implicada no sono12 e em distúrbios fisiodósiológicos da consciência13,14.
A esquiva dos mecanismos subjacentes à perda e ao retorno da consciência durante a anestesia pode ser atribuída parcialmente a ações não lineares e sinérgicas de anestésicos nos níveis celular, de rede e sistemas15. Isoflurane, por exemplo, suprime a atividade dentro das regiões cerebrais selecionadas 16,17,18, prejudica a conectividade entre regiões cerebrais distantes 19,20,21,22,23, e diminui as respostas sinápticas de forma específica da via24,25 . Quais efeitos dos anestésicos, do nível molecular ao dos sistemas, são necessários ou suficientes para efetuar a perda de consciência permanece incerto. Além das investigações clínicas substantivas da consciência utilizando técnicas não invasivas 19,20,26, é importante que os experimentalistas busquem desembaraçar as distintas interações celulares e de rede que subservem a experiência consciente.
Simplificando as interações complexas encontradas no cérebro intacto, as fatias cerebrais ex vivo permitem o estudo de componentes isolados dos sistemas dinâmicos do cérebro9. Uma preparação reduzida de fatias combina os benefícios de estruturas anatômicas relativamente intactas de circuitos neurais locais com a versatilidade de manipulações in vitro. No entanto, até recentemente, as restrições metodológicas têm impedido o estudo das propriedades sinápticas e de circuito de insumos de longo alcance em fatias cerebrais27,28; o caminho tortuoso dos tratos de fibra corticotalâmica tornou a ativação de vias independentes, mas impossíveis por estimulação elétrica.
Investigar os efeitos dos agentes anestésicos nas preparações de fatias cerebrais apresenta desafios adicionais. Sem um sistema respiratório e circulatório intacto, os agentes anestésicos devem ser aplicados no banho, e concentrações cuidadosamente combinadas com concentrações estimadas do local de efeito. Para muitos agentes anestésicos intravenosos, a lenta taxa de equilíbrio no tecido torna as investigações farmacológicas tradicionais laboriosas29,30. Investigar os efeitos de anestésicos voláteis de gás nas preparações ex vivo é mais tratável, mas também apresenta desafios. Estes incluem a conversão de doses de pressão parcial inaladas em concentrações aquosas, e a necessidade de um sistema de entrega modificado da droga para o tecido através de fluido espinhal cerebral artificial31.
Aqui, os métodos são descritos pelos quais os investigadores podem capitalizar as propriedades físico-químicas bem documentadas do anestésico volátil para entrega de drogas para fatias cerebrais ex vivo, ativar entradas específicas de caminhos e camadas para uma área cortical de interesse com alta resolução espacial, e realizar gravações simultâneas de laminar e registros de grampos direcionados de populações selecionadas de neurônios. Combinados, esses procedimentos permitem aos pesquisadores medir alterações induzidas por anestésicos voláteis em várias propriedades de resposta eletrofisiológica observável, do nível sináptico ao nível da rede local.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais descritos neste protocolo foram aprovados pela University of Wisconsin-Madison School of Medicine e public health animal care and Use Committee.
1. Reprodução de camundongos para expressar proteína fluorescente repórter em subpopulações de interneurônios
- Par homozyogous, cre-dependent tdTomato rato macho com ou homozygous SOM-Cre fêmea ou homozigos pv-cre rato fêmea.
NOTA: Outras populações neuronais específicas podem ser alvo usando as linhas cre apropriadas. - Permita que a prole heteroziga amadureca até pelo menos 3 semanas de idade antes de prosseguir. Para experimentos descritos aqui, genotipagem não é necessária, pois pais homozigos produzem descendentes que são todos heterozigosos tanto para cre recombinase específica do tipo celular quanto alelos repórteres dependentes de Cre.
2. Realizar injeção estereóxica unilateral de construção viral
- Ajuste as configurações do puxador de micropipette para pipetas de injeção conforme indicado no manual do usuário do instrumento (consulte tabela 1 para as configurações recomendadas). Puxe a micropipette de vidro.
- Quebre a ponta da extremidade afiada da pipeta de tal forma que o diâmetro da ponta seja de aproximadamente 30 μm com afunilamento mínimo sobre vários milímetros.
- Usando procedimentos previamente documentados, decida sobre o título adequado e o volume do vírus a ser injetado. Nos experimentos aqui descritos, 1,0 μL (titer: 3.1-5.7 TU/mL) injetado unilateralmente produziu bons resultados.
- Enchi o volume total da pipeta com óleo mineral. Coloque a pipeta na microsinga e flua uma pequena quantidade de óleo mineral através da ponta para garantir que a ponta não esteja entupida.
- Frontfill pelo menos 1.0 μL de construção viral. O vetor viral associado a adeno recombinante usado nesses experimentos foi AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
- Providencie a cortina estéril em uma área cirúrgica. Esterilize as ferramentas para o procedimento estereotax e coloque-a na cortina.
- Anestesia SOM-tdTomato ou pv-tdTomato animal heterozigous usando isoflurano (3% para indução, 1,5-2% para manutenção) e mistura de oxigênio. Confirme periodicamente o nível cirúrgico de anestesia com beliscão do dedo do pé durante toda a cirurgia. Certifique-se de que o animal não ultrapasse o plano cirúrgico da anestesia monitorando as respirações a cada 10-15 min.
- Raspe a parte de cima da cabeça do animal. Aplique 70% de álcool isopropílico e solução à base de iodo liberalmente à área cirúrgica e pomada oftalmica às órbitas oculares para evitar a secagem da membrana. Administrar bupivacaína/lidocaína (proporção 1:1, 1,0 mg/kg) subcutânea ao local cirúrgico para anestésico local.
- Coloque o animal em quadro estereotaxico.
- Use bisturi para fazer incisão ao longo do eixo sagitário da pele sobrepondo a superfície dorsal do crânio. Retraia a pele usando fórceps. Hidrate o crânio com 0,9% salina conforme necessário.
- Na superfície do crânio, marque levemente a intersecção das coordenadas anterior e lateral com uma cruz a lápis. Faça um furo nas coordenadas apropriadas no plano transversal (em mm em relação a Bregma, para injeção de córtex cingulado (Cg): anterior 0.2, lateral 0.3; para injeção de tálamo posterior (Po): posterior 2,25, lateral 3.4).
NOTA: As marcas devem ir além dos limites do orifício de rebarba para fornecer orientação para a colocação precisa da pipeta. - Ligue e equilibre a mesa de ar.
- Reposicione o manipulador de eletrodos do quadro estereotaxico a 0° para injeções em Cg, ou 45° no plano coronal para injeções em Po.
- Coloque a bomba de seringa no manipulador de eletrodos. Conecte o controlador da bomba de microsinga à bomba de seringa.
- Navegue pela ponta da pipeta perto (mas não toque) na superfície do cérebro, na intersecção de marcas criadas na Etapa 2.11. Avance a pipeta a aproximadamente 1 mm/s ao longo de seu eixo longitudinal para o cérebro 0,9 mm (injeção em Cg) ou 3,1 mm (injeção em Po). Espere 10 min antes de prosseguir.
- Injete 1,0 μL de construção viral durante um período de 10 min (100 nL/min). Se for observado o bem-estar do vírus do local de inserção da pipeta, diminua a taxa de injeção para 50 nL/min.
- Após a injeção, espere 10 minutos antes de retirar lentamente a pipeta de injeção.
- Sutura para fechar a incisão do couro cabeludo e administrar 2-5 mg/kg meloxicam subcutâneamente.
- Descontinuar isoflurane e monitorar animais durante o surgimento da anestesia. Permitir a recuperação de acordo com os procedimentos descritos pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Instituição, incluindo a administração de analgésicos.
3. Preparação de fatias cerebrais agudas
- Permita pelo menos 3 semanas para a expressão de construção viral antes de colher tecido.
- Prepare 1 L de fluido espinhal cerebral artificial para o procedimento de corte (fatiando fluido espinhal cerebral artificial, sACSF). Consulte a Tabela 2 para obter ingredientes.
- Durante todo o procedimento de corte, forneça sACSFcom mistura de CO2/5% dissolvida, fornecida via tubo de dispersão de gás.
- Prepare banho gelado para vibrar microtome de lâmina. Monte o estágio do espécime gelado no microtome e fixe a lâmina de safira no lugar para seção de tecido.
- Anesthetize rato com 3% de isoflurane e oxigênio até a perda do reflexo de direito.
- Decapitar o rato usando guilhotina e submergir imediatamente a cabeça em sACSF de 4°C. Para preservar a saúde do tecido, complete as seguintes etapas o mais rápido possível.
- Abra a cavidade do crânio fazendo uma pequena incisão na base do crânio e removendo suavemente cada placa do crânio. Remova suavemente a dura-mãe subjacente.
- Enquanto o cérebro ainda está na cavidade do crânio, use a lâmina de barbear para remover o cerebelo. Faça um segundo corte vertical ao longo do plano sagital no hemisfério esquerdo, apenas lateral para a linha média.
- Prepare o bloco de tecido para seção.
- Levante suavemente o cérebro da cavidade do crânio. Coloque o cérebro no papel do filtro com o plano liso e sagital para baixo. Guie o papel do filtro sobre o modelo de bloqueio e alinhe o cérebro ao contorno do modelo subjacente (Figura Suplementar 1).
- Faça dois cortes paralelos no plano coronal, conforme indicado pelas linhas do modelo. Adicione uma pequena gota de sACSF para manter o papel do filtro molhado, se necessário.
- Coloque o bloco tecidual em sACSF de 4°C brevemente enquanto a etapa 3.8.4 é realizada.
- Aplique uma pequena quantidade de super cola no estágio da amostra gelada.
- Levante o bloco tecidual do sACSF frio. Use o canto de uma toalha absorvente para afastar o excesso de sACSF. Cole o plano coronal posterior do bloco de tecido ao estágio da amostra, com a superfície dorsal do cérebro voltada para a lâmina de safira.
- Colete 500 μm de espessura de fatias cerebrais coronais. Coloque fatias de juros na malha de nylon (Figura Suplementar 2) em 34 °C sACSF e deixe o recipiente atingir a temperatura ambiente.
NOTA: Para experimentos descritos aqui, foram coletados registros eletrofisiológicos de uma seção coronal centrada aproximadamente 2,25 mm posteriormente ao bregma para estudar uma área sensorial não primária, córtex visual secundário medial (V2MM).
4. Preparação de sacos experimentais de fluido espinhal cerebral (eACSF) contendo isoflurane anestésico volátil dissolvido
- Prepare 300 mL de uma mistura de estoque de 3,0% de isoflurane.
- Em um saco de gás politetrafluoroetileno selado, adicione ~100 mL de 95% mistura de gás CO2 2 a 20-30 mL de isoflurane líquido e uma pequena quantidade de 0,9% salino. Aguarde pelo menos 30 minutos para permitir o equilíbrio do isoflurane entre as fases líquida e gasosa.
- Determine a quantidade de gás isoflurane saturado, Vsentado, para adicionar ao saco de estoque usando a seguinte equação:
onde p%stock é a composição-alvo do gás de estoque (3% neste caso),o estoque V é o volume final do saco de gás de estoque, Pisoflurane é a pressão parcial de isoflurane à temperatura ambiente (~240 mmHg), e Ptotal é a pressão atmosférica (~760 mmHg). - Adicione a quantidade calculada de gás saturado a um saco de gás vazio e encha o saco com um volume de 95% de mistura de gás CO2/5% para levar o volume total de saco de estoque para 300 mL.
- Prepare 2 L de fluido espinhal cerebral artificial para perfusão da fatia durante o experimento (ACSF experimental, eACSF). Consulte a Tabela 2 para obter ingredientes. Dissolva 95% Amistura de gás CO2 2 2 2 em solução.
- Prepare dois sacos separados de soluções de Controle e Isoflurane.
- Para um saco vazio de gás politetrafluoroetileno, adicione 600 mL eACSF e 600 mL de 95% mistura de gás O2/5% CO2 . Rotule esta bolsa como Controle.
- Para outro saco de gás politetrafluoroetileno vazio, adicione 300 mL de eACSF. Rotule esta bolsa como Isoflurane.
- Escolha uma concentração de fase de gás fisiologicamente relevante de isoflurane. Os experimentos foram realizados utilizando concentrações de gás equivalentes a 1,3% de isoflurane. Camundongos perdem reflexo de direita, e presumivelmente consciência, a 0,9% inalado isoflurane.
- Use a seguinte equação para calcular a concentração de fase de gás equivalente à temperatura ambiente, P%(Troom)31:
onde p%(T corpo) é a concentração de fase de gás fisiologicamente relevante escolhida na Etapa 4.3.3,a sala T é de 25 °C, eo corpo T é de 37 °C. - Use a seguinte equação para determinar o volume de gás do saco de gás de estoque,estoque V, para adicionar à solução Isoflurane.
onde asolução V é o volume de eACSF na bolsa ISOFLURANE (300 mL), P%(T room) é inserida a partir da equação (2), λ é o coeficiente de partição de ostwald salino/gás de isoflurane (λ = 1,232), e p% 32 estoque é a concentração de fase de gás do saco de gás de estoque (P%stock = 3,0%). - Ao saco de solução Isoflurane, adicione o volume de gás do saco de gás de estoque,estoque V, calculado na Etapa 4.3.5.
- À bolsa de solução Isoflurane, adicione um volume de 95% de mistura de gás DE2/5% DE CO2 para levar o volume total de gás na bolsa solução Isoflurane para 300 mL.
- Agite tanto os sacos control quanto isoflurane no shaker por pelo menos 1 h para permitir o equilíbrio da fase isoflurane.
- Depois de coletados todos os dados, a concentração correta pode ser verificada usando um monitor de gás anestésico para medir a concentração de gás equilibrado de isoflurane acima da solução restante no saco.
- Relatar concentrações experimentais de gases voláteis em unidades aquosas, pois as concentrações milimólares são mais robustas às mudanças de temperatura. Use a seguinte equação para converter a concentração da fase do gás de temperatura ambiente,sala P%(T), para concentração aquosa equivalente (Caquos, em mM)31:
onde α é o coeficiente de partição de Bunsen salino/gás para isoflurane a 25°C32.
5. Preparação de hardware e software para gravações multicanais
- Configure um sistema de aquisição de dados de 16 canais de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: Vários amplificadores disponíveis comercialmente e sistemas de aquisição de dados podem ser usados para coletar gravações multicanais. Nos experimentos descritos aqui, os sinais analógicos são fornecidos através de um painel de referência de eletrodos para dois amplificadores, onde são amplificados (2000x) e filtrados (0,1-10kHz). As entradas analógicas do sistema de aquisição de dados são digitalizadas a 40kHz. - Aperte o adaptador de palco apropriado de 16 canais a um micromanipulador de microscópio. Oriente o adaptador de tal forma que as portas do conector feminino estejam voltadas para baixo.
- Ajuste o ângulo de operação deste micromanipulador de tal forma que ele seja orientado para baixo em direção à câmara de gravação, em um ângulo aproximadamente 70° em relação à horizontal.
- Conecte a entrada do headstage a uma sonda 16 x 1 para eletrofisiologia in vitro através do adaptador de headstage ancorado ao micromanipulador.
- Conecte o conector de saída do headstage ao sistema de aquisição de dados.
- Instale software apropriado para aquisição de dados. Configure 15 canais de entrada para corresponder aos sinais de entrada dos primeiros 15 contatos de sonda multicanal. Configure o canal restante para receber entrada do eletrodo intracelular.
NOTA: Tome cuidado para considerar mapas de eletrodos e adaptador ao coletar e analisar dados, para garantir que o sinal adequado corresponda ao contato do eletrodo do qual foi coletado.
6. Configuração de protocolos de estimulação de luz
- Configure o sistema de entrega de luz e instale o software de acompanhamento.
- Abra o software. Escolha a configuração de fiação de hardware na qual uma fonte de gatilho (Digital/TTL Out) fornece o sinal Trigger In para o sistema de entrega de luz, e o sistema de entrega de luz fornece o sinal Trigger Out para um LED de 470 nm.
- Monte lente objetiva de alta potência. Usando câmera digital, calibrar o objetivo de alta potência para uso com sistema de entrega de luz.
- Crie uma nova sequência de perfil de perfis de estimulação de luz.
- Crie um padrão de escolha. Nos experimentos aqui descritos, um círculo de diâmetro de 150 μm é usado para permitir a ativação específica de camada de terminais de axônio.
- Para construir uma sequência de perfil, copie e cole este perfil para cada um dos vários ensaios.
- Crie uma lista de formas de onda que contenha formas de onda de qualquer intensidade de luz, duração do pulso ou número de pulso.
- Atribuir aleatoriamente formas de onda a cada perfil. Cada perfil com sua forma de onda atribuída corresponde a um pulso de gatilho de uma entrada TTL Digital ou um teste.
- Salve a sequência de perfil.
- No software de aquisição de dados, crie um novo protocolo.
- Defina o número de ensaios para igualar o número de perfis na sequência de perfil apenas criada.
- Escolha entradas de sinal para corresponder às configuradas na Etapa 5.6. Configure um protocolo que forneça uma única saída TTL digital, gravando a partir desses 16 canais de entrada por um período de tempo adequado antes e depois do gatilho digital.
7. Colocando sonda multicanal na fatia de tecido cerebral ex vivo
- Perfuse bolhas eACSF (não em sacos selados) a 3-6 mL/min.
- Transfira a fatia cerebral contendo área de interesse para a rede de malha na câmara de perfusão de microscópio. Ancorar com harpa de platina (ver Figura Suplementar 3).
- Gire a grade de malha de tal forma que a linha de contatos de eletrodos na extremidade distata da sonda multicanal seja aproximadamente perpendicular à superfície do pial.
- Sob iluminação de campo largo e sob controle fino do micromanipulador, abaixe a sonda multicanal em direção à superfície da fatia.
- Gire a torre do cubo do filtro para engatar o cubo de filtro apropriado para visualização da proteína repórter fluorescente expressa em terminais de axônio de afferents cortical. Se necessário, gire a fatia para alinhar mais precisamente a sonda com a superfície pial.
- Posicione a sonda logo acima do plano da fatia, ~200 μm a menos da posição alvo final ao longo do eixo x, deixando pelo menos um canal fora do limite da área de tecido sendo gravado
- Insira lentamente a sonda na fatia movendo o manipulador ao longo de seu eixo longitudinal. Para minimizar os danos ao tecido, basta avançar a sonda na medida em que as pontas afiadas são apenas visíveis abaixo da superfície do tecido. Isso minimizará os danos ao tecido, garantindo que os contatos com eletrodos estejam em contato com o tecido.
8. Fixação de neurônios direcionados de fixação de patches e obtenção de configuração de células inteiras
- Mude a fonte eACSF para a solução de controle ensacado.
- Identifique célula fluorescente rotulada para gravação de grampo de remendo direcionado.
- Restringir o diafragma de íris de abertura ao menor diâmetro. Engaje uma lente objetiva de baixa potência e leve o tecido ao foco.
- Centralize a luz sobre uma área de tecido adjacente (mas não sobreposta) à sonda multicanal.
- Engaje o objetivo de imersão de água de alta potência (40x ou 60x), usando cuidado para evitar contato entre a sonda multicanal e a lente objetiva.
- Gire a torre do cubo do filtro para engajar o conjunto de filtros apropriado para permitir imagens de células expressando marcador fluorescente dependente de Cre.
- Identifique uma célula fluorescentemente rotulada como um alvo para gravação de grampo de remendo. Levante a lente objetiva para criar amplo espaço para baixar uma pipeta de remendo.
- Carregue uma pipeta de remendo (ver Tabela 1) com solução interna (Tabela 2) e monte a pipeta no suporte de eletrodo. Usando seringa de 1 mL, aplique pressão positiva correspondente ao ar ~0,1mL.
- Abaixe a pipeta da correção para a solução. Coloque a ponta da pipeta em foco sob orientação visual.
- Obtenha gravação de células inteiras da célula alvo usando as etapas previamente demonstradas33.
- Se o planejamento de avaliar alterações nas propriedades intrínsecas da célula (por exemplo, resistência à entrada, taxa de disparo potencial de ação em resposta às etapas atuais), realize essas gravações. Caso contrário, mova-se para o protocolo de estimulação do axônio abaixo.
9. Ativação optogenética específica da camada dos terminais de axônio
- Manipule o campo de visão no plano x-y para alinhar o perfil de estimulação da luz com a localização desejada na fatia.
- Carregue o protocolo de estímulo leve e prepare o sistema de entrega de luz para receber um pulso TTL digital.
- O optogeneticamente ativa terminais de axônio ao mesmo tempo em que registra potenciais de campo extracelulares e flutuações de membrana intracelular.
- Mude a fonte eACSF para solução isoflurane e lave a droga por 15 minutos. Se necessário, colete gravações espontâneas durante a lavagem.
- Repita o passo 9.2-9.3.
- Mude a fonte eACSF para a solução controlar e lave a droga por 20 minutos. Se necessário, colete gravações espontâneas durante a lavagem.
- Repita o passo 9.2-9.3.
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Representative Results
Uma linha do tempo de etapas descritas no protocolo é mostrada na Figura 1. As entradas corticais que chegam de áreas corticais de ordem superior ou de núcleos talâmicos não primários têm campos terminais parcialmente sobrepostos na camada 1 do córtex visual não primário24. Para isolar caminhos aferentes independentes thalamocortical ou corticocortical, um vetor viral contendo ChR2 e um repórter fluorescente eYFP em Po ou Cg foi injetado. As células dentro do raio de injeção tomam o vetor viral e, após 2-4 semanas, expressam o canal de cáção não específico ChR2 e o repórter tanto no soma quanto na projeção de axônios (Figura 2A). Foram coletadas fatias coronais. Com o cubo de filtro apropriado engajado, os axônios que expressavam a construção viral foram imagedos (Figura 2B). O uso do ChR2 para ativar terminais de axônio permite a ativação de aferentes sem o pré-requisito para uma soma anexada.
Os animais utilizados nos experimentos descritos aqui foram animais híbridos SOM-tdTomato ou PV-tdTomato, que expressam a proteína fluorescente tdTomato em interneurônios somatostatina- (SOM+) ou parvalbumin-positivo (PV+), respectivamente. Os interneurônios SOM+ ou PV+ na camada 2/3 foram direcionados para fixação de patches sob orientação visual com o cubo de filtro apropriado ativado (Camada 1C). Esses interneurônios têm dendritos na camada 1 e são alvos de insumos corticocorticais (Figura 3A).
A adição de 125 mL de gás isoflurane de 3,0% e 175 mL de 95% O2/5% de CO2 a um saco selado resultou em uma concentração pré-equilíbrio de gás de 1,3%. Gás dissolvido em eACSF de acordo com seu coeficiente de partição; a concentração de equilíbrio de fase de gás prevista de isoflurane à temperatura ambiente foi de 0,6% (Figura 2D). Isso foi confirmado via monitor de gás.
A fatia de tecido foi transferida para a câmara de gravação e a sonda de gravação multicanal 16x1 foi colocada ortogonalmente para o laminado cortical (Figura 2E). Um círculo de 150 μm de luz de 470 nm centrado sobre a camada cortical 1 foi entregue através do caminho de luz objetivo, enquanto potenciais de campo extracelular foram coletados usando a sonda multicanal 16 x 1 e foram realizadas gravações de grampo de remendo de células inteiras direcionadas em interneurons. Um esquema da configuração da gravação é mostrado na Figura 2F.
Potenciais pós-sinápticos (PSPs) foram observados em interneurons em resposta a um trem de quatro pulsos de luz de 2 ms (10 Hz; Figura 3A). Também foram registrados potenciais de campo locais (Figura 3B). Densidade de origem atual (CSD; Figura 3C) e atividade multi-unidade (MUA; Figura 3D) foram extraídos de potenciais de campo locais. Dez ensaios em várias intensidades de luz diferentes foram usados para realizar análises pós-hoc. A amplitude das pias atuais extraídas do CSD aumentou em função da intensidade da luz (Figura 4A). Uma equação logística não linear de três parâmetros foi adequada aos dados para comparações entre as vias. A amplitude do PSP também aumentou com a amplitude atual da pia (Figura 4B).
As respostas sinápticas às entradas thalamocortical e corticocortical foram medidas durante o controle, isoflurano (0,28 mM) e condições de recuperação. Respostas pós-sinápticas da somatostatina- (Figura 5A) aos estímulos corticocorticais foram suprimidas durante o isoflurane, como foram evocadas as pias atuais (Figura 5B).
Figura 1: Um cronograma esquemático delineando cronograma de passos importantes no protocolo.
Início: Descreve a linha do tempo das etapas necessárias para a reprodução de animais transgênicos e expressão de vetor viral. Fundo: Retrata etapas e cronograma para preparar materiais e realizar experimentos no dia da preparação da fatia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Injeção de vetor viral e preparação de fatias cerebrais coronal ex vivo.
(A) Representação esquemática da injeção de vetor viral em ratos híbridos SOM-tdTomato ou PV-tdTomato. (B) As fatias coronais da área de associação parietal medial (mPtA) foram colhidas, e as fibras aferentes (superior) ou corticocortical (inferior) foram identificadas por seu repórter eYFP na camada 1. Este valor é modificado com permissão de24. (C) Sobreposição de terminais de axônio rotulados por eYFP na camada 1 (verde) e tdTomato-rotulados de interneurons SOM+ (vermelho) na camada superficial 2/3. (D) Os sacos selados foram preparados com uma mistura de solução para gás 50:50. (E) Colocação de uma sonda 16 x 1 em mPtA (contorno preto). (F) Esquema da configuração de gravação na fatia cortical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravações extracelulares intracelulares simultâneas e multicanais em fatia cortical.
(A) Gravação de patch de fixação de corrente de célula inteira a partir da soma de um interneuron de camada 2/3 PV+. Quatro pulsos (2 ms cada, setas azuis) de luz azul (2,2 mW) a 10 Hz foram entregues em terminais de axônio corticocortical em L1. Média (traço vermelho) de dez ensaios (traços cinzentos) são mostrados. (B) Dados brutos de 16 canais de sonda extracelular 16 x 1. Canais colocados em tecido cortical são mostrados em preto, e aqueles deitados fora do córtex em cinza. (C) Um diagrama de densidade de fonte atual, extraído do sinal potencial de campo local, mostra pias de corrente sináptica (azul) na camada 1. (D) A atividade multi-unidade, gerada pela aplicação de um filtro de alta passagem ao sinal potencial de campo local, isola a atividade de espiadores evocada em camadas inferiores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Comparação das respostas das gravações em duas fatias diferentes.
Intensidades de luz múltiplas foram usadas para evocar respostas sinápticas na camada cortical 1. Para cada ensaio, a amplitude máxima da resposta evocada foi extraída da pia de corrente extracelular da camada 1 e EPSPs em interneurônios pv+ de camada 2/3. (A) Perfis de resposta extracelular de afferents thalamocortical e corticocortical são comparados em função da intensidade da luz. (B) A relação entre a amplitude da pia atual e a amplitude do EPSP é dependente da via. Em cada via de estímulo, os dados de (A) e (B) foram coletados simultaneamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aplicação de banho de isoflurane dissolvido no eACSF durante gravações simultâneas.
(A) Registro de grampo de corrente de células inteiras intracelulares a partir da camada 2/3 DE INTERNEURon SOM+ após a ativação de aferentes corticocorticais durante as condições de controle, isoflurane e lavagem. Linhas azuis verticais indicam estímulos de luz (2 ms; 1,65 mW). (B) Traço de densidade de origem atual extraído do eletrodo na camada 1. Os dados foram coletados simultaneamente com os coletados em (A). A recuperação das respostas na lavagem demonstra depressão das respostas sinápticas por isoflurano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Micropipette para injeção de vírus | ||||
| Vidro | ID: 0,05 mm, OD: 0,11 mm | |||
| Loops | 1 | |||
| Calor | Puxar | Vel | Hora | Pressão |
| Rampa + 10 | 20 | 40 | 200 | 300 |
| Micropipette para gravações de grampo de remendo de células inteiras | ||||
| Vidro | ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm | |||
| Loops | 4 | |||
| Calor | Puxar | Vel | Hora | Pressão |
| Rampa | 0 | 25 | 250 | 500 |
Tabela 1: Vidro recomendado e parâmetros para puxar micropipettos para injeções virais e gravações de grampos de remendo de células inteiras. O vidro usado para injeções virais e gravações de grampos de células inteiras é descrito, bem como os parâmetros para puxar micropipettos usando o puxador de micropipette. Consulte manuais de instrução para o puxador de micropipette para obter recomendações adicionais ou ajuste fino das configurações.
| Fatiamento ACSF, sACSF (em mM) | Experimente ACSF, eACSF (em mM) | |
| NaCl | 111 | 111 |
| NaHCO3 | 35 | 35 |
| HEPES | 20 | 20 |
| Kcl | 1.8 | 1.8 |
| CaCl2 | 1.05 | 2.1 |
| MgSO4 | 2.8 | 1.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| glicose | 10 | 10 |
| Solução Interna | ||
| K-gluconato | 140 | |
| NaCl | 10 | |
| HEPES | 10 | |
| EGTA | 0.1 | |
| MgATP | 4 | |
| NaGTP | 0.3 | |
| pH = 7,2 |
Tabela 2: Composição de fluido espinhal cerebral artificial e solução intracelular. Reagentes e concentrações para solução de pipeta sACSF, eACSF e tubulação intracelular para gravações de grampos de remendo estão listados.
Figura suplementar 1: Modelo para preparar bloco de tecido para coletar fatias cerebrais. O modelo é ajustado ao tamanho apropriado, impresso e colado a um slide de microscópio. Um deslizamento de tampa é colado sobre o modelo para prolongar seu uso. O bloco de tecido é colocado em um pedaço de papel filtro com o plano sagital para baixo, alinhado ao fundo rosa, e um corte vertical é feito no plano coronal ao longo da linha preta. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 2: Câmara de incubação para fatias cerebrais colhidas. A câmara é preenchida com sACSF e borbulhada com 95% de mistura de gás de CO2/5%2 /5 por meio de uma agulha dobrada presa ao tubo. A plataforma de incubação é feita de nylon esticada sobre um encaixe circular plástico. Clique aqui para baixar este número.
Figura suplementar 3: Estruturas de platina para fatia na câmara de gravação. A fatia cerebral é transferida para a câmara de gravação via pipeta e colocada em cima da malha de nylon, que é esticada sobre um pedaço em forma de ferradura de fio de platina achatado e super colado no lugar. Harpa de platina é colocada sobre fatia cerebral para ancorá-la no lugar durante a gravação. Clique aqui para baixar este número.
Tabela suplementar 1: Coeficientes de Ostwald (λ) e Bunsen (α) para outros anestésicos voláteis. Adapte este protocolo para estudo de outros anestésicos voláteis de gás, como halotano, sevoflurano ou desflurano. Substitua as equações descritas no protocolo pelos coeficientes apropriados conforme listado nesta tabela. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Neste manuscrito, é descrito um protocolo para avaliação de respostas intra e extracelulares a caminhos aferentes seletivamente ativados em fatias cerebrais ex vivo.
O uso de ferramentas optogenéticas e esquemas paralelos de gravação permite que os investigadores testem respostas de populações locais a diferentes insumos de regiões cerebrais distantes, enquanto registram simultaneamente de populações-alvo de interneurons. O uso da tecnologia optogenética permite que terminais de axônio de projeções diferentes sejam preservados e ativados, mesmo que seus corpos celulares não estejam mais ligados. Isso alivia as restrições geométricas anteriormente impostas às fatias ex vivo , já que a preservação de conexões elétricas de longo alcance não é mais primordial. Ainda assim, deve-se tomar cuidado para preparar fatias em um plano geométrico que preserve quaisquer conexões de interesse restantes. Por exemplo, as células piramidas são orientadas verticalmente ao longo da coluna cortical, e a atividade de rede evocada medida pelas sondas multicanais nesses experimentos exige que tais conexões locais sejam preservadas o máximo possível. Assim, as fatias coronais foram preparadas para manter intacta a conectividade local.
Ao escolher construções optogenéticas e proteínas fluorescentes relevantes, devem ser consideradas propriedades de seus espectros de excitação/emissão e óptica microscópica. A estimulação persistente da luz pode resultar em inativação parcial de muitas variantes de channelrhodopsin34, que podem ser evitadas escolhendo proteínas repórteres cujos espectros de excitação não se sobrepõem ao da opsina. Variantes alternativas com diferentes cinéticas ou sensibilidades à luz também podem ser escolhidas dependendo do paradigma experimental35, incluindo manipulações usando opsinas excitatórias alternativas ou inibitórias. Os cubos de filtro também devem estar adequadamente alinhados com os repórteres fluorescentes escolhidos, de forma que os terminais de axônio ou interneurônios aferentes possam ser imagens independentemente e sem ativar opsinas expressas. Para explicar a variabilidade na expressão do vírus, também pode ser pertinente que os pesquisadores normalizem qualquer atividade optogeneticamente induzida ao nível de expressão do construto viral, medido pela saída fluorescente da proteína repórter.
A entrega de concentrações pré-calculadas de anestésicos voláteis para cortar tecido também é possível usando os métodos aqui descritos. Ao escolher percentuais de equilíbrio de gás fisiologicamente relevantes adequados, os pesquisadores devem responder pela perda de 10-15% de gás isoflurane dissolvido entre a linha de perfusão e o tecido36. Os métodos aplicáveis ao isoflurane foram apresentados, mas outras drogas como halotano, sevoflurano ou desflurano podem ser tratadas da mesma forma usando os coeficientes Ostwald e Bunsen apropriados (Tabela Suplementar 1). As propriedades particionárias dos anestésicos voláteis garantem que eles se dissolverão previsivelmente em ACSF. No entanto, como as pressões parciais são mais sensíveis às mudanças de temperatura do que as aquosas concentrações de EC50 37, os percentuais de volume de equilíbrio de gás de anestésicos voláteis devem ser convertidos em concentrações milimólares de temperatura ambiente previstas para comparar efeitos observados com doses fisiologicamente relevantes in vivo. Se optarem por estudar anestésicos intravenosos, como etomidato ou propofol em fatias cerebrais, os pesquisadores devem considerar perfis de difusão dos medicamentos em estudo, pois os tempos de equilíbrio e concentrações fisiologicamente relevantes podem variar muito30.
Neste manuscrito, um protocolo é descrito para testar os efeitos de anestésicos voláteis em componentes distintos de circuitos thalamocorticas em fatias cerebrais ex vivo. Muitas das variáveis e parâmetros nos métodos descritos podem ser manipulados para investigações posteriores. Por exemplo, diferentes áreas cerebrais, caminhos diferentes, alvos celulares ou anestésicos voláteis podem ser estudados adaptando os métodos descritos para responder a novas perguntas. Combinado com outros métodos teóricos e experimentais, o estudo de componentes celulares e de rede únicos usando fatias cerebrais ex vivo avançará nossa compreensão do cérebro dinâmico, e as mudanças que ele sofre durante as alterações farmacológicas e fisiodológicas na consciência.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem bryan Krause pelo apoio técnico e orientação sobre este projeto.
Este trabalho foi apoiado pela International Anesthesia Research Society (IMRA to AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 to MIB) e pelo Departamento de Anestesiologia, Faculdade de Medicina e Saúde Pública, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5x2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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