Summary
Denne protokollen avgrenser trinn som er nødvendige for genleveransen gjennom fokusert ultralyd blodhjernebarriere (BBB) åpning, evaluering av det resulterende genuttrykket og måling av nevromodulasjonsaktivitet av kjemogenetiske reseptorer gjennom histologiske tester.
Abstract
Akustisk målrettet kjemogenetikk (ATAC) muliggjør ikke-invasiv kontroll av spesifikke nevrale kretser. ATAC oppnår slik kontroll gjennom en kombinasjon av fokusert ultralyd (FUS) indusert blod-hjernebarriereåpning (FUS-BBBO), genlevering med adeno-assosierte virale (AAV) vektorer, og aktivering av cellulær signalering med konstruerte, kjemogenetisk, proteinreseptorer og deres kognitive ligander. Med ATAC er det mulig å transdusere både store og små hjernegrupper med millimeterpresisjon ved hjelp av en enkelt ikke-invasiv ultralydapplikasjon. Denne transduksjonen kan senere tillate en langsiktig, ikke-invasiv, enhetsfri nevromodulering i fritt bevegelige dyr ved hjelp av et stoff. Siden FUS-BBBO, AAV og kjemogenetikk har blitt brukt på flere dyr, bør ATAC også kunne skaleres for bruk i andre dyrearter. Denne artikkelen utvider en tidligere publisert protokoll og skisserer hvordan man optimaliserer genleveransen med FUS-BBBO til små hjerneområder med MR-veiledning, men uten behov for en komplisert MR-kompatibel FUS-enhet. Protokollen beskriver også utformingen av musemålretting og fastholdelseskomponenter som kan 3D-printes av et hvilket som helst laboratorium og enkelt kan modifiseres for forskjellige arter eller tilpasset utstyr. For å bidra til reproduserbarhet beskriver protokollen i detalj hvordan mikrobobler, AAV-er og venepunktur ble brukt i ATAC-utvikling. Til slutt vises et eksempeldata for å veilede de foreløpige undersøkelsene av studier som bruker ATAC.
Introduction
Bruk av kretsspesifikke nevromodulasjonsteknologier, som optogenetikk1,2 og kjemogenetikk 3,4,5, har avansert vår forståelse av psykiatriske tilstander som nevronkretsforstyrrelser. Nevrale kretser er vanskelige å studere og enda vanskeligere å kontrollere ved behandling av hjernesykdommer fordi de vanligvis er definert av spesifikke celletyper, hjernegrupper, molekylære signalveier og tidspunkt for aktivering. Ideelt for både forskning og kliniske anvendelser vil slik kontroll utøves ikke-invasivt, men å oppnå både presis og ikke-invasiv nevromodulering er utfordrende. For eksempel, mens nevroaktive stoffer kan nå hjernen ikke-invasivt, mangler de romlig spesifisitet ved å virke gjennom hele hjernen. På den annen side kan elektrisk dyphjernestimulering kontrollere bestemte hjernegrupper, men har problemer med å kontrollere spesifikke celletyper og krever kirurgi og enhetsplassering6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) gir nevromodulering med romlig, celletype og tidsmessig spesifisitet. Den kombinerer tre teknikker: fokusert ultralydindusert blod-hjernebarriereåpning (FUS-BBBO) for romlig målretting, bruk av adenoassosierte virale vektorer (AAV) for ikke-invasivt å levere gener under kontroll av celletypespesifikke promotorer, og konstruerte kjemogenetiske reseptorer for å modulere transfekterte nevrale kretser selektivt via legemiddeladministrasjon. FUS er en FDA-godkjent teknologi som utnytter ultralydets evne til å fokusere dypt inne i vev, inkludert den menneskelige hjerne, med millimeter romlig presisjon. Ved høy effekt brukes FUS til ikke-invasiv målrettet ablasjon, inkludert en FDA-godkjent behandling for essensiell tremor8. FUS-BBBO kombinerer ultralyd med lav intensitet med systemisk administrerte mikrobobler, som svinger i blodkar ved ultralydfokus, noe som resulterer i lokalisert, midlertidig (6-24 timer) og reversibel åpning av BBB9. Denne åpningen tillater levering av proteiner9,10, små molekyler 11 og virale vektorer7,12,13,14 til hjernen uten signifikant vevsskade hos gnagere 10 og ikke-menneskelige primater 15. Kliniske studier pågår for FUS-BBBO16,17, noe som indikerer mulige terapeutiske anvendelser av denne teknikken.
Viral genlevering ved hjelp av AAV utvikler seg også raskt til klinisk bruk for CNS-lidelser, med nylige FDA og EU-regulatoriske godkjenninger som viktige milepæler. Endelig er kjemogenetiske reseptorer18, som Designer Receptors Activated Exclusive by Designer Drugs (DREADDs), mye brukt av nevrologer for å gi farmakologisk kontroll over nevronal eksitasjon i transgene eller transfekterte dyr19,20. DREADDs er G-proteinkoblede reseptorer (GPCRs) som har blitt genetisk konstruert for å reagere på syntetiske kjemogenetiske molekyler i stedet for endogene ligander, slik at systemisk administrasjon av disse ligandene øker eller reduserer eksitabiliteten til DREADD-uttrykkende nevroner. Når disse tre teknologiene kombineres til ATAC, kan de brukes til ikke-invasiv modulering av utvalgte nevrale kretser med romlig, celletype og tidsmessig presisjon.
Her utvider og oppdaterer vi en tidligere publisert protokoll for FUS-BBBO11 ved å inkludere metodikk for nøyaktig målretting av hjernegrupper med FUS-BBBO hos mus ved hjelp av enkelt 3D-trykt målrettingsutstyr. Vi viser også en anvendelse av FUS-BBBO til ATAC. Vi viser nødvendige skritt for levering av AAV-er som bærer kjemogenetiske reseptorer, og evaluering av genuttrykk og nevromodulering ved histologi. Denne teknikken er spesielt anvendelig for å målrette store eller flere hjernegrupper for genuttrykk eller nevromodulering. For eksempel kan et bredt område av en cortex lett transduseres med FUS-BBBO og moduleres ved hjelp av kjemogenetikk. Imidlertid vil genlevering med en alternativ teknikk, intrakranielle injeksjoner, kreve et stort antall invasive injeksjoner og kraniotomier. FUS-BBBO og dens applikasjon, ATAC, kan skaleres til dyr av forskjellige størrelser, hvor hjernegrupper er større og vanskeligere å målrette invasivt.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført under en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved California Institute of Technology, hvor data opprinnelig ble innhentet av J.O.S.
1. Design og 3D-printing av maskinvare for sele og bildeveiledning for dyr
- Bruk filene fra Szablowski labs nettside på: https://www.szablowskilab.org/downloads for 3D-printing av komponentene.
- Sørg for at utskriftsmaterialet har lav følsomhet i MR, men har en MR-synlig støtte. Se detaljer om materialer som brukes i delen materialer og reagenser.
- Ta hensyn til materialnedbrytningen ved flere bruksområder ved å teste materialet gjentatte ganger og observere slitasjestedene som bør forsterkes. Sørg for at de trykte veggene er minst 2 mm tykke.
- Bruk 3D-skrivere med høy presisjon for å forbedre målrettingspresisjonen.
- Motvirke tyngdekraften og andre krefter for å unngå avvik fra plastiske 3D-printede komponenter ved å støtte komponentene langs lengden og øke tykkelsen på de 3D-printede veggene hvis det observeres bøying.
- Ta hensyn til presisjon i flere akser, inkludert anterior/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral, samt yaw, pitch og tilt.
- Test nøyaktigheten av målretting ved å utføre FUS-BBBO og registrere avviket fra målrettet posisjon.
- Hvis du bruker motoriserte stereotaksiske systemer, må du evaluere effekten av dynamisk bevegelse på materialelastisiteten ved å registrere FUS-BBBO-målrettingsprosedyren på video, og korrigere eventuelle avvik ved å fortykke 3D-printede materialvegger.
2. Ultralyd system beskrivelse
- Bruk et ultralydsystem med en åtte-element ringformet array-transduser (diameter = 25 mm, naturlig fokuspunkt = 20 mm; blenderåpning (F) = 0,8)) og par boliger til hodet med avgasset ultralydgel ved å påføre gel på det barberte musehodet.
MERK: Senterfrekvensen til en transduser brukt i en tidligere studie7 var 1,5 MHz, pulsvarigheten var 10 ms, og pulsrepetisjonsfrekvensen var 1 Hz over 120 s. Trykket ble kalibrert ved hjelp av optisk fiberhydrofon og opprettholdt mellom 0,36-0,45 MPa. Anta 18% akustisk demping gjennom skallen21 for 1,5 MHz og parietalben. Omfanget av forutsetninger for sikker BBB-åpning og AAV-levering er beskrevet andre steder i detalj 7,14,22.
3. Dyr forberedelse
- Bedøv en mus ved hjelp av isofluran inhalasjon ved 2% med medisinsk luft. Kontroller dybden av anestesi ved en berøringsklype for å bekrefte mangel på respons. Påfør deretter oftalmisk salve for å forhindre hornhinnetørking ved hjelp av en steril q-tips til engangsbruk for å forhindre krysskontaminering av salverøret.
MERK: Typisk prosedyre for FUS-BBBO kan variere mellom 30 minutter og 2 timer, og anestesi må opprettholdes gjennomgående. - Etter at musen er bedøvet, vask et rent kateter med heparinisert saltvann (10 E / ml).
MERK: Et passende kateter for en 25-35 g mus har en 30 G nål og PE10 slange. - Desinfiser deretter musehalen med 70% etanolpute. Plasser hale-venekateteret i en lateral hale vene og fest den med et vevslim. Vær oppmerksom på en tilbakestrømning av blod fra halvenen inn i kateteret for å bekrefte plasseringen.
- Barber musehodet og bruk deretter hårfjerningskrem etter at vevslimet har tørket for å redusere muligheten for at luftbobler blir fanget under ultralydgel under insonering.
- Plasser musen i en 3D-printet MR-vogn, monter fortennene på en bittstang og hodet inne i en nesekjegle (figur 1a).
- Injiser opptil 10 μL lidokain subkutant på stedet, kontakt de butte ørestengene. Deretter fester du de stumpe stengene til skallen og bruker sikre mengder trykk, og pass på at du ikke legger press på luftrøret da det hindrer pusten. Observer pusten i 30 s for å bekrefte at dyret puster fritt med en hastighet på 1/s.
- Koble målrettingsveiledningen til stolper, kontroller pusten som i trinn 3.6 (figur 1b), og fortsett å overvåke pusten visuelt gjennom hele prosedyren hvert minutt. En pustefrekvens forhøyet over 1/s er en av indikasjonene på tap av anestesi. Fortsett å overvåke tåklemmeresponsen hvert 5. minutt når mus ikke er i MR-skanneren eller hvis pustefrekvensen er forhøyet over 1/s.
- Overfør MR-vognen til en MR-holder og deretter inne i boringen på en magnet.
MERK: Utformingen av maskinvaren er optimalisert for en 72 mm spole inne i en 7T MR. - Skaff deg en MR-sekvens for å lokalisere musen i skanneren.
- Velg 3D rask lav vinkel skudd (FLASH) sekvens for å skaffe hele hjernen, ved hjelp av følgende parametere, i henhold til spesifikke instruksjoner fra instrumentprodusenten. Ekkotid: 3,9 ms, Repetisjonstid: 15 ms, Eksitasjonspulsvinkel: 15°, Matrisestørrelse: 130 x 130 x 114, Oppløsning: 350 x 200 x 200 μm per voxel, Gjennomsnitt: 1, Anskaffelsestid: 3 min 42s
- Overfør filer fra MR-systemet til et datastyrt FUS-system.
- Åpne bildesekvensen i programvaren for å utføre MR-veiledet målretting, der bildet skal vises som i figur 1c.
4. MR-veiledet målretting
MERK: Ved bruk av spesialdesignede målrettingsguider er det ikke nødvendig å plassere ultralydtransduser i en MR, og det er heller ikke nødvendig å snitte huden for å utføre målretting ved å nullstille stereotax på bregma- og lambda-linjer. Følg trinnene nedenfor for å utføre målrettingsprosessen.
- Plasser vognen innenfor et stereotaktisk instrument. Fest den på plass ved hjelp av en metallblokk med dobbeltsidig tape og ved å trykke vognen mot to støtteposter på det stereotaksiske instrumentet.
- Overfør MR-bilder til en datamaskin med en kjørende FUS-veiledningsprogramvare ved å velge filer i databehandler, høyreklikke for å hente menyalternativer og velge 'Overfør umiddelbart'.
- Åpne FUS-veiledningsprogramvaren og last inn bildet ved å klikke "Åpne sekvens" og laste inn alle filene i bildesekvensen.
- Reformat bildet til tre akser ved å trykke høyreklikk og 'Reformater'.
- Lokaliser svingeren til sirkelmålrettingsveiledningen (figur 1c) ved å høyreklikke.
- I sagittal visning, juster den vertikale posisjonen til en virtuell svinger for å ta hensyn til tykkelsen på vannbadet og transduserhuset (i dette tilfellet - 8,2 mm oppover, figur 1d).
- Pek på området (e) som skal målrettes i baneplanleggeren og noter koordinatene i et regneark (i dette tilfellet - midthjernen, som i figur 1d).
- Slå inn ønsket målrettingsdybde (z-verdi i elektronisk bane (figur 2) og noter koordinater i et regneark.
- Målrett hvert av punktene ved å trykke på 'Send bane' og 'Utfør' (figur 2).
MERK: Dette gjøres når en musebærer er plassert inne i motorene. Den samme målrettingen kan imidlertid oppnås med høy nøyaktighet på et stereotaktisk instrument. - For å korrelere koordinatene til en MR med den stereotaksiske rammen, plasser den spesialmonterte svingeren over en målrettingsguide og oversett til hver av de tre målrettingsboltene (figur 3, element A) kan gå gjennom både svingerholderen (figur 3, element B) og målrettingsveiledningen (figur 3, element C). Forsikre deg om at boltene ikke er under spenning eller vipping.
- Oversett svingeren 10,56 mm fremover i fremre/bakre retning til den er plassert på samme sted der et senter for en målrettingsveiledning vises på en MR-undersøkelse.
- Bestem avstanden fra et senter av den virtuelle svingeren (figur 3a, element A) til målområdet (figur 3a, element B), og flytt transduseren til disse koordinatene ved hjelp av stereotaksisk ramme.
- Fortsett til fremstilling av injeksjonsoppløsning.
5. Klargjøring av injeksjonsoppløsning
MERK: Mikrobobleløsningene er svært følsomme for trykk. Følgelig kan kraftig blanding eller rask injeksjon gjennom tynne nåler kollapse mikroboblene og redusere effekten av BBB-åpning. I tillegg er mikrobobler lettere enn vann og kan flyte til toppen av et rør, kateter eller sprøyte (figur 4), for eksempel i en automatisk injektor. Det anbefales sterkt å resuspendere mikrobobleoppløsningen umiddelbart før hver injeksjon.
- Trekk 0,8 ml saltvann opp med en sprøyte i en 1,5 ml slange.
- Bruk en sprøyte til å tilsette 0,1 ml MR-kontrastmiddel i det samme 1,5 ml røret og blande.
- Bring den ikke-aktiverte mikroboble23,24-løsningen til romtemperatur.
- Rett før insonasjonen, aktiver mikrobobler i 45 s i en mikrobobleaktiveringsenhet.
- Trekk opp 0,1 ml mikrobobler langsomt (over ~3 s) ved hjelp av en 1 ml tuberkulinsprøyte og 21 G kanyle fra den midterste dybden av en væske.
- Tilsett 0,08 ml mikrobobler i oppløsningen av kontrastmiddel og saltoppløsning fremstilt i trinn 5.3. Bland ved å banke med hånden i 15 s.
- Med den endelige konsentrasjonen av AAVer 0,5-2 x 10 10 viruspartikler per gram kroppsvekt (VP/g), injiser lasten for levering (i dette tilfellet AAV9) gjennom30 G nål i halevenekateter, i tilfelle ATAC – AAVs som bærer kjemogenetiske reseptorer, eller en negativ kontroll, for eksempel AAVer som bærer GFP under samme promotor.
- Bland mikrobobler for hånd i 15 s igjen for å unngå flyting (figur 4).
- Umiddelbart etterpå, aspirer 200 μl av mikrobobleoppløsningen gjennom en sprøyte uten påsatt nål. Mangel på nål vil redusere skjærkreftene på mikrobobler.
- Snu sprøyten og bland ved å trykke stempelet opp og ned.
- Fest 30 G-kanylen, og mens den fortsatt er snudd, skyv mikroboblene sakte ut til dråper kommer til syne på enden av en nål.
6. Insonasjon prosedyre
- Still inn parametrene for insonasjon: 10 ms pulsvarighet, 120 gjentakelser, hver s og 0,30-0,45 MPa trykk ved skallen.
- Fjern målrettingsveiledningen, og bruk avgasset ultralydgel på musehodet, og sørg for at det ikke dannes bobler.
- Senk svingeren og legg den direkte på ørestangholderen, og still inn koordinatene i de stereotaksiske instrumentene (figur 5).
- Injiser oppløsningen av AAV (0,5-2 x 1010 VP/g).
- Bland mikrobobler og MR-kontrastmiddeloppløsningen i 15 s og injiser i 80 μL per 30 g mus.
- Påfør ultralyd umiddelbart i 120 s ved å trykke 'Send' og 'Execute'.
- Hvis mer enn ett område er målrettet, flytter du svingeren til dette nettstedet og justerer dybdemålrettingen etter tallene i regnearket fra trinn 4.7–4.9. Gjenta deretter trinn 6.5-6.6 for hvert insonert nettsted.
7. MR-evaluering av BBB-åpning
MERK: MR-evalueringen av BBB-åpningen er beskrevet i detalj andre steder11. Plasseringen av BBB-åpningen kan visualiseres som lysere områder hos mus som fikk en injeksjon av et T1-vektet Gd-kontrastmiddel.
- Etter ultralydapplikasjonen, registrer en MR-sekvens som i trinn 3.10.
- Fjern musen fra MR-skanneren, og plasser den i et gjenopprettingsbur for å tillate utvinning fra anestesi. Overvåk musene daglig for tegn på nød, vekttap eller andre humane endepunkter. Rådfør deg med veterinærpersonalet og de institusjonelle IACUC-retningslinjene for å fortsette med enhver behandling dersom uventede bivirkninger skulle oppstå.
8. DREADD stimulering med en kjemogenetisk ligand
- Velg en kjemogenetisk reseptor. For DREADDs, velg hM3Dq-reseptoren for nevronaktivering via Gq-koblede veier19, hM4Di-reseptoren for inhibering av nevronaktivitet gjennom Gi/o-koblede veier20, eller KORD-reseptoren for aktivering av nevroner via Gs-koblede veier ved bruk av Salvinorin-B-ligand25.
- Oppløs klozapin-n-oksid (CNO) i steril saltoppløsning i konsentrasjon på 1 mg/ml. Oppbevar aliquoted CNO ved -20 °C.
- Administrer CNO19, eller en annen kjemogenetisk ligand26,27,28, intraperitonealt ved konsentrasjon mellom 0,3 – 10 mg/kg.
- Hvis effekter av CNO på atferd skal registreres, begynn å registrere atferdsaktiviteten innen 15-45 minutter etter legemiddeladministrasjonen for å oppnå maksimal aktivering av DREADDs19.
- Hvis analyse av nevronaktivering er ønsket, bruk mus til histologisk evaluering etter 60-120 minutter etter injeksjon.
- Fortsett til eutanasi gjennom hjerteperfusjon (se avsnitt 9).
9. Histologisk evaluering av genuttrykk og kjemogenetisk aktivering
MERK: Når det eksperimentelle endepunktet (f.eks. slutten av atferdsstudien, tiden som kreves for genuttrykk) er oppnådd, er det viktig å bekrefte plasseringen og tilstedeværelsen av genuttrykket.
- Etter aktivering med en kjemogenetisk ligand, utfør hjerteperfusjon for å bevare vev.
- Bedøv musen med Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) blanding i steril saltoppløsning gjennom en IP-injeksjon. Bekreft anestesien med en tåklype og sørg for at pustefrekvensen er senket til ca. 1/s. Gi termisk støtte gjennom varmeputen til bekreftelse av eutanasi.
- Forbered 10% nøytral bufret formalin (NBF) og PBS med 10 enheter heparin per ml.
MERK: Oppløsningen bør være ved 4 °C. - Hell hver buffer i separate 50 ml rør og koble til, og prime en peristaltisk pumpe koblet til et 25 G sommerfuglkateter med PBS / heparinløsning.
- Fest lemmer til en absorberende blå pute med tape og sørg for at dyret er plassert i liggende stilling på puten. Desinfiser pelsen for å unngå krysskontaminering av perifere organer i tilfelle de må samles inn.
- Åpne bukhulen ved et tverrgående snitt, som utsetter membranen.
- Åpne brystkassen gjennom to kutt av kirurgisk saks langs den fremre / bakre aksen.
- Blottlegg hjertet og plasser nålen i et venstre kammer (høyre side av hjertet sett liggende) og plasser i sommerfuglkateteret i trinn 9.1.3.
- Lag et lite snitt i høyre ventrikkel for å tillate blodutstrømning.
- Slå på den peristaltiske pumpen for å begynne å skylle ut blodet med PBS / heparin.
MERK: Hvis dette trinnet ikke utføres tilstrekkelig, vil blodet koagulere under fiksering med formalin og forhindre passende perfusjon. - Etter at alt blod er skyllet ut og klar PBS begynner å komme ut av høyre ventrikkel, bytt innløpet til en peristaltisk pumpe til en NBF-løsning og begynn perfusjon for 25 ml per mus.
- Pakk ut hjernen, sett i minst 4 ml NBF og post-fix i 24 timer.
- Seksjon hjernen ved hjelp av koronale seksjoner på en vibratome med 50 μm seksjonstykkelse.
- Plasser hver seksjon i en brønn på en 24 brønnplate som lagrer seksjonene i hele hjernen.
- Evaluer ekspresjonen av kjemogenetiske reseptorer fusjonert til fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry eller mCitrine), under et fluorescerende mikroskop for å identifisere seksjonene som viser uttrykk for å bekrefte plasseringen. Uttrykket er sannsynligvis svakt.
- Utfør immunfarging mot fluoroforen ved hjelp av følgende protokoll:
- Plasser 3 seksjoner i 0,5 ml oppløsning inneholdende 10% serum av en vert av et sekundært antistoff og inkuber i 30 minutter.
- Overfør seksjonene til en oppløsning av et primært antistoff ved 1:250 – 1:1,000 fortynning, med 1:500 som utgangspunkt.
- Inkuber seksjonene med primært antistoff over natten ved 4 °C i en mikroplate forseglet med en parafinfilm.
- Vask seksjonene med PBS, 3x i 5 min om gangen.
- Tilsett 0,5 ml per brønn av den sekundære antistoffoppløsningen i 10% serum.
- Inkuber i 4 timer i romtemperatur.
- Vask seksjonene med PBS, 3x i 5 min om gangen.
- Monteres på lysbilder med et vandig monteringsmedium som inneholder en kjernefysisk flekk (f.eks. DAPI).
- Evaluer lokalisering og spredning ved hjelp av et konfokalmikroskop ved å utføre en flisskanning av en hel seksjon.
- Evaluer intensiteten av ekspresjon ved å måle fluorescens pikselintensitet i målrettede hjernegrupper og sammenligne med en intrakranielt injisert kontroll.
- Alternativt kan du evaluere prosentandelen av positive nevroner ved å telle celler farget mot kjemogenetiske reseptorer, sammenlignet med DAPI-positive celler eller cellespesifikke markører.
- Evaluer vevskaden ved å utføre hematoksylinfarging på 50 μm seksjon og avbildning for tap av celler, akkumulering av celleavfall og andre tegn på grov skade.
- For å evaluere spesifisiteten til cellemålretting, utfør dobbel immunfarging som beskrevet nedenfor for den kjemogenetiske reseptoren og en cellespesifikk markør. Utfør deretter cellepositive tellinger som i trinn 9.8.
- Plasser 3 seksjoner i 0,5 ml av en oppløsning inneholdende 10% serum av en vert av et sekundært antistoff og inkuber i 30 minutter.
- Overfør seksjonene til en løsning av et primært antistoff mot en fluorescerende markør av en kjemogenetisk reseptor ved 1:250 – 1:1,000 fortynning, med 1:500 som utgangspunkt. Legg til et annet primært antistoff fra en annen vertsart som er rettet mot en cellespesifikk markør av interesse (f.eks. CamkIIa).
- Inkuber seksjonene med primært antistoff over natten ved 4 °C i en mikroplate forseglet med parafinfilm.
- Vask seksjonene med PBS, 3x i 5 min om gangen.
- Tilsett 0,5 ml per brønn av sekundær antistoffoppløsning i 10% serum av vertsartene av begge sekundære antistoffer.
MERK: Hvert antistoff skal ha en distinkt fluorofor og skal være reaktivt mot primære antistoffer i trinn 9.10.2. - Inkuber i 4 timer i romtemperatur.
- Vask seksjonene med PBS, 3x i 5 min om gangen.
- Monter på lysbilder og fest med et vandig monteringsmedium som inneholder en atomflekk.
10. Evaluer nevronaktivering med immunfarging for c-Fos
- Utfør c-Fos-farging som i punkt 9.5 i denne protokollen ved bruk av et c-Fos primært antistoff og et sekundært antistoff med en fluorescerende tag forskjellig fra den nukleære flekken.
- Telle prosentandelen av celler som er positive for både c-Fos og nukleær flekk i området målrettet av en kjemogenetisk reseptor.
- Analyser prosentandelen av c-Fos positive kjerner i gruppe mus som uttrykker kjemogenetiske reseptorer og behandlet med en kjemogenetisk ligand eller kjøretøykontroll og i gruppe av villtypemus som behandles med en kjemogenetisk ligand eller kjøretøykontroll.
Representative Results
Det første trinnet i å utføre ATAC-protokollen er målrettingen av FUS-BBBO til de ønskede hjernegruppene. For eksempel, etter den beskrevne protokollen, ble hippocampus målrettet med FUS-BBBO, og kontrastmiddel og AAV9 som bærer DREADDs ble injisert i musene, etterfulgt av en FLASH 3D MR-sekvens som skaffer bilder av musehjernen. En T1-signalforsterkning ble oppnådd i hippocampusregionen (figur 6) og i andre deler av hjernen (figur 7). Etter flere uker ble DREADDs uttrykt inne i målhjerneregionen. Mens mange DREADDs er smeltet til en fluorescerende reporter (f.eks. mCherry), ble prosessen med perfusjon og fiksering med formaldehyd funnet å drastisk redusere fluorescensen av disse proteinene. Immunfarging mot mCherry eller DREADD førte til sikrere påvisning av uttrykket (figur 8) basert på tidligere erfaringer. I tidligere eksperimenter viste ~ 85% av musene uttrykk etter FUS-BBBO7. En enkel test for tilstrekkelige uttrykksnivåer av DREADDs tester funksjonaliteten på mobilnivå. Det kan for eksempel gjøres ved å gi en kjemogenetisk ligand eller en saltvannskontroll, som CNO 19, desklorklozapin28 eller andre29, og vente 2 timer før en hjerteperfusjon og fiksering. Hjerneseksjonene ble deretter co-immunfarget for c-Fos protein30, noe som indikerer økt aktivitet av nevroner, og for DREADD. Forsøket ble ansett som vellykket, hvis hjernestedet målrettet med DREADDs viste signifikant høyere antall nevronkjerner som er c-Fos-positive i gruppen som fikk en kjemogenetisk ligand sammenlignet med gruppen som fikk saltvann7 eller sammenlignet med et kontralateralt sted som ikke ble utsatt for FUS-BBBO. Merk at det er et potensial for noen av disse ligandene å aktivere nevroner ikke-spesifikt uten uttrykk for DREADDs. For eksempel har CNO vist seg å metaboliseres til lave nivåer av klozapin hos mus, som krysser BBB og aktiverer DREADDs med høy styrke27. Det ble imidlertid også vist å binde seg til ikke-spesifikke steder. Som i alle eksperimenter er det viktig å inkludere alle riktige kontroller i kjemogenetiske studier31. En mulig kontroll er administrering av den kjemogenetiske liganden til villtypemus, uten prosedyrer, for å utelukke effekter av stoffet alene på ønsket atferdsmessig eller histologisk analyse. En annen kontroll kan være inklusjon av fire grupper: DREADD + ligand, DREADD + kjøretøy, EGFP + ligand, EGFP + kjøretøy, som vil redegjøre for potensielle effekter av både genlevering med FUS-BBBO og den kjemogenetiske liganden.
Figur 1: Prosessen med MR-veiledet målretting av FUS i ATAC. (a) Museplassering med ørestenger, en nesekjegle og en plattform som kan passe inn i en MR-skanner. (b) En 3D-trykt guide (blå) som er synlig i MR ble festet til endene av ørestangrammen og deretter festet på plass med en holder av en overflate MR-spole som inneholder fire snap-on bolter (semi-gjennomsiktig blå). (c) Utseende av den 3D-printede veiledningen i sagittal MR (venstre panel), med en bunn av den virtuelle representasjonen av en svinger justert (gul halvcirkel) med bunnen av guiden. Høyre panel viser utseendet til den 3D-printede veiledningen på MR fra koronalvisning. Den lyse sirkelen ble laget av et polyjetstøttemateriale som har en sterk MR-kontrast. Korset ble dannet med plast. En gul sirkel representerer svingerens plassering som ble justert konsentrisk med guiden inne i en stereotaksisk ramme. (d) For å målrette hjernestrukturer ble en virtuell svinger flyttet i z-retning over musene for å matche tykkelsen på en ultralydkegle / hus. I dette tilfellet, på grunn av tykkelsen på vannbadet, ble transduseren flyttet 8,2 mm over guiden for nøyaktig målretting. Hjernestrukturer ble valgt ved hjelp av MR-bildedata, og deres MR-koordinater ble deretter skrevet ned og lagt inn i den stereotaktiske maskinen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Grensesnittet til programvaren som brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prosess for å matche MR-koordinatrom til stereotaktisk instrument. (a) Tre hull i en svingerholder ble justert med tre hull i MR-styret, og tre koniske målbolter ble satt inn uten å forårsake flex til hele forsamlingen. (b) Ideelt sett ville alle tre boltene sitte i midten av hullene. (c) Hvis det er upresisjon i justeringen, vil ikke alle tre boltene passe inn, for eksempel i tilfelle av liten, sannsynlig umerkelig yaw på 1 °, vil bare en bolt passe inn mens de motsatte boltene vil sitte fast ved MR-guiden. Alternativt kunne det være synlig fleksing av hele forsamlingen når bolter ble presset gjennom. (d) Forstørret visning av boltmontering. Boltene bør plasseres konsentrert for best nøyaktighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Rask omfordeling av mikrobobler i sprøyten. (a) Sprøyten ble fotografert 5 s etter blanding. (b) Ett minutt senere var det et godt synlig lag som viste noen av boblene konsentrat nær toppen av 1 ml tuberkulinsprøyte. Dette eksemplet brukte spesielt en løsning av mikrobobler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Prosess for å plassere sentrum av en transduser over et senter av en MR-guide. (a) I modellene vist i denne artikkelen er den røde bæreren konstruert for å bevege seg 10,56 mm fremover fra posisjonen vist i figur 3b, til en som vises her. (b) Den blå MR-guiden ble fjernet før sonikering, og en ultralydgel ble påført mellom musen og transduseren (oransje) for å sikre ultralydpassasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: MR-visualisering av BBB-åpningen. (a) Aksialt bilde av BBB-åpningen. Lysere område utpekt med pilspiss viser ekstravasasjon av et MRT1-kontrastmiddel . (b) Koronal utsikt over dorsal hippocampus og cortex over hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilspisser). (c) Koronal utsikt over den sentrale hippocampus målrettet med FUS-BBBO (pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Eksempel på målretting av 4 hjernesider ved hjelp av treboltsmålrettingssystemet beskrevet i denne artikkelen. Områder med pilspisser viste BBB åpne steder med diffusjon av et MR-kontrastmiddel. De fire stedene ble målrettet etter hverandre, med ~ 150 s mellom hver BBB-åpning, fra bunn til topp. Bildet ble tatt innen 2 min etter siste BBB-åpning. Skalastangen er 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Påvisning av DREADD-uttrykk. (a) Immunfarging for fluoroforen festet til DREADDs, i dette tilfellet mCherry var en pålitelig metode for påvisning i noen studier. (b) I en annen representativ seksjon med DREADDs rettet mot hippocampus med de samme forholdene som i (a), ga fluorescensen av mCherry i seg selv sterk bakgrunn og relativt svakt signal. (c) Som negativ kontroll ble det brukt en mus som fikk systemisk injeksjon av AAV, men som ikke gjennomgikk FUS-BBBO. Ingen signifikant uttrykk kan bli funnet ved mCherry immunostaining. Skalastenger er 500 mm. (Data i a, c tilpasset fra7 med tillatelser, Copyright 2020 Nature-Springer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
ATAC krever vellykket implementering av flere teknikker for vellykket nevromodulering av spesifikke nevrale kretser, inkludert nøyaktig MR-veiledet målretting, FUS-BBBO og histologisk evaluering av genuttrykk. 3D-printbare komponenter ble utviklet for å forenkle målretting av små hjernestrukturer med bildeveiledet FUS-BBBO.
Administrering av MR-veiledet fokusert ultralyd (MRIgFUS) byr på en rekke utfordringer. For det første har typisk MR-spole begrenset plass som er designet for å bare imøtekomme en prøve og ikke ultralydmaskinvaren. De større boringene av MR øker kostnadene for utstyr og reduserer bildekvaliteten, da signalet er relatert til fyllfaktoren til en spole32. Følgelig vil enhver FUS-maskinvare plassert på toppen av et dyrebilde i MR kompromittere bildekvaliteten. For det andre er det vanskelig og dyrt å designe MR-kompatible enheter. MR-kompatible materialer må være diamagnetiske, ha lav tilbøyelighet til å skape virvelstrømmer under radiofrekvent bestråling, og ha lav magnetisk følsomhet i høye magnetfelt. I et hvilket som helst ledende materiale vil dannelsen av virvelstrømmer eller dens magnetiske følsomhet også påvirke bildekvaliteten negativt. Endelig har de tilgjengelige MR-kompatible materialene lavere Youngs moduli og holdbarhet enn metallene som vanligvis brukes i produksjon av presise målmaskiner, for eksempel stereotaksiske rammer. Motorene som brukes til posisjonsjusteringer må være MR-kompatible og plasseres utenfor MR-boringen på grunn av størrelsen. Disse motorene må kobles på avstand til transduseren inne i en MR-boring ved hjelp av MR-kompatible materialer. Problemer med plastvridning, mangel på tilstrekkelig plass inne i boringen for å implementere robuste komponenter og utilstrekkelig rom for å endre målposisjoner over hele hjernen har påvirket målrettingsnøyaktigheten i tidligere arbeid.
For å løse disse problemene ble det besluttet å utføre bildediagnostikk i MR- og FUS-BBBO-administrasjon utenfor skanneren. For å tillate MR-veiledning ble mus plassert inne i en 3D-printet begrensning som hadde en MR-synlig målrettingsguide som kunne brukes til å lokalisere musehjernestrukturene både i MR og i stereotaks-koordinatrommet. Siden både museskallen og målrettingsveiledningen er godt festet til ørebøyleholdere (figur 1a,b), kan en målrettingsveiledning brukes til å korrelere romlige koordinater i MR-bildet og nullstille de stereotaksiske instrumentene. Fastholdelsen har ikke bevegelige deler og inneholder ikke en svinger, noe som tillot oss å gjøre den både robust og tilstrekkelig liten til å passe inn i en MR og fjernet signalforstyrrelser fra transduserens elektronikk. Plassen inne i målrettingsveiledningen har blitt uthult ettersom den 3D-printede støtten for noen materialer er synlig i MR (figur 1c). Hull i forsamlingen ble introdusert for å muliggjøre stereotakskalibrering (figur 3). Ultralydtransduseren var festet til en elektrodeholder med stereotaks, og målretting ble utført som beskrevet i avsnitt 4 (figur 1d). Transduseren skal støttes langs lengden ved å huse ørestenger, og forhindre avvik fra nivåplanet. Målrettingen i dorso-ventral retning kan oppnås ved hjelp av faseforskyvninger i en ringformet matrise.
Den praktiske målrettingspresisjonen bestemmes av ultralydfokusering og skalledemping. FUS-BBBO-prosedyren er beskrevet i detalj for rotter 11 og er implementert i en rekke andre modellorganismer23,33,34 og hos mennesker 16,17. Forholdet mellom ultralydfokusstørrelsen omvendt proporsjonal med frekvensen, hvor høyere frekvenser kan resultere i mer presis levering. Imidlertid øker dempingen av skallen med frekvensene35, noe som kan føre til kranieoppvarming og skade på kortikale områder. Den nøyaktige målrettingsstrategien vil avhenge av hjernens nettsted. Stedene der et halvt maksimalt trykk i full bredde passer inn i hjernevevet, gir forutsigbar og sikker BBB-åpning i mange hjernestrukturer som striatum, midthjerne og hippocampus. Regioner nær hjernebunnen utgjør en spesifikk utfordring hos mus. Musehjernen måler omtrent 8-10 mm i dorso-ventral retning, noe som kan sammenlignes med den maksimale størrelsen på halv bredde for mange kommersielt tilgjengelige transdusere. Følgelig kan målretting på bunnen av skallen føre til ultralydrefleksjon fra bein og luft som er tilstede i ørekanaler, munn eller luftrør som kan føre til uforutsigbare mønstre av høyt og lavt trykk36. Noen av disse trykkene kan krysse en treghetskavitasjonsterskel som har vist seg å forårsake blødning og vevskader37. For å målrette regioner som ligger nær bunnen av skallen, kan det være å foretrekke å bruke interseksjonell ATAC7, hvor interseksjonell genetikk38 brukes til å begrense genuttrykk til et mindre område enn det som er målrettet med FUS-stråle. I det publiserte eksemplet på interseksjonell ATAC har et transgent dyr som uttrykker et genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerge celler blitt målrettet med ultralyd i den delen av regionen som inneholder dopaminerge celler. Endelig kan de kortikale områdene målrettes med FUS, men diffraksjon og refleksjon av ultralyd kan forekomme som fører til ujevne trykkprofiler. Denne protokollen dekker ikke målretting av kortikale regioner, da den vil være svært avhengig av den brukte arten; Imidlertid er det observert en viss målretting av cortex over hippocampus 7 (f.eks. figur 7) som indikerer at det, i det minste hos mus, er mulig.
Valget av kjemogenetisk aktivator og dosering vil avhenge av de spesifikke eksperimentelle behovene. En rekke studier, inkludert en av forfatternes studier7, viste ingen signifikant uspesifikk respons39,40, mens høyere doser (f.eks. 10 mg/kg) kan gi bivirkninger, i hvert fall i noen tilfeller41. Imidlertid, som med alle atferdseksperimenter, er riktige kontroller31 avgjørende på grunn av potensiell off-målrettet aktivitet av CNO og dets metabolitter42. Slike kontroller kan omfatte administrering av CNO og saltvannskontroller til dyr, uttrykke DREADDs og administrering av CNO til villtype, eller i noen spesifikke tilfeller en sammenligning av ipsi- og kontralaterale steder i hjernen som henholdsvis uttrykker og ikke uttrykker kjemogenetiske reseptorer. I tillegg avslørte nyere forskning en rekke nye DREADD-agonister med forbedret spesifisitet28,29,43. Andre kjemogenetiske reseptorer 5,25,44 kan også brukes i forbindelse med ATAC-prosedyre.
Histologisk evaluering av genuttrykk er nødvendig post mortem for hvert dyr. En liten brøkdel av dyrene viser dårlig genuttrykk etter FUS-BBBO7. I tillegg er det nødvendig å vise den romlige nøyaktigheten og spesifisiteten til genuttrykk siden feilmålretting er mulig. Merk at noen AAV-er kan vise retrograd eller anterograd sporingsevne45 og kan forårsake transfeksjon langt fra stedet som er målrettet med ultralyd til tross for nøyaktig ultralydmålretting. Hvis den uttrykte kjemogenetiske reseptoren er fusjonert til eller co-uttrykker en fluorofor, kan avbildning av fluoroforen i vevsseksjoner være tilstrekkelig til å evaluere lokalisering og intensitet av ekspresjon. Imidlertid er mange fluorescerende proteiner skadet av vevsfikseringsprosessen, og immunfarging for mCherry-protein som ofte brukes med DREADDs ga bedre signal i tidligere studier7. Til slutt, på grunn av tettheten av nevroner i visse deler av hjernen (f.eks. Granulært cellelag i hippocampus), kan bruk av kjernefysisk lokaliserte fluoroforer uttrykt under IRES, i motsetning til fusjoner, for å utføre celletelling, være fordelaktig siden kjerner lett kan segmenteres og motfarges med kjernefysiske flekker, for eksempel DAPI eller TO-PRO-3. For å evaluere nevromodulering ved c-Fos-farging, er det viktig å utføre kjernefysisk motfarging og telle c-Fos-positive kjerner, i stedet for noe fluorescenssignal. I noen tilfeller kan cellulært rusk vise fluorescens og forvirre målingene av positive celler.
Begrensninger av stoffet og genleveransen med FUS-BBBO inkluderer lavere oppløsning enn levering med invasive intrakranielle injeksjoner og behovet for større mengder injiserte legemidler eller virale vektorer. I tillegg, mens en direkte injeksjon i hjernen resulterer i eksklusiv levering til et injisert sted, bruker FUS-BBBO en intravenøs rute som resulterer i mulig levering til perifert vev. Begrensninger ved bruk av kjemogenetikk for nevromodulering inkluderer en langsom tidsskala, noe som kan være utilstrekkelig for noen atferdsprotokoller som krever raske endringer i intensiteten av nevromodulering.
Disclosures
Ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flere 3D-printede komponenter ble opprinnelig designet av Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrike). Forfatter takker John Heath (Caltech) og Margaret Swift (Caltech) for teknisk hjelp med å forberede manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
| 25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
| 30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
| Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
| Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
| Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
| Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
| Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
| Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
| Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
| Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
| Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
| Depilation crème | Nair | n/a | |
| Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
| Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
| PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
| Peristaltic pump | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
| Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
| Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
| Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
| Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
| ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
| Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
| Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
| VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
| Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
| Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Zhang, F., Wang, L. -P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature Methods. 3, 785-792 (2006).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 5163-5168 (2007).
- Lerchner, W., et al. Reversible silencing of neuronal excitability in behaving mice by a genetically targeted, ivermectin-gated Cl- channel. Neuron. 54, 35-49 (2007).
- Magnus, C. J., et al. Chemical and genetic engineering of selective ion channel-ligand interactions. Science. 333, 1292-1296 (2011).
- Deeb, W., et al. Proceedings of the fourth annual deep brain stimulation think tank: a review of emerging issues and technologies. Frontiers in Integrative Neuroscience. 10, 38 (2016).
- Szablowski, J. O., Lee-Gosselin, A., Lue, B., Malounda, D., Shapiro, M. G. Acoustically targeted chemogenetics for the non-invasive control of neural circuits. Nature Biomedical Engineering. 2, 475-484 (2018).
- Elias, W. J., et al. A pilot study of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 369, 640-648 (2013).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4, 519-526 (2013).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103, 11719-11723 (2006).
- Samiotaki, G., Acosta, C., Wang, S., Konofagou, E. E. Enhanced delivery and bioactivity of the neurturin neurotrophic factor through focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening in vivo. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 611-622 (2015).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3555 (2012).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hsu, P. -H., et al. Noninvasive and targeted gene delivery into the brain using microbubble-facilitated focused ultrasound. PloS One. 8, 58682 (2013).
- Wang, S., Olumolade, O. O., Sun, T., Samiotaki, G., Konofagou, E. E. Noninvasive, neuron-specific gene therapy can be facilitated by focused ultrasound and recombinant adeno-associated virus. Gene Therapy. 22, 104 (2015).
- Downs, M. E., et al. Long-Term Safety of Repeated Blood-Brain Barrier Opening via Focused Ultrasound with Microbubbles in Non-Human Primates Performing a Cognitive Task. PLoS One. 10, 0125911 (2015).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9, 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8, 343 (2016).
- Sternson, S. M., Roth, B. L. Chemogenetic Tools to Interrogate Brain Functions. Annual Reviews Neurosciences. 37, 387-407 (2014).
- Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63, 27-39 (2009).
- Zhu, H., et al. Chemogenetic inactivation of ventral hippocampal glutamatergic neurons disrupts consolidation of contextual fear memory. Neuropsychopharmacology. 39, 1880-1892 (2014).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33, 95-104 (2007).
- Thévenot, E., et al. Targeted delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the brain, using magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound. Human Gene Therapy. 23, 1144-1155 (2012).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Yang, F. -Y., Fu, W. -M., Chen, W. -S., Yeh, W. -L., Lin, W. -L. Quantitative evaluation of the use of microbubbles with transcranial focused ultrasound on blood-brain-barrier disruption. Ultrasonics Sonochemistry. 15, 636-643 (2008).
- Vardy, E., et al. A New DREADD Facilitates the Multiplexed Chemogenetic Interrogation of Behavior. Neuron. 86, 936-946 (2015).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Sciences. 1, 61-72 (2018).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Nagai, Y., et al. Deschloroclozapine: a potent and selective chemogenetic actuator enables rapid neuronal and behavioral modulations in mice and monkeys. bioRxiv. , 854513 (2019).
- Thompson, K. J., et al. DREADD Agonist 21 Is an Effective Agonist for Muscarinic-Based DREADDs in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology and Translational Science. 1, 61-72 (2018).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. Journal of Comparative Neurology. 296, 517-530 (1990).
- Mahler, S. V., Aston-Jones, G. CNO Evil? Considerations for the use of DREADDs in behavioral neuroscience. Neuropsychopharmacology. 43, 934 (2018).
- Gruber, B., Froeling, M., Leiner, T., Klomp, D. W. J. RF coils: A practical guide for nonphysicists. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 48, 590-604 (2018).
- Treat, L. H., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Transcranial MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening in rats. IEEE. 2, 998-1000 (2004).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Feasibility of transcranial, localized drug-delivery in the brain of Alzheimer's-model mice using focused ultrasound. IEEE. 2, 988-991 (2005).
- Cobbold, R. S. Foundations of Biomedical ultrasound. , Oxford university press. (2006).
- Younan, Y., et al. Influence of the pressure field distribution in transcranial ultrasonic neurostimulation. Medical Physics. 40, 082902 (2013).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine and Biology. 51, 793-807 (2006).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a Revolution: The Impact of Site-Specific Recombinases on Genetic Analyses in Mice. Developmental Cell. 6, 7-28 (2004).
- Jendryka, M., et al. Pharmacokinetic and pharmacodynamic actions of clozapine-N-oxide, clozapine, and compound 21 in DREADD-based chemogenetics in mice. Scientific Reports. 9, 4522 (2019).
- Manvich, D. F., et al. The DREADD agonist clozapine N-oxide (CNO) is reverse-metabolized to clozapine and produces clozapine-like interoceptive stimulus effects in rats and mice. Scientific Reports. 8, 3840 (2018).
- Martinez, V. K., et al. Off-Target Effects of Clozapine-N-Oxide on the Chemosensory Reflex Are Masked by High Stress Levels. Frontiers in Physiology. 10, 521 (2019).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, 503-507 (2017).
- Bonaventura, J., et al. High-potency ligands for DREADD imaging and activation in rodents and monkeys. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
- Roth, B. L.
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS One. 8, 76310 (2013).
