Summary
Этот протокол представляет собой метод выполнения реологической характеристики слизи, которая находится на жаберных граблях (ГР) толстолобица. Вязкоупругие характеристики GR-слизи, полученные путем измерения вязкости, модулей хранения и потерь, оцениваются для кажущейся предельности текучести, чтобы понять механизм подачи фильтра в ГР.
Abstract
Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является инвазивной планктиворной фильтрующей фидерной рыбой, которая заразила естественные водные пути верхнего бассейна реки Миссисипи из-за ее высокоэффективного механизма подачи фильтра. Характерные органы, называемые жаберными граблями (ГР), обнаруженные во многих таких фильтрующих питателей, способствуют эффективной фильтрации частиц пищи, таких как фитопланктон, размером в несколько микрон.
Мотивация исследовать реологию слизи GR проистекает из нашего желания понять ее роль в оказании помощи процессу подачи фильтра у толстолобица. Богатая слизью жидкость в «густом и липком» состоянии может способствовать адгезии пищевых частиц. Проникновение и транспорт через мембрану GR облегчается действием внешних сил сдвига, которые вызывают изменяющиеся скорости деформации сдвига. Таким образом, реология слизи может дать жизненно важный ключ к огромному аутоконкурентоспособной природе толстолобица в бассейне фильтрующих кормящих рыб. Исходя из этого, было установлено, что слизь ГР может обеспечивать адгезивную функцию для частиц пищевых продуктов и действовать как транспортное средство для оказания помощи в процессе подачи фильтра.
Основной целью протокола является определение предела текучести слизи, относящегося к минимальному напряжению сдвига, необходимому для инициирования потока, при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается на структурированном вязкоупругом материале. Соответственно, реологические свойства слизи GR, т. е. вязкость, хранение и модули потерь, были исследованы для ее неньютоновской, сдвиго-истончаемой природы с использованием ротационного реометра.
Протокол, представленный здесь, используется для анализа реологических свойств слизи, извлеченной из жаберных граблей толстолобиком, выловленного в Харт-Крик на реке Миссури. Протокол направлен на разработку эффективной стратегии реологического тестирования и характеристики материала слизи, предполагаемой как структурированный вязкоупругий материал.
Introduction
Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является планктиворным фильтрующим кормушкой и инвазивным видом, который проник в несколько естественных водных путей в Соединенных Штатах. Этот вид был первоначально интродуцирован в верхний бассейн реки Миссисипи для контроля цветения водорослей1,2,3. Толстолобик является чрезвычайно эффективным кормушителем. Как правило, его потребляемые пищевые частицы варьируются от 4 до 20 мкм до более крупного зоопланктона, которые составляют около 80 мкм3,4,5. Этот вид перетравл с другими местными рыбами и потенциально может нанести огромный ущерб местным водным путям, ограничив доступные ресурсы1,2,6. Таким образом, фильтрующие кормовые рыбы, такие как толстолобик и большеголовый карп, представляют серьезную угрозу для Великих озер1,2,6,7,8.
Фильтрующие кормовые рыбы обладают специальными органами, называемыми жаберными граблями (ГР), с тонким слоем слизи, обитающей на их поверхности. Эти органы повышают эффективность фильтрации и агрегации мелких частиц из поступающей жидкости. Целью протокола, представленного в настоящем описании, является характеристика неньютоновского, сдвигового истончающего свойства материала и предела текучести слизи GR, полученной с внутренней поверхности жаберных граблей в толстолобике. Значение предела текучести GR-слизи, установленное с помощью ротационного реометра, представляет интерес в данном исследовании. Измеренное напряжение предела текучести, также называемое «кажущееся напряжением предела текучести», зависит от методов испытаний, таких как устойчивая скорость сдвига или динамическая колебательная деформация типа9,10. Сдвиг-истончение, «жидкость предел-текучесть», претерпевает переход от твердого к жидкому поведению при критическом прикладном напряжении9,11. Кажущееся предел текучести - это минимальное напряжение сдвига, необходимое для инициирования потока или при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается, когда слизь переходит из гелеобразного материала в жидко-подобный материал. Такое поведение можно наблюдать в структурированных вязкоупругих материалах. Переход от гелеобразного к жидкостному поведению грязевой слизи влечет за собой две функции: адгезивную роль для сбора пищевых частиц и роль транспортного средства для оказания помощи в процессе доставки и фильтрации твердых частиц. Расширенная функция слизи включает в себя создание диффузионных барьеров в резистентности к болезням и дыхании, обеспечение контролируемого высвобождения питательных факторов, токсичных компонентов и экскреции, создание метаболических путей для кормления и гнездования, помощь в защите хищников и производство модификаций пограничного слоя, которые улучшают локомоцию и эффективность движения12,13,14.
В отличие от простых жидкостей, сложные жидкости, такие как слизь, обладают свойствами, которые варьируются в зависимости от условий потока и требуют дополнительных параметров измерения для определения их физического поведения в масштабе объема. Для мониторинга вязкости и предела текучести GR-слизи проводятся реологические измерения с использованием ротационного реометра. Ротационный реометр применяет устойчивое или колебательное напряжение сдвига или деформацию с помощью вращающегося диска, контактирующего с образцом жидкости, и измеряет его реакцию. Обоснование использования этого прибора и метода заключается в том, что реометр может обеспечить набор измерений для описания свойств материала GR-слизи толстолобица, которые не могут быть определены только вязкостью.
Слизь является вязкоупругим материалом, и ее механическая реакция на навязанную деформацию находится между реакцией чистого твердого тела (регулируется законом упругости Гука) и реакцией чистой жидкости (управляемой законом вязкости Ньютона)15,16. Сложная макромолекулярная сеть, содержащаяся в слизи, может растягиваться и переориентироваться в ответ на внешние силы или деформацию. Вращающийся реометр состоит из геометрии конуса и пластины Пельтье, как показано на рисунке 1 и рисунке 2 (см. Таблицу 1 для спецификаций приборов). Целью данного исследования была разработка протокола для определения реологических свойств ГР-слизи. Преимуществом ротационного реометра перед вискозиметром является его способность производить динамические измерения с использованием небольших объемов образцов. Объем образца слизи GR в этом исследовании составил примерно 1,4 мл. Вискозиметр, с другой стороны, ограничен постоянными скоростями сдвига и требует больших объемов образца.
Ожидается, что реологические свойства слизи будут сильно варьироваться в пределах анатомии толстолобика. Например, свойства слизи, находящейся на поверхностях GR, могут отличаться от свойств эпибранхиального органа. Для учета потенциальной изменчивости свойств слизи в разных регионах рыбы полученный образец ГР-слизи разбавляли, а растворы трех концентраций создавали и тестировали с помощью ротационного реометра. Данные и результаты, касающиеся реологии слизи, представленные после выполнения протокола, продемонстрировали эффективность метода измерения. Иллюстративные данные, представленные в этой статье, не предназначены для обобщения всей популяции толстолобиком. Протокол, представленный в настоящем документе, может быть расширен для исследования реологии слизи в больших наборах образцов для проверки других гипотез.
Целью данного исследования является демонстрация вариации реологических свойств реологии слизи ГР с тремя различными концентрациями слизи (400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл). Концентрация 400 мг/мл представляет собой образец сырой слизи, собранный из рыбных ГР. Деионизированная вода (ДИ) использовалась для разбавления образца сырой слизи до концентраций 200 мг/мл и 100 мг/мл. Разбавление образцов слизи позволило оценить степень истончения сдвига и кажущийся предел текучести в зависимости от концентрации и определить концентрацию, при которой gr-слизь переходит в неньютоновское поведение. Шейкер использовался для разбиения любых больших скоплений слизи в образцах, чтобы смягчить ошибки в реологических данных из-за неоднородности.
У большинства позвоночных, включая рыб, преобладающими слизеобразующими макромолекулами являются гликопротеины (муцины), которые имеют тенденцию набухать в воде путем запутывания или химического сшивания и создают гелеобразный материал12,13,17,18,19,20. Высокомолекулярные, гелеобразующие макромолекулы и высокое содержание воды отражают скользкость в слизи13. Высокая степень межмакломолекулярных взаимодействий приводит к образованию геля, тогда как более низкие уровни межмакломолекулярных взаимодействий или разрыва связей приводят к образованию высоковязких флюидов21.
Процессам фильтрации пищевых частиц в рыбах, кормящихся фильтром, способствуют свойства, связанные со слизью GR, такие как когезия и вязкость, которые определяют ее потенциал для адгезии и прилипание22. Прочность адгезии на основе слизи зависит от конкретных межмолекулярных, электростатических или гидрофобных взаимодействий23. Sanderson et al.24 провели исследование суспензионного кормления у черной рыбы, в котором они обнаружили доказательства адгезии на основе слизи. Они заявили, что за адгезией взвешенных пищевых частиц со слизистой поверхностью следует транспорт агрегированных сгустков частиц, связанных вместе со слизью направленным потоком воды, действующим на нее24. Слизь, подверженная сдвиговым деформациям, образующаяся в результате потока воды, облегчает доставку пищевых частиц в органы пищеварения. Эндоскопические методы использовались для наблюдения за отфильтрованными частицами24.
Литература о диапазоне скоростей сдвига и практических пределах при реологическом тестировании ГР-слизи скудна. Поэтому руководство было запрошено у реологических исследований желудочной, носовой, шейной и легочной слизи, слизи кожи лосося, слизи hagfish и смазки поверхности костного сустава, в которых были изучены реологические характеристики и неньютоновские признаки11,12,25, 26,27,28,29,30,31. Совсем недавно влияние слизи рыбьей кожи на локомоцию и двигательную эффективность было изучено с помощью вискометрии с постоянной скоростью сдвига. Исследования реологии слизи кожи (без какого-либо разбавления или гомогенизации), относящиеся к морскому лесяму, морскому окуню и скудной области, продемонстрировали неньютоновское поведение при типично низких скоростях сдвига14. В другом связанном исследовании было обнаружено, что образцы сырой слизи кожи с дорсальной и вентральной сторон сенегальской подошвы демонстрируют неньютоновское поведение, что указывает на более высокую вязкость вентральной слизи при всех скоростях сдвига, рассматриваемыхкак 32. Другие реологические протоколы, относящиеся к развитию гидрогелевых каркасов и для высококонцентрированных суспензий с использованием вискозиметра с постоянной скоростью сдвига, также были зарегистрированы в литературе33,34.
В этом исследовании свойства слизи GR были исследованы с использованием ротационных реометров с контролируемой скоростью деформации, который широко использовался в реологических экспериментах на сложных биологических жидкостях25. Для ньютоновских жидкостей кажущаяся вязкость остается постоянной, не зависит от скорости сдвига, а напряжения сдвига изменяются линейно со скоростью деформации сдвига(рисунок 3A,B). Для неньютоновских жидкостей (таких как жидкости, разжижающих сдвиг) вязкость зависит от скорости сдвига или от истории деформации(рисунок 3A,B). Модуль потерь (G") представляет степень, в которой материал сопротивляется склонности к текучести и является репрезентативным для вязкости жидкости(рисунок 4). Модуль хранения (G') представляет собой тенденцию материала к восстановлению своей первоначальной формы после деформации, вызванной напряжением, и эквивалентен упругости(рисунок 4). Фазовый угол (δ) или значение касательной потерь вычисляется из обратного тангенса G"/G'. Он представляет собой баланс между потерей энергии и хранением, а также является общим параметром для характеристики вязкоупругих материалов (δ = 0° для твердого вещества Хуке; δ = 90° для вязкой жидкости; δ < 45° для вязкоупругого твердого вещества и δ > 45° для вязкоупругой жидкости)(рисунок 4)25. Кажущееся предел текучести (σy)в структурированных жидкостях представляет собой изменение состояния, которое можно наблюдать в реологических данных из устойчивого состояния развертки и динамических разверток напряжения-деформации10. Если внешнее приложенное напряжение меньше кажущейся предельной текучести, материал будет деформироваться упруго. Когда напряжение превышает кажущееся предел текучести (обозначенное как «среднее напряжение» на рисунке 3B),материал перейдет от упругой к пластической деформации и начнет течь в жидком состоянии35. Измерение модуля накопления (G') и модуля потерь (G") в образце слизи в условиях колебательного напряжения (или деформации) количественно определяет изменение состояния материала от гелеобразного до вязкоупругого жидкого поведения.
Здесь описаны типы тестов реометра, выполняемых для мониторинга данных, относящихся к модулю хранения (G'), модулю потерь (G") и кажущейся вязкости (η). Динамические испытания колебаний (развертки деформации и частотные развертки) контролировали G' и G" при контролируемых колебаниях геометрии конуса. Динамические испытания на развертку деформации определяли линейную вязкоупругую область (LVR) слизи путем мониторинга внутренней реакции материала(рисунок 4). Деформационные развертки использовались для определения поведения выхода при постоянной частоте колебаний и температуре. В ходе динамических испытаний на частотную развертку контролировалась характеристика материала на возрастающую частоту (скорость деформации) при постоянной амплитуде (деформация или напряжение) и температуре. Деформация поддерживалась в линейной вязкоупругой области (LVR) для динамических испытаний на частотную развертку. В ходе стационарных испытаний на скорость сдвига наблюдалась кажущаяся вязкость (η) при устойчивом вращении геометрии конуса. СЛИЗЬ ГР подвергали постепенным шагам напряжения, а кажущуюся вязкость (η, Па.с)) контролировали на предмет различной скорости сдвига (ý, 1/с).
Протокол, представленный в данной статье, рассматривает слизь GR как сложный структурированный материал неизвестной вязкоупругости с определенным линейным диапазоном вязкоупругого отклика. Рыбья слизь была извлечена из ГР толстолобика во время рыболовной экспедиции на месте ручья Харт в реке Миссури профессором Л. Патрисией Эрнандес (Департамент биологических наук, Университет Джорджа Вашингтона) 1,2,36. Массив ГР внутри устья толстолобица показан на рисунке 5А, а схематический рисунок представлен на рисунке 5B. Исеченный ГР показан на рисунке 5C. Извлечение слизи из ГР толстолобица представлено в качестве примера на схематических рисунках, рисунок 5D,E. Все испытания реометра проводились при постоянной, контролируемой температуре 22 ± 0,002 °C, температура, зарегистрированная на месте промысла1,2,36. Каждый образец слизи был протестирован три раза с помощью реометра, и усредненные результаты представлены вместе со статистическими погрешностностями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов слизи различной концентрации
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента подготовлены три концентрации раствора слизи (400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл с приблизительными объемами, 1 мл, 1 мл и 2 мл соответственно).
- Чтобы рассчитать массу слизи, измерьте среднюю массу флаконов с (Mс-слизью; мг) и без слизи(Мфлаконы); мг). Затем вычтите массу флаконов со слизью из слизи без слизи (Mслизь = M сослизью - Mфлаконы ; мг).
- Разбавьте слизь в трех концентрациях (400, 200, 100 мг/мл) деионизированной (DI) водой.
- Приготовьте первую концентрацию раствора слизи, 400 мг/мл, добавив 0,6 мл воды DI в слизь с помощью микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку приблизительный объем экстрагированной слизи составлял 1,4 мл, раствор 400 мг/мл будет иметь общий объем ~ 2 мл. - Поместите флакон с раствором слизи 400 мг / мл на шейкер, чтобы убедиться, что раствор слизи адекватно гомогенизирован, и любая агломерация частиц слизи смягчается.
- Подготовьте вторую концентрацию раствора слизи, 200 мг/мл, втянув половину объема раствора слизи первой концентрации в новый флакон с помощью микропипетки и добавив 1 мл воды DI в новый флакон.
- Повторите шаг 1.2.2 для первого и второго флаконов со слизью.
- Подготовьте третью концентрацию раствора слизи, 100 мг/мл, втянув половину объема (1 мл) раствора 200 мг/мл в новый флакон с помощью микропипетки и добавьте воду DI в новый флакон.
- Повторите этап 1.2.2 для всех трех концентраций растворов слизи в соответствующих флаконах (см. дополнительный рисунок 1).
- Храните флаконы со слизью в холодильнике до тех пор, пока не будет выполнена калибровка и тестирование реометра.
- Приготовьте первую концентрацию раствора слизи, 400 мг/мл, добавив 0,6 мл воды DI в слизь с помощью микропипетки.
2. Измерения и сбор данных с помощью реометра
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое в этом протоколе для управления прибором и сбора данных с помощью реометра, указано в таблице материалов. Это программное обеспечение будет называться «программным обеспечением для управления приборами реометра».
- Настройте и откалибруйте прибор реометра.
- Включите подачу сжатого воздуха к реометру и убедитесь, что пневматический стол и реометр выровнированы с помощью пузырькового датчика. Сверните защитный колпачок на валу реометра и удерживайте вал неподвижно, пока он откручивается.
- Включите основные переключатели реометра, чтобы активировать магнитные подшипники на реометре.
- Включите компьютер управления реометром с установленным в нем программным обеспечением для управления реометром и запустите программное обеспечение для управления прибором реометра (см. Дополнительный рисунок 2).
- Выполните калибровку прибора, выбрав вкладки 'Калибровка | Инструмент' из окна программного обеспечения. Выберите опцию'Инструмент'. Нажмите«Калибровка»в разделе«Инерция». Запишите калибровочное значение инерции прибора в мкН.m.с2 и повторите калибровку не менее 3x, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга (см. Дополнительный рисунок 3).
- Установите геометрию реометра на вал реометра.
- Перейдите на вкладку«Геометрия»в программном обеспечении управления реометром.
- Очистите конус с нужной геометрией (диаметр 40 мм, 1◦ 0' 11'' конус) и пластину Пельтье изопропанолом (см. Таблицу 1, Таблицу материалов, Рисунок 1,и Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина Пельтье устанавливается на реометр; его можно очистить изопропанолом, при этом он непосредственно закреплен на реометре. - Убедитесь, что пластинчатый светильник Пельтье свободен от видимой пыли и, при необходимости, очищен изопропанолом. Установите пластину Пельтье, если она не установлена предварительно в реометре, и подключите соединения радиатора.
- Нажмитекнопку 'Lock'на реометре к валу замка, который подключен к геометрии конуса. Это замыкает положение вала, но он может свободно вращаться в положении.
- Нажмите на 'Smart Swap | Включено' на вкладке программного обеспечения для управления прибором реометра, чтобы обеспечить автоматическое определение геометрии (см. Дополнительный рисунок 4).
- Поверните вал поверх реометра, чтобы прикрутить геометрию. На этом этапе программное обеспечение определит геометрию угла конуса диаметром40 мм, 1 ◦ 0' 11 '' (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов).
- Повторите шаги 2.2.5 – 2.2.6, чтобы убедиться, что геометрия определена.
- Выберите'Gap'под'Панель управления'программного обеспечения управления реометром, нажмите на значок'Options'и выберите'Axial Force'. Установите осевую силу в'1 Ньютон'; это необходимо для того, чтобы геометрия конуса касался пластины Пельтье для инициализации с нулевым зазором (см. Дополнительный рисунок 5).
- Выполните калибровку геометрии реометра.
- Выберите вкладку'Геометрия'в окне программного обеспечения. Нажмите«Калибровка»в разделе«Инерция». Запишите калибровочное значение инерции геометрии в мкН.m.с2 и повторите это 2-3 раза, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга.
- Нажмите«Калибровка»в разделе«Трение»в окне программного обеспечения. Запишите калибровочное значение трения геометрии в мкН.m/(рад/с) и повторите это 2-3 раза, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга (см. Дополнительный рисунок 6).
- Выполнение инициализации с нулевым зазором
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку геометрия не может быть точно поднята над пластиной Пельтье для выполнения измерений без опорного «нулевого» положения, выполняется инициализация с нулевым зазором. Для целей измерения геометрия имеет встроенный геометрический зазор 24 мкм и зазор обрезки 28 мкм. Зазор отделки настроен на эффективную очистку лишней жидкости, которая может выплеснуться за пределы поверхности геометрии. Эти пробелы необходимы для точного измерения данных с использованием образца и реометра. Шаг 2.4.1 абсолютно необходим для обеспечения того, чтобы геометрия была установлена на нулевой зазор для достижения геометрии и зазоров обрезки 24 мкм и 28 мкм соответственно.- Нажмите на значок'Нулевой зазор'на вкладке'Gap'в'Панели управления'в окне программного обеспечения. Инициализация завершается, когда осевая сила, испытываемая геометрией, больше или равна 1 Н, поскольку она касается пластины Пельтье. Убедитесь, что зазор реометра обнулен таким образом, чтобы его опорное положение было точным (см. Дополнительный рисунок 7 и Дополнительный рисунок 8).
- Нажмите 'стрелки вверх и вниз' элементы управления на реометре или значки 'геометрия поднимать и опускать' под вкладкой 'Gap' в программном обеспечении управления реометром прибора, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту. Экран управления на приборе реометра и панель управления программного обеспечения управления реометром будут отображать (одинаковую) высоту зазора.
- Настройте экспериментальную процедуру в программном обеспечении управления реометром. Выполните характеристику реологических свойств с помощью геометрии пластины конуса на Пельтье при 22 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайт Геологической службы США был использован для определения температуры воды в реке 20 сентября 2018 года, когда толстолобик, используемый для экспериментов со слизью GR, был выловлен в месте36Харт-Крик. Температура слизи может влиять на реологические свойства. Значение корректировки значений температуры реки заключается в том, чтобы приблизительно соответствовать температуре, при которой свойства слизи могут быть реально оценены.- Выберите вкладку«Эксперименты»в программном обеспечении для управления реометром и заполните соответствующую информацию, такую как«Имя»,«Оператор»,«Проект»и т. Д. (см. дополнительный рисунок 9)
- Выберите вкладку'Геометрия'и убедитесь, что информация согласуется с шагами 2.2.5. - 2.2.7. (см. дополнительный рисунок 10).
- Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '1: Амплитуда колебаний'. (см. дополнительный рисунок 11).
- Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 120 с' и погверните флажок 'Дождаться температуры' (см. Дополнительный рисунок 11).
- Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Частота = 1 Гц'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Крутящий момент = от 10 до 10000 мкН.m'; «Баллов за десятилетие = 5» (см. дополнительный рисунок 11).
- Установить эксперимент для определения линейного вязкоупругого диапазона (LVR) слизи известной концентрации (100 мг/мл)
- С помощью соответствующей микропипетки и наконечника пипетки вытягивайте приблизительно 0,3 мл раствора рыбьей слизи концентрацией 100 мг/мл (см. Этап 1.2, Таблица материалов).
- Введите раствор слизи на пластину Пельтье с помощью микропипетки (см. рисунок 2).
- Нажмите кнопку'Trim Gap'на реометре, чтобы понизить геометрию на пластине Пельтье. Кроме того, нажмите на значок'Trim Gap'на вкладке'Gap'в опции'Панель управления'в программном обеспечении для управления реометром (см. Дополнительный рисунок 12).
- Используйте микропипетку с наконечником пипетки, чтобы удалить любой избыточный раствор слизи и убедиться, что жидкость находится под геометрией без какого-либо разлива вблизи периферии геометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная загрузка жидкости приведет к ошибкам в измерениях. Под заполненным образцом будет ниже распределение крутящего момента, а перенаполненный образец приведет к ошибочному распределению напряжений из-за разлива по краям. - Выберите вкладки'Двигатель'и'Скорость'до 5 рад/с и 0 рад/с попеременно, пока в образце под геометрией не будет минимальной инерции и скорости. Экран управления на приборе реометра и панель управления программного обеспечения управления реометром будут отображать скорость (см. Дополнительный рисунок 13).
- Нажмите кнопку'Geometry Gap'на реометре, чтобы понизить геометрию до заданного подходящего зазора для конкретной геометрии. Кроме того, нажмите на значок'Geometry Gap'на вкладке'Gap'в опции'Панель управления'в программном обеспечении для управления реометром (см. Дополнительный рисунок 14).
- Провести эксперимент по определению линейного вязкоупругого диапазона (LVR) слизи известной концентрации (100 мг/мл).
- Нажмите значок'Пуск'на программном обеспечении управления прибором реометра (см. Дополнительный рисунок 15).
ПРИМЕЧАНИЕ: Реометр выполняет автоматические измерения; как только кнопка'Start'будет нажата, реометру потребуется около 20 минут для завершения теста. Параметр «Точек за десятилетие» на шаге 2.5.5 определяет, сколько времени потребуется реометру для завершения измерений. - Запустите эксперимент, щелкнув«Да»во всплывающем окне, которое появляется и предлагает снизить геометрический зазор до правильного расстояния, чтобы начать эксперимент, если он еще не опущен.
- Наблюдайте за графиком в реальном времени, генерируемым реометром, который сообщает модули хранения (G') и потерь (G'').
ПРИМЕЧАНИЕ: G' и G" являются модулями хранения и потерь соответственно. Модуль хранения представляет собой тенденцию к восстановлению материалом своей первоначальной формы после деформации, вызванной напряжением, и эквивалентен упругости. Модуль потерь представляет собой степень, в которой материал сопротивляется склонности к текучести и является репрезентативным для вязкости жидкости (см. Рис. 4). - Установите для оси X графика значение'Процент деформацииколебаний'. Для этого щелкните правой кнопкой мыши на представленном графике и выберитевкладку 'Graph Variables' (см. Дополнительный рисунок 16).
- Запишите процентный диапазон деформаций колебаний с графика, прежде чем материал войдет в нелинейный вязкоупругий диапазон после завершения испытания.
- Нажмите'стрелки вверх и вниз'на реометре илизначки 'геометрия поднимает и опускает'под вкладкой'Gap'в программном обеспечении управления реометром, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту над пластиной Пельтье.
- Сохраните файл, содержащий как экспериментальную процедуру, так и результаты в собственном формате файла программного обеспечения для управления реометром, чтобы определить линейную вязкоупругость (LVR) образца слизи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, установив ось X графика на амплитуду деформации (%) и/или напряжение колебаний
до того, как данные попадут в нелинейную вязкоупругую область (NLVR) (см. Дополнительный рисунок 16).
- Нажмите значок'Пуск'на программном обеспечении управления прибором реометра (см. Дополнительный рисунок 15).
- Провести эксперименты по динамическому развертке и устойчивому сдвигу потока в линейном вязкоупругом диапазоне (LVR) для слизи известной концентрации 100 мг / мл для получения результатов из трех независимых образцов слизи 100 мг / мл. Выполните эти шаги на доступных образцах концентрации слизи по отдельности.
- Повторите шаги 2.5.1 – 2.5.4.
- Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Частота = 1 Гц'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Деформация % = от 100 до 10000 %; 'Очков за десятилетие = 10'.
- Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '2: Частота колебаний'.
- Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 0.0 с'.
- Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Деформация % = 1 %'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Частота = от 20 до 1 Гц'; 'Очков за десятилетие = 10'.
- Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '3: Flow Sweep'.
- Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 0.0 с'.
- Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Скорость сдвига = от 1 до 10000 1/с'; 'Баллов за десятилетие = 10'; флажок 'Датчик устойчивого состояния'.
- Повторите шаги 2.7.1 – 2.7.2 и дождитесь завершения эксперимента, примерно 45 минут.
- Нажмите'стрелка вверх и вниз'на реометре или значки 'геометрия поднимается и опускается' на вкладке 'Gap' в программном обеспечении управления реометром, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту.
- Используйте одноразовые салфетки и перчатки для удаления и очистки слизи на пластине Пельтье раствором изопропанола (см. Таблицу материалов).
- Сохраните файл, содержащий как экспериментальную процедуру, так и результаты в собственном формате файла программного обеспечения управления реометром.
3. Повторите протокол для других концентраций растворов слизи 200 мг/мл и 400 мг/мл.
- Выполните шаги 2,5 – 2,8, включая все перечисленные в них подэтаймы для оставшихся двух концентраций растворов слизи, 200 мг/мл и 400 мг/мл.
4. Графическое представление и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Код, представленный в файле дополнительного кода, выполняет усреднение данных и генерирует ошибки повторяемости, накладывает данные из всех экспериментов. Функции расчета стандартного отклонения недоступны в программном обеспечении управления реометром. Код написан на языке программирования для анализа данных, постобработки и графического представления (подробнее см. Таблицу материалов).
- Экспорт данных, полученных на этапе 2.8, относящемся к концентрации слизи ГР 100 мг/мл, и на этапе 3.1, относящемся к концентрациям слизи ГР 200 мг/мл и 400 мг/мл ГР, в формат электронной таблицы, щелкнув вкладку 'Файл | Экспорт | Excel' в программном обеспечении управления реометром (см. Дополнительный рисунок 17).
- Запустите дополнительные коды для создания графиков кажущейся вязкости (η) для различных скоростей деформации сдвига (
) и модуля потерь (G"), модуля хранения (G') и фазового угла (δ) для изменяющегося напряжения колебаний ( ) и получения репрезентативных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе мы представляем результаты экспериментов на GR-слизи с использованием ротационного реометра с геометрией конуса (диаметр 40 мм, 1° 0' 11'') и пластины Пельтье. Эксперименты помогли охарактеризовать неньютоновское, истонченное поведение грязевой слизи GR и кажущийся предел текучести, изображающий переход слизи из гелеобразного материала в жидко-подобный материал. Репрезентативные результаты влекут за собой количественные описания пределов низкого крутящего момента и вторичных эффектов потока вращательного реометра. Измерительные пределы и стационарные и динамические измерения скорости деформации помогли точно определить вязкоупругие поведенческие тенденции и кажущийся предел текучести слизи GR. Измерения кажущегося предельного предела текучести обеспечивают средства для наблюдения минимального напряжения, необходимого для необратимой пластической деформации слизи ГР, и для инициирования потока. Тенденция к инициации потока слизи GR может быть объяснена адгезией и транспортными функциями пищевых частиц. Адгезионные и транспортные функции слизи GR были макроскопическими атрибутами материала, которые были основаны на реологических измерениях в протокольных экспериментах. Поэтому макрорегологическая характеристика слизи ГР была выполнена с помощью этого протокола.
Использованная в эксперименте слизь была получена из нескольких жаберных граблей до трех толстолобиков и не имел видимых следов крови1,2. Полученный образец разбавляли двумя дополнительными образцами, как описано в протоколе. Все измерения производились при контролируемой температуре 22 ± 0,002 °C36. Эта температура поддерживалась на пластине Пельтье реометра. Геометрия конуса была выбрана за ее универсальность в измерении широкого диапазона вязкостей в биологических материалах, таких как слизь GR. Минимальный крутящий момент в установившихся условиях сдвига (10 x 10-9 Нм),минимальный крутящий момент в колебательных условиях (2 x 10-9 Нм) вместе с углом конуса (1° 0' 11") и сводка спецификаций реометра, необходимых для оценки режимов низкого крутящего момента и вторичного потока, представлены в таблице 1. Мы сообщаем о репликах последних трех образцов для характеристики и сравнения неньютоновского и сдвигового истончения поведения.
Широкие выводы после успешного выполнения протокола
Успешное выполнение протокола и анализ привели к характеристике (макро) реологических свойств, влекущих за собой неньютоновское, сдвиговое истончение поведения слизи, извлеченной из жаберных граблей толстолобика, Hypophthalmichthys molitrix. В частности, было решено явление выхода и установлен кажущийся предел выхода слизи (концентрация 400 мг/мл, наиболее близкая к фактической консистенции экстрагированной слизи) (σy = 0,2736 Па). Протокол хорошо подходил для измерений с участием очень небольшого объема образца (приблизительно, 1,4 мл) слизи. Из-за нехватки литературы, относящейся к характеристике слизи ГР, эти данные помогут в аналитическом моделировании и расширенных реометрических исследованиях.
Результаты экспериментов динамической развертки
В данном разделе представлены результаты экспериментов по динамической частоте и амплитуде. Это результаты процедур, созданных на этапах 2.8.2 - 2.8.5. Пределы низкого крутящего момента для колебательной частоты развертки и амплитуды GR-слизи с концентрацией 400 мг/мл отмечены на рисунке 6A,B.
Данные о частотной развертке(рис. 6А)были получены для углового диапазона частот 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 рад с-1 при постоянной колебательной амплитуде деформации 0,01. Угловое значение частоты 6,28 рад/с (1 Гц) было выбрано в качестве приблизительной частоты движения небных складок в междоузлах жаберных граблей и обозначено на рисунке 6А. Выбор значения амплитуды деформации был получен из линейной вязкоупругой области, установленной на этапе протокола 2.7. На рисунке 6Адва потенциальных нижних предела режима низкого крутящего момента были рассчитаны с использованием амплитуд деформации 0,01 и 0,001 (γ0)и минимальных крутящих моментов 2x10-9 Нм и 10 x 10-9 Нм (Tmin,см. таблицу 1.)соответственно. Данные, представленные на рисунке 6А, начинаются с приближенной частоты движения небной складки (1 Гц или 6,28 рад/с) и увеличиваются до более высоких угловых частот, которые выходят за рамки физической интерпретации в данном исследовании. Следовательно, эти данные не были проанализированы дальше, так как они требуют более детального параметрического исследования амплитуды деформации и частоты движения небной складки.
Данные амплитудной развертки(рис. 6В)были получены при фиксированной угловой частоте (ω) 6,28 рад/с (1 Гц). Следует отметить, что на данные амплитудной развертки не влиял режим низкого крутящего момента прибора(рисунок 6В). Следовательно, эти данные были дополнительно проанализированы для всех трех концентраций слизи (100 мг / мл, 200 мг / мл и 400 мг / мл) для определения степени вязкоупругости и урожайного поведения.
Графическое представление, показанное на рисунке 4, использовалось в качестве ориентира для расширенного анализа экспериментов по амплитудной развертке. Результаты трех растворов слизи с концентрациями 100 мг/мл, 200 мг/мл и 400 мг/мл обсуждаются ниже.
Результат для концентрации слизи 100 мг/мл(рисунок 7А)показывает, что при низких колебательных напряжениях (0,01 
≤ ≤ 0,1 Па)модули хранения и потерь (G' и G") значительно перекрывались. При колебательных напряжениях более 0,1 Па модуль накопления снижается, что указывает на меньшую упругость. Модуль потерь, представляющий вязкость, остается постоянным во всем диапазоне колебательных напряжений (0,01 ≤ ≤ 0,5 Па). Это явление можно отнести к ньютоновскому флюидоподобным поведению и согласуется с постоянной кажущейся вязкостью концентрации слизи 100 мг/мл(рисунок 7А и рисунок 8А,В). Соответствующие данные фазового угла (δ) показывают, что при умеренных и высоких напряжениях колебаний (0,05 ≤ ≤ 0,3 Па)значения варьируются от 55° до 70°(рисунок 7D). Таким образом, можно сделать вывод, что раствор слизи 100 мг / мл демонстрирует жидкостное поведение с незначительным кажущейся пределом текучести.
Как видно на рисунке 7В,концентрация 200 мг/мл при низких колебательных напряжениях (0,02 ≤ ≤ 0,04 Па),модуль накопления (G') уменьшается, но все еще остается больше, чем модуль потерь (G"). В диапазоне колебательных напряжений (0,04 ≤ ≤ 0,07 Па)существовала область «кроссовера», в которой значения G' и G" остаются примерно равными. Эта область отмечена на рисунке 7B пунктирными линиями и соответствующими значениями напряжений колебаний (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Па). За пределами этой области G" достиг более высокого значения, чем G', предполагая переход к флюидодобной поведению. Однако G" (представляющая вязкость) оставалась постоянной в полном диапазоне колебательных напряжений (0,01 ≤ ≤ 0,5 Па). Данные о фазовом угле, представленные на рисунке 7E, показывают более высокую степень дисперсии, особенно в диапазоне напряжений колебаний (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Па). Из рисунков 7B,E можно сделать вывод, что наблюдалось переходное поведение жидкости из линейной вязкоупругой в нелинейную вязкоупругую область. Кроме того, концентрация слизи 200 мг/мл представляла собой неньютоновские характеристики и склонность к выходу в диапазоне колебательных напряжений (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Па). Неньютоновское, разбавляющее сдвиг флюидное поведение согласуется с данными о кажущейся вязкости, представленными на рисунке 8А, и соответствующими вариациями напряжений на рисунке 8B.
Данные о концентрации слизи 400 мг/мл представлены на рисунке 7C,F. Тенденции G' и G" на рисунке 7C ясно демонстрируют урожающее явление с точкой пересечения между G" и G'. Значение кажущегося предела текучести (σy)было зафиксировано как 0,2736 Па, что указывает на явное изменение состояния слизи из гелеобразного в неньютоновское жидкостообразное состояние. Данные о фазовом угле, представленные на рисунке 7F, показывают резкое увеличение при кажущейся предельности текучести (σy = 0,2736 Па)примерно с 20° до 65°. Такое резкое увеличение фазового угла может произойти, когда материал подвергается выходу и начинает течь как жидкость. Неньютоновское флюидоподобные поведения могут быть дополнительно подкреплены результатами стационарных испытаний на сдвиг, представленных на рисунке 8A,8B. Кажущееся предел текучести, о котором сообщалось в тестах на сдвиг в устойчивом состоянии, составляло 0,2272 Па(рисунок 8B).
Результаты экспериментов с устойчивой скоростью сдвига
Результаты экспериментов с устойчивой скоростью сдвига представлены для трех растворов слизи с концентрациями 100 мг/мл, 200 мг/мл и 400 мг/мл в данном разделе с использованием графических представлений в качествеориентира (рис. 3А,В). Эти результаты соответствуют процедуре, инициализированной на этапах протокола 2.8.6-2.8.8.
На рисунке 8А для концентрации слизи 100 мг/мл показаны данные о кажущейся вязкости с высокой дисперсией при низких скоростях сдвига (1 
≤ ≤4 с-1)вместе со наклоном,1,4. Также отмечено расположение режима низкого крутящего момента. Предполагается, что высокая дисперсия данных 100 мг/мл в этом диапазоне (1 ≤ ≤ 4с-1)является следствием (затененный) режима с низким крутящим моментом. На рисунке 8Bсоответствующее изменение напряжения с данными о скорости сдвига указывало на небольшой диапазон скоростей сдвига, когда образец достигал «напряженного плато» (или плоской области). Эта область игнорируется для оценки пределов текучести, поскольку соответствующие данные о вязкости подвержены воздействию низкого крутящего момента. В диапазоне высокой скорости сдвига (2500 ≤ ≤ 10000с-1)на данные о кажущейся вязкости влиял режим вторичного потока. Таким образом, раствор слизи 100 мг/мл ведет себя как ньютоновская жидкость, которая не зависит от скорости сдвига вне режимов с низким крутящим моментом и вторичного потока и с постоянной кажущейся вязкостью 0,00088 Па с (±1,656 x10-5 Па с).
Как видно на рисунке 8А,концентрация слизи в 200 мг/мл оставалась незатронутой низкими ограничениями крутящего момента и демонстрировала эффект истончения сдвига в диапазоне скорости сдвига, 1 ≤ ≤ 15с-1. Вязкость с нулевой скоростью деформации сдвига (ηo)была отмечена как 0,032 Па с (±0,024 Па с),а вязкость бесконечной сдвиговой деформации (η∞)при скорости сдвига ( ), 1995 с-1, была отмечена как 0,00085 Па с (±2,495 х 10-5Па с). Эффект сдвигового истончения жидкости был продемонстрирован с наклоном -1,8 в пределах диапазона скорости сдвига, 1 ≤ ≤ 4 с-1. Соответствующее изменение напряжения на рисунке 8Bдемонстрирует «напряженное плато», которое представляет собой явление урожайности со средним пределом текучести 0,1446 Па (±0,0037 Па).
Концентрация слизи 400 мг/мл является наименее разбавленной и, следовательно, наиболее близкой по консистенции материала к фактически экстрагированной ГР-слизи. На рисунке 8Аобратите внимание, что характеристика сдвига-истончения хорошо определена для концентрации слизи 400 мг/мл по сравнению с концентрацией слизи 200 мг/мл. Вязкость с нулевым сдвигом (ηo)и скоростью деформации с бесконечным сдвигом (η∞)при скорости сдвига ( ), 1995 с-1, составляла 0,137 Па с (±0,032 Па с)и 0,00099 Па с (±9,323 х 10-5Па с)соответственно. Кроме того, наклон области сдвигового истончения был установлен как -0,91 в пределах диапазона скорости сдвига, 1 ≤ ≤ 32с-1. Соответствующее «напряженное плато» из вариаций напряжений со скоростью сдвига, наблюдаемое на рисунке 8B,представляет собой кажущееся напряжение текучести 0,2272 Па (±0,0948 Па).
| Компонент | Модель/Номер детали/Версия | Описание параметра | Спецификации |
| Реометр | РДХР-2 | Диапазон частот | 1 x 10−7 - 100 Гц |
| Максимальная угловая скорость | 300 рад/с | ||
| Минимальный крутящий момент при устойчивом сдвиге | 10 нН.m | ||
| Минимальный крутящий момент при колебаниях | 2 нН.m | ||
| Максимальный крутящий момент | 200 мкН*м | ||
| Разрешение крутящего момента | 0,1 нН.m | ||
| Диапазон скорости сдвига | 5,73 x 10−6 до 1,72 x 104 [1/с] | ||
| Максимальное нормальное усилие | 50 Н | ||
| Нормальное разрешение силы | 0,5 мН | ||
| Геометрия | 513404.905 | Размеры | Диаметр 40 мм |
| 1° 0' 11" Угол конуса | |||
| Тарелка Пельтье | 533210.901 | Температурный диапазон | от -40°C до 200°C ± 0.1°C |
Таблица 1: Технические характеристики реометра
Рисунок 1: CAD рендеринг компонентов реометра. (A) 40 мм 1° геометрия конуса, (B) Крепление пластины Пельтье. Геометрия конуса должна быть прикреплена к валу реометра, а пластина Пельтье должна быть соединена с основанием вращательного реометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Размещение жидкости на пластине Пельтье. Образец жидкости должен быть помещен в центр пластины Пельтье, чтобы обеспечить равномерное распространение жидкости по всей пластине при понижении геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графическое представление устойчивых реологических свойств. Изменение(A)кажущейся вязкости (η) и(B)напряжения сдвига ( ) со скоростью деформации сдвига. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Графическое представление динамических реологических свойств. Изменение модуля хранения (G') и потерь (G") и фазового угла (δ) с напряжением колебаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения и схематические чертежи жаберных граблей (GR). (A) Вид массива жаберных граблей и небных складок (B) Схематический рисунок массива жаберных граблей и небных складок (C) Иссеченный жаберный грабль (D) Схематический рисунок жаберного грабля с характерными особенностями (E) Расположение извлечения слизи в жаберном грабле. Изображения 5A и 5C были сделаны во время вскрытия, выполненного профессором Л. Патрисией Эрнандес с факультета биологических наук в Университете Джорджа Вашингтона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Эффекты низкого крутящего момента. Изменение модуля хранения и потерь для 400 мг/мл, концентрация слизи с(А)Частотные развертки при амплитуде деформации = 0,01 и(В)Амплитудные развертки при частоте колебаний = 1 Гц (или 6,28 рад/с). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Амплитуда размахов для трех концентраций слизи толстолобица. Испытания проводились при f = 1 Гц или ω = 6,28 рад/с(A)Изменении модуля хранения и потерь для концентрации слизи, 100 мг/мл(B)Изменение модуля хранения и потерь для концентрации слизи, 200 мг/мл(C)Изменение модуля хранения и потерь для концентрации слизи GR, изменение фазового угла для концентрации слизи GR, изменение фазового угла для концентрации слизи GR, 100 мг/мл(E)Изменение фазового угла для концентрации слизи, 200 мг/мл(F)Изменение фазового угла для концентрации слизи, 400 мг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Изменение кажущейся вязкости (η) и напряжения (σ) при скорости сдвига ( ) для всех трех концентраций рыбьей слизи. (A) Кажущееся изменение вязкости со скоростью сдвига для концентраций слизи, 400 мг / мл, 200 мг / мл и 100 мг / мл наряду с режимами эффектов низкого крутящего момента и вторичных эффектов потока (B) Изменение напряжения при скорости сдвига для концентраций слизи GR, 400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл, обозначающие «плато стресса» (или плоскую область) пунктирными линиями. Пунктирные линии представляют собой средние значения кажущейся предельности текучести для трех концентраций слизи ГР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Три концентрации слизи GR из толстого карпа. Слева направо: 400 мг/мл, 200 мг/мл, 100 мг/мл. Первоначальная концентрация 400 мг/мл была выбрана с соблюдением критериев, согласно которым после разбавления образец будет содержать разумное количество рыбьей слизи, а также обеспечивать достаточно большой объем для проведения нескольких тестов. Две последующие концентрации были разбавлены 50% ВОДОЙ DI по объему. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Запуск программного обеспечения для управления реометром. Это программное обеспечение должно быть запущено только после того, как устройство включено. В противном случае прибор может быть откалиброван неправильно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Калибровка прибора. Инерциальная калибровка является единственной калибровкой, необходимой для прибора. Существуют и другие калибровки, выполняемые после установки геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Интеллектуальный переключатель свопов. Этот параметр предназначен для включения или отключения интеллектуальной подкачки. Smart swap - это программная функция управления реометром, которая автоматически определяет геометрию после ее установки на вал реометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Варианты измерительных разрывов Были доступны параметры вкладки «Зазор», чтобы задать условия для режима нулевого зазора и скорости прохождения измерительной головки. Осевая сила контакта между геометрией и пластиной Пельтье была установлена на 1 Н для обеспечения нулевого зазора, т. е. контакта между геометрией конуса и поверхностью пластины Пельтье. Затем измерительную головку сделали для точного прохождения до измерительного зазора в 24 мкм между геометрией конуса 40 мм 1° и пластиной Пельтье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 6: Калибровка геометрии навесного оборудования. После установки геометрии конуса 40 мм 1° и ее обнаружения программным обеспечением для управления реометром геометрия калибровалась так же, как и калибровка прибора, чтобы обеспечить точные измерения во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 7: Значок нулевого зазора. Инициализация с нулевым зазором выполняется с помощью этого значка. После завершения инициализации с нулевым зазором реометр может точно ссылаться на положение вала с прикрепленной к нему геометрией, когда он поднимается или опускается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 8: CAD-рендеринг геометрии конуса и пластины Пельтье после установления привязки нулевого зазора. Геометрия настроена на установление нулевого зазора при создании осевой контактной силы 1 Н при контакте с пластиной Пельтье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 9: Этап 2.5.1 протокола. На рисунке показано, как задаются имена образцов и выходные данные файлов и данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 10: Этап 2.5.2 протокола. На рисунке показано, как можно задать параметры геометрии, такие как объем образца, геометрический зазор и зазор обрезки. Для некоторых геометрий, а именно конуса, используемого в этом эксперименте, эти настройки неизменны и определяются на основе геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 11: Этап 2.5.3 протокола. На рисунке показано, как настройка теста и кондиционирование задаются на этом процедурном этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 12: Значок обрезки зазора. Зазор отделки был установлен таким образом, чтобы геометрия могла быть опущена достаточно, чтобы обрезать лишнюю жидкость, которая вытекает из области между пластиной Пельтье и геометрией конуса. Зазор зависит от геометрии в использовании. Для геометрии конуса 40 мм, 1 °, используемой в протоколе, зазор обрезки составлял 28 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 13: Значок скорости двигателя. Настройки двигателя использовались для регулировки скорости вращения вала и минимизации инерции геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 14: Значок геометрии зазора. Геометрический зазор понижает геометрию на определенное расстояние над пластиной Пельтье, как указано геометрией конусной пластины. Для геометрии конуса 40 мм, 1°, используемой в протоколе, геометрический зазор составляет 24 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 15: Значок запуска. Кнопка Пуск инициирует всю последовательность процедур, которые были настроены ранее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 16: Изменение переменных графика. На рисунке представлены переменные, которые могут быть определены для представления данных при выполнении процедур. В частности, деформация колебаний и напряжение колебаний имеют важное значение во время экспериментов динамической развертки в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 17: Экспорт файлов программного обеспечения для управления реометром в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. После того, как файлы экспортируются в виде электронных таблиц, анализ данных стал возможным с помощью другого программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Файл дополнительного кода: Постобработка файлов данных с помощью программы анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одной из основных целей разработки этого протокола является установление того, что он хорошо подходит для реологической характеристики слизи ГР при наличии очень малых объемов образцов. Мы признаем, что для полной характеристики реологических свойств слизи GR необходимы дополнительные образцы из стаи толстолобица, и данные, представленные здесь, не являются обобщением по всей популяции толстолобика. Наша методика оправдана своей эффективностью с реологической характеристикой небольших объемов образцов и с расширенными исследованиями с участием более крупных ансамблей образцов слизи.
Критическими шагами в рамках протокола являются приготовление растворов слизи различных концентраций, измерения и сбор данных с использованием ротационного реометра, а также графическое представление и анализ данных для физических прозрений.
Физическое понимание данных о слизи GR извлекаются из графических представлений, показанных на рисунках 3 и 4,которые аннотированы атрибутами ожидаемого поведения материала. Значения вязкости деформации с нулевым сдвигом (ηo)можно наблюдать при низких скоростях деформации сдвига, где доминирует подвижность молекул материала(рисунок 3A и рисунок 8A). Значения вязкости бесконечной деформации сдвига (η∞)в неньютоновских жидкостях на порядки ниже вязкости деформации с нулевым сдвигом. Эти данные можно заметить при высоких скоростях сдвига, где мало или вообще нет зависимости от межмолекулярных взаимодействий(рисунок 3A и рисунок 8A). Для неньютоновских жидкостей кажущаяся вязкость постепенно уменьшается по мере увеличения скорости сдвига и достижения постоянного низкого значения(рисунок 3A и рисунок 8A). Поведение выхода в слизи GR при измерениях устойчивого состояния может быть представлено наклоном, как показано на рисунке 3A и представлено в уравнении 1., где ηa представляет собой кажущуюся вязкость, σy - (постоянное) напряжение текучести и - скорость деформации сдвига.
Рисунки 3A и 8B представлены на логарифмической шкале, и поэтому уравнение 1 достигает следующей формы:
где k – представляет собой кажущееся предел текучести. На логарифмической шкале кажущаяся вязкость уменьшается с наклоном '-1' указывает на выход материала, как показано на рисунке 3A10. Концентрации слизи 200 мг/мл и 400 мг/мл имели наклоны -1,8 и -0,91 соответственно и демонстрировали поведение выхода(рисунок 8А). При измерениях динамических колебаний вязкоупругие характеристики не зависят от амплитуды деформации в линейной вязкоупругой области (LVR)(рисунок 4). Поведение выхода в СЛИЗИ GR при динамических колебаниях можно наблюдать, когда вязкоупругий материал (GR слизь) входит в нелинейную вязкоупругую область (NLVR) по мере уменьшения модуля хранения (G')(рисунок 4). В режиме NLVR вязкоупругий материал будет демонстрировать твердогелеобразное поведение, если модуль хранения больше модуля потерь (G' > G"). Когда модуль потерь превышает модуль хранения (G' < G"), происходит "пересечение" между данными G' и G". Как показано на рисунке 7B,C,концентрации слизи ГР 200 мг/мл и 400 мг/мл ГР продемонстрировали жидкостное поведение, отмеченное данными «кроссовера» между G' и G" данными. Кажущееся предел текучести при измерениях устойчивого состояния представляется как среднее значение напряжения до тех пор, пока не будет достигнута точка перегиба(рисунок 3B). После этого напряжение начинает резко увеличиваться с увеличением скорости деформации сдвига, как показано на рисунках 3B и 8B. Данные GR-слизи (концентрации 200 мг/мл и 400 мг/мл) показали поведение жидкости, разжижающее сдвиг, до тех пор, пока материал не начнет давать(рисунок 8A,B). Кажущийся предел текучести отчетливо наблюдался в концентрациях слизи 200 мг/мл и 400 мг/мл из-за их неньютоновских характеристик(рисунок 8B). Кажущееся напряжение текучести при измерениях динамических колебаний показано на рисунке 4 и рисунке 7B,C как область "пересечения" между данными G' и G", за которой следуют значения G", превышающие G'. Данные о слизи ГР 400 мг/мл показали разжижающее сдвиг, неньютоновское поведение. Точка начала выхода материала наблюдалась при кажущейся предельности текучести приблизительно 0,2736 Па(рисунок 7C). Гидрогель-подобный переход с фазовым углом (δ = tan-1 (G"/G')) представлен на рисунках 4 и 7D-F. Экстрема в фазовом углу связана с твердым телом Хука при 0° и вязкой жидкостью при 90°, как показано на рисунке 4. Значения фазового угла около 45° были отнесенные к переходу гелеобразного поведения материала к жидкосто-подобному поведению. Концентрация слизи 400 мг/мл ясно показала изменение характеристик материала от гидрогеля к жидкостному поведению в процессе выхода с кажущимся пределом текучести ~ 0,2736 Па(рисунок 7F).
Понимание ограничений измерений и избегание данных, непригодных для физической интерпретации, является проблемой для сложных и мягких биологических жидкостей, особенно в исследованиях с участием небольших объемов выборки11. Данные, полученные при эффектах низкого крутящего момента и вторичного потока, непригодны для физической интерпретации и зависят от геометрии, используемой в реометре (например, конус и пластина в этом исследовании). Эти режимы были определены во избежание любого искажения экспериментальных данных, связанных с разрешением приборов и измерительными артефактами из-за диффузии импульса. Пределы низкого крутящего момента(рис. 6А и Рисунок 8А)являются функциями геометрии и минимального крутящего момента, генерируемого прибором(таблица 1). В условиях измерения устойчивого сдвига критерий отклонения данных, на которые влияет предел низкого крутящего момента для геометрии конусной пластины радиуса (R) с минимальным крутящим моментом (Tmin = 10 x10 -9 Нм, таблица 1),обсуждался Ewoldt et al. и представлен ниже11:
где — скорость деформации сдвига. В отличие от концентраций слизи ГР 100 мг/мл, концентрации слизи ГР 200 мг/мл и 400 мг/мл ГР не были затронуты эффектами низкого крутящего момента, на что явно демонстрируются неньютоновское, истонченное поведение при деформации с высокой скоростью сдвига при низких скоростях деформации сдвига. Критерий минимального измеримого вязкоупругогого модуля при динамических измерениях колебаний обсуждался Ewoldt et al. и представлен ниже (Уравнение 4)11. В уравнении 4 для геометрии конусной пластины радиуса (R) минимальный крутящий момент при колебательном сдвиге (Tmin = 2 x 10-9 Нм, таблица 1).
где Gmin — модуль накопления (G') или модуль потерь (G») и — скорость деформации сдвига. Режимы ограничения контрольно-измерительных приборов, регулируемые эффектами низкого крутящего момента, обозначены на рисунках 6А и 6В. Режим вторичного потока при измерениях устойчивого состояния регулируется диффузией флюидания флюидом внутрь с помощью вихря, находящегося внутри вращательного конуса и геометриипластины 11. Картина вторичного потока неправильно увеличивает крутящий момент, в результате что жидкость кажется сгущающейся(рисунок 8А). Предел вторичного потока, предложенный Ewoldt et al. на рисунке 8A, был проведен с использованием следующего отношения11:
где L = βR, β — угол конуса, R — радиус конуса, ρ = 1000 кг м-3,Recrit = 4 и — скорость сдвига. Этот режим помог оценить значения вязкости штамма с бесконечным сдвигом (η∞)в образцах слизи GR.
Модификация протокола может быть произведена с использованием геометрии плоской пластины вместо геометрии конусной пластины, как показано в протоколе, представленном в настоящем документе. Испытания на плоской пластине должны проводиться с параметрическим изменением измерительного зазора во вращательном реометре, чтобы выявить зависимость кажущегося предела текучести от измерительного зазора и геометрии. Предлагаемые усовершенствования протокола, представленные в настоящем документе, описываются ниже. Следует выполнить параметрическое изменение амплитуды деформации в линейном вязкоупругом режиме (LVR) и частоты колебаний. Реологические тесты «Tack and peel» должны быть выполнены для развития полного понимания адгезивности слизи GR. Реологические характеристики слизи GR должны выполняться на ансамблях большего объема образцов вместе с исследованиями для измерения любых следов клеток крови для учета ее влияния на общие реологические свойства GR.
Ограничения протокола описаны ниже. Тонкости процедур экстракции слизи GR и наличие клеток крови или фрагментов ткани в образцах слизи могут влиять на реологию слизи. Однако следует отметить, что используемая в протоколе слизь не имеет видимых следов крови. Образец слизи GR является гетерогенным материалом и может обладать различными реологическими свойствами из-за дисперсии в местоположении и условиях после экстракции. Это ограничение было устранено путем достаточной гомогенизации слизи GR с использованием шейкер для разрушения любых больших скоплений слизи и присутствия в тканях. Другим важным ограничением являются очень малые объемы образцов слизи ГР (приблизительно 1,4 мл), собранные для анализов, которые ограничивают обобщение свойств слизи ГР.
Значение этого протокола заключается в том, что он позволяет точно реологическую характеристику неньютоновских биологических жидкостей, таких как слизь. Протокол, представленный в настоящем документе, прокладывает путь для исследования других подобных биологических жидкостей, связанных с выделениями человека, животных и растений. Кроме того, синтетические жидкости или растворы на основе полимеров, которые являются аналогами биологических жидкостей, могут быть испытаны с использованием этого протокола для понимания свойств материала при различных напряжениях, частотах колебаний и температуре. Протокол хорошо подходит для реологической характеристики биологических жидкостей, когда доступны очень маленькие объемыобразцов.
Расширенный результат протокола заключается в том, что кажущаяся вязкость и кажущееся пределы текучести слизи ГР облегчат создание аналитических моделей для интерпретации результатов фундаментальных гидродинамических исследований подачи фильтров и передовых технологий, требующих и включающих поперечный поток и мембранную фильтрацию.
Макрорегологическое исследование утверждает, что слизь, контактируя с частицами пищи, изначально находится в гелеобразном состоянии, которое служит адгезивом. При инициации сил потока и сдвига слизь достигает кажущейся предельности текучести и подвергается пластической деформации. Протокол выполнения с использованием ротационного реометра помог охарактеризовать переход слизи из гелеобразного в жидкостообразное поведение. Этот переход наблюдался экспериментально, и кажущееся напряжение текучести было зарегистрировано на уровне 0,2736 Па в экспериментах с вращательным реометром. Когда внешние нагрузки на слизь меньше, чем кажущийся предел урожайности, слизь будет демонстрировать гелеобразное поведение, чтобы облегчить адгезию пищевых частиц. Когда внешние напряжения превышают кажущийся предел текучести, слизь будет демонстрировать поведение разжижения, которое облегчит транспортировку агломерированных пищевых частиц к органам пищеварения у толстолобика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не заявлен.
Acknowledgments
Авторы признают поддержку и финансирование со стороны Центра биомиметики и биоинспирированной инженерии GW. Мы благодарим профессора Л. Патрисию Эрнандес из Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона за вдохновение для исследования и постоянного сотрудничества, предоставление биологической экспертизы по физиологии толстолобиком и предоставление образцов слизи. Мы благодарим студентов, г-на Дэвида Палумбо, г-жу Карли Коэн, г-на Исаака Финберга, г-на Доминика Петросино, г-на Алексиса Рендероса, г-жу Присциллу Варгезе, г-на Картера Тегена и г-на Рагхава Паджжура за помощь в лаборатории и г-на Томаса Эванса и г-на Джеймса Томаса из TA Instruments, New Castle, DE за поддержку в обучении и обслуживании реометра. Изображения для рисунков 5A, C были сделаны во время вскрытия, выполненного профессором Л. Патрисией Эрнандес с факультета биологических наук в Университете Джорджа Вашингтона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L.
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J.
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L.
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C.
- Litt, M.
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T.
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
- National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).
