Summary
我々は、社会行動に関連する機能的プラスチック変化の一部となり得る神経原性ニッチ間の性依存性差を分析するために、大草原の渦の脳の脳下脳領域および脳内胞から神経前駆細胞を培養する条件を確立した。
Abstract
神経球は、神経幹細胞と前駆細胞を含む一次細胞凝集体である。これらの3D構造は、神経幹細胞の分化および増殖の可能性を決定し、時間をかけてアッセイできるよりも細胞株を生成するための優れたツールです。また、神経球は、様々な成長因子、ホルモン、神経伝達物質などの動的変化環境のモデリングを可能にするニッチ(インビトロ)を作成することができます。 マイクロタス・オクロガスター (大草原のボレ)は、社会性行動と社会的認知の神経生物学的基礎を理解するためのユニークなモデルです。しかし、これらの行動に関与する細胞機構は、よく知られていない。このプロトコルは、非接着条件下で培養される成体大草原の神経原性ニッチから神経前駆細胞を得て、神経球を生成することを目的としている。神経球の大きさと数は、領域(脳室内領域またはデンテート回)および大草原の性別に依存する。この方法は、インビトロにおける神経原性ニッチの性依存性に依存する違いを研究するための顕著なツールであり、ペアボンディングおよびバイペアペアケアなどの社会的行動に関連する神経可塑性の変化である。また、社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損を伴う認知状態を調べることができる。
Introduction
クリセチダ科の一員である大草原のボレ(ミクロトゥス・オクロガスター)は、社会的に一夫一婦制で社交的な種として生命戦略が発展する小さな哺乳類です。男性と女性の両方が交配後または同棲の長い期間の後に永続的なペアの絆を確立し、巣を共有し、自分の領土を守り、子孫1、2、3、4のための二人の世話を表示することを特徴とする。このように、大草原のボレは、社会認知における社会性行動および障害の神経生物学的基礎を理解するための貴重なモデルである5。
成人の神経新生は、行動の変化につながる神経可塑性の最も重要なプロセスの一つです。例えば、我々の研究グループは、海馬の脳内胞領域(VZ)および樹状回(DG)における脳室領域(VZ)およびサブ顆粒帯における交配との社会的同居が、大草原の交配によって誘発される対結合の形成に役割を果たすことができることを示唆している男性のボルで報告した(未発表データ)。一方、新しいニューロンが生成され、統合された脳領域はよく知られているが、これらのプロセスに関与する分子および細胞機構は、脳モデル6全体の技術的な欠点のために未確定のままである。例えば、遺伝子発現および他の細胞活動を制御するシグナル伝達経路は、比較的短い活性化期間(ホスホプロテオームの検出)7を有する。代替モデルの1つは、成人神経新生に関与する分子成分を解明するために、単離された、培養された成体神経幹細胞または前駆細胞である。
成人哺乳類(マウス)脳からのインビトロ神経前駆体を維持するための最初のアプローチは、神経球のアッセイであり、これは、ニューロンを生成する多能性の可能性を維持する非接着条件下で成長する細胞凝集体であり、アストロサイト8、9、10であった。その開発の間に、前駆体だけが上皮成長因子(EGF)や線維芽細胞成長因子2(FGF2)などの有糸原物質に反応して神経球8、9、10を増殖させ、生成する選択プロセスがある。
我々の知る限りでは、大草原から成体神経前駆物質を得るためのプロトコルは文献に報告されていない。ここでは、神経球形成アッセイを通じて神経原性ニッチとそのインビトロ維持から神経前駆細胞を分離する培養条件を確立した。したがって、実験は、増殖、移動、分化および前駆体の神経幹細胞および前駆細胞の生存に関与する分子および細胞のメカニズムを同定するために設計されることができ、大草原の中でまだ知られていないプロセスである。さらに、VZおよびDGに由来する細胞の特性のインビトロの違いを解明することは、社会性行動および認知行動の変化に関連する神経可塑性における神経原性ニッチの役割に関する情報を提供し、性依存性依存性に依存する可能性のある社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損に関する情報を提供する可能性がある。
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Protocol
この研究は、ニューロバイオロジー研究所、メキシコ、メキシコ国立大学、国立副正書デペリナトリシア研究所(2018-1-163)の研究倫理委員会によって承認されました。動物の繁殖、ケア、人道的エンドポイントは、メキシコ保健事務局の「レイ・ジェネラル・デ・サルド・アン・マテリア・デ・インベスティガシオン・パラ・ラ・サルード」(健康研究一般健康法)に基づいてメキシコ公式スタンダード(NOM-062-Z00-1999)に従って設立されました。
1. ソリューションと株式の準備
- ダルベックコの改変イーグルミディアムF12(DMEM-F12)の485 mL、N2サプリメント(100x)5 mL、グルタミンサプリメント5 mL(100x)、抗生物質抗ミキマティック(100x)5 mLのN2培地を調製します。
- 480 mLの神経基底培地、10 mLの B27 サプリメント(50x)、5 mLのグルタミンサプリメント、5 mLの抗抗菌薬(100x)を用いたB27培地を調製する。
- コラゲナーゼ粉末を1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で再構成し、100単位/μL(1000x)の活性を有するアリコートを得、-20°Cで保存する。 コラゲローゼ活性は、企業のロット数によって異なります。
- 1x PBS(50 mg/mL)に5mgのジスパーゼ粉末を溶解して、ディスパーゼストックアリコートを調製します。-20°Cで保管してください。
- DMEM-F12培地100mL、50μLのストックコラゲナーゼ(100単位/μL)を用いた酵素溶液を調製し、最終濃度は50 U/mL、ストックディスパーゼ(50mg/mL)の最終濃度は333μL(50mg/mL)で、最終濃度は0.33mg/mLです。
- 洗浄液を調製するには、1x PBSの1,000mLに、0.4766 gのHEPES(最終濃度2mM)、3.6gのD-グルコース(最終濃度20mM)および2.1gのNaHCO3( 最終濃度25mM)を加える。
- 滅菌水を使用してポリ-L-オルニチンストックアリコート(1mg/mL)を調製し、-20°Cで保管してください。
- ポリ-L-オルニチンの働く溶液を準備します。ストックアリコート(1mg/mL)を49mLの滅菌水で希釈し、最終濃度20μg/mLにします。
- ラミニンの作業溶液を準備します。5 μg/mLの最終濃度のために滅菌水の5 mLのラミニンの25 μL(1 mg/mLの元のストック)を薄くします。
注:準備後、汚染を避けるために、培養培地、作業およびストックソリューションをフィルタリングしてください。シリンジまたはボトルトップ真空フィルター(0.2 μmの孔径のポリエーテルサルホン膜)を使用してください。培養培地と作業ソリューションは4°Cで最大30日間保存でき、ストックは-20°Cで最大4ヶ月間保存できます。
2. マイクロディシスを開始する前の準備
- オートクレーブまたはホットガラスビーズドライ滅菌装置で手術器具を殺菌します。
- 厳密な無菌および防腐条件下でマイクロディスセクション表面積を清掃します(例えば、オゾン水で)。
注:各ボレ脳からの両方の神経原性ニッチのマイクロディセクションのタイミングは約30分です。全手順で1~4匹の動物を使用することをお勧めします。
3. 脳全体の抽出
- 腹腔内注射によるペントバルビタール(6.3mg/動物)の過剰摂取で成人のボレ(12-16週)を麻酔します。しっかりとしたつまみに応答してペダル反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。
- ボレが完全に麻酔されると、首切りによって安楽死を誘発し、頭を回復する。
- 頭蓋骨から皮膚をはさみで解剖し、尾骨-鼻の切開(長さ15mm)を作り、頭蓋骨を露出させる。
- 後頭骨と足頭間骨を切り取り、矢頭と頭頂縫合糸に沿って頭蓋骨に切開をトレースします。
- はさみを使用して前頭骨と頭頂骨の接合部で頭蓋骨に穴を開け、脳組織に損傷を与えないように非常に注意してください。
- 脳を露出させるために、鋭利な尖ったピンセットで両方の脳半球を覆う残りの頭蓋骨の断片を取り除く。
- 頭蓋の基盤から脳全体を持ち上げるためにステンレス製のへらを使用してください。
- 20 mLの冷たい洗浄液を用いた遠心分離管(50 mL)に脳を集めなさい。
- 冷たい洗浄液で脳を2回洗います。
4. 神経組織の微細解剖
- 氷に囲まれた表面にペトリ皿を置きます。
- 皿に脳を堆積させ、冷たい洗浄液の20 mLを加える。
- メスでは、コロナ平面で、脳を組織の2つのブロック(ロストラルと尾体)に分けます。神経解剖学的基準として、前後軸11 においてブレグマレベルでコロナカットを行う(図1A、実線)。
- ロストラルブロックからVZ組織(図1B)を抽出し、コーダルブロックからDGを取り外します(図1C)。
- VZをステレオ顕微鏡で解剖する。
- デュモン鉗子で、半球の1つを保持します。次に、心室の高さで、第2のデュモン鉗子の微細な先端を、カウデート・プタメンに並ぶ組織下に挿入する(図2A)。
- 組織を分離するために、ドーソベントラ軸に沿って鉗子を開きます。
- 2 mLの冷たい洗浄液を用いた遠心分離管に、個人毎にVZ組織を回収します。2匹以上の動物の組織をプールしないでください。
- 他の半球でマイクロディショ切を繰り返します。
- 二国間VZ組織を含むチューブを氷の上に保存し、DGの解剖を続ける。
- ステレオ顕微鏡下で尾ブロックからDGを解剖する。
- メスで、コロナをブロックに切り込み、海馬の形成が観察される2つのスライスを得る。目印として、カットはマウス脳アトラス11(図1A、点線および図1C)に従って前部後軸の-2mmブレグマ座標で行われる。
- デュモン鉗子で、スライスの1つを保持し、ファインポイントのデュモン鉗子でDGとCA1の間に水平切削を行い、DGとCA3の間で垂直切開を行い、DGを分離します(図2B)。
- 他の半球の最初のスライスで解剖を繰り返します。
- 2 番目のスライスで両半球の解剖を繰り返します。
- 遠心分離管に各ボレの4つのDG部分を集める。2匹以上の動物のDG組織をプールしないでください。
注:複数の動物の解剖が必要な場合は、脳の残りの部分を解剖し続けながら、氷の上にVZまたはDG組織と遠心管を保存します。解剖中に脳組織を覆うすべての血管を取り除きます。血管が廃棄されない場合、培養物は過剰な赤血球と混合され、神経球形成を妨げることができる。
5. 神経細胞の分離
- バイオセーフティキャビネット内に遠心管を入れ、組織断片が重力によって沈殿するまで約10分待ちます。
- 洗浄液を取り出し、各チューブに温かい酵素溶液1mLを加えます。
- 37°Cで10分間チューブをインキュベートします。
- 組織断片を崩壊させる;ピペットは1 mLの先端で上下に。30倍以上のピペットを使用しないでください。
- 37°Cで10分の2回目のインキュベーションを行います。
- 第2インキュベーションの終わりに、ピペットは組織を分割する。30倍以上のピペットを使用しないでください。
注:ピペット処理後、組織断片は完全に崩壊する必要があります。それらが崩壊していない場合は、37°Cで別の10分間インキュベートし、再ピペット。消化期間は30分を超えてはなりません。 - 酵素処理を希釈するためにチューブあたり9 mLのN2培地を加えます。
- 室温で4分間200 x g でチューブを遠心します。
- 上清を捨て、10mLのN2培地で洗います。
- ステップ5.8と同じ条件で遠心分離機。
- 各チューブから上澄み液を取り出し、VZおよびDGの細胞ペレットをそれぞれ2mLおよび1mLのB27培地に再懸濁する。
- 非崩壊組織を除去するには、細胞ストレーナー(サイズ40μm)を使用して各細胞懸濁液を濾過します。
6. 神経球形成
- ストレーナーを通過した細胞を超低い付着、24ウェルプレートに培養する。VZには2つの井戸を使用し、DGには井戸1つ(B27培地/ウェルの1 mL)を使用してください。
- 各ウェル(最終濃度1x)に20 ng /mLのFGF2と20 ng /mLのEGFを加えます。
- 37°C、5%CO2、高湿度(90~95%)でインキュベートします。48時間(1日目と2日目の培養、D1-D2)の邪魔をしないでください。
- 3日目(D3)に、培養培地の半分を取り除き、成長因子の二重濃度(2x)を加えた新鮮なB27培地(ウェルあたり500 μL)に置き換えます。
- 3日ごとに繰り返し、培養培地(その半分)を変更し、成長因子の二重濃度(2倍)を添加した新鮮なB27培地に置き換えます。
- 培養培地を変更する必要がない日には、1倍の最終濃度に成長因子を加える。
- 神経球がD8-D10の周りに形成されていることを確認してください。
- D10では、全ての残骸を除去するために完全な培養培地を変更する。
- 遠心分離管の各ウェルの培地と神経球を個別に収集します。
- 室温で10分間インキュベートします。この手順は、重力による神経球の沈殿を可能にする。
- 上清を除去し、成長因子を補充した新鮮なB27培地の1 mLで再中断します。
- 神経球を同じ超低い取り付けプレートに戻し、37°C、5%CO2でインキュベートします。
- D10からD15へ、培地の半分を変更し、成長因子を追加し続けます。
7. 神経球の通過
- 一次培養のD15で、1 mLピペットを用いて遠心管に神経球を集める。ピペットチップを切って開口部のサイズを大きくし、神経球の損傷を避けます。
- 室温で10分間インキュベートします。神経球は重力によって沈殿する。
- 培地を取り出し、チューブあたり1mLの細胞剥離培地を加えます。
- 37°Cで7分間チューブをインキュベートします。
- ピペットは、神経球を解体するために1 mLの先端で上下に。
- 細胞剥離培地をチューブあたり3mLのB27培地で希釈します。
- 200 x gで 5 分間の細胞懸濁液を遠心分離します。
- 上清を捨て、成長因子を補充した新鮮なB27培地で各細胞ペレットを再懸濁する。
- VZ由来細胞を培地4mL、DG由来細胞を2mLの培地で再懸濁する。
- 一次培養で使用されたウェルの数を2倍にして新しい超低い付着プレートで細胞(継代1)を培養する(VZおよびDGの場合は4および2ウェルずつ)。
- 3 日ごとに培地の半分を変更し、成長要因を毎日追加します。
- 10日後(D10)を通過1にして、次の通路で付着条件に変更する。
8. 付着条件での通路
- 通過2を実施する前に、ポリ-L-オルニチンおよびラミニンでコーティングされたプレートを準備する。
- 24ウェルプレートに、1xポリL-オルニチン(20μg/mL)の500 μLをウェルあたりに加えます。一晩で37°Cでインキュベートする。
- ポリL-オルニチンを取り出し、1x PBS(500 μL/ウェル)で4倍洗います。
- 1ウェルあたり1xラミニン(5 μg/mL)の200 μL(1つのウェルの表面を覆う最小体積)を加え、細胞を培養する前に37°Cで2〜3時間インキュベートします。
- 遠心分離管に切り取られた先端と1 mLピペットと神経球を収集します。
- 室温で10分間インキュベートし、重力によって神経球を沈殿させます。
- 上清を捨て、成長因子を含まない新鮮なB27培地で神経球を再中断する。
- コーティングされたプレートからラミニンを吸引し、切り取られた先端と1 mLピペットを使用して井戸に神経球を沈着させます。
注:コーティングされた井戸がラミニン除去とメッキ神経球の間で乾燥しないようにしてください。 - カルチャを 2 つの条件に分割します。
- 6日間の分化された神経球を維持する(D6)。3 日ごとにメディアを変更し、成長要因を毎日追加します。
- 神経球由来細胞の分化を12日(D12)で観察する。成長因子なしで3日ごとに培地を変更します。
注:分化条件のD6の終わりに、分化条件のためのD6またはD12の終わりに、細胞は従来の免疫検査、細胞選別分析、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)染色、RNA抽出などに使用することができます。
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Representative Results
神経球は、女性と男性の両方の成人大草原のVZとDGから分離された神経幹細胞から形成された。培養開始から約8~10日後、細胞は神経球を形成しているはずだ。なお、プレートには、一次培養物に破片が含まれていてもよい(図3A)。しかし、通路1では、培養は神経球のみで構成されるべきである(図3B)。
女性と男性の両方の雄VZおよびDGと比較して、より多くの神経球が女性VZから得られた(図4A)。これらのデータは、得られる神経球の数が増殖ゾーンとボレ性に依存することを示唆している。神経圏が出現すると(D8-D10)、さらに7日間培養が維持され、この期間中に成長が監視された。神経球の直径は、D8、D11、およびD14(表1および図4B)で測定した。神経圏のサイズ(直径)は、両方の神経領域における男性と女性の文化の日に応じて徐々に増加した。男性の脳由来の神経球は、両方の神経原性領域における女性の脳由来の神経球と比較して小さかった(図4B)。
浮動条件に関する15日間の一次培養の後、同じ条件下で通路1で神経球が拡大した。その後の継代2に対して、細胞は接着培養で成長し、それらは、通過1以降に付着することができた。付着した神経球は、成長因子(未分化状態、 図5A)の存在下で6日目(D6)、または成長因子を含まない15日目(D15)まで(分化された状態、 図5B)で特徴づけられた。
D6では、未分化条件下で、神経球由来細胞は、ネチン(神経前駆物質のマーカー)を発現した(図6)。また、ニューロン前駆体または未熟なニューロンの存在を示す、ダブルコルチン(DCX)陽性細胞(移行細胞)および増殖マーカーKi67を同定することが可能であった。しかし、Ki67とDCXの共局在化の欠如は、ポストミトキズ神経芽細胞の存在を示唆している(図7)。最後に、分化条件下でD15で、成熟したニューロン(MAP2陽性細胞)と、グリア表現型(GFAP陽性細胞)を有する細胞が見つかり、単離した細胞の分化ポテンシャルを示す(図8)。
図1:成人のボレ脳とその神経形成領域の後視図(A)ブレグマレベルの実線は、脳を二つのブロック、露皮と尾に分ける解剖学的な基準であった。点線は、DGを含む2つのスライスを得るために尾のブロックを分割するための参照でした。(B) VZが位置する第1切開で露出した神経領域のコロナ図。(C) DG が位置する第 2 切開で露出した解剖学的領域のコロナ図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:神経原性領域の解剖のための解剖学的参照(A)VZ位置(点線)を示すロストラルブロックからのコロナセクションのスキームと写真。(B)DG解剖を示す尾部ブロックからのコロナ部のスキームと写真。CPu, コーデートプタメン;V、心室;VZ、心室領域、DG、歯状回り;CA1およびCA3、海馬の領域。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成人大草原の神経起源ニッチに由来する神経球培養の代表的な顕微鏡写真。(A) D10における女性のVZから分離された神経球の一次培養(B) D10における女性のVZに由来する神経球の1の通過。スケールバー= 200 μm. n= 3 各神経原性領域およびvoleの性別. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:神経球の数と大きさは、性と神経原性の両方のソースに依存した。(A) D10における女性と男性の両方のVZとDGから得られた一次培養における神経球の数。データは一方向のANOVAで分析され、続いてTukeyのポストホックテストが行われました。女性VZと他のグループの間に有意な差が見られた。(B) 主要培養におけるD8-D14全体の神経球の直径は、ボレ性に依存した。データは双方向のANOVAで分析され、続いてTukeyのポストホックテストが行われました。グループ内比較(同じグループ内の違い)は、D8とD11とD14の間の神経球サイズの増加を示しました(*p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001)。そして、D11 対 D14 (+++ p<0.001) は、女性と男性のボルの VZ および DG で行います。グループ間比較(同じ領域のグループ間の違い)は、女性のVZおよびDG神経球がD11およびD14の男性神経球よりも大きいことを示した。### p<0.0001.VZは、男性と女性のボル(n =3、グループごとに)から得られた。15個の女性および10個の男性の神経球を分析した。DGは男性と女性のボル(n =3、グループあたり)から得られた。8つの女性の神経球と5つの男性の神経球が処理された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:継通路2における接着条件で培養した雌VZに由来する神経球の代表的な画像。(A)D2で成長因子を有する通路2に神経球が付着した。(B)D10での成長因子を伴わない通路2に付着した神経球由来細胞。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:神経球におけるネスチンの発現代表的な、未分化段階における雌および男性の成人脳のVZ由来のネスチン陽性細胞のエピフルエンス顕微鏡画像。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:神経球におけるDCXおよびKi67の発現DCX-Ki67陽性細胞の代表的な蛍光顕微鏡画像と、未分化段階における成人女性脳と男性脳の両方のVZ由来の結合。スケールバー= 25 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:神経球におけるMAP2およびGFAPの発現代表は、MAP2(成熟ニューロン)およびGFAP(グリア細胞)の代表的な、分化段階における成人女性脳と男性脳の両方のVZ由来の陽性細胞の顕微鏡観察画像。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 神経球のサイズ (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| 文化の日々 | セックス | 平均± SD | 文化の日々 | セックス | 平均± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5±15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 | F | 217.3±35.7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158.9±47.2 | M | 71.8±14.4 | ||
| D14 | F | 306.6±44.4 | D14 | F | 243.8±37.4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
表1:一次培養における神経原性ニッチから分離された神経球の平均サイズ(直径)の定量化。 大きな違いは 図 4に示されています。VZは、男性と女性のボル(n =3、グループごとに)から得られた。女性から15個、男性から10個の神経球を分析した。DGは男性と女性のボル(n =3、グループあたり)から得られた。8つの女性の神経球と5つの男性の神経球が処理された。
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Discussion
神経幹細胞培養を得る段階は酵素溶液による消化期間であり、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、30分を超えてはならない。神経球は、最初の培養後8〜10日で出現するはずです。12日目までに出現しない場合は、培養を捨てて実験を繰り返し、消化期間を短縮する。もう一つの問題は、脳組織をカバーする血管です。赤血球の過剰が神経球形成を妨げる可能性があるため、解剖中に完全に除去する必要があります。
このプロトコルは、通過2まで浮遊神経球を拡大し、神経球由来細胞を評価するために付着条件に変化することを可能にする。しかしながら、神経原性ポテンシャルの低下などの制限があり、これは、インビトロ条件12に対する適応応答として連続した通路でのグリオゲン分化に切り替わる。そのため、一次培養・通過1の神経球を特徴付け、起源による違いを解明しない実験のために細胞を展開する必要がある場合にのみ、次の通過を続けることを推奨しています。
興味深いことに、神経解剖学的(VZまたはDG)または性依存(女性または男性)源の結果として、神経球の主要な培養物に本質的な違いが見られる。したがって、女性の神経原性領域の両方に由来する神経球の数と直径は、男性と比較して高い。これは、このアッセイでインビトロで分子機構を研究できる男性と比較して、女性の脳ニッチの機能的な違いである可能性があります。
成人の脳のボレに由来する神経球の細胞培養は、生体内の研究間の不一致を解決するのに役立つ貴重なツールです。例えば、ファウラーと同僚は、48時間の社会的孤立が、DG6に影響を与えることなく、VZにおける5-Bromo-2'-デオキシウリジン(BrdU)陽性細胞の増加を誘導すると報告した。対照的に、リーバーヴィルトら。DG13における細胞増殖の減少を実証した。さらに、インビトロ培養は、大草原のような社会モデルの行動変化に関連する可能性のある神経原性領域における分子機構を評価するためのモデルとすることができる。例えば、新生児への曝露が、非親および親のボルの両方において、DG14におけるBrdU陽性細胞の増加を誘発することが示唆されている。この研究結果は、BrdU標識を用いた細胞培養プロトコルを用いて確認できる。しかし、ボルや他の哺乳動物に関する研究のほとんどは、新しい細胞を同定するためにBrdU標識を使用するが、デメリットは、注入された用量15に応じてラベリングが変化する可能性があることである。EdUは、別のチミジンアナログ、細胞周期期の細胞をインビトロ培養で同定する理想的な代替手段である。同じ実験では、EdUの組み込みのためにいくつかの期間を有することができ、かつBrdUとは異なり、DNA変性または抗体によるインキュベーションはその検出に必要ではない。また、EU陽性細胞をマーカーと共局在化して細胞分裂周期(Ki67)を同定し、神経幹細胞または前駆細胞(Nestin、Sox2およびPax6)のマーカーを用いてその表現型を決定することができる。
神経圏培養は、ホルモン、低分子、または薬物の増殖速度、神経新生および神経幹細胞および大草原の前駆体におけるエピジェネティック修飾の効果を研究するモデルとして確立することができる。例えば、以前の研究では、大草原における成人神経新生の調節におけるストレスホルモン(コルチコステロンのような)およびエストロゲンの役割が示唆されているが、基礎となる調節機構は不明である6。
最後に、自閉症スペクトラム障害(ASD)および統合失調症(SZ)は、社会的認知における障害16、17に関連している。興味深いことに、オキシトシンとアルギニン-バソプレシンは社会的および感情的行動において基本的な役割を有し、それらの受容体(OXTRおよびバソプレシン1a(V1AR)における遺伝子発現の変化は、それぞれASDおよびSZ18、19、20、21の両方に関連している。また、神経発達中の神経新生および神経移行の変化は、これらの行動障害22、23、24の生理病理学に関与する。そこで、これらのホルモンによって媒介される神経新生、神経遊走、その他の細胞性事象に関する分子メカニズムを分析することを提案し、その変化は、OXTRおよびV1AR受容体による大草原ボレ海馬25,26に見られるだけで、体外モデルにおけるプレーリーボレ細胞培養を用いた神経障害に関連する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、CONACYT 252756および253631の助成金によって支えられた。ウナム-ダパ-パピット IN202818 および IN203518;INPER 2018-1-163、およびNIH P51OD11132。デイジー・ガスカ、カルロス・ロザーノ、マルティン・ガルシア、アレハンドラ・カスティーリャ、ニディア・ヘルナンデス、ジェシカ・ノリス、スサナ・カストロの技術支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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