Summary
Este protocolo presenta un método para realizar la caracterización reológica del moco que reside en los rastrillos branquiales (GUR) de la carpa plateada. Las características viscoelásticas del MOG-GR, obtenidas midiendo la viscosidad, el almacenamiento y los módulos de pérdida, se evalúan para el estrés de rendimiento aparente para comprender el mecanismo de alimentación del filtro en los RR.
Abstract
La carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix,es un pez alimentador de filtro planctívoro invasor que infestó las vías fluviales naturales de la cuenca superior del río Mississippi debido a su mecanismo de alimentación por filtro altamente eficiente. Los órganos característicos llamados rastrillos branquiales (RDA), que se encuentran en muchos de estos alimentadores de filtro, facilitan la filtración eficiente de partículas de alimentos como el fitoplancton que son de unas pocas micras de tamaño.
La motivación para investigar la reología del moco GR proviene de nuestro deseo de comprender su papel en la ayuda al proceso de alimentación por filtro en la carpa plateada. El líquido rico en moco, en un estado "espeso y pegajoso" puede facilitar la adhesión de las partículas de los alimentos. La permeación y el transporte a través de la membrana GR se ven facilitados por la acción de fuerzas de cizallamiento externas que inducen diferentes tasas de deformación por cizallamiento. Por lo tanto, la reología del moco puede proporcionar una pista vital sobre la tremenda naturaleza de la carpa plateada dentro del grupo de peces que se alimentan por filtro. Sobre la base de esto, se postuló que el moco GR puede proporcionar una función adhesiva a las partículas de alimentos y actuar como un vehículo de transporte para ayudar en el proceso de alimentación del filtro.
El objetivo principal del protocolo es determinar la tensión de rendimiento del moco, atribuida a la tensión de cizallamiento mínima requerida para iniciar el flujo en el que se observa por primera vez una deformación plástica irreversible a través de un material viscoelástico estructurado. En consecuencia, las propiedades reológicas del moco GR, es decir, la viscosidad, el almacenamiento y los módulos de pérdida, se investigaron por su naturaleza no newtoniana, adelgazamiento por cizallamiento utilizando un reómetro rotacional.
Un protocolo presentado aquí se emplea para analizar las propiedades reológicas del moco extraído de los rastrillos branquiales de una carpa plateada, pescado en la ubicación de Hart Creek del río Missouri. El protocolo tiene como objetivo desarrollar una estrategia efectiva para las pruebas reológicas y la caracterización de materiales de moco que se supone que es un material viscoelástico estructurado.
Introduction
La carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix,es un alimentador de filtro planctívoro y una especie invasora que se ha infiltrado en varias vías fluviales naturales en los Estados Unidos. Esta especie se introdujo inicialmente en la cuenca alta del río Mississippi para controlar las floraciones de algas1,2,3. La carpa plateada es un alimentador extremadamente eficiente. Por lo general, sus tamaños de partículas de alimentos consumibles varían de 4 a 20 μm a zooplancton más grande que son alrededor de 80 μm3,4,5. Esta especie ha superado a otros peces nativos y potencialmente puede causar enormes daños a las vías fluviales nativas al limitar los recursos disponibles1,2,6. Por lo tanto, los peces que se alimentan por filtro como la carpa plateada y la carpa cabe cabeza grande representan una gran amenaza para los Grandes Lagos1,2,6,7,8.
Los peces que se alimentan por filtro poseen órganos especiales llamados rastrillos branquiales (RDA) con una capa delgada de moco que reside en su superficie. Estos órganos mejoran la eficiencia de filtración y agregación de pequeñas partículas del fluido entrante. El objetivo del protocolo presentado en este documento es caracterizar la propiedad no newtoniana del material de adelgazamiento por cizallamiento y la tensión de rendimiento del moco GR adquirido de la superficie interna de los rastrillos branquiales en la carpa plateada. El valor de la tensión de rendimiento del GR-moco, determinado mediante un reómetro rotacional, es de interés en este estudio. La tensión de rendimiento medida, también llamada "tensión de rendimiento aparente", depende de los métodos de prueba, como la velocidad de cizallada constante o la deformación oscilatoria dinámica tipo9,10. El adelgazamiento por cizallamiento, 'fluido de estrés de rendimiento', experimenta una transición de un comportamiento sólido a un comportamiento líquido en una tensión crítica aplicada9,11. La tensión de rendimiento aparente es la tensión de cizallamiento mínima requerida para iniciar el flujo o aquella en la que se observa por primera vez una deformación plástica irreversible cuando el moco pasa de un material similar a un gel a un material similar a un fluido. Este comportamiento se puede observar en materiales viscoelásticos estructurados. La transición del comportamiento similar a un gel a un comportamiento fluido del moco GR implica dos funciones, es decir, un papel adhesivo para recolectar partículas de alimentos y un papel de vehículo de transporte para ayudar en el proceso de entrega y filtración de partículas. La función extendida del moco incluye la creación de barreras de difusión en la resistencia a las enfermedades y la respiración, proporcionando una liberación controlada de factores nutricionales, componentes tóxicos y excreción, creando vías metabólicas para la alimentación y la anidación, ayudando en la protección de los depredadores y produciendo modificaciones de la capa límite que mejoran la locomoción y la eficiencia propulsiva12,13,14.
A diferencia de los fluidos simples, los fluidos complejos como el moco poseen propiedades que varían con las condiciones de flujo y requieren parámetros de medición adicionales para definir su comportamiento físico a gran escala. Para controlar la viscosidad y el estrés por rendimiento del moco GR, las mediciones reológicas se realizan utilizando un reómetro rotacional. El reómetro rotacional aplica una tensión o tensión de cizallamiento constante u oscilatoria por medio de un disco giratorio en contacto con la muestra de fluido y mide su respuesta. La razón detrás del uso de este instrumento y técnica es que el reómetro puede proporcionar un conjunto de mediciones para describir las propiedades materiales del moco GR de la carpa plateada, que no se pueden definir solo por la viscosidad.
El moco es un material viscoelástico y su respuesta mecánica a una deformación impuesta es entre la de un sólido puro (regido por la ley de elasticidad de Hooke) y el de un líquido puro (regido por la ley de viscosidad de Newton)15,16. La compleja red macromolecular contenida dentro del moco puede estirarse y reorientarse en respuesta a fuerzas externas o deformación. Un reómetro rotacional se compone de una geometría de cono y una placa de Peltier como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2 (consulte la Tabla 1 para las especificaciones de instrumentación). El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo para determinar las propiedades reológicas del moco GR. Una ventaja del reómetro rotacional sobre un viscosímetro es su capacidad para realizar mediciones dinámicas utilizando pequeños volúmenes de muestra. El volumen de la muestra de moco GR en este estudio fue de aproximadamente 1,4 ml. El viscosímetro, por otro lado, está limitado a velocidades de cizallamiento constantes y requiere grandes volúmenes de muestra.
Se espera que las propiedades reológicas del moco varíen mucho dentro de la anatomía de la carpa plateada. Por ejemplo, las propiedades del moco que reside en las superficies GR pueden ser diferentes del órgano epibranquial. Para tener en cuenta la variabilidad potencial de las propiedades del moco en diferentes regiones del pez, la muestra de moco GR adquirida se diluyó y se crearon y probaron soluciones de tres concentraciones utilizando el reómetro rotacional. Los datos y resultados relativos a la reología del moco informados tras la ejecución del protocolo demostraron la eficacia de la técnica de medición. Los datos ilustrativos presentados en este documento no están destinados a generalizarse en toda la población de carpa plateada. El protocolo presentado en este documento se puede extender para investigar la reología del moco en conjuntos de muestras más grandes para probar otras hipótesis.
El propósito de este estudio es demostrar la variación de las propiedades reológicas de la reología del moco GR con tres concentraciones diferentes de moco (400 mg/mL, 200 mg/mL y 100 mg/mL). La concentración de 400 mg/ml representa la muestra de moco crudo cosechada de los GRs de pescado. Se utilizó agua desionizada (DI) para diluir la muestra de moco crudo en concentraciones de 200 mg/mL y 100 mg/mL. La dilución de las muestras de moco permitió la evaluación del grado de adelgazamiento por cizallamiento y la tensión aparente del rendimiento en función de la concentración y la determinación de la concentración a la que el moco GR pasa a un comportamiento no newtoniano. Se utilizó un agitador para descomponer cualquier grupo grande de moco en las muestras para mitigar los errores en los datos reológicos debido a la no homogéneidad.
En la mayoría de los vertebrados, incluidos los peces, las macromoléculas formadoras de moco predominantes son las glicoproteínas (mucinas) que tienden a hincharse en el agua por enredos o reticulaciones químicas y crean un material similar a un gel12,13,17,18,19,20. Las macromoléculas formadoras de gel de alto peso molecular y el alto contenido de agua reflejan el deslizamiento en el moco13. Un alto grado de interacciones inter-macromoleculares conduce a la formación de gel, mientras que los niveles más bajos de interacciones inter-macromoleculares o enlaces rotos dan como resultado fluidos de alta viscosidad21.
Los procesos de filtración de partículas de alimentos en peces que se alimentan por filtro son ayudados por propiedades relacionadas con el moco GR, como la cohesión y la viscosidad, que determinan su potencial de adhesión yadherencia 22. La fuerza de la adhesión basada en moco depende de interacciones intermoleculares, electrostáticas o hidrofóbicas específicas23. Sanderson et al.24 realizaron un estudio de alimentación en suspensión en peces negros en el que encontraron la evidencia de adhesión basada en moco. Afirmaron que la adhesión de partículas de alimentos en suspensión con una superficie mucosa es seguida por el transporte de grupos agregados de partículas unidas con el moco por el flujo de agua dirigido que actúa sobre él24. El moco expuesto a las tasas de tensión de cizalla generadas por el flujo de agua facilita la entrega de partículas de alimentos a los órganos digestivos. Se utilizaron técnicas endoscópicas para observar partículas filtradas24.
La literatura sobre el rango de las tasas de cizallamiento y los límites prácticos en las pruebas reológicas del moco GR es escasa. Por lo tanto, se buscó orientación de estudios reológicos sobre moco gástrico, nasal, cervical y pulmonar, moco de piel de salmón, limo de pez bruja y lubricante de superficie de articulación ósea en los que se estudió la caracterización reológica y los atributos no newtonianos11,12, 25,26, 27,28,29,30,31. Más recientemente, el efecto del moco de la piel de los peces en la locomoción y la eficiencia propulsiva se ha estudiado utilizando viscometría de velocidad de cizallamiento constante. Los estudios de reología del moco cutánico (sin ninguna dilución u homogeneización) relacionados con la dorada, la lubina y la exigua demostraron un comportamiento no newtoniano a tasas de cizallamiento típicamente bajas14. En otro estudio relacionado, se encontró que las muestras de moco cutángeo crudo de los lados dorsal y ventral del lenguado senegalés exhiben un comportamiento no newtoniano, lo que indica una mayor viscosidad del moco ventral a todas las tasas de cizallamiento consideradas32. Otros protocolos reológicos relacionados con el desarrollo del andamio de hidrogel y para suspensiones altamente concentradas utilizando un viscosímetro de velocidad de cizallamiento constante también han sido reportados en la literatura33,34.
En este estudio, las propiedades del moco GR se investigaron utilizando un reómetro rotacional controlado por la velocidad de deformación que ha sido ampliamente utilizado en experimentos de reología en fluidos biológicos complejos25. Para los fluidos newtonianos, la viscosidad aparente permanece constante, es independiente de la velocidad de cizallamiento y las tensiones de cizallamiento varían linealmente con las tasas de deformación de cizallamiento(Figura 3A,B). Para fluidos no newtonianos (como los fluidos de adelgazamiento por cizallamiento) la viscosidad depende de la velocidad de cizallamiento o de la historia de la deformación(Figura 3A,B). El módulo de pérdida (G") representa la medida en que el material resiste la tendencia a fluir y es representativo de la viscosidad del fluido(Figura 4). El módulo de almacenamiento (G') representa la tendencia del material a recuperar su forma original después de la deformación inducida por tensión y es equivalente a la elasticidad (Figura 4). El ángulo de fase (δ) o valor tangente de pérdida, se calcula a partir de la tangente inversa de G"/G'. Representa el equilibrio entre la pérdida de energía y el almacenamiento y también es un parámetro común para caracterizar materiales viscoelásticos (δ = 0° para un sólido hookeo; δ = 90° para un líquido viscoso; δ < 45° para un sólido viscoelástico y δ > 45° para un líquido viscoelástico) (Figura 4)25. La tensión de rendimiento aparente (σy) en fluidos estructurados representa un cambio de estado que se puede observar en los datos reológicos de barrido en estado estacionario y barridos dinámicos de tensión-deformación10. Si la tensión externa aplicada es menor que la tensión de rendimiento aparente, el material se deformará elásticamente. Cuando la tensión excede la tensión de rendimiento aparente (marcada como "tensión promedio" en la Figura 3B),el material pasará de la deformación elástica a la plástica y comenzará a fluir en su estado líquido35. La medición del módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") en la muestra de moco en condiciones de tensión oscilatoria (o deformación) cuantifica el cambio en el estado del material de un comportamiento similar al gel al viscoelástico similar al líquido.
Los tipos de pruebas de reómetro realizadas para monitorear datos relacionados con el módulo de almacenamiento (G'), el módulo de pérdida (G") y la viscosidad aparente (η) se describen aquí. Las pruebas de oscilación dinámica (barridos de deformación y barridos de frecuencia) monitorearon G' y G" bajo oscilación controlada de la geometría del cono. Las pruebas de barrido de deformación dinámica determinaron la región viscoelástica lineal (LVR) del moco mediante el monitoreo de la respuesta intrínseca del material(Figura 4). Se utilizaron barridos de deformación para determinar el comportamiento de rendimiento a una frecuencia y temperatura de oscilación constantes. Las pruebas de barrido de frecuencia dinámica monitorearon la respuesta del material al aumento de la frecuencia (tasa de deformación) a una amplitud y temperatura constantes (tensión o tensión). La deformación se mantuvo en la región viscoelástica lineal (LVR) para las pruebas de barrido de frecuencia dinámica. Las pruebas de velocidad de cizallado en estado estacionario monitorearon la viscosidad aparente (η) bajo rotación constante de la geometría del cono. El moco GR se sometió a pasos de tensión incrementales y la viscosidad aparente (η, Pa.s) se monitoreó para variar la velocidad de cizallamiento (ý, 1/s).
El protocolo presentado en este trabajo trata el moco GR como un material estructurado complejo de viscoelasticidad desconocida con un cierto rango de respuesta viscoelástica lineal. El moco de pescado fue extraído de los RR de la carpa plateada durante una expedición de pesca en la ubicación de Hart Creek en el río Missouri por la profesora L. Patricia Hernández (Departamento de Ciencias Biológicas, The George Washington University) 1,2,36. Una matriz de RDA dentro de la boca de una carpa plateada se muestra en la Figura 5A y un dibujo esquemático se presenta en la Figura 5B. Un GR extirpado se muestra en la Figura 5C. La extracción de moco de los ER de la carpa plateada se presenta como ejemplo en los dibujos esquemáticos, Figura 5D,E. Todas las pruebas del reómetro se realizaron bajo una temperatura constante y controlada de 22 ± 0.002 ° C, la temperatura registrada en el sitio de pesca1,2,36. Cada muestra de moco se probó tres veces con el reómetro, y los resultados promediados se presentan junto con las barras de error estadístico.
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Protocol
1. Preparación de las soluciones de moco de diversas concentraciones
NOTA: Tres concentraciones de la solución de moco (400 mg/mL, 200 mg/mL y 100 mg/mL con volúmenes aproximados, 1 mL, 1 mL y 2 mL, respectivamente) están preparadas para este experimento.
- Para calcular la masa del moco, mida la masa media de los viales con (Mcon moco ; mg) y sin moco (M viales ; mg). Luego reste la masa de los viales con moco con la que no tiene moco (Mmoco = M conmoco - Mviales ; mg).
- Diluya el moco en tres concentraciones (400, 200, 100, mg/ml) con agua desionizada (DI).
- Prepare la primera concentración de la solución de moco, 400 mg / ml agregando 0.6 ml de agua DI al moco usando una micropipeta.
NOTA: Dado que el volumen aproximado del moco extraído fue de 1,4 ml, la solución de 400 mg/ml tendrá un volumen total de ~ 2 ml. - Coloque el vial de solución de moco de 400 mg/ml en un agitador para asegurarse de que la solución de moco esté adecuadamente homogeneizada y se mitigue cualquier aglomeración de partículas de moco.
- Prepare la segunda concentración de la solución de moco, 200 mg/ml, extrayendo la mitad del volumen de la solución de moco de primera concentración en un nuevo vial utilizando una micropipeta y añadiendo 1 ml de agua DI en el nuevo vial.
- Repita el paso 1.2.2 para el primer y segundo vial con soluciones de moco.
- Preparar la tercera concentración de la solución de moco, 100 mg/ml, extrayendo la mitad del volumen (1 ml) de la solución de 200 mg/ml en un nuevo vial utilizando una micropipeta y añadiendo agua DI en el nuevo vial.
- Repita el paso 1.2.2 para las tres concentraciones de soluciones de moco en sus respectivos viales (véase la figura complementaria 1).
- Guarde los viales de solución de moco en un refrigerador hasta que se realice la calibración y las pruebas del reómetro.
- Prepare la primera concentración de la solución de moco, 400 mg / ml agregando 0.6 ml de agua DI al moco usando una micropipeta.
2. Mediciones y adquisición de datos utilizando un reómetro
NOTA: El software utilizado en este protocolo para el control de instrumentos y la adquisición de datos con reómetro se indican en la Tabla de Materiales. Este software se denominará «software de control de instrumentos de reómetro».
- Configure y calibre el instrumento del reómetro.
- Encienda el suministro de aire comprimido al reómetro y asegúrese de que la mesa neumática y el reómetro estén nivelados con un medidor de burbujas. Gire la tapa protectora en el eje del reómetro y mantenga el eje quieto mientras se desenrosca.
- Encienda los interruptores principales del reómetro para activar los rodamientos magnéticos del reómetro.
- Encienda la computadora de control del reómetro con el software de control del instrumento del reómetro instalado en ella e inicie el software de control del instrumento del reómetro (consulte la Figura suplementaria 2).
- Realice la calibración del instrumento seleccionando las pestañas'Calibración | Instrumento' desde la ventana del software. Elija la opción'Instrumento'. Haga clic en'Calibrar'en'Inercia'. Registre el valor de calibración de inercia del instrumento en μN.m.s2 y repita la calibración al menos 3 veces para garantizar que los valores de calibración estén dentro del 10% entre sí (consulte la Figura suplementaria 3).
- Instale la geometría del reómetro en el eje del reómetro.
- Haga clic en la pestaña 'Geometrías' en el software de control del instrumento del reómetro.
- Limpie el cono con la geometría deseada (40 mm de diámetro, 1◦ 0' 11'' cono) y la placa peltier con isopropanol (ver Tabla 1, Tabla de Materiales, Figura 1y Figura 2).
NOTA: La placa Peltier viene instalada en el reómetro; se puede limpiar con isopropanol mientras se fija directamente al reómetro. - Asegúrese de que el accesorio de la placa Peltier esté libre de polvo visible y limpie, si es necesario, con isopropanol. Instale la placa Peltier si no está preinstalada en el reómetro y conecte las conexiones del disipador de calor.
- Pulse elbotón 'Bloquear'en el reómetro del eje de bloqueo que está conectado a la geometría del cono. Esto detiene la posición del eje, pero puede girar libremente en la posición.
- Haga clic en 'Smart Swap | Habilitado' en la pestaña del software de control del instrumento del reómetro para permitir la detección automática de la geometría (consulte la Figura suplementaria 4).
- Gire el eje en la parte superior del reómetro para atornillar la geometría. El software detectará la geometría del ángulo del cono de 40 mm de diámetro, 1◦ 0' 11'' en esta etapa (ver Tabla 1 y Tabla de Materiales).
- Repita los pasos 2.2.5 – 2.2.6 para asegurarse de que se detecta la geometría.
- Seleccione'Gap'en el 'Panel decontrol'del software de control del instrumento del reómetro, haga clic en el icono'Opciones'y elija la opción'Fuerza axial'. Establecer la fuerza axial en '1 Newton'; esto es para garantizar que la geometría del cono toque la placa de Peltier para la inicialización de espacio cero (consulte la Figura suplementaria 5).
- Realice la calibración de la geometría del reómetro.
- Seleccione la pestaña 'Geometría' en la ventana del software. Haga clic en'Calibrar'en'Inercia'. Registre el valor de calibración de inercia de geometría en μN.m.s2 y repita esto 2-3 veces para garantizar que los valores de calibración estén dentro del 10% entre sí.
- Haga clic en'Calibrar'en'Fricción'en la ventana del software. Registre el valor de calibración de fricción de la geometría en μN.m/(rad/s) y repita esto 2-3 veces para asegurarse de que los valores de calibración estén dentro del 10% entre sí (ver Figura suplementaria 6).
- Realizar la inicialización de brecha cero
NOTA: Dado que la geometría no se puede elevar con precisión por encima de la placa de Peltier para realizar mediciones sin una posición de referencia "cero", se realiza la inicialización de espacio cero. Para los fines de medición, la geometría tiene un espacio de geometría incorporado de 24 μm y un espacio de recorte de 28 μm. El espacio de recorte está configurado para limpiar eficazmente el exceso de líquido que puede derramarse fuera del área de superficie de la geometría. Estas brechas son imperativas para medir con precisión los datos utilizando la muestra y el reómetro. El paso 2.4.1 es absolutamente necesario para asegurarse de que la geometría se establece en cero espacio para lograr la geometría y recortar los huecos de 24 μm y 28 μm, respectivamente.- Haga clic en el icono'Cero espacio'en la pestaña'Espacio'en el'Panel de control'en la ventana del software. La inicialización se completa cuando la fuerza axial experimentada por la geometría es mayor o igual a 1 N, ya que toca la placa de Peltier. Asegúrese de que el espacio del reómetro esté a cero para que su posición de referencia sea precisa (véase la Figura suplementaria 7 y la Figura suplementaria 8).
- Pulse los controles de laflecha arriba y abajoen el instrumento del reómetro o los iconos de"subir y bajar" de la geometríabajo la pestaña"Gap"en el software de control del instrumento del reómetro para elevar la geometría a cualquier altura arbitraria. La pantalla de control en el instrumento del reómetro y el panel de control del software de control del instrumento del reómetro mostrarán la (misma) altura del espacio.
- Configure el procedimiento experimental en el software de control del instrumento del reómetro. Realizar la caracterización de las propiedades reológicas mediante el uso de una geometría de placa de cono sobre Peltier a 22 °C.
NOTA: El sitio web del Servicio Geológico de los Estados Unidos se utilizó para determinar la temperatura del agua del río el 20 de septiembre de 2018, cuando se pescó la carpa plateada utilizada para los experimentos de moco GR en la ubicación de Hart Creek36. La temperatura del moco puede afectar las propiedades reológicas. La importancia de ajustar los valores a la temperatura del río es que coincida aproximadamente con la temperatura bajo la cual se pueden estimar de manera realista las propiedades del moco.- Seleccione la pestaña'Experimentos'en el software de control del instrumento reómetro y complete la información relevante como 'Nombre', 'Operador', 'Proyecto', etc. (véase la figura complementaria 9)
- Seleccione la pestaña 'Geometría' y asegúrese de que la información esté de acuerdo con los pasos 2.2.5. - 2.2.7. (véase la figura complementaria 10).
- Seleccione la ficha 'Procedimiento', y utilice las teclas de flecha configuradas en '1: Amplitud de oscilación' procedimiento. (véase la figura complementaria 11).
- Inicialice la configuración de 'Control ambiental' como sigue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tiempo de remojo = 120 s' y marque la casilla 'Esperar la temperatura' (ver Figura suplementaria 11).
- Inicialice la configuración de 'Parámetrosde prueba ' de la siguiente manera: 'Frecuencia = 1 Hz'; establecer 'Barrido logarítmico'; «Par = 10 a 10000 μN.m»; «Puntos por década = 5» (véase la figura complementaria 11).
- Configure el experimento para determinar el rango viscoelástico lineal (LVR) del moco de concentración conocida (100 mg / ml)
- Utilizando una micropipeta apropiada y una punta de pipeta extraiga aproximadamente 0,3 ml de solución de moco de pescado de concentración 100 mg/ml (consulte el Paso 1.2, Tabla de materiales).
- Introduzca la solución de moco en la placa de Peltier utilizando la micropipeta (ver Figura 2).
- Pulse el botón 'Trim Gap' en el reómetro para bajar la geometría a la placa Peltier. Alternativamente, haga clic en el icono'Recortar hueco'en la pestaña'Hueco'en la opción'Panel de control'en el software de control del instrumento del reómetro (consulte la Figura suplementaria 12).
- Use la micropipeta con la punta de la pipeta para eliminar cualquier exceso de solución de moco y asegúrese de que el fluido esté debajo de la geometría sin derramarse cerca de la periferia de la geometría.
NOTA: La carga incorrecta del fluido dará lugar a errores en las mediciones. La muestra rellena bajará la distribución del par y la muestra sobrellenó conducirá a distribuciones de tensión erróneas debido al derrame a lo largo de los bordes. - Seleccione las pestañas 'Motor' y 'Velocidad' a 5 rad/s y 0 rad/s alternativamente, hasta que haya una inercia y velocidad mínimas en la muestra debajo de la geometría. La pantalla de control en el instrumento del reómetro y el panel de control del software de control del instrumento del reómetro mostrarán la velocidad (ver Figura suplementaria 13).
- Presione el botón 'Geometry Gap' en el reómetro para bajar la geometría al espacio adecuado preestablecido por geometría específica. Alternativamente, haga clic en el icono'Geometry Gap'en la pestaña'Gap'en la opción 'Panel de control' en el software de control del instrumento del reómetro (consulte la Figura suplementaria 14).
- Ejecute el experimento para determinar el rango viscoelástico lineal (LVR) del moco de la concentración conocida (100 mg / ml).
- Haga clic en el icono'Inicio'en el software de control del instrumento del reómetro (consulte la Figura complementaria 15).
NOTA: El reómetro realiza mediciones automáticas; una vez pulsado el botón 'Inicio', el reómetro tardará aproximadamente 20 minutos en completar la prueba. La configuración "Puntos por década" en el paso 2.5.5 determina cuánto tiempo necesitará el reómetro para completar las mediciones. - Ejecute el experimento haciendo clic en 'Sí' en el cuadro emergente que aparece y sugiere que el espacio de geometría se reduzca a la distancia correcta para iniciar el experimento, si aún no se ha bajado.
- Observe la gráfica en tiempo real generada por el reómetro que informa los módulos de almacenamiento (G') y pérdida (G'').
NOTA: La G' y la G" son los módulos de almacenamiento y pérdida, respectivamente. El módulo de almacenamiento representa la tendencia del material a recuperar su forma original después de la deformación inducida por la tensión y es equivalente a la elasticidad. El módulo de pérdida representa la medida en que el material resiste la tendencia a fluir y es representativo de la viscosidad del fluido (ver Figura 4). - Establezca el eje X de la gráfica en 'Porcentaje de deformación de oscilación'. Para ello, haga clic con el botón derecho en el gráfico presentado y elija lapestaña 'Variables del gráfico' (consulte la Figura complementaria 16).
- Registre el rango de porcentaje de deformación de oscilación de la gráfica antes de que el material entre en el rango viscoelástico no lineal, una vez que se complete la prueba.
- Pulse los controles de laflecha arriba y abajoen el instrumento del reómetro o los iconos de"subir y bajar" de geometríadebajo de la pestaña"Gap"en el software de control del instrumento del reómetro para elevar la geometría a cualquier altura arbitraria por encima de la placa de Peltier.
- Guarde el archivo que contiene tanto el procedimiento experimental como los resultados en el formato de archivo nativo del software de control del instrumento reómetro para determinar la región viscoelástica lineal (LVR) de la muestra de moco.
NOTA: Esto se puede hacer configurando el eje X de la gráfica para que la amplitud de deformación (%) y/o la tensión de oscilación
antes de que los datos entren en la región viscoelástica no lineal (NLVR) (consulte la Figura suplementaria 16).
- Haga clic en el icono'Inicio'en el software de control del instrumento del reómetro (consulte la Figura complementaria 15).
- Ejecute los barridos dinámicos y los experimentos de prueba de flujo de velocidad de cizallamiento en estado estacionario en el rango viscoelástico lineal (LVR) para el moco de concentración conocida 100, mg / ml para generar resultados de tres muestras de moco independientes de 100 mg / ml. Realice estos pasos en las muestras de concentración de moco disponibles individualmente.
- Repita los pasos 2.5.1 – 2.5.4.
- Inicialice la configuración de 'Parámetrosde prueba ' de la siguiente manera: 'Frecuencia = 1 Hz'; establecer 'Barrido logarítmico'; «Cepa % = 100 a 10000 %; 'Puntos por década = 10'.
- Seleccione la pestaña'Procedimiento'y utilice las teclas de flecha configuradas en el procedimiento '2: Frecuencia de oscilación'.
- Inicialice la configuración de 'Control ambiental' como sigue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tiempo de remojo = 0.0 s'.
- Inicialice la configuración de 'Parámetrosde prueba ' de la siguiente manera: 'Strain % = 1 %'; establecer 'Barrido logarítmico'; «Frecuencia = 20 a 1 Hz»; 'Puntos por década = 10'.
- Seleccione la pestaña'Procedimiento'y utilice las teclas de flecha configuradas en el procedimiento '3: Flow Sweep'.
- Inicialice la configuración de 'Control ambiental' como sigue: 'Temperatura = 22 °C'; 'Tiempo de remojo = 0.0 s'.
- Inicialice la configuración de 'Parámetrosde prueba ' como sigue: 'Velocidad de cizalla = 1 a 10000 1/s'; 'Puntos por década = 10'; casilla de verificación 'Detección de estado estacionario'.
- Repita los pasos 2.7.1 – 2.7.2 y espere hasta que se complete el experimento, aproximadamente 45 minutos.
- Presione los controles de laflecha hacia arriba y hacia abajoen el instrumento del reómetro o los iconos de "geometría de subir y bajar" en la pestaña "Brecha" en el software de control del instrumento del reómetro para elevar la geometría a cualquier altura arbitraria.
- Use toallitas y guantes desechables para eliminar y limpiar el moco en la placa Peltier con solución de isopropanol (ver Tabla de Materiales).
- Guarde el archivo que contiene tanto el procedimiento experimental como los resultados en el formato de archivo nativo del software de control del instrumento del reómetro.
3. Repita el protocolo para otras concentraciones de soluciones de moco de 200 mg/ml y 400 mg/ml.
- Realice los pasos 2.5 – 2.8 incluyendo todos los sub-pasos enumerados en el mismo para las dos concentraciones restantes de soluciones de moco, 200 mg / ml y 400 mg / ml.
4. Representación gráfica y análisis de datos
NOTA: El código proporcionado en el archivo de código suplementario realiza el promedio de datos y genera errores de repetibilidad, superpone los datos de todos los experimentos. Las funciones de cálculo de desviación estándar no están disponibles en el software de control del instrumento del reómetro. El código está escrito en un lenguaje de programación para el análisis de datos, el posprocesamiento y la representación gráfica (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
- Exporte los datos generados a partir del paso 2.8 relacionados con la concentración de moco GR de 100 mg / ml y el paso 3.1 relacionado con las concentraciones de moco GR de 200 mg / ml y 400 mg / ml gr en formato de hoja de cálculo haciendo clic en la pestaña'Archivo | exportación | Excel' en el software de control de instrumentos del reómetro (ver Figura suplementaria 17).
- Ejecute códigos suplementarios para generar gráficos de viscosidad aparente (η) para variar las tasas de deformación por cizallamiento (
) y el módulo de pérdida (G"), el módulo de almacenamiento (G') y el ángulo de fase (δ) para variar la tensión de oscilación ( ) y generar resultados representativos.
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Representative Results
En esta sección, presentamos los resultados de los experimentos sobre moco GR utilizando un reómetro rotacional con una geometría de cono (40 mm de diámetro, 1° 0' 11'') y una placa de Peltier. Los experimentos ayudaron a caracterizar el comportamiento no newtoniano, de adelgazamiento por cizallamiento del moco GR y el estrés aparente del rendimiento que representa la transición del moco de un material similar a un gel a un material similar a un fluido. Los resultados representativos implican descripciones cuantitativas de los límites de par bajo y los efectos de flujo secundario de la instrumentación del reómetro rotacional. Los límites de instrumentación y las mediciones de la velocidad de deformación dinámica y de estado estacionario ayudaron a determinar con precisión las tendencias de comportamiento viscoelástico y el estrés aparente del rendimiento del moco GR. Las mediciones de tensión de rendimiento aparente proporcionaron un medio para observar la tensión mínima requerida para la deformación plástica irreversible del moco GR e iniciar el flujo. La tendencia de iniciación del flujo del moco GR podría atribuirse a las funciones de adhesión y transporte de partículas de alimentos. Las funciones de adhesión y transporte del moco GR fueron atributos macroscópicos del material que fueron informados por las mediciones reológicas en los experimentos del protocolo. Por lo tanto, la caracterización macro-reológica del moco GR se realizó con este protocolo.
El moco utilizado en el experimento se adquirió de varios rastrillos branquiales de hasta tres carpas plateadas y no tenía ningún rastro visible de sangre1,2. La muestra adquirida se diluyó en dos muestras adicionales, como se describe en el protocolo. Todas las mediciones se realizaron a la temperatura controlada de 22 ± 0.002 °C36. Esta temperatura se mantuvo en la placa Peltier del reómetro. La geometría del cono fue elegida por su versatilidad en la medición de una amplia gama de viscosidades en materiales biológicos como el moco GR. El par mínimo en condiciones de cizallamiento en estado estacionario (10 x10 -9 Nm),el par mínimo en condiciones oscilatorias (2 x10 -9 Nm) junto con el ángulo de cono (1° 0' 11") y el resumen de las especificaciones del reómetro requeridas para evaluar los regímenes de bajo par y flujo secundario se presentan en la Tabla 1. Reportamos réplicas de tres muestras finales para la caracterización y comparación del comportamiento no newtoniano y de adelgazamiento por cizallamiento.
Amplias inferencias después de la ejecución exitosa del protocolo
La ejecución exitosa del protocolo y el análisis dieron como resultado la caracterización de propiedades reológicas (macro) que implican un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento no newtoniano del moco extraído de los rastrillos branquiales de la carpa plateada, Hypophthalmichthys molitrix. En particular, se resolvió el fenómeno de rendimiento y se determinó una tensión aparente del rendimiento del moco (concentración de 400 mg / ml, más cercana a la consistencia real del moco extraído) (σy = 0,2736 Pa). El protocolo era adecuado para mediciones que involucraban un volumen de muestra muy pequeño (aproximadamente, 1,4 ml) de moco. Debido a la escasez de literatura relacionada con la caracterización del moco GR, estos datos ayudarán en el modelado analítico y los estudios reométricos extendidos.
Resultados de experimentos de barrido dinámico
Los resultados de los experimentos de barrido dinámico de frecuencia y amplitud se presentan en esta sección. Estos son los resultados de los procedimientos creados en los pasos 2.8.2 - 2.8.5. Los límites de par bajo para el barrido de frecuencia oscilatoria y el barrido de amplitud del moco GR con concentración de 400 mg / ml se marcan en la Figura 6A,B.
Los datos de barrido de frecuencia(Figura 6A)se adquirieron para un rango de frecuencia angular, 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 rad s-1 a una amplitud de deformación oscilatoria constante de 0,01. El valor de frecuencia angular, 6,28 rad/s (1 Hz) fue elegido como frecuencia aproximada de movimiento de los pliegues palatales en los intersticios de los rastrillos branquiales y marcado en la Figura 6A. La elección del valor de amplitud de deformación se derivó de la región viscoelástica lineal determinada en el paso 2.7 del protocolo. En la Figura 6A,se calcularon dos límites inferiores potenciales del régimen de par bajo utilizando amplitudes de deformación de 0,01 y 0,001 (γ0), y pares mínimos de 2x10-9 Nm y 10 x 10-9 Nm (Tmin,véase la Tabla 1.), respectivamente. Los datos presentados en la Figura 6A comienzan en la frecuencia aproximada del movimiento del pliegue palatal (1 Hz o 6.28 rad/s) y aumentan a frecuencias angulares más altas que están más allá del alcance de la interpretación física en este estudio. Por lo tanto, estos datos no se analizaron más a fondo, ya que requieren una investigación paramétrica más detallada de la amplitud de la deformación y la frecuencia de movimiento del pliegue palatal.
Los datos de barrido de amplitud(Figura 6B)se adquirieron a una frecuencia angular fija (ω) de 6,28 rad/s (1 Hz). Cabe señalar que los datos de barrido de amplitud no se vieron afectados por el régimen de bajo par de la instrumentación(Figura 6B). Por lo tanto, estos datos se analizaron más a fondo para las tres concentraciones de moco (100 mg / ml, 200 mg / ml y 400 mg / ml) para determinar el grado de viscoelasticidad y el comportamiento de rendimiento.
La representación gráfica que se muestra en la Figura 4 se utilizó como guía para el análisis extendido de los experimentos de barrido de amplitud. Los resultados de tres soluciones de moco con concentraciones de 100 mg/mL, 200 mg/mL y 400 mg/mL se discuten a continuación.
El resultado para la concentración de moco de 100 mg/ml (Figura 7A), muestra que a bajas tensiones de oscilación (0,01 ≤ 
≤ 0,1 Pa) los módulos de almacenamiento y pérdida (G' y G") se superpusieron significativamente. A tensiones de oscilación superiores a 0,1 Pa, el módulo de almacenamiento disminuye, lo que indica una menor elasticidad. El módulo de pérdida, representativo de la viscosidad, permanece constante en todo el rango de tensión de oscilación (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Este fenómeno se puede atribuir a un comportamiento similar a un fluido newtoniano y está de acuerdo con la viscosidad aparente constante de la concentración de moco de 100 mg / ml(Figura 7A y Figura 8A, B). Los datos correspondientes del ángulo de fase (δ) muestran que a tensiones de oscilación moderadas y altas (0,05 ≤ ≤ 0,3 Pa), los valores varían entre 55° y 70°(Figura 7D). Por lo tanto, se puede inferir que la solución de moco de 100 mg / ml demuestra un comportamiento similar al fluido, con un estrés de rendimiento aparente insignificante.
Como se observa en la Figura 7B,concentración de 200 mg/ml a bajas tensiones de oscilación (0,02 ≤ ≤ 0,04 Pa),el módulo de almacenamiento (G') disminuye pero sigue siendo mayor que el módulo de pérdida (G"). Dentro del rango de tensión de oscilación (0,04 ≤ ≤ 0,07 Pa), hubo una región "cruzada" en la que los valores de G' y G' permanecen aproximadamente iguales. Esta región está marcada en la Figura 7B con líneas discontinuas y se observaron los valores de tensión de oscilación correspondientes (0.04193 ≤ ≤ 0.06467 Pa). Más allá de esta región, G" alcanzó un valor más alto que G', lo que sugiere una transición a un comportamiento similar al fluido. Sin embargo, G" (que representa la viscosidad) se mantuvo constante dentro del rango completo de tensión de oscilación (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Los datos de ángulo de fase presentados en la Figura 7E muestran un mayor grado de varianza, especialmente en el rango de tensión de oscilación (0.04193 ≤ ≤ 0.06467 Pa). De las Figuras 7B,E se puede inferir que hubo un comportamiento de transición del fluido de la región viscoelástica lineal a la región viscoelástica no lineal. Además, la concentración de moco de 200 mg/ml representó características no newtonianas y propensión a ceder en el rango de tensión de oscilación (0.04193 ≤ ≤ 0.06467 Pa). El comportamiento no newtoniano, similar al de un fluido de adelgazamiento por cizallamiento, estuvo de acuerdo con los datos de viscosidad aparente presentados en la Figura 8A y las variaciones de tensión correspondientes en la Figura 8B.
Los datos de concentración de moco de 400 mg/ml se presentan en la Figura 7C,F. Las tendencias G' y G' en la Figura 7C demuestran claramente un fenómeno de rendimiento con un punto de cruce entre G' y G'. El valor de tensión de rendimiento aparente (σy) se registró como 0.2736 Pa, lo que indica un cambio claro en el estado del moco de gel a un estado fluido no newtoniano. Los datos de ángulo de fase presentados en la Figura 7F muestran un fuerte aumento en la tensión de rendimiento aparente (σy = 0.2736 Pa) de aproximadamente 20 ° a 65 °. Un aumento tan brusco en el ángulo de fase puede ocurrir cuando el material se somete a ceder y comienza a fluir como un fluido. El comportamiento fluido no newtoniano puede apoyarse aún más con los resultados de las pruebas de cizallamiento en estado estacionario informadas en la Figura 8A,8B. La tensión aparente de rendimiento reportada en las pruebas de cizalla en estado estacionario fue de 0.2272 Pa(Figura 8B).
Resultados de experimentos de velocidad de cizalla en estado estacionario
Los resultados de los experimentos de velocidad de cizallamiento en estado estacionario se presentan para tres soluciones de moco con concentraciones de 100 mg/mL, 200 mg/mL y 400 mg/mL en esta sección utilizando representaciones gráficas como guía(Figuras 3A,B). Estos resultados corresponden al procedimiento inicializado en los pasos del protocolo 2.8.6-2.8.8.
En la Figura 8A para la concentración de moco de 100 mg/ml, se muestran los datos de viscosidad aparente con alta varianza a bajas tasas de cizallado (1 
≤ ≤ 4 s-1) junto con la pendiente, -1.4. La ubicación del régimen de bajo par también está marcada. Se supone que la alta varianza de los datos de 100 mg/ml dentro de ese rango (1 ≤ ≤ 4 s-1), es un efecto del régimen de bajo par (sombreado). En la Figura 8B,la variación de tensión correspondiente con los datos de la velocidad de cizallado indicó un pequeño rango de tasas de cizallado donde la muestra alcanzó una "meseta de tensión" (o la región plana). Esta región se descuida para la estimación del estrés de rendimiento, ya que los datos de viscosidad correspondientes están sujetos a efectos de bajo par. Dentro del rango de alta velocidad de cizallado (2500 ≤ ≤ 10000 s-1) los datos de viscosidad aparente se vieron afectados por el régimen de flujo secundario. La solución de moco de 100 mg/ml, por lo tanto, se comporta como un fluido newtoniano que es independiente de la velocidad de cizallamiento fuera de los regímenes de bajo par y flujo secundario, y con una viscosidad aparente constante de 0,00088 Pa s (±1,656 x10-5 Pa s).
Como se observa en la Figura 8A,la concentración de moco de 200 mg/ml no se vio afectada por los límites de par bajo y demostró un efecto de adelgazamiento por cizallamiento en el rango de velocidad de cizallamiento, 1 ≤ ≤ 15 s-1. La viscosidad de la velocidad de deformación de cizallamiento cero (ηo) se observó como 0,032 Pa s (±0,024 Pa s) y la viscosidad de la velocidad de deformación de cizallamiento infinito(η ∞) a velocidad de cizallamiento ( ), 1995 s-1, se observó como 0,00085 Pa s (±2,495 x 10-5Pa s). El efecto de adelgazamiento por cizallamiento del fluido se demostró con una pendiente de -1,8 dentro del rango de velocidad de cizallamiento, 1 ≤ ≤ 4 s-1. La variación de tensión correspondiente en la Figura 8B,demuestra una 'meseta de tensión' que representa un fenómeno de rendimiento con la tensión de rendimiento promedio de 0.1446 Pa (±0.0037 Pa).
La concentración de moco de 400 mg/ml es la menos diluida y, en consecuencia, la más cercana en consistencia material al moco GR real extraído. En la Figura 8A,observe que la característica de adelgazamiento por cizallamiento está bien definida para la concentración de moco de 400 mg/ml en comparación con la concentración de moco de 200 mg/ml. Las viscosidades de cizallamiento cero (ηo) y velocidad de deformación de cizallamiento infinito(η ∞) a velocidad de cizallamiento ( ), 1995 s-1, fueron 0,137 Pa s (±0,032 Pa s) y 0,00099 Pa s (±9,323 x 10-5Pa s), respectivamente. Además, la pendiente de la región de adelgazamiento por cizallamiento se estableció como -0,91 dentro del rango de velocidad de cizallamiento, 1 ≤ ≤ 32 s-1. La correspondiente 'meseta de tensión' de las variaciones de tensión con tasa de cizallaje observadas en la Figura 8B,representa una tensión de rendimiento aparente de 0,2272 Pa (±0,0948 Pa).
| Componente | Modelo/Pieza No./Versión | Descripción del parámetro | Características técnicas |
| Reómetro | DHR-2 | Rango de frecuencia | 1 x 10−7 - 100 Hz |
| Velocidad angular máxima | 300 rad/s | ||
| Par mínimo bajo cizalla constante | 10 nN.m | ||
| Par mínimo bajo oscilación | 2 nN.m | ||
| Par máximo | 200 μN *m | ||
| Resolución de par | 0,1 nN.m | ||
| Rango de velocidad de cizalla | 5,73 x 10−6 a 1,72 x 104 [1/s] | ||
| Fuerza normal máxima | 50 N | ||
| Resolución de fuerza normal | 0,5 mN | ||
| Geometría | 513404.905 | Dimensiones | 40 mm de diámetro |
| 1° 0' 11" Ángulo del cono | |||
| Placa Peltier | 533210.901 | Rango de temperatura | -40°C a 200°C ± 0.1°C |
Tabla 1: Especificaciones del reómetro
Figura 1: Representación CAD de componentes del reómetro. (A) 40 mm 1° geometría del cono, (B) Fijación de placa Peltier. La geometría del cono debe estar unida al eje del reómetro, y la placa de Peltier debe estar conectada a la base del reómetro rotacional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Colocación de fluido sobre la placa de Peltier. La muestra de fluido debe colocarse en el centro de la placa peltier para garantizar una propagación uniforme del fluido por toda la placa cuando se reduce la geometría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación gráfica de propiedades reológicas estables. Variación de (A) Viscosidad aparente (η) y (B) Tensión de cizallamiento ( ) con velocidad de deformación de cizallamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación gráfica de las propiedades reológicas dinámicas. Variación de los módulos de almacenamiento (G') y pérdida (G") y ángulo de fase (δ) con tensión de oscilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes representativas y dibujos esquemáticos de rastrillos branquiales (GR). (A) Vista de la matriz de rastrillo branquial y los pliegues palatales (B) Dibujo esquemático de la matriz de rastrillo branquial y los pliegues palatales (C) Rastrillo branquial extirpado (D) Dibujo esquemático del rastrillo branquial con características sobresalientes (E) Ubicación de la extracción de moco en el rastrillo branquial. Las imágenes 5A y 5C fueron tomadas durante una disección realizada por la profesora L. Patricia Hernández del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efectos de bajo par. Variación del módulo de almacenamiento y pérdida para 400 mg/ml, concentración de moco con (A) Barridos de frecuencia a amplitud de deformación = 0.01 y (B) Barridos de amplitud a frecuencia de oscilación = 1 Hz (o 6.28 rad / s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Barridos de amplitud para tres concentraciones de moco de carpa plateada. Las pruebas se completaron a f = 1 Hz o ω = 6,28 rad/s (A) Variación del módulo de almacenamiento y pérdida para la concentración de moco, 100 mg/ml (B) Variación del módulo de almacenamiento y pérdida para la concentración de moco, 200 mg/mL (C) Variación del módulo de almacenamiento y pérdida para la concentración de moco GR, 400 mg/mL (D) Variación del ángulo de fase para la concentración de moco GR, 100 mg/mL (E) Variación del ángulo de fase para la concentración de moco, 200 mg/mL (F) Variación del ángulo de fase para la concentración de moco, 400 mg/mL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Variación de la viscosidad aparente (η) y la tensión (σ) con la velocidad de cizallamiento ( ) para las tres concentraciones de moco de pescado. (A) Variación de viscosidad aparente con la tasa de cizallamiento para las concentraciones de moco, 400 mg / ml, 200 mg / ml y 100 mg / ml junto con regímenes de efectos de bajo par y efectos de flujo secundario (B) Variación de tensión con tasa de cizallamiento para concentraciones de moco GR, 400 mg/mL, 200 mg/mL y 100 mg/mL, marcando las «mesetas de estrés» (o región plana) con líneas discontinuas. Las líneas discontinuas representan los valores medios de tensión aparente de rendimiento para las tres concentraciones de moco GR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Tres concentraciones de moco GR de carpa plateada. De izquierda a derecha: 400 mg/mL, 200 mg/mL, 100 mg/mL. La concentración inicial de 400 mg/ml se eligió con el criterio de que una vez diluida la muestra contendría una cantidad razonable de moco de pescado al tiempo que proporcionaba un volumen lo suficientemente grande como para realizar varias pruebas. Las dos concentraciones posteriores se diluyeron en un 50% de agua DI por volumen. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Lanzamiento del software de control de instrumentos reómetros. Este software debe iniciarse solo después de encender la máquina. De lo contrario, es posible que el instrumento no esté calibrado correctamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Calibración del instrumento. La calibración inercial es la única calibración necesaria para el instrumento. Hay otras calibraciones realizadas después de instalar la geometría. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 4: Interruptor de intercambio inteligente. Esta opción es para habilitar o deshabilitar el intercambio inteligente. Smart swap es una función de software de control de instrumentos de reómetro que detecta automáticamente una geometría una vez que se instala en el eje del reómetro. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 5: Opciones de brecha de medición Se accedió a las opciones de la pestaña "Gap"para establecer las condiciones para el modo de brecha cero y la velocidad de recorrido del cabezal de medición. Se estableció una fuerza de contacto axial entre la geometría y la placa de Peltier en 1 N para garantizar la referencia de espacio cero, es decir, el contacto entre la geometría del cono y la superficie de la placa de Peltier. Luego, el cabezal de medición se hizo para atravesar con precisión el espacio de medición de 24 μm entre la geometría del cono de 40 mm y 1 ° y la placa de Peltier. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 6: Calibración de la fijación de geometría. Tras la instalación de la geometría del cono de 40 mm y 1° y su detección por el software de control del instrumento del reómetro, la geometría se calibró de la misma manera que la calibración del instrumento para garantizar mediciones precisas durante un experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 7: Icono de brecha cero. La inicialización de brecha cero se realiza utilizando este icono. Una vez que se completa la inicialización de espacio cero, el reómetro puede hacer referencia con precisión a la posición del eje, con la geometría unida a él, a medida que se eleva o baja. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 8: Representación CAD de la geometría del cono y la placa de Peltier después de establecer la referencia de espacio cero. La geometría se configura para establecer el espacio cero cuando se genera una fuerza de contacto axial de 1 N a medida que hace contacto con la placa dePeltier. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 9: Paso 2.5.1 del protocolo. La figura representa la forma en que se establecen los nombres de ejemplo y la salida de archivos y datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 10: Paso 2.5.2 del protocolo. La figura representa cómo se pueden establecer los ajustes de geometría, como el volumen de muestra, el espacio de geometría y el espacio de recorte. Para algunas geometrías, es decir, el cono utilizado en este experimento, estos ajustes son inmutables y se definen en función de la geometría. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 11: Paso 2.5.3 del protocolo. La figura representa cómo se establecen la configuración y el acondicionamiento de la prueba en este paso de procedimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 12: Icono de recorte de hueco. El espacio de ajuste se estableció para que la geometría pudiera reducirse lo suficiente como para recortar el exceso de líquido que se escapa del área entre la placa de Peltier y la geometría del cono. El espacio depende de la geometría en uso. Para la geometría de cono de 40 mm y 1 ° utilizada en el protocolo, el espacio de recorte fue de 28 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 13: Icono de velocidad del motor. Los ajustes del motor se utilizaron para ajustar la velocidad de rotación del eje y minimizar la inercia de la geometría. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 14: Icono de espacio de geometría. El espacio de geometría reduce la geometría a una distancia específica por encima de la placa de Peltier según lo especificado por la geometría de la placa de cono. Para la geometría de cono de 40 mm y 1° utilizada en el protocolo, el espacio de geometría es de 24 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 15: Icono de inicio. El botón de inicio inicia toda la secuencia de procedimientos que se configuraron anteriormente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 16: Cambio de las variables del gráfico. La figura representa las variables que se pueden definir para la presentación de datos al ejecutar los procedimientos. En particular, la tensión de oscilación y la tensión de oscilación son importantes durante los experimentos de barrido dinámico en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 17: Exportación de archivos de software de control de instrumentos de reómetro a un software de hoja de cálculo. Después de que los archivos se exportan como hojas de cálculo, el análisis de datos se hizo factible utilizando otro software de programación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de código suplementario: Post-procesamiento de archivos de datos utilizando el programa de análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Uno de los principales objetivos del desarrollo de este protocolo es establecer que es adecuado para la caracterización reológica del moco GR cuando se dispone de volúmenes de muestra muy pequeños. Reconocemos que se necesitan más muestras de una escuela de carpa plateada para caracterizar completamente las propiedades reológicas del moco GR y los datos presentados aquí no son una generalización en toda la población de carpa plateada. Nuestra técnica se justifica por su eficacia con la caracterización reológica de pequeños volúmenes de muestra y con investigaciones extendidas que involucran conjuntos más grandes de muestras de moco.
Los pasos críticos dentro del protocolo son la preparación de soluciones de moco de diversas concentraciones, mediciones y adquisición de datos utilizando un reómetro rotacional, y representación gráfica y análisis de datos para obtener información física.
Los conocimientos físicos sobre los datos de moco GR se extraen de las representaciones gráficas que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4,que se anotan con atributos del comportamiento material esperado. Los valores de viscosidad de la velocidad de deformación de cizallamiento cero (ηo) se pueden observar a bajas tasas de deformación de cizallamiento donde domina la movilidad de las moléculas del material(Figura 3A y Figura 8A). Los valores de viscosidad de deformación de cizalla infinita(η ∞)en fluidos no newtonianos son órdenes de magnitudes inferiores a la viscosidad de la tasa de deformación de cizalla cero. Estos datos se pueden notar a altas tasas de cizallamiento donde hay poca o ninguna dependencia de las interacciones intermoleculares(Figura 3A y Figura 8A). Para los fluidos no newtonianos, las viscosidades aparentes disminuyen progresivamente a medida que aumentan las tasas de cizallamiento y alcanzan un valor bajo constante(Figura 3A y Figura 8A). El comportamiento de rendimiento en el moco GR bajo mediciones de estado estacionario se puede representar con pendiente como se muestra en la Figura 3A y se presenta en la Ecuación 1., donde ηa representa la viscosidad aparente, σy es la tensión de rendimiento (constante) y es la tasa de deformación de cizallamiento.
La Figura 3A y la Figura 8B se presentan en una escala logarítrica y, por lo tanto, la Ecuación 1 alcanza la siguiente forma:
donde k – representa la tensión aparente del rendimiento. En una escala logarítzima, la viscosidad aparente disminuye con una pendiente de '-1' indica el rendimiento del material como se muestra en la Figura 3A10. Las concentraciones de moco de 200 mg/mL y 400 mg/mL poseían pendientes de -1.8 y -0.91, respectivamente, y demuestran el comportamiento de rendimiento(Figura 8A). Bajo mediciones de oscilación dinámica, las características viscoelásticas son independientes de la amplitud de deformación en la Región Viscoelástica Lineal (LVR) (Figura 4). El comportamiento de rendimiento en el moco GR bajo mediciones de oscilación dinámica se puede observar a medida que el material viscoelástico (moco GR) ingresa a la región viscoelástica no lineal (NLVR) a medida que disminuye el módulo de almacenamiento (G')(Figura 4). En el régimen NLVR, el material viscoelástico demostrará un comportamiento similar al gel sólido si el módulo de almacenamiento es mayor que el módulo de pérdida (G' > G"). Cuando el módulo de pérdida excede el módulo de almacenamiento (G' < G"), se produce un "cruce" entre los datos G' y G". Como se muestra en la Figura 7B,C,las concentraciones de moco GR de 200 mg/mL y 400 mg/mL demostraron un comportamiento similar al fluido marcado por el "cruce" entre los datos de G' y G". La tensión de rendimiento aparente bajo mediciones de estado estacionario se representa como el valor promedio de la tensión hasta que se alcanza un punto de inflexión(Figura 3B). A partir de entonces, la tensión comienza a aumentar bruscamente con un aumento en la tasa de deformación de cizallamiento como se muestra en la Figura 3B y la Figura 8B. Los datos de moco GR (concentraciones de 200 mg/ml y 400 mg/ml) mostraron un comportamiento del líquido de adelgazamiento por cizallamiento hasta que el material comienza a ceder(Figura 8A,B). El estrés aparente del rendimiento se observó claramente en concentraciones de moco de 200 mg/ml y 400 mg/ml debido a sus características no newtonianas(Figura 8B). La tensión de rendimiento aparente bajo las mediciones de oscilación dinámica se muestra en la Figura 4 y la Figura 7B,C como la región "cruzada" entre los datos de G' y G", seguida de los valores de G" que exceden G'. Los datos de moco GR de 400 mg / ml mostraron un comportamiento no newtoniano de adelgazamiento por cizallamiento. El punto de inicio del rendimiento del material se observó con una tensión de rendimiento aparente de aproximadamente 0,2736 Pa(Figura 7C). La transición similar al hidrogel al fluido con el ángulo de fase (δ = tan-1 (G"/G')) se presenta en las Figuras 4 y 7D-F. El extremo en el ángulo de fase se asocia con un sólido hookeo a 0° y fluido viscoso a 90° como se muestra en la Figura 4. Los valores de ángulo de fase alrededor de 45 ° se atribuyeron a la transición del comportamiento similar a un gel del material a un comportamiento similar al fluido. La concentración de moco de 400 mg / ml mostró claramente un cambio en la característica del material de hidrogel a un comportamiento similar al fluido a través del proceso de rendimiento con una tensión de rendimiento aparente de ~ 0.2736 Pa(Figura 7F).
Comprender las limitaciones de medición y evitar datos inadecuados para la interpretación física es un desafío con fluidos biológicos complejos y blandos, especialmente en estudios que involucran volúmenes de muestra pequeños11. Los datos generados bajo efectos de bajo par y flujo secundario no son adecuados para la interpretación física y dependen de la geometría utilizada en el reómetro (como el cono y la placa en este estudio). Estos regímenes se identificaron para evitar cualquier tergiversación de los datos experimentales que sufren de la resolución del instrumento y los artefactos de medición debido a la difusión del momento. Los límites de par bajo (Figura 6A y Figura 8A) son funciones de geometría y par mínimo generados por el instrumento (Tabla 1). En condiciones de medición de cizallamiento constante, el criterio para rechazar los datos afectados por el límite de par bajo para una geometría de radio (R) de placa cónica con par mínimo (Tmin = 10 x 10-9 Nm, Tabla 1)ha sido discutido por Ewoldt et al. y se presenta a continuación11:
donde es la velocidad de deformación por cizalla. A diferencia de las concentraciones de moco GR de 100 mg/ml, las concentraciones de moco GR de 200 mg/ml y 400 mg/ml no se vieron afectadas por efectos de bajo par que demuestran claramente un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento no newtoniano con altas viscosidades de velocidad de deformación de cizallamiento cero a bajas tasas de deformación de cizallamiento. El criterio para los módulos viscoelásticos mínimos medibles bajo mediciones de oscilación dinámica ha sido discutido por Ewoldt et al. y presentado a continuación (Ecuación 4)11. En la ecuación 4, para una geometría de placa cónica de radio (R) el par mínimo bajo cizalladura oscilatoria (Tmin = 2 x 10-9 Nm, Tabla 1).
donde Gmin es el módulo de almacenamiento (G') o módulo de pérdida (G") y es la velocidad de deformación de cizallamiento. Los regímenes de limitación de la instrumentación regidos por efectos de bajo par están marcados en las Figuras 6A y 6B. El régimen de flujo secundario bajo mediciones de estado estacionario se rige por una difusión de momento hacia adentro del fluido por medio de un remolino que reside dentro del cono rotacional y la geometría de la placa11. El patrón de flujo secundario aumenta el par incorrectamente haciendo que el fluido parezca estar engrosándose por cizallamiento (Figura 8A). El límite de flujo secundario, propuesto por Ewoldt et al. en la Figura 8A se dibujó utilizando la siguiente relación11:
donde L = βR, β es el ángulo del cono, R es el radio del cono, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 y es la velocidad de cizallamiento. Este régimen ayudó a estimar los valores de viscosidad de la cepa de cizalla infinita (η∞)en muestras de moco GR.
Se puede realizar una modificación del protocolo utilizando una geometría de placa plana en lugar de la geometría de placa de cono como se muestra en el protocolo presentado en este documento. Las pruebas de placa plana deben realizarse con una variación paramétrica de la brecha de medición en el reómetro rotacional para revelar la dependencia de la tensión de rendimiento aparente en la brecha de medición y la geometría. A continuación se describen las mejoras sugeridas del protocolo presentadas en este documento. Se debe realizar una variación paramétrica de la amplitud de la deformación en el régimen viscoelástico lineal (LVR) y la frecuencia de oscilación. Se deben realizar pruebas reológicas de "pegado y peeling" para desarrollar una comprensión completa de la adhesividad del moco GR. Las características reológicas del moco GR deben realizarse en conjuntos de volumen de muestra más grandes junto con estudios para medir cualquier rastro de células sanguíneas para tener en cuenta su efecto sobre las propiedades reológicas generales de GR.
Las limitaciones del protocolo se describen a continuación. Las complejidades de los procedimientos de extracción de moco GR y la presencia de células sanguíneas o fragmentos de tejido en las muestras de moco pueden influir en la reología del moco. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el moco utilizado en el protocolo no tenía ningún rastro visible de sangre. La muestra de moco GR es un material heterogéneo y puede poseer diferentes propiedades reológicas debido a la varianza en la ubicación y las condiciones posteriores a la extracción. Esta limitación se abordó homogeneizando suficientemente el moco GR utilizando un agitador para descomponer cualquier grupo grande de mucosidad y presencia de tejido. Otra limitación importante son los volúmenes muy pequeños de muestra de moco GR (aproximadamente 1,4 ml), cosechados para análisis que restringen una generalización de las propiedades del moco GR.
La importancia de este protocolo es que permite una caracterización reológica precisa de fluidos biológicos no newtonianos como el moco. El protocolo presentado aquí allana el camino para investigar otros fluidos biológicos similares asociados con secreciones humanas, animales y vegetales. Además, los fluidos sintéticos o las soluciones a base de polímeros que son análogos de los fluidos biológicos se pueden probar utilizando este protocolo para comprender las propiedades del material bajo diferentes tensiones, frecuencias de oscilación y temperatura. El protocolo es muy adecuado para la caracterización reológica de fluidos biológicos cuando se dispone de volúmenes de muestra muypequeños.
El resultado extendido del protocolo es que la viscosidad aparente y el estrés aparente del rendimiento del moco GR facilitarán la creación de modelos analíticos para interpretar los resultados de la investigación hidrodinámica fundamental de la alimentación por filtro y las tecnologías avanzadas que requieren e involucran el flujo cruzado y la filtración por membrana.
El estudio macro-reológico postula que el moco en contacto con las partículas de los alimentos está inicialmente, en un estado similar a un gel que sirve como adhesivo. Al iniciar el flujo y las fuerzas de cizallamiento, el moco alcanza una tensión de rendimiento aparente y sufre una deformación plástica. La ejecución del protocolo utilizando un reómetro rotacional ayudó en la caracterización de la transición del moco de un comportamiento similar al gel a un comportamiento similar al fluido. Esta transición se observó experimentalmente, y la tensión aparente del rendimiento se registró en 0,2736 Pa en experimentos de reómetro rotacional. Cuando las tensiones externas en el moco son menores que la tensión aparente del rendimiento, el moco demostrará un comportamiento similar al gel para facilitar la adhesión de las partículas de los alimentos. Cuando las tensiones externas exceden la tensión aparente del rendimiento, el moco demostrará un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento que facilitará el transporte de partículas de alimentos aglomerados a los órganos digestivos en la carpa plateada.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo y la financiación del GW Center for Biomimetics and Bioinspired Engineering. Agradecemos a la profesora L. Patricia Hernández del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington por inspirar la investigación y la colaboración continua, proporcionar experiencia biológica en la fisiología de la carpa plateada y proporcionar las muestras de moco. Agradecemos a los estudiantes, el Sr. David Palumbo, la Sra. Carly Cohen, el Sr. Isaac Finberg, el Sr. Dominick Petrosino, el Sr. Alexis Renderos, la Sra. Priscilla Varghese, el Sr. Carter Tegen y el Sr. Raghav Pajjur por su ayuda en el laboratorio y al Sr. Thomas Evans y el Sr. James Thomas de TA Instruments, New Castle, DE por su apoyo con la capacitación y el mantenimiento del reómetro. Las imágenes para las Figuras 5A, C fueron tomadas durante una disección realizada por la profesora L. Patricia Hernández del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
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