Summary
Abbiamo stabilito le condizioni per coltura delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dentare il giro del cervello adulto delle arvicole della prateria, come studio complementare in vitro, per analizzare le differenze dipendenti dal sesso tra nicchie neurogeniche che potrebbero far parte dei cambiamenti plastici funzionali associati ai comportamenti sociali.
Abstract
Le neurosfere sono aggregati cellulari primari che comprendono cellule staminali neurali e cellule progenitrici. Queste strutture 3D sono uno strumento eccellente per determinare il potenziale di differenziazione e proliferazione delle cellule staminali neurali, nonché per generare linee cellulari di quanto possa essere analizzato nel tempo. Inoltre, le neurosfere possono creare una nicchia (in vitro) che consente la modellazione dell'ambiente dinamico che cambia, come diversi fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori, tra gli altri. Microtus ochrogaster (prateria arvicola) è un modello unico per comprendere le basi neurobiologiche dei comportamenti socio-sessuali e della cognizione sociale. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questi comportamenti non sono ben noti. Il protocollo mira ad ottenere cellule progenitrici neurali dalle nicchie neurogeniche della prateria adulta, che sono coltivate in condizioni non aderenti, per generare neurosfere. Le dimensioni e il numero di neurosfere dipendono dalla regione (zona subventricolare o giro dentato) e dal sesso dell'arvicola della prateria. Questo metodo è uno strumento notevole per studiare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche in vitro e i cambiamenti di neuroplasticità associati a comportamenti sociali come il legame tra coppie e la cura biparentale. Inoltre, potrebbero essere esaminate le condizioni cognitive che comportano deficit nelle interazioni sociali (disturbi dello spettro autistico e schizofrenia).
Introduction
La prateria(Microtus ochrogaster),un membro della famiglia Cricetidae, è un piccolo mammifero la cui strategia di vita si sviluppa come specie socialmente monogama e altamente socievole. Sia i maschi che le femmine stabiliscono un legame duraturo di coppia dopo l'accoppiamento o lunghi periodi di convivenza caratterizzati dalla condivisione del nido, dalla difesa del loro territorio e dall'esposizione di cure biparentali per la loro progenie1,2,3,4. Pertanto, l'arvicola della prateria è un modello prezioso per comprendere le basi neurobiologiche del comportamento socio-sessuale e delle menomazioni nella cognizione sociale5.
La neurogenesi adulta è uno dei processi più importanti della plasticità neurale che porta a cambiamenti comportamentali. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riferito nelle arvicole maschili che la convivenza sociale con accoppiamento ha aumentato la proliferazione cellulare nella zona subventricolare (VZ) e nella zona subgranulare nel giro dentato (DG) dell'ippocampo, suggerendo che la neurogenesi adulta può svolgere un ruolo nella formazione del legame di coppia indotto dall'accoppiamento nelle arvicole della prateria (dati inediti). D'altra parte, sebbene le regioni cerebrali in cui vengono generati e integrati nuovi neuroni siano ben note, i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti in questi processi rimangono indeterminati a causa di inconvenienti tecnici nell'intero modellocerebrale 6. Ad esempio, le vie di segnalazione che controllano l'espressione genica e altre attività cellulari hanno un periodo di attivazione relativamente breve (rilevamento del fosfoproteoma)7. Un modello alternativo è le cellule staminali neurali adulte isolate e coltivate o le cellule progenitrici per chiarire i componenti molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta.
Il primo approccio per mantenere i precursori neurali in vitro del cervello di mammiferi adulti (topo) è stato il test delle neurosfere, che sono aggregati cellulari che crescono in condizioni non aderenti che preservano il loro potenziale multipotente per generare neuroni, così come gli astrociti8,9,10. Durante il loro sviluppo, c'è un processo di selezione in cui solo i precursori risponderanno a mitogeni come il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) per proliferare e generare neurosfere8,9,10.
A nostra conoscenza, nessun protocollo è riportato in letteratura per ottenere progenitori neurali adulti dalle arvicole della prateria. Qui, abbiamo stabilito le condizioni di coltura per isolare i progenitori neuronali dalle nicchie neurogeniche e il loro mantenimento in vitro attraverso il test di formazione della neurosfera. Pertanto, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e dei progenitori, processi che sono ancora sconosciuti nell'arvicola della prateria. Inoltre, chiarire le differenze in vitro nelle proprietà delle cellule derivate dalla VZ e dalla DG potrebbe fornire informazioni sul ruolo delle nicchie neurogeniche nella plasticità neurale associate ai cambiamenti nel comportamento socio-sessuale e nei comportamenti cognitivi e ai deficit nelle interazioni sociali (disturbo dello spettro autistico e schizofrenia), che potrebbero anche dipendere dal sesso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lo studio è stato approvato dal Comitato etico della ricerca dell'Instituto de Neurobiología, universidad nacional autónoma de México, Messico e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La riproduzione, la cura e gli endpoint umani degli animali sono stati stabiliti seguendo lo standard ufficiale messicano (NOM-062-Z00-1999) basato sul "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Legge generale sulla salute per la ricerca sanitaria) della Secretaria della Salute messicana.
1. Soluzioni e preparazione delle scorte
- Preparare un mezzo di coltura N2 con 485 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL di integratore N2 (100x), 5 mL di integratore di glutammina (100x) e 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x).
- Preparare un mezzo di coltura B27 con 480 mL di mezzo neurobasale, 10 mL di integratore B27 (50x), 5 mL di integratore di glutammina e 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x).
- Ricostituire la polvere di collagenasi in 1x PBS (soluzione salina tamponata da fosfati) per ottenere aliquote con un'attività di 100 unità/μL (1000x) e conservare a -20 °C. Nota, l'attività della collagenasi dipende dal numero di lotto delle aziende.
- Preparare le aliquote delle scorte di dispasi sciogliendo 5 mg di polvere dispasi in 1x PBS (50 mg/mL). Conservare a -20 °C.
- Preparare una soluzione enzimatica con 100 mL di mezzo DMEM-F12, 50 μL di collagenasi stock (100 unità/μL) per avere una concentrazione finale di 50 U/mL e 333 μL di dispasi stock (50 mg/mL) per avere una concentrazione finale di 0,33 mg/mL.
- Per preparare una soluzione di lavaggio, a 1.000 mL di 1x PBS, aggiungere 0,4766 g di HEPES (concentrazione finale 2 mM), 3,6 g di D-glucosio (concentrazione finale 20 mM) e 2,1 g di NaHCO3 (concentrazione finale 25 mM).
- Preparare aliquote di poli-L-ornitina (1 mg/mL) utilizzando acqua sterile e conservare a -20 °C.
- Preparare una soluzione funzionante di poli-L-ornitina. Diluire un'aliquota di stock (1mg/mL) in 49 mL di acqua sterile per una concentrazione finale di 20 μg/mL.
- Preparare una soluzione funzionante di laminina. Diluire 25 μL di laminina (1 mg/mL di stock originale) in 5 mL di acqua sterile per una concentrazione finale di 5 μg/mL.
NOTA: Dopo la preparazione, filtrare i mezzi di coltura, le soluzioni di lavoro e di magazzino per evitare la contaminazione. Utilizzare una siringa o filtri per vuoto bottle-top (membrana in polieteresolfone con una dimensione del poro di 0,2 μm). I supporti di coltura e le soluzioni di lavoro possono essere conservati fino a 30 giorni a 4 °C, mentre le scorte possono essere conservate fino a quattro mesi a -20 °C.
2. Preparazione prima di iniziare la microdisezione
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave o con uno sterilizzatore secco di perline di vetro caldo.
- Pulire la superficie della microdisezione in condizioni asettiche e antisettiche rigorose (ad esempio, con acqua ozonizzata).
NOTA: La tempistica della microdisezione di entrambe le nicchie neurogeniche da ogni cervello di arvicola è di circa 30 minuti. Si consiglia di lavorare con 1-4 animali per l'intera procedura.
3. Estrazione di tutto il cervello
- Anestetizzare l'arvicola adulta (12-16 settimane) con un sovradosaggio di pentobarbital (6,3 mg/animale) attraverso iniezione intraperitoneale. Verificare la profondità dell'anestesia dall'assenza di riflesso del pedale in risposta a un dito fermo.
- Una volta che l'arvicola è completamente anestetizzata, indurre l'eutanasia per decapitazione e recuperare la testa.
- Sezionare la pelle dal cranio con le forbici, facendo un'incisione caudale-rostrale (lunga 15 mm) per esporre il cranio.
- Tagliare le ossa occipitali e interparietali e rintracciare un'incisione nel cranio lungo le suture sagittali e parietali.
- Fai un buco nel cranio alla giunzione delle ossa frontali e parietali usando le forbici, facendo molta attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale.
- Per esporre il cervello, rimuovere i frammenti di cranio rimanenti che coprono entrambi gli emisferi cerebrali con pinzette appuntite.
- Utilizzare una spatola in acciaio inossidabile per sollevare l'intero cervello dalla base cranale.
- Raccogliere il cervello in un tubo di centrifuga (50 ml) con 20 ml di soluzione di lavaggio a freddo.
- Lavare il cervello due volte con la soluzione di lavaggio a freddo.
4. Microdisezione del tessuto neurale
- Posizionare una piastra di Petri su una superficie circondata da ghiaccio.
- Depositare il cervello sul piatto e aggiungere 20 mL di soluzione di lavaggio a freddo.
- Con un bisturi, nel piano coronale, dividere il cervello in due blocchi di tessuto (rostrale e caudale). Come riferimento neuroanatomonico, eseguire il taglio coronale a livello di Bregma nell'asse anteriore-posteriore11 (Figura 1A,linea continua).
- Dal blocco rostrale estrarre il tessuto VZ (Figura 1B), mentre dal blocco caudale rimuovere la DG (Figura 1C).
- Sezionare il VZ al microscopio stereo.
- Con una forza di Dumont, tenere uno degli emisferi; quindi, inserire, all'altezza del ventricolo, le punte fini di un secondo Dumont forza sotto il tessuto che rivestisce il caudato-putamen (Figura 2A).
- Aprire le forcep lungo l'asse dorsoventrale per separare il tessuto.
- Raccogliere il tessuto VZ per individuo in un tubo di centrifuga con 2 ml di soluzione di lavaggio a freddo. Non mettere in comune il tessuto di più di due animali.
- Ripetere la microdisezione nell'altro emisfero.
- Conservare il tubo contenente il tessuto VZ bilaterale sul ghiaccio e continuare a sezionare la DG.
- Sezionare la DG dal blocco caudale al microscopio stereo.
- Con un bisturi, fare un taglio coronale nel blocco per ottenere due fette, in cui si osserva la formazione ippocampale. Come punto di riferimento, il taglio viene effettuato a -2 mm di coordinate Bregma nell'asse anteriore-posteriore secondo l'atlante cerebrale del mouse11 (Figura 1A,linea tratteggiata e Figura 1C).
- Con una flessione Dumont, tenere una delle fette, e con forcep Dumont a punto fine fare un taglio orizzontale tra DG e CA1 e quindi eseguire un'incisione verticale tra la DG e CA3 per separare la DG (Figura 2B).
- Ripetere la dissezione nella prima fetta dell'altro emisfero.
- Ripetere la dissezione in entrambi gli emisferi nella seconda fetta.
- Raccogli i quattro pezzi DG di ogni arvicola in un tubo di centrifuga. Non mettere in comune il tessuto DG di più di due animali.
NOTA: Se è richiesta la dissezione di più di un animale, conservare i tubi di centrifuga con il tessuto VZ o DG sul ghiaccio continuando a sezionare il resto del cervello. Rimuovere tutti i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale durante la sezionazione. Se i vasi non vengono scartati, la coltura potrebbe essere mescolata con un eccesso di etitrociti e disturbare la formazione della neurosfera.
5. Isolamento delle cellule neurali
- Posizionare i tubi di centrifuga all'interno dell'armadio di biosicurezza e attendere circa 10 minuti che i frammenti di tessuto precipitino per gravità.
- Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml della soluzione enzimatica calda ad ogni tubo.
- Incubare i tubi a 37 °C per 10 minuti.
- Disintegrare i frammenti di tessuto; pipetta su e giù con una punta da 1 mL. Non pipettare più di 30x.
- Effettuare una seconda incubazione di 10 min a 37 °C.
- Alla fine della seconda incubazione, pipetta per rompere i tessuti. Non pipettare più di 30x.
NOTA: Dopo la pipettazione, i frammenti di tessuto devono essere completamente disintegrati; se non sono disintegrati, incubare per altri 10 minuti a 37 °C e ri-pipettare. Il periodo di digestione non deve superare i 30 minuti. - Aggiungere 9 ml di mezzo N2 per tubo per diluire il trattamento enzimatico.
- Centrifugare i tubi a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il supernatante e lavare con 10 mL di mezzo N2.
- Centrifuga alle stesse condizioni del passaggio 5.8.
- Rimuovere il supernatante da ciascun tubo e rimescolare i pellet cellulari del VZ e della DG rispettivamente in 2 mL e 1 mL del mezzo B27.
- Per rimuovere qualsiasi tessuto non disintegrato, filtrare ogni sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare (dimensione 40 μm).
6. Formazione di neurosfere
- Coltura le cellule passate attraverso il colino in un attacco ultra-basso, piastra da 24 pozzi. Utilizzare due pozzali per la VZ e un pozzo per la DG (1 mL di B27 medio/pozzo).
- Aggiungere 20 ng/mL di FGF2 e 20 ng/mL di FEG ad ogni pozzo (concentrazione finale 1x).
- Incubare a 37 °C, 5% CO2 e alta umidità (90-95%). Non disturbare per 48 ore (giorno 1 e giorno 2 di cultura, D1-D2).
- Il terzo giorno (D3), rimuovere metà del mezzo di coltura e sostituirlo con un mezzo B27 fresco (500 μL per pozzo) integrato con doppia concentrazione (2x) di fattori di crescita.
- Ripetere ogni terzo giorno, cambiare il mezzo di coltura (metà di esso) e sostituirlo con un nuovo mezzo B27 integrato con doppia concentrazione (2x) di fattori di crescita.
- Nei giorni in cui non è necessario cambiare il mezzo di coltura, aggiungere fattori di crescita a una concentrazione finale di 1x.
- Assicurarsi che le neurosfere si formano intorno al D8-D10.
- Al D10, cambiare il mezzo di coltura completo per rimuovere tutti i detriti.
- Raccogliere il mezzo e le neurosfere singolarmente di ogni pozzo in tubi di centrifuga.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Questa procedura consente alle neurosfere di precipitazioni per gravità.
- Rimuovere il supernatante e resuspend in 1 mL di mezzo B27 fresco integrato con fattori di crescita.
- Riposizionare le neurosfere nella stessa piastra di attacco ultra-bassa e incubare a 37 °C, 5% CO2.
- Da D10 a D15, continua a cambiare metà del mezzo e ad aggiungere fattori di crescita.
7. Passaggio delle neurosfere
- Al D15 della coltura primaria, raccogliere le neurosfere in tubi di centrifuga utilizzando pipetta da 1 ml. Tagliare la punta della pipetta per aumentare le dimensioni dell'apertura per evitare danni alle neurosfere.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Le neurosfere precipitano per gravità.
- Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 ml del mezzo di distacco cellulare per tubo.
- Incubare i tubi per 7 min a 37 °C.
- Pipetta su e giù con una punta da 1 mL per smantellare le neurosfere.
- Diluire il mezzo di distacco cellulare con 3 ml di mezzo B27 per tubo.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 200 x g.
- Scartare il supernatante e rimescolare ogni pellet cellulare con un mezzo B27 fresco integrato con fattori di crescita.
- Rimospendare le cellule derivate da VZ in 4 mL di medie e le cellule derivate da DG in 2 mL di mezzo.
- Coltura delle cellule (passaggio 1) in una nuova piastra di attacco ultra-bassa raddoppiando il numero di pozzi utilizzati nella coltura primaria (4 e 2 pozzi rispettivamente per VZ e DG).
- Cambia metà del mezzo ogni terzo giorno e aggiungi fattori di crescita ogni giorno.
- Dopo 10 giorni (D10) nel passaggio 1, cambiare le condizioni aderenti nel passaggio successivo.
8. Il passaggio in condizioni di adesione
- Prima di effettuare il passaggio 2, preparare piastre rivestite con poli-L-ornitina e laminina.
- Nelle piastre a 24 polietilene aggiungere 500 μL di 1x poli-L-ornitina (20 μg/mL) per pozzo. Incubare a 37 °C durante la notte.
- Rimuovere la poli-L-ornitina e lavare 4 volte con 1x PBS (500 μL/pozzo).
- Aggiungere 200 μL (volume minimo per coprire la superficie di un singolo pozzo) di 1 laminina (5 μg/mL) per pozzo e incubare per 2-3 h a 37 °C prima di coltivare le cellule.
- Raccogliere le neurosfere con pipetta da 1 ml con punte tagliate in un tubo di centrifuga.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per far precipitare le neurosfere per gravità.
- Scartare il supernatante e rimescolare le neurosfere in un mezzo B27 fresco senza fattori di crescita.
- Aspirare la laminina dalla piastra rivestita e depositare le neurosfere nei pozzi utilizzando pipette da 1 mL con punte tagliate.
NOTA: Evitare che i pozzi rivestiti si asciughino tra la rimozione della laminina e la placcatura delle neurosfere. - Dividere la cultura in due condizioni:
- Mantenere neurosfere differenziate per 6 giorni (D6). Cambia il mezzo ogni tre giorni e aggiungi fattori di crescita ogni giorno.
- Osservare la differenziazione delle cellule derivate dalla neurosfera di 12 giorni (D12). Cambia il mezzo ogni tre giorni senza fattori di crescita.
NOTA: Alla fine di D6 per condizioni di differenziazione indifferenziate o D12, le cellule possono essere utilizzate per l'immunoistochimica convenzionale, l'analisi di smistamento cellulare, la colorazione 5-etynyl-2'-deossiuridina (EdU), l'estrazione dell'RNA, tra gli altri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le neurosfere erano formate da cellule staminali neurali isolate dalla VZ e dalla DG di arvicole di prateria adulta sia femminile che maschile. Circa 8-10 giorni dopo aver iniziato la coltura, le cellule avrebbero dovuto formare le neurosfere. Si noti che la piastra può contenere detriti nella coltura primaria (Figura 3A). Tuttavia, nel passaggio 1 la coltura dovrebbe consistere solo di neurosfere (Figura 3B).
Un numero maggiore di neurosfere è stato ottenuto dalla VZ femminile rispetto al VZ maschile e dg sia delle femmine che dei maschi (Figura 4A). Questi dati suggeriscono che il numero di neurosfere ottenute dipende dalla zona proliferativa e dal sesso delle arvicole. Una volta apparse le neurosfere (D8-D10), sono state mantenute per altri sette giorni in cultura e la loro crescita è stata monitorata durante questo periodo. Il diametro delle neurosfere è stato misurato su D8, D11 e D14(tabella 1 e figura 4B). Le dimensioni (diametro) della neurosfera aumentarono progressivamente a seconda dei giorni di coltura per le arvicole maschili e femminili in entrambe le regioni neuronali. Le neurosfere derivate dal cervello maschile erano più piccole rispetto alle neurosfere derivate dal cervello femminile in entrambe le aree neurogeniche (Figura 4B).
Dopo 15 giorni di coltura primaria in condizioni galleggianti, le neurosfere sono state espanse nel passaggio 1 nelle stesse condizioni. Per il passaggio successivo 2, le cellule sono cresciute in coltura adesiva, anche se sono state in grado di aderire dal passaggio 1. Le neurosfere aderenti sono state caratterizzate al sesto giorno (D6) in presenza di fattori di crescita (condizione indifferenziata, figura 5A)o invece fino al giorno 15 (D15) senza fattori di crescita (condizione differenziata, figura 5B).
A D6 in condizioni di indifferenziazione, le cellule derivate dalla neurosfera hanno espresso la nedrina (un marcatore per i progenitori neurali) (Figura 6). Inoltre, è stato possibile identificare le cellule positive a doppiacortina (DCX) (cellule di migrazione) e il marcatore di proliferazione Ki67, che indicano la presenza di precursori neuronali o neuroni immaturi. Tuttavia, la mancanza di colocalizzazione di Ki67 con DCX suggerisce la presenza di neuroblasti postmitotici (Figura 7). Infine, a D15 in condizioni di differenziazione, sono stati trovati neuroni maturi (cellule positive MAP2), così come cellule con fenotipo gliale (cellule gfap-positive), che dimostra il potenziale di differenziazione delle cellule isolate (Figura 8).
Figura 1: Vista dorsale di un cervello adulto arvicola e delle sue regioni neurogeniche. (A) La linea solida a livello di Bregma era il riferimento anatomico per separare il cervello in due blocchi, rostrale e caudale. La linea tratteggiata era il riferimento per dividere il blocco caudale per ottenere due fette contenenti la DG. (B) Vista coronale delle regioni neuronali esposte con la prima incisione, dove si trova la VZ. (C) Vista coronale delle regioni anatomiche esposte con la seconda incisione, in cui si trova la DG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Riferimenti anatomici per la dissezione delle regioni neurogeniche. (A) Schema e fotografia della sezione coronale dal blocco rostrale che mostra la posizione VZ (linea tratteggiata). (B) Schema e fotografia della sezione coronale del blocco caudale che mostra la dissezione della DG. CPu, putamen caudato; V, ventricolo; VZ, zona ventricolare, DG, giro dentato; CA1 e CA3, regioni dell'ippocampo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Micrografie rappresentative della cultura delle neurosfere derivate da nicchie neurogeniche della prateria adulta. (A) Cultura primaria delle neurosfere isolate dal VZ delle arvicole femminili a D10. (B) Passaggio 1 delle neurosfere derivate dal VZ delle arvicole femminili a D10. Barre di scala = 200 μm. n= 3 per ogni regione neurogenica e sesso dell'arvicola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il numero e le dimensioni delle neurosfere dipendevano sia dal sesso che dalla fonte neurogenica. (A) Il numero di neurosfere nella cultura primaria ottenute da VZ e DG in arvicole sia femminili che maschili a D10. I dati sono stati analizzati con un ANOVA uni-way seguito da test post hoc di tukey. Differenze significative sono state riscontrate tra la VZ femminile e il resto dei gruppi, ***p<0.001. (B) Il diametro delle neurosfere in D8-D14 nella coltura primaria dipendeva dal sesso arvicola. I dati sono stati analizzati con un ANOVA a due modi seguito dai test post hoc di Tukey. I confronti all'interno dei gruppi (differenze all'interno dello stesso gruppo) hanno mostrato un aumento delle dimensioni della neurosfera tra D8 e D11 e D14 (*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001); e D11 vs D14 (+++ p<0.001) nel VZ e DG di arvicole femminili e maschili. Il confronto tra gruppi (differenze tra gruppi nella stessa regione) ha mostrato che le neurosfere VZ e DG femminili sono più grandi delle neurosfere maschili a D11 e D14. ### p<0.0001. La VZ è stata ottenuta da arvicole maschili e femminili (n=3, per gruppo). Sono state analizzate 15 neurosfere femminili e 10 maschili. La DG è stata ottenuta da arvicole maschili e femminili (n=3, per gruppo). Sono state elaborate 8 neurosfere femminili e 5 neurosfere maschili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini rappresentative delle neurosfere derivate dalla VZ femminile coltivate in condizioni di adesione nel passaggio 2. (A) Le neurosfere hanno aderito al passaggio 2 con fattori di crescita a D2. (B) Cellule derivate dalla neurosfera aderenti al passaggio 2 senza fattori di crescita a D10. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Espressione della nedrina nelle neurosfere. Immagini rappresentative, epifluorescenza-microscopia di cellule positive alla nenina derivate dalla VZ del cervello adulto sia femminile che maschile allo stadio indifferenziato. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Espressione di DCX e Ki67 nelle neurosfere. Immagini rappresentative di epifluorescenza-microscopia di cellule DCX-, Ki67-positive e fusione derivate dal VZ del cervello femminile e maschile adulto allo stadio indifferenziato. Barre di scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Espressione di MAP2 e GFAP nelle neurosfere. Immagini rappresentative, di epifluorescenza-microscopia di cellule positive MAP2 (neuroni maturi) e GFAP (cellule gliali) derivate dal VZ del cervello femminile adulto e maschile nella fase differenziata. Barre di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dimensioni delle neurosfere (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Giorni di cultura | Sesso | SD ± medio | Giorni di cultura | Sesso | SD ± medio |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5±15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 | F | 217,3±35,7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71.8±14.4 | ||
| D14 | F | 306.6±44.4 | D14 | F | 243.8±37.4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
Tabella 1: Quantificazione della dimensione media (diametro) delle neurosfere isolate dalle nicchie neurogeniche nella coltura primaria. Differenze significative sono indicate nella figura 4. La VZ è stata ottenuta da arvicole maschili e femminili (n=3, per gruppo). Sono state analizzate quindici neurosfere di femmine e dieci maschi. La DG è stata ottenuta da arvicole maschili e femminili (n=3, per gruppo). Sono state elaborate otto neurosfere femminili e cinque neurosfere maschili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uno stadio per ottenere una coltura di cellule staminali neurali è il periodo di digestione con la soluzione enzimatica, che non dovrebbe superare i 30 minuti perché potrebbe diminuire la vitalità cellulare. Le neurosfere dovrebbero emergere a 8-10 giorni dopo la cultura iniziale; se non emergono entro il giorno 12, scartare la coltura e ripetere l'esperimento, riducendo il periodo di digestione. Un altro problema sono i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale. Dovrebbero essere completamente rimossi durante la dissezione perché l'eccesso di etrociti può interferire con la formazione delle neurosfere.
Questo protocollo consente di espandere le neurosfere galleggianti fino al passaggio 2 e di cambiare le condizioni aderenti per valutare le cellule derivate dalla neurosfera. Tuttavia, ha limitazioni come una diminuzione del potenziale neurogenico, che passa alla differenziazione gliogenica nei passaggi successivi come risposta di adattamento alle condizioni in vitro12. Per questo motivo, abbiamo raccomandato di caratterizzare le neurosfere nella coltura primaria e nel passaggio 1, e continuare con il passaggio successivo solo se è necessario espandere le cellule per esperimenti che non comportano differenze chiarizzanti dovute all'origine.
È interessante notare che le differenze intrinseche possono essere trovate nella cultura primaria delle neurosfere come risultato della fonte neuroanatomica (VZ o DG) o dipendente dal sesso (femmine o maschi). Pertanto, il numero e il diametro delle neurosfere derivate da entrambe le regioni neurogeniche delle femmine sono più alti rispetto ai maschi. Questa potrebbe essere una differenza funzionale nella nicchia cerebrale femminile rispetto a quella dei maschi, che i meccanismi molecolari possono essere studiati in vitro con questo saggio.
La coltura cellulare delle neurosfere derivate dall'arvicola cerebrale adulta è uno strumento prezioso che potrebbe aiutare a risolvere le discrepanze tra gli studi in vivo. Ad esempio, Fowler e colleghi hanno riferito che l'isolamento sociale per 48 ore induce un aumento delle cellule positive alla 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) nella VZ, senza influire sulla DG6. Al contrario, Lieberwirth et al.; ha dimostrato una diminuzione della proliferazione cellulare nella DG13. Inoltre, la coltura in vitro può essere un modello per valutare i meccanismi molecolari nelle regioni neurogeniche che potrebbero essere associati a cambiamenti comportamentali in un modello sociale come l'arvicola della prateria. Ad esempio, è stato suggerito che l'esposizione ai neonati induce, sia nelle arvicole non parentali che parentali, un aumento delle cellule positive brdU nella DG14. I risultati di questo studio possono essere confermati utilizzando il nostro protocollo di coltura cellulare con etichettatura BrdU. Tuttavia, sebbene la maggior parte degli studi sulle arvicole e su altri mammiferi utilizzi l'etichettatura BrdU per identificare nuove cellule, uno svantaggio è che la labbeling potrebbe cambiare a seconda delle dosi iniettate15. EdU, un altro analogo della timidina, è un'alternativa ideale per identificare le cellule sotto la fase del ciclo cellulare in colture in vitro. Nello stesso esperimento, è possibile avere diversi periodi per l'incorporazione di EdU, e a differenza di BrdU, denaturazione del DNA o incubazione con anticorpi non è necessario per la sua rilevazione. Inoltre, le cellule edu-positive possono essere valutate per la co-localizzazione con marcatori per identificare il ciclo di divisione cellulare (Ki67) e determinare il loro fenotipo usando marcatori di cellule staminali neurali o progenitori (Nestin, Sox2 e Pax6).
La coltura delle neurosfere può essere stabilita come modello per studiare l'effetto di ormoni, piccole molecole o farmaci nel tasso di proliferazione, neurogenesi e modifiche epigenetiche nelle cellule staminali neurali e progenitori delle arvicole della prateria. Ad esempio, studi precedenti hanno suggerito il ruolo degli ormoni dello stress (come il corticosterone) e degli estrogeni nella regolazione della neurogenesi adulta nelle arvicole della prateria, ma i meccanismi regolatori sottostanti sono sconosciuti6.
Infine, i disturbi dello spettro autistico (ASD) e la schizofrenia (SZ) sono correlati a menomazioni nellacognizione sociale 16,17. È interessante notare che l'ossitocina e l'arginina-vasopressina hanno un ruolo fondamentale nel comportamento sociale ed emotivo, e le variazioni dell'espressione genica nei loro recettori (OXTR e vasopressina 1a (V1AR), rispettivamente) sono associate sia all'ASD che all'SZ18,19,20,21. Inoltre, l'alterazione della neurogenesi e la migrazione neurale durante il neurosviluppo sono implicate nella fisiopatologia di questi disturbicomportamentali 22,23,24. Pertanto, proponiamo di analizzare i meccanismi molecolari mediati da questi ormoni sulla neurogenesi, la migrazione neurale e altri eventi cellulari le cui alterazioni sono correlate a disturbi neurologici utilizzando la coltura delle cellule arvicole della prateria nel modello in vitro a causa dei recettori OXTR e V1AR si trovano nella prateria vole hippocampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca fu sostenuta da sovvenzioni CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT NEL 202818 e NEL 203518; INPER 2018-1-163 e NIH P51OD11132. Ringraziamo Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro per l'eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
