Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av insulin- og sammentrekningstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert moden skjelettmuskulatur fra mus

Published: May 16, 2021 doi: 10.3791/61398
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Section of Molecular Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen, 2Section of Integrative Physiology, Department of Nutrition, Exercise and Sports, University of Copenhagen

Summary

Intakt regulering av muskelglukoseopptak er viktig for å opprettholde hele kroppen glukose homeostase. Denne protokollen presenterer vurdering av insulin- og sammentrekningsstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert moden skjelettmuskulatur ved avgrensning av virkningen av ulike fysiologiske inngrep på hele kroppens glukosemetabolisme.

Abstract

Skjelettmuskulatur er et insulinresponsivt vev og tar vanligvis opp det meste av glukosen som kommer inn i blodet etter et måltid. Videre har det blitt rapportert at skjelettmuskulatur kan øke utvinningen av glukose fra blodet med opptil 50 ganger under trening sammenlignet med hvileforhold. Økningen i muskelglukoseopptaket under trening og insulinstimulering er avhengig av translokasjon av glukosetransportør 4 (GLUT4) fra intracellulære rom til muskelcelleoverflatemembranen, samt fosforylering av glukose til glukose-6-fosfat ved hexokinase II. Isolasjon og inkubasjon av musemuskler som m. soleus og m. extensor digitorum longus (EDL) er en passende ex vivo-modell for å studere effekten av insulin og elektrisk indusert sammentrekning (en modell for trening) på glukoseopptak i moden skjelettmuskulatur. Dermed tillater ex vivo-modellen evaluering av muskelinsulinfølsomhet og gjør det mulig å matche muskelkraftproduksjonen under sammentrekning, noe som sikrer jevn rekruttering av muskelfibre under målinger av muskelglukoseopptak. Videre er den beskrevne modellen egnet for farmakologisk sammensatt testing som kan ha innvirkning på muskelinsulinfølsomhet eller kan være til hjelp når du prøver å avgrense den regulatoriske kompleksiteten i skjelettmuskulaturglukoseopptaket.

Her beskriver og gir vi en detaljert protokoll om hvordan man måler insulin- og sammentrekningsstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert soleus og EDL muskelpreparater fra mus ved hjelp av radiomerket [3H]2-deoksy-D-glukose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. Dette tillater nøyaktig vurdering av glukoseopptak i moden skjelettmuskulatur i fravær av forvirrende faktorer som kan forstyrre den intakte dyremodellen. I tillegg gir vi informasjon om metabolsk levedyktighet av inkubert mus skjelettmuskulatur som antyder at metoden som brukes har noen advarsler under visse forhold når du studerer muskelenergimetabolisme.

Introduction

Skjelettmuskulaturen har evnen til å trekke ut store mengder glukose fra det ekstracellulære rommet som respons på insulin og trening. Dette bidrar til å opprettholde glukose homeostase i hele kroppen og sikrer glukoseforsyning i tider med høy energibehov. Siden intakt regulering av skjelettmuskulaturglukoseopptak har vist seg å være viktig for generell helse og fysisk ytelse 1,2, har målinger av muskelglukoseopptak under ulike forhold fått mye oppmerksomhet. Hos mennesker og dyr har den hyperinsulinemisk-euglykemiske klemmen blitt brukt som gullstandardteknikk for å vurdere insulinfølsomhet in vivo 3,4. I motsetning til funn hentet fra en oral glukosetoleransetest, krever den hyperinsulinemiske-euglykemiske klemmeteknikken ikke intakt gastrointestinal funksjon eller insulinsekresjon fra bukspyttkjertelen og tillater dermed insulinresponser å bli sammenlignet mellom personer som viser variasjoner i gastro-tarm- og / eller bukspyttkjertelfunksjon. Målinger av muskelglukoseopptak in vivo under trening hos mennesker har blitt utført ofte siden 1960-tallet5. Først ved bruk av arteriovenøse balanseteknikker6 og senere ved bruk av positronutslippstomografi (PET) avbildning i kombinasjon med en positron som avgir glukoseanalogi, for eksempel 18F-Fluoro-deoksy-glukose7. Hos gnagere utføres treningsstimulerte muskelglukoseopptak in vivo vanligvis ved bruk av radioaktive eller stabile isotopmerkede glukoseanaloger 8,9,10.

En komplementær metode for målinger av muskelglukoseopptak in vivo, er å isolere og inkubere små muskler fra gnagere og deretter måle glukoseopptak ved hjelp av radioaktive eller stabile isotopmerkede glukoseanaloger 11,12,13. Denne metoden tillater nøyaktig og pålitelig kvantifisering av glukoseopptakshastigheter i moden skjelettmuskulatur og kan utføres i nærvær av ulike insulinkonsentrasjoner og under sammentrekning fremkalt av elektrisk stimulering. Enda viktigere er at målinger av glukoseopptak i isolert og inkubert skjelettmuskulatur er relevante når man undersøker muskelmetabolisk fenotype av mus som har gjennomgått ulike intervensjoner (f.eks. ernæring, fysisk aktivitet, infeksjon, terapeutiske stoffer). Den isolerte skjelettmuskulaturmodellen er også et egnet verktøy for farmakologisk sammensatt testing som kan påvirke glukoseopptaket i seg selv og/eller endre insulinfølsomheten12,14. På denne måten kan effekten av forbindelser designet for å regulere muskelglukosemetabolismen testes og evalueres i et svært kontrollert miljø før etterfølgende in vivo-testing i prekliniske dyremodeller.

Under noen forhold kan metabolsk levedyktighet utgjøre en utfordring i det isolerte og inkuberte skjelettmuskulaturmodellsystemet. Faktisk innebærer mangelen på et sirkulasjonssystem i de inkuberte musklene at levering av substrater (f.eks. oksygen og næringsstoffer) avhenger helt av enkel diffusjon mellom muskelfibrene og omgivelsene. Når det gjelder dette, er det av betydning at de inkuberte musklene er små og tynne og dermed representerer mindre av en barriere for oksygendiffusjon under inkubasjon15. Spesielt under langvarige inkubasjoner i flere timer kan hypoksiske tilstander utvikle seg på grunn av utilstrekkelig oksygentilførsel som resulterer i muskelenergiuttømming15. Selv om ulike markører for metabolsk levedyktighet i inkubert rottemuskel har blitt rapportert tidligere sammen med identifisering av viktige variabler som bidrar til å opprettholde rottemuskelens levedyktighet15, er en omfattende evaluering av metabolsk levedyktighet i små inkuberte musemuskler fortsatt berettiget. Derfor har glykogeninnhold for tiden hovedsakelig blitt brukt som en markør for metabolsk levedyktighet i inkubert mus skjelettmuskel16,17.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å måle basal, insulin- og sammentrekningsstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert soleus og EDL muskel fra mus ved hjelp av radiomerket [3H]2-deoxy-D-glukose og [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. I den nåværende studien ble glukoseopptak målt i løpet av en 10-minutters periode, og metoden presenteres ved bruk av submaksimalt og maksimalt effektive insulinkonsentrasjoner samt en enkelt sammentrekningsprotokoll. Protokollene som er beskrevet her, kan imidlertid enkelt endres med hensyn til inkubasjonstid, insulindosering og elektrisk stimuleringsprotokoll. Videre gir vi en grundig karakterisering av ulike markører av metabolsk levedyktighet i inkubert soleus og EDL musemuskel. Resultatene indikerer at glukosetilskudd til inkubasjonsbufferen er avgjørende for å bevare metabolsk levedyktighet av muskel inkubert i 1 time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer som involverer forskningsdyr bør utføres i samsvar med relevante retningslinjer og lokal lovgivning. Alle dyreforsøk som ble brukt til denne studien fulgte den europeiske konvensjonen om beskyttelse av virveldyrdyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål og ble godkjent av det danske dyreforsøksinspektøratet.

1. Forberedelse av eksperimentelt apparat og suturløkker

MERK: I denne studien bruker du et integrert muskelstripe-myografsystem med tilpassede inkubasjonskroker for å inkubere isolerte museskjelemuskler (figur 1). Dette systemet gjør det mulig for muskler å bade i en fysiologisk løsning med kontinuerlig oksygenering (95% O2 og 5% CO2) og ved konstant temperatur. Muskelvevsbadet er koblet til en krafttransduser for måling av muskelkraftproduksjon under sammentrekning. For å fremkalle og registrere myo-mekaniske responser under sammentrekning, bruk henholdsvis en elektrisk pulsstimulator og et datainnsamlingsprogram. Stimulere de inkuberte musklene til å trekke seg sammen med platinaelektroder plassert sentralt og på begge sider av muskelen.

  1. Slå på myografisystemet og varme kamre til 30 °C. Åpne datainnsamlingsprogramvare som er kompatibel med myografisystemet og kalibrer krafttransdusere for å sikre sammenlignbarhet mellom datasett.
  2. Begynn med å kutte ~ 16 cm tråder av ikke-absorberbar kirurgisk nylon sutur. Bruk tang for å lage en løkke på ca. 0,4 cm i diameter fra en enkelt tråd. Gjenta dette til det er produsert nok løkker. Hver muskel trenger to løkker - en for proksimal og en for den distale senen.

2. Utarbeidelse av løsninger og inkubasjonsmedier

  1. Forberedelse av basale inkubasjonsmedier
    1. Forbered følgende lagerløsninger: 2,5 M natriumklorid (NaCl, 250 ml), 0,5 M natriumbikarbonat (NaHCO3, 250 ml), 0,5 M kaliumklorid (KCl, 50 ml), 0,25 M kalsiumklorid (CaCl2, 50 ml), 0,25 M kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4, 50 ml), 0,25 M magnesiumsulfat (MgSO4, 50 ml), 110 mM natriumpyuvat (Na-Pyruvat, 100 ml), 500 mM D-mannitol (100 ml), 1 M 2-deoksy-D-glukose (4 ml), 15 % løsning av bovint serumalbumin (BSA) som er oppringt mot Krebs-Ringer-Henseleit (KRH)-buffer (beskrevet nedenfor i trinn 4) (100 ml).
      MERK: Det kreves to løsninger for å måle hvile- og sammentreknings-stimulert glukoseopptak. Videre krever hver enkelt insulinkonsentrasjon som brukes til å vurdere insulin-stimulert glukoseopptak to løsninger. Dermed er det nødvendig med totalt seks forskjellige løsninger for å måle basal, submaksimal insulin-, maksimal insulin- og sammentrekningsstimulert glukoseopptak i isolert museskjelletaturmuskel. I det følgende refererer 'basal inkubasjonsmedier' til medier uten insulin eller radioaktive sporstoffer. 'Inkubasjonsmedier' refererer til medier som inneholder insulin. 'Glukoseopptak inkubasjonsmedier' refererer til medier som inneholder 2-deoksy-D-glukose og radioaktive sporstoffer i tillegg til insulin i en konsentrasjon som er identisk med det som brukes i 'inkubasjonsmediet'.
    2. Forbered en KRH-buffer ved å supplere ultrapure vann (ddH2O) med NaCl (117 mM), NaHCO3 (24,6 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM) og MgSO4 (1,2 mM). Deretter gasser KRH-bufferen med 95% O2 og 5% CO2 i minst 10 min. Den ønskede pH i KRH-bufferen skal være mellom 7,35-7,45 ved 30 °C. Hvis pH-justering utføres ved romtemperatur, skal pH på KRH-bufferen være mellom 7,25-7,35.
    3. Tilsett BSA (0,1 %), Na-Pyruvate (2 mM) og D-mannitol (8 mM) i den gassede og pH-justerte KRH-bufferen for å fullføre basal inkubasjonsmediet. Oppbevar basale inkubasjonsmedier i en forseglet beholder for å minimere avfetting av O2 og CO2 og plasser medier ved 30 °C.
      MERK: Vanligvis holdes osmolariteten til KRH-tilskuddene (dvs. Na-Pyruvate, D-Mannitol og D-glukose) konstant over et helt eksperiment for å unngå krymping eller utvidelse av muskelcellene. Protokollen som er beskrevet her, bruker en osmolaritet på 10 mM for KRH-tilskuddene. Hvis det er behov for en glukoseholdig buffer, bytt ut KRH-tilskudd for å imøtekomme behovene, for eksempel 5 mM D-glukose og 5 mM D-mannitol.
    4. For å unngå mulige BSA-assosierte forurensninger i inkubasjonsbufferen, dialyze BSA mot KRH.
      1. For å lage en 15% BSA lagerløsning dialysert mot KRH-buffer, start med å oppløse 300 g analytisk fettfri BSA i 900 ml KRH-buffer. Kok deretter dialyserøret i redistillert vann til slangen er myk.
      2. Fyll slangen med BSA-KRH-løsningen og fest slangeendene. Plasser slangen med BSA-KRH i 5 L KRH buffer og la den stå over natten ved 4 °C. Neste dag erstatter du KRH-bufferen og lar slangen stå med BSA-KRH i KRH-buffer over natten ved 4 °C.
      3. Til slutt samler du inn BSA-KRH-løsningen fra slangen og legger krh-bufferen til et sluttvolum på 2 L (dvs. 15% BSA-KRH lagerløsning). Del 15% BSA-KRH lagerløsning i aliquots og oppbevar i fryser ved ~ -20 °C.
  2. Fremstilling av inkubasjonsmedier som inneholder insulin
    1. For inkubasjonsmediet som inneholder en submaksimalt effektiv insulinkonsentrasjon, tilsett 1 μL av en 100 ml insulinbestandsoppløsning per ml basal inkubasjonsmedier (100 μU/ml insulin).
    2. For inkubasjonsmediet som inneholder en maksimal effektiv insulinkonsentrasjon, tilsett 1 μL av en 10 U/ml insulinbestandsoppløsning per ml basal inkubasjonsmedier (10 ml/ml insulin).
  3. Forberedelse av glukoseopptak inkubasjonsmedier
    FORSIKTIG: Håndtering av radioaktivt materiale er kun tillatt i et avgrenset og kontrollert område av autorisert personell, og enkelte universiteter, forskningsinstitusjoner og selskaper kan kreve anskaffelse av en "Radioactivity Use Permit". Materiale og avfall må håndteres i henhold til passende lokale prosedyrer, retningslinjer og lovgivning.
    1. Følg samme prosedyre som beskrevet i pkt. 2.1.2.
    2. Tilsett BSA (0,1 %), Na-Pyruvate (2 mM), D-mannitol (7 mM) og 2-deoksy-D-glukose (1 mM) til den gassede og pH-justerte KRH-bufferen.
    3. Tilsett [3H]2-deoksy-D-glukose (0,028 MBq/ml) og [14C]mannitol (0,0083 MBq/ml) i den ekstra krh-bufferen for å fullføre inkubasjonsmediet for glukoseopptak. Oppbevars ved 30 °C. Hvis [3H]2-deoksy-D-glukose og [14C]mannitol oppløses i etanol, fjern etanolet ved N2 mediert fordampning før bruk.
    4. For glukoseopptak inkubasjonsmediet som inneholder en submaksimalt effektiv insulinkonsentrasjon, tilsett 1 μL av en 100 mU / ml insulinbestandsoppløsning per ml glukoseopptak inkubasjonsmedier (100 μU / ml insulin).
    5. For glukoseopptak inkubasjonsmediet som inneholder en maksimal effektiv insulinkonsentrasjon, tilsett 1 μL av en 10 U / ml insulin lageroppløsning per ml glukoseopptak inkubasjonsmedier (10 ml / ml insulin).

3. Dyr og disseksjon av mussålen og EDL muskel for inkubasjon

MERK: Prosedyrer som involverer forskningsdyr bør utføres i samsvar med relevante retningslinjer og lokal lovgivning. Den beskrevne prosedyren kan brukes med interne avlet eller kommersielt tilgjengelige mannlige og kvinnelige mus med ulike stammer og genetisk bakgrunn. Følgende prosedyre er gitt for matet kvinnelige C57Bl / 6J mus. I gjennomsnitt var mus 19 uker gamle og veide 25 g. Musene ble opprettholdt på en 12:12 timers lys-mørk syklus med fri tilgang til standard gnager chow og vann. Dyreforsøk ble igangsatt ved ~ 9:00 lokal tid og alle dyr ble ofret innen en periode på 2 timer.

  1. Tilsett 4 ml forvarmede (30 °C) basale inkubasjonsmedier til hvert inkubasjonskammer og sørg for at basal inkubasjonsmediene kontinuerlig oksygeneres med 95% O2 og 5% CO2.
  2. Bedøv mus med intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (10 mg/100 g kroppsvekt) eller annen tilgjengelig anestesi (f.eks. tribromoetanol).
    MERK: Vær oppmerksom på at i noen land kan det være nødvendig med lisens til å håndtere pentobarbital og andre bedøvelsesmidler. Før muskel disseksjon kan initieres, anestesi av hvert dyr må være riktig indusert. For å sikre dette testes hale- og ben reflekser. For optimale resultater bør disseksjonen praktiseres godt for å unngå å skade musklene under fjerning.
  3. Plasser bedøvede mus utsatt på en disseksjonsbrett (f.eks. styrofoamlokk) og fest foran og bak poter etter behov ved hjelp av en nål.
  4. Fjern huden fra underbenet og sørg for at både akillessenen og kneleddet er synlige.
    1. For disseksjon av soleusmuskel, start med å feste en enkelt suturløkke til akillessenen. Sikre en pean tang til akillessenen distalt av suturløkken og kutt for å frigjøre sålen og gastrocnemius musklene fra poten. Skyv forsiktig pean tang over musen og dermed utsette soleus muskelen.
    2. Pin ned pean tang og plassere en andre sutur sløyfe rundt den proksimale senen av soleus muskelen. Deretter kutter du den proksimale senen og dissekerer soleus (inkludert de to vedlagte suturløkkene) fri for gastrocnemius muskel. Plasser raskt soleusmuskelen i inkubasjonskammeret ved å feste hver suturløkke til de respektive krokene.
  5. Fjern fascia som dekker m. tibialis fremre (TA) ved hjelp av tang. Hvis det gjøres riktig, bør distale sener i TA- og EDL-musklene være klare hvite og synlige; og skilt fra hverandre.
  6. Klipp den distale senen i TA-muskelen og disseker ut muskelen for senere analyser (f.eks. genotyping). Bruk tang, frigjør forsiktig EDL-muskelen fra det omkringliggende vevet, men la muskelen være intakt og ikke kutt senene. Plasser en suturløkke rundt den distale senen og en annen suturløkke rundt den proksimale senen til EDL.
  7. Deretter kutter du senene som frigjør EDL-muskelen med to vedlagte suturløkker og plasserer raskt muskelen i inkubasjonskammeret ved å feste hver suturløkke til de respektive krokene. For ikke å miste spenning under inkubasjon og spesielt under elektrisk indusert sammentrekning av soleus- og EDL-musklene, er det av stor betydning å fikse suturløkkene rundt senene med tette knuter.
  8. Til slutt, euthanize dyret ved f.eks Cervical dislokasjon.
  9. Når musklene har blitt dissekert og plassert i inkubasjonskamre, juster hvilespenningen til hver muskel til ~ 5 mN og inkuber musklene i minst 10 minutter før du starter den eksperimentelle protokollen.

4. Insulin-stimulert glukoseopptak i isolert mus skjelettmuskulatur

  1. Etter trinn 3.9 erstatte basal inkubasjonsmedier med inkubasjonsmedier som ikke inneholder insulin (basal inkubasjonsmedier), en submaksimalt effektiv insulinkonsentrasjon eller en maksimal effektiv insulinkonsentrasjon og la i inkubasjonskamrene i 20 minutter. Plass hvert inkubasjonskammer med 1 min, og dermed ta seg tid til etterfølgende høsting av muskler.
  2. På slutten av 20 min stimuleringsperioden, erstatt inkubasjonsmediet med glukoseopptak inkubasjonsmediet som inneholder en identisk konsentrasjon av insulin og la i inkubasjonskamrene i 10 minutter, igjen med 1 min avstand mellom hvert inkubasjonskammer.
  3. Etter 10 min inkubasjon i glukoseopptaket fjerner inkubasjonsmedier forsiktig muskler fra inkubasjonskamrene og vasker dem i iskalde basale inkubasjonsmedier. Tørk deretter musklene raskt på filterpapir før suturløkkene fjernes og musklene fryses i flytende nitrogen. Det er viktig at de inkuberte musklene høstes raskt hvis man også ønsker å undersøke ulike intracellulære metabolitter og proteinsignalering i tillegg til glukoseopptak.
  4. Samle 100 μL av glukoseopptaket inkubasjonsmedier fra hvert inkubasjonskammer og lagre det ved -20 °C. Mengden radioaktivitet i disse prøvene vil bli inkludert i beregningen av muskelglukoseopptak.

5. Sammentrekningsstimulert glukoseopptak i isolert mus skjelettmuskulatur

MERK: For å indusere sammentrekning av isolert mus skjelettmuskulatur bruk følgende protokoll: 1 tog / 15 s, hvert tog 1 s lang bestående av 0,2 ms pulser levert på 100 Hz. Imidlertid vil andre lignende protokoller som fremkaller sammentrekning av isolert mus skjelettmuskulatur sannsynligvis fungere også. Det er viktig at spenningen justeres for å generere maksimal kraftutvikling av den inkuberte muskelen, som er avhengig av det eksperimentelle oppsettet. Hvis dette ikke er sikret, kan du risikere at ikke alle fibre i muskelen trekker seg sammen. Dette kan igjen føre til skjevheter i datasettet.

  1. Etter trinn 3.9 plasser platinaelektrodene sentralt og på begge sider av musklene. Initier sammentrekning av musklene umiddelbart etter å ha erstattet basale inkubasjonsmedier med glukoseopptaket inkubasjonsmedier. Hvis det er mulig, plass til hvert inkubasjonskammer med 1 min, og dermed ta seg tid til den etterfølgende høstingen av muskler. Husk å registrere kraftproduksjon fra hver inkuberte muskel.
  2. Etter 10 min sammentrekning i glukoseopptak inkubasjonsmediet, fjern platinaelektrodene, samle forsiktig musklene fra inkubasjonskamrene og vask dem i iskalde basale inkubasjonsmedier. Tørk deretter musklene raskt på filterpapir før suturløkkene fjernes og musklene fryses i flytende nitrogen. Hele muskelhøstprosedyren skal utføres så fort som mulig.
  3. Samle 100 μL av glukoseopptaket inkubasjonsmedier fra hvert inkubasjonskammer og lagre det ved -20 °C. Mengden radioaktivitet i disse prøvene vil bli inkludert i beregningen av muskelglukoseopptak.

6. Skjelettmuskulatur homogenisering og behandling

MERK: Prosedyren nedenfor for muskelhomogenisering gjør det mulig å bestemme både glukoseopptak og myocellulær signalering ved vestlig blotting i samme sett med muskelprøver.

  1. Homogeniser hver muskel i 400 μL iskald buffer med pH 7,5 som inneholder 10% glyserol, 20 mM natriumpyrofosfat, 1% IGEPAL CA-630 (NP-40), 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (oppløst i isopropanol), 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 mM β-glyserofosfat, 10 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM etylendiamintetrakeatisk syre (EDTA), 1 mM glykoleterdiamintetraacetisk syre (EGTA), 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 3 mM benzamidin og 2 mM natrium-orthovanadate ved hjelp av stålperler og en vevslys (2 x 45 s ved 30 Hz). Roter alle homogenater ende-over-end i 1 t ved 4 °C, hvorpå de sentrifugeres ved 16 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Samle lysate (supernatant) som brukes til å bestemme muskel glukose opptak.

7. Bestemmelse av radiomerket 2-deoksyglucose og mannitol

  1. Tilsett 150 μL av hver muskellyse og 25 μL glukoseopptak inkubasjonsmedier fra hvert inkubasjonskammer for å skille flytende scintillasjonstelling av hetteglass som inneholder 2 ml flytende scintillasjonsvæske. Forbered dessuten to blinde kontrollhetter som bare inneholder 3 ml flytende scintillasjonsvæske. Lukk alle hetteglassene og bland grundig ved å virvelere hvert hetteglass i ca. 5 s.
  2. Plasser hetteglassene i en flytende scintillasjonsteller og mål radioaktivitet av [3H]2-deoksy-D-glukose og [14C]mannitol i henhold til produsentens retningslinjer. Registrer DPM (oppløsninger per minutt) for hvert flytende scintillasjonshette hetteglass.

8. Beregning av muskelglukoseopptakshastigheter

  1. Bruk lysatet fra trinn 6.1 til å måle den totale proteinkonsentrasjonen i hver muskelprøve ved hjelp av standard protein kvantifiseringsmetoder (f.eks. bicinchoninsyre eller Bradford-analyser). Beregn mengden protein (mg) som legges til hvert scintillasjonshette hetteglass.
    MERK: Hastigheten på glukoseopptaket for hver muskelprøve beregnes ved å trekke mengden [3H]2-deoksy-D-glukose som ligger i det ekstracellulære rommet fra den totale mengden [3H]2-deoksy-D-glukose i muskelprøven ved hjelp av [14C]mannitol som en ekstracellulær markør. Det antas at [3H]2-deoksy-D-glukose og [14C]mannitol viser lignende diffusjonsegenskaper i muskelvevet under inkubasjon. Utfør følgende beregninger:
  2. Begynn med å trekke fra [3H] og [14C] DPM for blindkontrollprøvene fra alle muskel- og medieprøver.
  3. Bestem muskelens ekstracellulære rom i μL (μL-ECS):
    [14C] DPMmuskel / ([14C]DPMmedia / Mvol)
  4. Beregn mengden [3H]DPM i ekstracellulært område for muskler ([3H]DPMECS):
    μL-ECS × ([3H]DPMmedia / Mvol)
  5. Beregn mengden [3H]DPM i muskelens intracellulære rom ([3H]DPMICS):
    [3H] DPMmuskel− [3H]DPMECS
  6. Beregn muskelglukoseopptakshastigheten (μmol / g protein / time):
    [3H] DPMICS / ([3H]DPMmedia / Mvol) / [2-deoksy-D-glukose])) / mg protein) / Th
    MERK: For alle ligningene ovenfor,
    [14C] DPMmuskel er mengden [14C]mannitol radioaktivitet i en muskelprøve;
    [14C] DPM-medier er mengden [14C]mannitolradioaktivitet i et medieeksempel.
    [3H] DPMmuskel er mengden av [3H]2-deoxy-D-glukose radioaktivitet i en muskelprøve;
    [3H] DPM-medierer mengden [3H]2-deoksy-D-glukoseradioaktivitet i en medieprøve.
    [3H] DPMECS er mengden [3H]2-deoksy-D-glukoseradioaktivitet i muskelens ekstracellulære rom;
    [3H] DPMICS er mengden [3H]2-deoksy-D-glukoseradioaktivitet i muskelens intracellulære rom;
    μL-ECS er muskelen ekstracellulær plass i μL;
    Mvol er volumet (μL) av inkubasjonsmedier som brukes til scintillasjonstelling (f.eks. '25' som nevnt ovenfor);
    Th er tidsfaktoren som brukes til å beregne opptakshastigheter per time (dvs. '1/6' ved inkubering av muskler med glukoseopptaksmedier i 10 minutter)
  7. Ta hensyn til denne eksempelberegningen. DPMfor de blinde kontrollprøvene (henholdsvis 17 og 6) er trukket fra DPM-verdiene som er nevnt nedenfor.
    [14C] DPMmuskel: 343
    [14C] DPM-medier: 11846
    [3H] DPMmuskel: 4467
    [3H] DPM-medier: 39814
    Mvol: 25
    mg protein: 0,396 (i 150 μL muskelprotein lysat)
    [2-deoksy-D-glukose]: 1 (mM)
    Th: 1/6 (t)
    μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0,724 μL
    [3H] DPMECS: 0,724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
    [3H] DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
    Glukoseopptak: ((3314 DPM / (39814 DPM / 25 μL) / 1 mmol/L) / 0,396 mg protein) / (1/6 time) = 31,53 μmol / g protein / time

9. SDS-PAGE og vestlige blotanalyser

  1. Forbered soleus og EDL muskel lysater i Laemmli buffer og varme i 5 min ved 96 °C.
  2. Skill like mengder muskelprotein ved SDS-PAGE på selvstøpte geler og overfør proteinene til polyvinyllidfluoridmembraner ved semidry blotting.
  3. Deretter inkuberes membraner i Tris-bufret saltvann som inneholder 0,05% Tween 20 og 2% skummet melk og sondemembraner med relevante primære og sekundære antistoffer.
  4. Oppdag proteiner med chemiluminescens og visualiser dem ved hjelp av et digitalt bildebehandlingssystem.

10. Muskelglykogen, nukleotider, laktat, kreatin og fosfokreatin

  1. Bruk perklorsyre til å trekke ut EDL- og soleusmuskelprøver.
  2. Deretter nøytraliserer du prøver og analyserer dem for laktat, kreatin og fosfokreatin som tidligere beskrevet18.
  3. Analyser nukleotidinnhold i EDL og soleusmuskel ved omvendt fase HPLC etter ekstraksjon i perklorsyre.
  4. Bestem muskelgllykogeninnhold i hele muskelhomogenat som glykosylenheter etter syrehydrolyse ved en fluorometrisk metode som tidligere beskrevet18.

11. Statistikk

  1. Utføre statistiske analyser med statistisk analyseprogramvare.
  2. Bruk en toveis test av variansanalyse (ANOVA) til å vurdere statistiske forskjeller mellom verdier som presenteres i tabell 1.
  3. Bruk uparrede Student t-tester for å vurdere statistiske forskjeller i glukoseopptak mellom EDL og soleus i hver gruppe presentert i figur 2. Presentere data på samme måte som ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM). P < 0,05 regnes som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som vist i figur 2 var basalglukoseopptaksratene like mellom isolert soleus og EDL-muskel fra kvinnelige mus. Dette er også rapportert flere ganger før 12.13.19.20. Glukoseopptaket økte med henholdsvis ~0,8 og ~0,6 ganger 12 og 9 μmol/g protein/t i soleus- og EDL-muskel, som svar på en submaksimalt effektiv insulinkonsentrasjon (100 μU/ml). Denne økningen var enda høyere (~ 4 og ~ 2 ganger når henholdsvis 33 og 19 μmol / g protein / t i soleus og EDL muskel) når musklene ble stimulert med en maksimal effektiv insulinkonsentrasjon (10 mU / ml). Videre var både submaksimal og maksimal insulinstimulert glukoseopptak betydelig høyere i soleusmuskelen, noe som indikerer at soleusmuskelen viser forbedret insulinfølsomhet og respons sammenlignet med EDL-muskel. Dette kan være relatert til det høyere uttrykket av glukosetransportøren 4 (GLUT4) samt insulinsignalerende transduserprotein kinase B (Akt) i soleusmuskulatur sammenlignet med EDL muskel 10,21,22,23,24.

Sammentrekningsindusert glukoseopptak var signifikant høyere i EDL-muskel sammenlignet med soleusmuskel (figur 2) som også tidligere rapporterte13,19. Dermed økte glukoseopptaket med ~ 2 og ~ 2,5 ganger når 14 og 22 μmol / g protein / t i henholdsvis soleus og EDL-muskel som svar på elektrisk induserte sammentrekninger. Figur 3 viser maksimal muskelkraftproduksjon i soleus og EDL-muskel i løpet av 10 min stimuleringsperioden. Sett og tidligere rapportert19, genererer EDL-muskelen mer kraft (225 mN i EDL vs. 150 mN i soleus) i den første delen av stimuleringsperioden. På den annen side viser EDL-muskelen en raskere nedgang i kraftproduksjonen sammenlignet med soleusmuskelen senere i stimuleringsperioden. Disse funnene skyldes sannsynligvis forskjellen i fibertypefordeling mellom soleus (type 1 > type 2) og EDL (type 2 > type 1) muskel25 som type 2 fibre genererer mer kraft, men tretthet raskere sammenlignet med type 1 fibre26,27.

For å evaluere effekten av insulin og sammentrekning på intracellulær signalering i isolert soleus og EDL muskel, fosforylering av Akt Thr308, TBC1 domene familiemedlem 4 (TBC1D4) Ser588, AMPKα Thr172 og acetyl-CoA karboksylase (ACC) Ser212 ble utført av den vestlige blottingsteknikken (figur 4). Som forventet induserte den submaksimalt og maksimalt effektive insulinkonsentrasjonen en økning i fosforylering av Akt Thr308 og TBC1D4 Ser588 mens sammentrekning induserte en økning i fosforylering av AMPKα Thr172 og ACC Ser212. Verken insulin eller sammentrekning førte til en endring i det totale proteininnholdet i Akt2, TBC1D4, AMPKα2 og ACC i soleus og EDL muskel (figur 4).

Ved å undersøke ulike markører for metabolsk levedyktighet av inkubert soleus og EDL-muskel, observerte vi en total reduksjon i nivåene av adenosinkjerner (ATP, ADP, AMP) (~ 15-25%) samt kreatin (~ 10-35%) uavhengig av om musklene ble inkubert i nærvær av pyruvat eller glukose sammenlignet med ikke-inkuberte muskler (tabell 1 ). På den annen side ble nedgangen i glykogennivåer observert i soleus og EDL-muskler inkubert med pyruvat forhindret hvis musklene ble inkubert med glukose. Interessant skjønt, vi observerte at inosin monofosfat (IMP) nivåer økte flere ganger, men bare i inkubert soleus muskel. IMP nivåer vanligvis øke i muskel under alvorlig metabolsk stress som muskelen forsøker å hindre AMP akkumulering ved å konvertere AMP til IMP for å opprettholde ATP / ADP forholdet28. Dette indikerer at soleusmuskelen er noe mer metabolsk stresset sammenlignet med EDL-muskelen under inkubasjon. Denne forestillingen støttes også av funn av forhøyet AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering i soleusmuskelen inkubert med pyruvat (figur 5). Viktigst, den observerte økningen i IMP-nivåer samt AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering reduseres når soleusmuskelen inkuberes med glukose. Derfor virker det fordelaktig å inkubere isolert skjelettmuskulatur i en glukoseholdig buffer for å minimere svingninger i adenosinkjerner og forhindre en dråpe muskelgllykogen når musklene inkuberes i en lengre periode. Når det gjelder 2-deoksyglucoseopptak, har vi bevis som tyder på at inkubering av muskler i 6 til 8 timer i nærvær av pyruvat vil øke basal / hvilende glukoseopptakshastigheter. Inkubering av muskler i et medium som inneholder glukose ser ut til å forhindre en slik økning i glukoseopptaket (upubliserte data).

Figure 1
Figur 1: Inkubasjonssystem. (A) Myografisystem med fire enkle inkubasjonskamre. (B) Tilpassede inkubasjonskroker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Glukoseopptak i isolert moden skjelettmuskulatur fra mus. 2-deoksyglucoseopptak ble bestemt i isolerte soleus (svarte stenger) og EDL (grå barer) muskler som svar på en submaksimalt effektiv insulinkonsentrasjon (100 μU/ml), en maksimal effektiv insulinkonsentrasjon (10 mU/ml) og elektrisk induserte sammentrekninger (0,2 ms puls, 100 Hz, 1 s/15s, 30 V, 10 min). Data ble analysert av studenter t-prøve i hver gruppe. ###p<0.001, ##p<0.01 vs. soleus muskel. Verdier er betyr ± SEM. n = 4-6 per gruppe. h, time. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Muskelkraftkurver som svar på elektrisk induserte sammentrekninger. Peak force produksjon under elektrisk stimulering ble beregnet for soleus (svarte prikker) og EDL (grå prikker) muskel. Hver enkelt verdi tilsvarer et gjennomsnitt på de siste 500 ms av hver 1-s stimuleringsperiode. Verdier er betyr ± SEM. n = 5-6 per gruppe. s, andre. mN, milli-Newton. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative vestlige flekker av Akt Thr308, TBC1D4 Ser588, AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering samt Akt2, TBC1D4, AMPKα2 og ACC-protein. Vestlige flekkanalyser ble utført på musesålen og EDL muskelprøver beskrevet i figur 2. B, basal. S, submaksimalt effektivt insulin. M, maksimalt effektivt insulin. C, sammentrekning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative vestlige flekker av AMPKα Thr172 og ACC Ser212 fosforylering samt AMPKα2- og ACC-protein. Vestlige flekkanalyser ble utført på musesålen og EDL muskelprøver beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

ikke-inkubert Inkubert 1t med pyruvat Inkubert 1t med glukose Hovedeffekter Interaksjon
Soleus EDL Soleus EDL Soleus EDL
Laktat 1,00 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,96 ± 0,03 0,98 ± 0,02 1.05 ± 0.01 0,99 ± 0,01 - -
Cr 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,06 0,64 ± 0,07 ### 0,76 ± 0,05 ### 0,76 ± 0,07 ## 0,88 ± 0,09 ## p < 0,001 -
PCr 1.00 ± 0.19 1,00 ± 0,06 0,80 ± 0,12 1.13 ± 0,14 0,65 ± 0,31 0,75 ± 0,08 - -
PCr/(Cr + PCr) 1,00 ± 0,20 1,00 ± 0,07 1.17 ± 0.11 1.25 ± 0.12 0,78 ± 0,36 0,92 ± 0,11 - -
ATP 1,00 ± 0,03 1,00 ± 0,02 0,72 ± 0,03 ###,§§§ 0,99 ± 0,03 * 0,81 ± 0,06 ### 0,85 ± 0,04 ## - p < 0,001
ADP 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,04 0,75 ± 0,05 ### 0,92 ± 0,03 ### 0,84 ± 0,04 ## 0,86 ± 0,03 ## p < 0,001 -
AMP 1.00 ± 0.11 1.00 ± 0.12 0,85 ± 0,15 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,18 0,75 ± 0,13 - -
SKØYER 1.00 ± 0.17 1.00 ± 0.30 4.43 ± 0.67 ###,§§§ 0,72 ± 0,29 3.33 ± 1.25 ##,§ 1.08 ± 0.01 - p < 0,001
AMP/ATP-forhold 1.00 ± 0.12 1.00 ± 0.13 1.18 ± 0.22 0,81 ± 0,16 1.06 ± 0,23 0,90 ± 0,19 - -
Glykogen 1,00 ± 0,08 1.00 ± 0.12 0,74 ± 0,07 (#),* 0,80 ± 0,12 (#),* 1.12 ± 0,10 1.10 ± 0,03 p = 0,035 -
pAMPK Thr172 / AMPKα2 1.00 ± 0.10 1.00 ± 0.12 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ 1,55 ± 0,27 1.68 ± 0.19 # 1.36 ± 0.19 - p = 0,002
pACC Ser212 / ACC 1,00 ± 0,18 1.00 ± 0.12 2.22 ± 0.58 ###,**,§§ 0,96 ± 0,21 0,99 ± 0,15 0,83 ± 0,09 - p = 0,030

Tabell 1: Sammenligning av metabolsk levedyktighet av mus soleus og EDL muskler inkuberes i 1 time i nærvær av 2 mM pyruvat eller 5 mM glukose. Ikke-inkuberte muskler ble dissekert fra bedøvede og matet dyr før de ble frosset i flytende nitrogen. Separate muskler ble inkubert i 1 time i KRH-buffer supplert med BSA (0,1 %), Na-pyruvat (2 mM) og D-mannitol (8 mM), mens andre ble inkubert i 1 t i KRH-buffer supplert med BSA (0,1 %), D-glukose (5 mM) og D-mannitol (5 mM) før de ble frosset i nitrogen. Data ble konvertert til relative enheter for å markere observerte endringer i ulike markører for metabolsk levedyktighet. Absolutte verdier fra ikke-inkubert mus soleus og EDL muskler er gitt nedenfor. Laktat (mmol/kg m.w): 137,53soleus; 139.05EDL. Cr (mmol/kg m.w): 9,35soleus; 8.98EDL. PCr (mmol/kg m.w): 1,50soleus; 5.20EDL. PCr/(PCr+Cr): 13,98soleus; 37.30EDL. ATP (mmol/kg m.w): 3,07soleus; 4.24EDL. ADP (mmol/kg m.w): 0,60soleus; 0,51EDL. AMP (mmol/kg m.w): 0,18soleus; 0,08EDL. IMP (mmol/kg m.w): 0,07soleus; 0.14EDL. AMP/ATP-forhold: 0,06soleus; 0.02EDL. Glykogen (pmol/μg protein): 77,01soleus; 67.56EDL. Data ble analysert av en toveis ANOVA i hver gruppe. ###p<0.001, ##p<0.01 og #p<0.05 vs. ikke-inkubert. p<0,001, **p<0,01 og *p<0,05 vs inkubert 1 time med glukose. §§§p<0.001, §§p<0.01 og §p<0.05 vs EDL. Verdier er midler ± SEM. n = 12 i ikke-inkubert gruppe, n = 4-6 i inkuberte grupper. Cr, Kreatin; PCr, Fosfokreatin; w.w, våt vekt; h, time.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intakt regulering av glukoseopptak i skjelettmuskulatur er viktig for å bevare den generelle helsen1. Dermed fungerer undersøkelse av muskelglukoseopptak ofte som en primær avlesning når man vurderer ulike helseforandrende intervensjoner. Her beskriver vi en ex vivo-metode for måling av glukoseopptak i isolert og inkubert soleus og EDL-muskel fra mus som respons på insulin og elektrisk induserte sammentrekninger. Metoden er rask og pålitelig og tillater en presis kontroll av det omkringliggende miljøet i den inkuberte muskelen som tillater nøyaktige undersøkelser av muskelglukoseopptakshastigheter isolert fra den potensielt forvirrende påvirkningen av hormoner og substrater som finnes i blodet. Metoden har vært brukt i flere år i mange studier og er allment vedtatt av muskelforskningssamfunnet.

Ex vivo inkubasjonsmodellen har generelt blitt ansett som en metode for å vurdere glukosetransportkapasitet i stedet for glukoseopptak i skjelettmuskulatur. Glukosetransportkapasitet i inkubert muskel kan bestemmes ved å måle akkumulert D-glukose over en periode. Dette utgjør imidlertid et problem da D-glukose raskt metaboliseres i muskelcellen etter opptak. For å omgå dette problemet har glukoseanalogen 3-O-Methyl-D-glukose (3-MG) blitt mye brukt til å vurdere glukosetransportkapasitet, da 3-MG ikke metaboliseres ytterligere inne i cellen etter å ha blitt transportert over celleoverflatemembranen. Dermed fungerer den opprinnelige frekvensen av intracellulær akkumulert 3-MG som en indeks over cellulær glukosetransportkapasitet i seg selv fordi den ikke påvirkes av andre trinn i glukosemetabolismen. Bruk av 3-MG kan imidlertid utgjøre et problem, da 3-MG vil akkumuleres og dermed redusere transmembrangradienten for 3-MG og deretter redusere ytterligere opptak. For å oppnå et mål på membrantransportkapasiteten må dermed starthastigheten på 3 MG-opptaket estimeres. Spesielt når transportkapasiteten er høy, kan dette utgjøre et problem på grunn av efflux på 3-MG fra muskelen29,30. Det potensielle problemet med 3 MG efflux kan unngås ved bruk av 2-deoksy-D-glukose (2-DG). Etter transport til skjelettmuskulatur, er 2-DG fosforylatert av hexokinase II til 2-deoksy-D-glukose-6-fosfat (2-DG-6P). Siden skjelettmuskulaturen mangler glukose-6-fosfor og GLUT4 ikke kan transportere fosforilert 2-DG, vil 2-DG-6P bli fanget i muskelcellen. I motsetning til glukose-6-fosfat er 2-DG-6P en svært svak allosterisk hemmer av hexokinase II30 som bidrar til å opprettholde transmembrangradienten for 2-DG. Observasjoner har således vist at 2-DG-opptak i inkubert (rotte) muskel forblir lineær til den intracellulære 2-DG-6P-konsentrasjonen overstiger 30 mM, en konsentrasjon som senker hexokinase II aktivitet30. Videre, i inkubert mus skjelett muskel 2-DG opptak forblir lineær i ~ 30 min når temperaturen på inkubasjon buffere er 37°C eller mindre31. Dette antyder at 2-DG kan brukes til å måle glukosetransportkapasitet i stedet for glukoseopptak i inkubert muskel, bortsett fra situasjoner der 2-DG-6P-konsentrasjoner blir svært høye (f.eks. observert under inkubasjoner >2 timer med 1 mM 2-DG og en maksimal insulinkonsentrasjon29,30). Ideen om at 2-DG-opptak sannsynligvis gjenspeiler glukosetransportkapasitet støttes også av funn som viser at maksimal insulinstimulert 2-DG-opptak er lik i inkubert muskel fra villtype mus og mus som overekspresserer hexokinase II32. En potensiell bekymring ved bruk av 2-DG for muskelglukosetransportmålinger under sammentrekning er en økning i den intracellulære glukose-6-fosfatkonsentrasjonen på grunn av en forhøyet glykogenolyse. Men siden en lineær økning i (rotte) muskel 2-DG opptak observeres under sammentrekning over tid29, dette indikerer at akkumulering av glukose-6-fosfat fra nedbrytning av glykogen under sammentrekning ikke forstyrrer hexokinase II aktivitet og dermed 2-DG opptakshastigheter. Basert på dette virker 2-DG godt egnet for målinger av glukosetransport i isolert skjelettmuskulatur under insulin og sammentrekning med tanke på begrensningene til 3-MG.

Selv om det generelt antas at 2-DG ikke er ytterligere metabolisert etter fosforylering av hexokinase II, har det blitt rapportert at noen 2-DG er rettet mot og innlemmet i muskelgllykogen. Således, under en 2 h normoglykemisk hyperinsulinemic klemme hos rotter ~ 30% av 2-DG tatt opp av skjelettmuskulaturen er innlemmet i glykogen33. Derfor kan det begrunnes at insulinstimulerte 2-DG-opptak i inkubert skjelettmuskulatur undervurderes hvis akkumulering av 2-DG i glykogen blir neglisjert. Vi har fastslått at den heri beskrevne protokollen om hvordan du forbereder muskellytter (supernatant) for etterfølgende analyser av 2-DG-opptaksrater i tidligere inkubert skjelettmuskulatur, ikke påvirkes av potensiell inkorporering av 2-DG i glykogen. Det kan hevdes at glykogen akkumuleres i pellets når sentrifugerer hele muskelhomogenat for å generere lysat for 2-DG opptaksmålinger. Men når vi sammenligner nivåene av radioaktivitet i insulin-stimulert hel muskel homogenat vs. lysat, oppdager vi ingen signifikant forskjell (upubliserte data). Dette antyder at inkubering av musemuskel i 10 min i 1 mM 2-DG ikke forårsaker en påviselig akkumulering av 2-DG i glykogen.

Bestemmelse av skjelettmuskulatur 2-DG opptak uten å vurdere at 2-DG fordeles i både ekstra- og intracellulær plass vil føre til en overestimering av 2-DG opptak. For å omgå dette, bør L-glukose brukes som en ekstracellulær markør, da dette ikke transporteres over cellemembranen, men ellers viser lignende egenskaper som D-glukose inkludert masse, løselighet, passiv diffusjon, binding, etc. På grunn av de overdrevne kostnadene ved produksjon og dermed innkjøp av L-glukose, brukes mannitol vanligvis som en ekstracellulær markør siden mannitol ikke tas opp av muskelcellen, er relativt billig og anslås å ha et noe lignende ekstracellulært distribusjonsvolum som glukose og 2-DG34.

Iboende cellulære og molekylære klokker synes å spille en viktig rolle for regulering av hele kroppen metabolisme og energi homeostase35. Det har blitt observert at muskelspesifikk knockout av kjerneklokkegenet Bmal1 svekker insulinstimulert glukoseopptak i isolert mus skjelettmuskulatur36. Videre viser submaksimalt insulinstimulert glukoseopptak av isolert skjelettmuskulatur døgnrytme med den laveste og høyeste insulinresponsen midt i den lyse og mørke fasen, henholdsvis37. Basert på disse funnene er det derfor viktig å innlemme tid for dyreoffer i eksperimentell design for å øke reproduserbarheten av data.

En stor ulempe ved ex vivo-metoden er mangelen på kapillærstrømning i den isolerte muskelen. Dette betyr at levering og fjerning av ulike substrater fullt ut avhenger av enkel diffusjon mellom muskelfibrene og omgivelsene. Følgelig har validering av metabolsk levedyktighet av isolert muskel inkubert ex vivo vært fokusert på diffusjonsbegrensninger av oksygen til overfladiske så vel som dype muskelfibre. Dermed har inkubert muskel, spesielt svært metabolsk musemuskel, en tendens til å utvikle hypoksiske kjerner der nedbrytning av glykogen forekommer 16,17,38. I en detaljert gjennomgang av Bonen og kolleger15 ble det antydet at hypoksiske kjerner av inkubert muskel sannsynligvis utvikler seg når du inkuberer muskler for tykke til å bli riktig oksygenert, spesielt når du inkuberer ved temperaturer på ≥ 37 °C. Dette førte til anbefalingen om at bare tynne og sylindriske musemuskler, som soleus og EDL, bør brukes til inkubasjoner ved 25-30 °C for å unngå utvikling av hypoksiske kjerner. Dette indikerer at tykkelse og geometri i stedet for masse er viktige faktorer å vurdere når du inkuberer mus skjelettmuskler. I tillegg ble det anbefalt at inkubasjonstemperatur, muskeltykkelse samt ATP, fosfokreatin og glykogeninnhold og/eller frigjøring av laktat bør måles og rapporteres rutinemessig for å evaluere levedyktigheten til den inkuberte muskelen15. Så vidt vi vet er slike komplette analyser av inkubert muskel hovedsakelig rapportert for rottemuskel 39,40,41,42 og bare i begrenset grad rapportert for musemuskel16,17. For å øke innsikten i ulike metabolske markører av levedyktighet i inkubert mus skjelettmuskulatur, vurderte vi mulige endringer i intracellulært innhold av laktat, kreatin, fosfokreatin, adenosinkjerner, glykogen og AMPK-signalering i soleus og EDL-muskel etter 1 time inkubasjon i glukose- eller pyruvat-supplert KRH-buffer. I likhet med tidligere funn i inkubert mus soleus og EDL muskel17, observerte vi at glykogennivået ble redusert når musklene ble inkubert i glukosefrie medier. Dette indikerer at fraværet av glukose under inkubasjon fremmer glykogennedbrytning og den påfølgende innføringen av glukose-6-fosfat i glykolyse som kan virke for å sikre ATP-produksjon spesielt hvis oksygentilførselen er utilstrekkelig. Videre fant vi en samlet reduksjon i ATP og ADP nukleotid bassenger i inkubert soleus og EDL muskel. Dette kan innebære at oksygentilførselen ikke er helt tilstrekkelig til å møte etterspørselen etter inkubert musemuskel både i nærvær og fravær av glukose. Siden den oksidative soleusmuskelen er mer avhengig av oksygen for ATP-produksjon sammenlignet med glykolytisk EDL-muskel, vil dette antyde at soleusmuskelen i større grad påvirkes av inkubasjonsprosedyren. Etter avtale fant vi at de intracellulære nivåene av IMP samt AMPK-signalering ble markert økt i soleus sammenlignet med EDL-muskel når de inkuberes i fravær av glukose. Dette betyr at soleusmuskelen viser en høyere grad av metabolsk stress under inkubasjon, som må tas i betraktning når du vurderer data fra ex vivo musmuskelmodellen.

Kultivert muskelceller inkludert udødeliggjort L6 og C2C12 samt primære menneskelige myotubes brukes ofte som surrogat for moden skjelettmuskulatur for å studere effekten av ulike genetiske og farmakologiske manipulasjoner på insulinstimulerte muskelglukoseopptak. Men på flere måter ligner ikke dyrkede muskelceller moden skjelettmuskulatur, og når man sammenligner de to modellsystemene, blir mange forskjeller tydelige. Disse inkluderer forskjeller i proteinuttrykk, dimensjonsstruktur, omkringliggende miljø, spredning og differensieringstilstand, fibertypesammensetning, metabolske prosesser og funksjonelle egenskaper43 som alle kan påvirke hvordan muskelcellen regulerer glukoseopptak som respons på ulike stimuli. Vanligvis observeres større relative effekter av insulin på glukoseopptakshastigheter i modne skjelettmuskulatur sammenlignet med dyrkede muskelceller44 , noe som kan indikere at dyrkede muskelceller til en viss grad mangler maskineriet som er ansvarlig for å regulere glukoseopptakshastigheten, inkludert et høyt uttrykksnivå for den insulinfølsomme glukosetransportøren GLUT443 . Tatt i betraktning begrensningene og forbeholdene forbundet med bruk av enten dyrkede muskelceller og isolert skjelettmuskulatur, er det derfor sannsynlig at det er fordelaktig å ta på seg en kombinert tilnærming når man studerer ulike muskelmetaboliske prosesser som glukoseopptak.

Soleus- og EDL-muskler anses vanligvis som representative for henholdsvis langsomme og raske muskler. Derfor er disse muskeltypene ideelle for mekaniske studier som søker å undersøke intervensjoner som påvirker muskelkraft og tretthetsutvikling. Videre er soleus muskel vanligvis rapportert å ha forbedret insulin følsomhet og respons sammenlignet med EDL muskel og dermed intervensjoner som er rettet mot muskel insulin følsomhet kan påvirke soleus og EDL annerledes. I tillegg varierer den relative fordelingen av de forskjellige AMPK-kompleksene mellom soleus- og EDL-muskelen som ser ut til å påvirke ampk-aktiveringsforbindelsenes evne til å øke muskelglukoseopptaket. Dermed oppnås den største innsikten i reguleringen av muskelglukoseopptak hvis både soleus- og EDL-musklene brukes under eksperimentering med ex vivo inkubasjonsmodellen.

Den heri beskrevne metoden relaterer glukoseopptak til mengden av total protein overflod bestemt i hver muskelprøve etter homogenisering. Det er vår erfaring at variasjonen avtar når man relaterer glukoseopptak per mengde muskelprotein i stedet for muskelvekt (upubliserte data). Videre gjør homogenisering av muskelprøver i en buffer som brukes til ulike biokjemiske analyser det mulig å bestemme både glukoseopptak, myocellulær signalering og enzymaktiviteter i samme prøvepreparering 45,46. Dette vil ofte redusere mengden mus som brukes til en studie. Likevel kan glukoseopptak lett bestemmes i skjelettmuskulaturprøver som oppløses ved oppvarming i natriumhydroksid (NaOH) etterfulgt av nøytralisering med hydrogenklorid20. Siden behandling av muskler med NaOH forstyrrer målinger av total muskelproteinkonsentrasjon, må glukosetransport målt ved denne prosedyren være relatert til muskelvekt.

Basert på ulike optimaliseringer inneholder vår glukoseopptak inkubasjonsbuffer en spesifikk aktivitet på 0,028 MBq/ml [3H]2-deoksy-D-glukose og 0,0083 MBq/ml [14C]Mannitol. På den ene siden senker dette mengden lysat (150 av 400 μL) som trengs for å få tilstrekkelige og pålitelige radioaktivitetsmålinger. På den annen side øker det mengden radioaktiv [3H]2-deoksy-D-glukose og [14C]mannitol som trengs for hvert eksperiment, noe som øker eksperimentelle kostnader. For ethvert eksperimentelt oppsett er det derfor mulig å regulere mengden radioaktivitet som brukes i glukoseopptaket inkubasjonsmedier for å passe til spesifikke krav. Det må imidlertid utvises forsiktighet for ikke å redusere mengden radioaktivitet i inkubasjonsbufferen i en grad som gjør målinger av radioaktivitet upålitelige. Dette sikres ved å holde radioaktivitet i prøver høyere enn de angitte deteksjonsgrensene for væskeskrampetellingsmaskiner som brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Dansk råd for uavhengig forskning - Medical Sciences (FSS8020-00288B) og Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046). Dette arbeidet ble også støttet av et forskningsstipend til Rasmus Kjøbsted fra Det danske diabetesakademiet, som er finansiert av Novo Nordisk Foundation, tilskuddsnummer NNF17SA0031406. Forfatterne vil takke Karina Olsen, Betina Bolmgren og Irene Bech Nielsen (Institutt for ernæring, trening og idrett, Det vitenskapelige fakultet, Københavns Universitet) for deres dyktige tekniske assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[14C]D-mannitol American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0127
[3H]2-deoxy-D-glucose  American Radiolabeled Chemicals, Inc. ART 0103A
2-Deoxy-D-glucose Sigma D8375
4-0 USP non-sterile surgical nylon suture Harvard Apparatus 51-7698
Streptavidin/HRP (Conjugate) DAKO P0397 Used to detect ACC protein
Akt2 antibody Cell Signaling 3063
AMPKα2 antibody Santa Cruz SC-19131
aprotinin Sigma A1153
benzamidine Sigma B6505
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
CaCl2 Merck 1020831000
Calibration kit (force) Danish Myo Technology A/S 300041
Chemiluminescence Millipore WBLUF0500
D-Glucose Merck 1084180100
D-Mannitol Sigma M4125
Data collection program National Instruments LabVIEW software version 7.1
Dialysis tubing Visking DTV.12000.09 Size No.9
Digital imaging system BioRad ChemiDoc MP
EDTA Sigma EDS E9884
EGTA Sigma E4378
Electrical Pulse Stimulator Digitimer D330 MultiStim System
Glycerol Sigma G7757
HEPES Sigma H7637
IGEPAL CA-630  Sigma I8896
Insulin Novo Nordisk Actrapid, 100 IE/mL
KCl Merck 1049361000
KH2PO4 Merck 104873025
leupeptin Sigma L2884
MgSO4 Merck 1058860500
Muscle Strip Myograph System Danish Myo Technology A/S Model 820MS
Na-Orthovanadate Sigma S6508
Na-Pyrophosphate Sigma 221368
Na-Pyruvate Sigma P2256
NaCl Merck 106041000
NaF Sigma S1504
NaHCO3 VWR 27778260
pACC Ser212 antibody Cell Signaling 3661
pAkt Thr308 antibody Cell Signaling 9275
pAMPK Thr172 antibody Cell Signaling 2531
phenylmethylsulfonylfluoride Sigma P7626
Platinum electrodes Danish Myo Technology A/S 300145
pTBC1D4 Ser588 antibody Cell Signaling 8730
Scintillation counter Perkin Elmer Tri-Carb-2910TR
Scintillation fluid  Perkin Elmer 6013329
Statistical analyses software Systat SigmaPlot version 14
TBC1D4 antibody Abcam ab189890
TissueLyser II  Qiagen 85300
Ultrapure water Merck Milli-Q Reference A+ System
β-glycerophosphate Sigma G9422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
  2. Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
  3. Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
  4. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  5. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
  6. Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
  7. Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
  8. Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
  9. Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
  10. Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
  11. Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
  12. Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
  13. Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
  14. Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
  15. Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
  16. van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
  17. Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
  18. Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
  19. Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
  20. Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
  21. Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
  22. Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
  23. Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
  24. Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
  25. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
  26. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  27. Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
  28. Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
  29. Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
  30. Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
  31. Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
  32. Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
  33. Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
  34. Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
  35. Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
  36. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
  37. Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
  38. Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
  39. Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
  40. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  41. Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
  42. Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
  43. Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
  44. Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
  45. Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
  46. Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).

Tags

Biologi Utgave 171 skjelettmuskulatur glukosetransport glukoseopptak insulinfølsomhet sammentrekning explant ex vivo in vitro inkubasjon radioaktive glukosesporere 2-deoksy-D-glukose
Måling av insulin- og sammentrekningstimulert glukoseopptak i isolert og inkubert moden skjelettmuskulatur fra mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, … More

Kjøbsted, R., Kido, K., Larsen, J. K., Jørgensen, N. O., Birk, J. B., Hellsten, Y., Wojtaszewski, J. F. P. Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice. J. Vis. Exp. (171), e61398, doi:10.3791/61398 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter