Summary
Hier beschreven we een protocol om de assemblage en structuur van de axon initiële segmenten (AIS) van hippocampale neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS missen vanwege de afwezigheid van een gigantische ankyrine-G kwantitatief te bestuderen.
Abstract
Neuronale axon initiële segmenten (AIS) zijn plaatsen van initiatie van actiepotentiaal en zijn uitgebreid bestudeerd op hun moleculaire structuur, assemblage en activiteitsafhankelijke plasticiteit. Giant ankyrine-G, de hoofdorganisator van AIS, associeert direct met membraan-spanning gated sodium (VSVG) en kaliumkanalen (KCNQ2/3), evenals 186 kDa neurofascine, een L1CAM celadhesiemolecuul. Giant ankyrine-G bindt ook aan en rekruteert cytoplasmatische AIS moleculen waaronder bèta-4-spectrine, en de microtubulusbindende eiwitten, EB1/EB3 en Ndel1. Reuze ankyrine-G is voldoende om AIS-vorming in ankyrine-G-deficiënte neuronen te redden. Ankyrine-G omvat ook een kleinere 190 kDa isoform gelegen op dendritische stekels in plaats van de AIS, die niet in staat is om zich te richten op de AIS of het redden van de AIS in ankyrine-G-deficiënte neuronen. Hier beschreven we een protocol met gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-floxmuizen, die, wanneer getransfecteerd met Cre-BFP, verlies van alle isovorm van ankyrine-G vertonen en de vorming van AIS belemmeren. Gecombineerd met een gemodificeerd Banker glia/neuron co-cultuursysteem, ontwikkelden we een methode om ankyrine-G null neuronen te transfecteren met een 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide, wat voldoende is om de vorming van AIS te redden. We gebruiken verder een kwantificeringsmethode, ontwikkeld door Salzer en collega's om te gaan met variatie in AIS-afstand tot de neuronale cellichamen die optreedt in hippocampale neuronculturen. Dit protocol maakt kwantitatieve studies van de de novo assemblage en dynamisch gedrag van AIS mogelijk.
Introduction
Het axon initiële segment bevindt zich bij het proximale axon in de meeste gewervelde neuronen. Functioneel gezien is AIS waar actiepotentiaal wordt geïnitieerd vanwege de hoge dichtheid van spanningspoortnatriumkanalen in deze regio. AIS van sommige excitatory neuronen zijn ook gericht door remmende interneurons door het vormen van GABAergic synapsen1,2,3. Daarom is AIS een kritieke locatie om celsignalering te integreren en de prikkelbaarheid van neuronen te moduleren. AIS is normaal gesproken 20-60 μm lang en bevindt zich binnen 20 μm van het cellichaam. De lengte en positie van AIS varieert in neuronen in hersengebieden, evenals in verschillende ontwikkelingsstadia van hetzelfde neuron4,5. Geaccumuleerd bewijs suggereerde dat de samenstelling en positie van AIS dynamisch zijn in het reageren op de verandering van neuronale activiteit4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G is de hoofdorganisator van AIS. 480 kDa ankyrine-G is een membraan geassocieerd adaptereiwit dat zich direct bindt aan spanning gated natriumkanalen en andere belangrijke AIS-eiwitten, waaronder beta4-spectrin, KCNQ2/3 kanalen die natriumkanaalactiviteit8,9en 186 kDa neurofascine moduleren, een L1CAM die GABAergische synapsen naar de AIS2,10leidt . 480 kDa ankyrine-G deelt canonieke ankyrinedomeinen die te vinden zijn in de korte 190 kDa ankyrine-G isoform (ANK repeats, spectrin binding domain, regulatory domain), maar onderscheiden zich door een gigantische exon die alleen in gewervelde dieren voorkomt en specifiek wordt uitgedrukt in neuronen (Figuur 1A)11,12. Het 480 kDa ankyrine-G neuron specifiek domein (NSD) is vereist voor AIS-vorming12. De 190 kDa ankyrine-G bevordert geen AIS-assemblage of richt zich niet op AIS in ankyrine-G-null neuronen12. Echter, 190 kDa ankyrine-G is geconcentreerd op de AIS met 480 kDa ankyrine-G12. Dit vermogen van de 190 kDa ankyrine-G om zich te richten op voorgemonteerde AIS van wildtype neuronen is een bron van verwarring in de literatuur geweest en heeft de waardering van de kritische gespecialiseerde functies van de 480 kDa ankyrine-G in AIS-assemblage vertraagd. Daarom is het van cruciaal belang om AIS-assemblage te bestuderen in ankyrine-G-null neuronen die geen vooraf geassembleerde AIS hebben.
Hier presenteren we een methode om de assemblage en structuur van de AIS te bestuderen met behulp van gekweekte hippocampale neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die alle isovormen van ankyrine-G13 elimineert (Figuur 1B). Door neuronen te transfecteren met een Cre-BFP-constructie voordat AIS wordt geassembleerd, genereerden we ankyrine-G-deficiënte neuronen die volledig geen AIS hadden (Figuur 1B, Figuur 2). De assemblage van AIS wordt volledig gered na co-transfectie van 480 kDa ankyrine-G-GFP plasmide met een Cre-BFP plasmide. Deze methode biedt een manier om de AIS-assemblage te bestuderen in een niet-voorgemonteerde AIS-omgeving. We hebben ook het glia-neuron co-cultuursysteem van Gary Banker aangepast zonder antibiotica te gebruiken, eerder ontworpen voor embryonale dag 18 neuronen, voor toepassing op postnatale muisneuronen en een AIS-kwantificeringsmethode aangepast aan gemiddelde AIS-metingen van meerdere neuronen om de variatie van AIS14,15te normaliseren .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Deze kweekmethode van hippocampale neuronen van postnatale 0-daagse ANK3-E22/23f/f muizen is aangepast aan gary banker's glia/neuron co-cultuur systeem. Daarom is het van cruciaal belang om alle stappen na dissectie in een schone kap uit te voeren met behulp van gesteriliseerd gereedschap. Dit protocol duurt maximaal 1 maand. De werkstroom wordt weergegeven in figuur 3. Het protocol volgt de dierrichtlijnen van Duke University.
1. Het bereiden van coverslips en neuronale plating gerechten
- Laad de afdeklips ten minste een week voor de kweekdag op het afdekliprek en week het 's nachts in salpeterzuur (70% W/W) (kan dagenlang worden verlengd).
- Was salpeterzuur behandelde coverslips met gedestilleerd water op een lage snelheid shaker in een glazen pot 2 keer, 1 uur elk.
- Incubeer dekt lips in verzadigde KOH opgelost in 100% ethanol 's nachts. Voeg KOH toe aan ethanol tot het niet meer is opgelost.
- Herhaal de wasstap met gedestilleerd water. Spoel de deklipjes eenmaal gedurende 10 minuten af met 100% ethanol.
- Breng de afdeklips van het rek over naar een glazen beker. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie. Bak de afdeklips 's nachts in een oven van 225 °C om de afdeklips te steriliseren. (Coverslips kunnen weken in het bekerglas worden bewaard).
- Leg de afdeklips in een petrischaaltje en breng vervolgens 3-4 waspunten aan op de afdeklip om als voetjes te dienen. Gebruik een Pasteur pipet om in gekookte was in een glazen fles te dopen. Raak vervolgens snel de coverslip aan om een punt te maken. Een petrischaal van 60 mm kan 4 afdeklipjes bevatten. Een petrischaal van 10 mm kan ~ 10 coverslips bevatten.
- 2 dagen voor de kweekdag, vacht coverslips (de zijkant met de waspunten) met filter gesteriliseerd 1 mg/ml poly-L-lysine in 0,1 M boorzuur (pH 8,5) gedurende minimaal 6 uur en spoelen met water 2 keer, 1 uur elke keer. Coverslips blijven in dezelfde Petrischaal.
- Voeg plating medium (MEM aangevuld met glucose 0,6% (wt/vol) en 10% (vol/vol) paardenserum) langzaam toe aan platen zonder deklipjes te verstoren. Leg platen in de incubator tot de kweekdag om neuronen te zaaien.
2. Bereiden van gliacelvoedergerechten (2 weken voor kweekdag)
- Ontleed de cortex van een postnatale 1-daagse muizenhersenen en pel de hersenvliezen af.
- Hak het cortexweefsel zo fijn mogelijk met een schone schaar in een schone petrischaal in een schone bank.
- Breng het gehakte weefsel over in 12 ml HBSS en voeg 1,5 ml 2,5% trypsine en 1% (wt/vol) DNase toe. Incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 15 minuten, schommel elke 5 minuten. Goed verteerd weefsel wordt plakkerig en vormt een grote cluster. Trituraat 10-15 keer met een pipet van 10 ml om het weefsel af te breken en een betere spijsvertering te krijgen.
- Trituraat het goed verteerde weefsel 10-15 keer met een pipet van 5 ml totdat de meeste brokken verdwijnen en het medium troebel wordt. Ga door een celzeef om de resterende brokken te verwijderen en voeg 15 ml gliamedium (minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met glucose (0,6% wt/vol), 10% (vol/vol) paardenserum en Penicilline-Streptomycine (1x) toe om de spijsvertering te stoppen.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 120 x g en aspireer het supernatant. Resuspend de celkorrel met verse glia medium en zaad in celkweek gerechten (ongeveer 105 cellen/cm2).
- Vervang medium de volgende dag door een vers gliamedium om niet-aangehed cellen te verwijderen.
- Voed de glia-gerechten elke 3-4 dagen met vers gliamedium. Sla de kolf 5-10 keer met een hand om los losgemaakte cellen los te maken voordat u van medium verandert.
- Na 10 dagen kweek moeten gliacellen bijna samenvloeien. Maak gliacellen los met 0,25% trypsine-EDTA en zaai ongeveer 105 cellen in een nieuwe celkweekschaal van 60 mm. Resterende cellen kunnen worden ingevroren voor toekomstig gebruik.
- 3 dagen voor de cultuurdag, verander het glia medium naar neuronaal kweekmedium (Neurobasal-A Medium met 1x GlutaMAX-I en 1x B27 supplement).
3. Cultuur hippocampale neuronen
OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Ontleed 6-8 hippocampi van postnatale 1-daagse pups van ANK3-E22/23f/f muizen met HBSS medium in een Petrischaaltje op kamer gematigd. Hak de hippocampi met dissectieschaar in kleinere stukken. Breng hippocampi over van de Petrischaal naar een buis van 15 ml.
- Was hippocampi 2x met 5 ml HBSS in de tube. Laat de hippocampi na het wassen in 4,5 ml 1x HBSS staan.
- Voeg 0,5 ml 2,5% trypsine toe aan 4,5 ml HBSS en incubeer gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Keer de buis om de 5 minuten om. Goed verteerde hippocampi moeten plakkerig worden en een cluster vormen. Verleng indien nodig de spijsvertering nog 5 minuten.
- Was hippocampi met HBSS 3 keer gedurende elk 5 minuten. Gebruik geen vacuüm om de HBSS te verwijderen. Het is heel gemakkelijk om de hippocampi te verwijderen.
- Voeg na het wassen 2 ml HBSS toe en pipet de hippocampi 15 keer op en neer met een Pasteur pipet.
- Tritureer het weefsel met een vuurgepolijste Pasteur pipet (de diameter van de open is met de helft vernauwen) 10 keer. Ga niet verder dan 10 keer, zelfs als er nog steeds brokken over zijn. Horen doodt neuronen.
- Laat de buis 5 minuten rusten tot alle brokken op de bodem zijn gezet. Gebruik voorzichtig een pipetpunt van 1 ml om het supernatant met de gedissocieerde neuronen over te brengen naar platingschalen (105 cellen/60 mm schotel). Voeg het direct toe aan het voorgeïncubeerde beplatingsmedium en schud de plaat zachtjes.
- Herhaal stap 3.6-3.7 met de resterende brokken totdat de meeste brokken zijn verdwenen.
- 2-4 uur na het zaaien, controleer de plating gerechten met een lichte microscoop. De meerderheid van de neuronen moet zich aan de coverslip hebben bevestigd. Aange gehechte cellen zijn rond en helder. Flip coverslips met behulp van een fijne tip forceps naar de glia cel feeder gerechten met geconditioneerde neuronale cultuur medium met de wax dots kant naar beneden gericht.
- Neuronen kunnen maximaal 1 maand in de gliacelvoederschalen groeien. Voer neuronen elke 7 dagen met 1 ml vers neuronaal cultuurmedium.
- Optionele stap: Voeg 1 week na het zaaien cytosine arabinoside (1-β-D-arabinofuranosylcytosine) toe aan een uiteindelijke concentratie van 5 μM om de gliale proliferatie te beteugelen.
4. Verstoring van AIS door knock-out van Ankyrine-G in een eerder stadium van neuronontwikkeling
- Draai op 3 div (dag in vitro)de coverslips met waspunten naar boven gericht op een gliacelvoederschaal met geconditioneerd neuronaal kweekmedium.
- Meng 0,25 μg Cre-BFP DNA met 0,5 μg ankyrine-G-GFP (WT/mutant) DNA in een buis van 1,7 ml om 4 coverslips (~ 2:1 verhouding van het DNA-kopienummer) te transfecteren. Voeg 100 μL kweekmedium (bijv. Opti-MEM) toe, meng en rust op een rek. Als alleen Cre-BFP wordt getransfecteerd, wordt de GFP plasmide backbone gebruikt om overeen te komen met de totale hoeveelheid DNA.
- Meng 3 μL transfectiereagens (bijv. Lipofectamine 2000) (~ 3 keer DNA) met 100 μL kweekmedium in een nieuwe buis van 1,7 ml. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Meng 100 μL DNA-oplossing uit stap 4.2 met 100 μL transfectiereagens uit stap 4.3. Rust 5-10 minuten op een rek.
- Voeg 50 μL DNA-mix toe vanaf stap 4.4 direct bovenop elke coverslip door de punt net onder het medium in te brengen zonder de coverslips aan te raken. Pipet langzaam om verspreiding van DNA-mix te voorkomen.
- Breng het gerecht langzaam terug naar de incubator en incubeer gedurende 30-45 minuten.
- Draai de coverslips terug naar de home glia feeder dish met wax dots kant naar beneden en leg de plaat terug naar de incubator.
5. Kwantificering van axon initiële segment
- Fix neuronen op 7-10 div en vlek met AIS marker volgens de standaard immunocytochemie protocol voor het eiwit van interessant.
- Verzamel fluorescerende foto's met de gewenste microscopie.
- Neem secties uit de Z-serie om het signaal van het hele AIS te verzamelen. Houd dezelfde Z-diepte voor alle foto's.
- Pas de laserintensiteit aan om het beste dynamische bereik voor pixelintensiteit te bereiken.
- Zorg ervoor dat alle AIS-foto's op dezelfde microscoopopstelling zijn gemaakt.
- Controleer altijd het signaal van Cre-BFP.
- AIS-kwantificering
- Open foto met Fiji (https://fiji.sc).
- Genereer maximale projectie van afbeeldingen uit de Z-serie.
- Trek het lege coverslip achtergrondsignaal van de afbeelding af.
- Teken een lijn langs de AIS. De breedte van de lijn moet het AIS volledig bedekken. Start de lijn voordat het AIS-signaal boven de achtergrond wordt verhoogd en stop nadat het naar de achtergrond is gedropt.
- Meet alleen de gemiddelde pixelintensiteit van de lijn en exporteer naar een spreadsheet (~ 10-15 AISs zijn nodig).
- Genereer de gemiddelde intensiteitscurve van AIS met behulp van het MATLAB-script dat is aangepast aan Berger et al.15.
- Voor elk experiment, omvatten Cre alleen en Cre plus wildtype 480 kDa ankyrine-G getransfecteerde neuronen als negatieve en positieve controles om ervoor te zorgen dat de knock-out van AIS is efficiëntie en de redding is succesvol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een volledige reeks experimenten moet cre-BFP alleen transfectie als negatieve controle, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrine-G co-transfectie als positieve controle en een niet-getransfecteerde toestand als techniekcontrole omvatten. In cre-BFP alleen controle, transfected neuronen missen de accumulatie van AIS markers, met inbegrip van ankyrine-G (ankG), beta4-spectrine (β4), neurofascin (Nf) en voltage gated sodium channels (VSVG) (Figuur 4A)16. Cre en 480 kDa ankyrine-G co-getransfecteerde neuronen hebben daarentegen AIS volledig geassembleerd, onthuld door het heden van AIS-markers (Figuur 4B). Het is belangrijk om de kwaliteit van de cultuur te bevestigen door te vergelijken met de niet-getransfecteerde gerechten. Ongezonde neuronen vertonen meestal een abnormale AIS-structuur, zoals gestaakte of ectopische AIS (Figuur 4C).
Vervolgens toonden we een voorbeeld van het evalueren van hoe een ankyrine-G menselijke neuroontwikkelingsstoornismutatie (ankG-K2864N) de AIS-assemblage beïnvloedt (Figuur 5). 3 div ANK3-E22/23f/f neuronen werden getransfecteerd met Cre-BFP en wildtype 480 kDa ankyrine-G (ankG-WT) of 480 kDa ankyrine-G baring menselijke mutatie (ankG-K2864). Neuronen werden gefixeerd op div7 en gekleurd voor ankyrine-G. Beelden werden verzameld van 10-15 getransfecteerde neuronen en 10-15 controleneuronen op dezelfde coverslips en verwerkt met maximale intensiteitsprojectie. Vervolgens trekken we een lijn bij het AIS zoals getoond en meten we de gemiddelde intensiteit over de lijn. Na het gemiddelden van de AIS-intensiteit, plotten we de AIS-intensiteit van de soma tot het distale axon. AIS verrijkt eiwit vertoonde normaal gesproken een snelle toename van het signaal van het proximale axon en een langzame afname van het signaal naar het distale axon. AIS geassembleerd door ankyrine-G met menselijke mutant toonde een toename en afname van het signaal. Maar wanneer uitgelijnd met de niet-getransfecteerde AIS, is de mutante curve breder en is de piek van de curve lager, wat wijst op een structuurverandering van AIS. Het wilde type ankyrine-G verzamelde AIS nauw afgestemd op de niet-getransfecteerde.
Figuur 1: De genomische bewerking van ANK3-E22/23-flox. (A) Schematische weergave van eiwitdomeinen voor 3 ankyrine-G isovormen. De locatie van exon 22 en 23 gecodeerde regio's in canoniek domein wordt aangegeven door de streepjeslijn. (B) De positie van LoxP-locaties in ANK3-E22/23-floxmuizen wordt aangegeven door een driehoek. In het heden van Cre recombinase, exon 22 en 23 wordt verwijderd en veroorzaakt verlies van de expressie van alle 3 isovormen van ankyrine-G. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Verlies van AIS in ANK3-E22/23-flox neuronen in het heden van Cre recombinase. Een diagram toont het tijdsbestek van ankyrine-G expressie en AIS assemblage in wild type neuronen versus in ANK3-E22/23f/f neuronen met Cre transfectie op 3 div. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Workflow van protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Een volledige redding van AIS door 480kDa AnkG in ANK3-E22/23-flox neuronen getransfecteerd met Cre. 3 div neuronen van ANK3-E22/23f/f muizen werden getransfecteerd met Cre-BFP (A) of met een Cre-BFP en wild type 480 kDa ankyrine-G-GFP (B). Neuronen werden gefixeerd op 7 div en gekleurd voor ankyrine-G (ankG), β4-spectrine (β4), neurofascine (Nf) en voltage gated sodium channels (VSVG). Witte pijlpunt wijst naar de AIS van een getransfecteerd neuron. Schaalbalk is 20 μm. Dit cijfer werd aangepast van Yang et al16. (C) Twee ongezonde neuronen getransfecteerd met tdTM en 480 kDa ankyrine-G-GFP werden getoond. De vorming van aggregaten (omcirkeld in wit en vergroot) is een teken van ongezonde neuronen. Boven: 480 kDa ankyrine-G verschijnt in het niet-AIS-gebied (gericht door witte pijlpunten. Onder: Neuron gevormd 3 AIS en ectopische accumulatie van ankyrine-G op soma. Schaalbalk is 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van AIS structurele verandering. div3 neuronen van ANK3-E22/23f/f muizen werden getransfecteerd met Cre-BFP en wild type 480 kDa ankyrine-G of 480 kDa ankyrine-G-K2864N. Bij 7 div werden neuronen gefixeerd en gekleurd voor ankyrine-G. Representatieve beelden tonen het ankyrine-G signaal bij het AIS. De groene lijn en gele lijn geven aan waar de lijn voor AIS-intensiteitsmeting is getekend. Witte streepjeslijn omcirkelde het cellichaam van het getransfecteerde neuron. Schaalbalk is 20 μm. De gemiddelde AIS-intensiteit voor beide omstandigheden wordt alleen op afstand uitgezet en uitgelijnd met niet-getransfecteerde cellen (n=10). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De assemblage van AIS wordt georganiseerd door 480 kDa ankyrin-G. Ankyrine-G heeft echter kortere isovormen die zich kunnen richten op de AIS van wildtype neuronen, wat kan leiden tot problemen bij de interpretatie van structuurfunctieanalyses van AIS-assemblage. Hier presenteren we een methode met neuronen van ANK3-E22/23-flox muizen die studie van de novo assemblage van de AIS mogelijk maakt. Door te transfecteren met Cre-BFP op 3 div, elimineren we alle endogene isovormen van ankyrine-G. We kunnen ook 480 kDa ankyrine-G co-transfecteren om de vorming van AIS te redden. Dit maakt studie van AIS-vorming in een schoon systeem mogelijk. Door verder gebruik te maken van het Banker-cultuursysteem dat de levensvatbaarheid verbetert zonder complicaties van gliacelovergroei, zouden we een hoge transfectie-efficiëntie kunnen bereiken, die ons voldoende neuronen biedt voor kwantitatieve meting van AIS-dimensies.
Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol. De eerste kritieke stap is het overwegen van het beste tijdvenster om de transfectie uit te voeren, die vroeg genoeg moet zijn om de assemblage van AIS te voorkomen en laat genoeg om de hoogste transfectie-efficiëntie te bereiken. We probeerden 0 div elektroporatie transfectie, die gaf ongeveer 10% transfectie efficiëntie met Cre-BFP alleen, maar we waren nooit in staat om transfect 480 kDa Ankyrin-G op 0 div. We vermoeden dat het te wijten is aan de grote omvang van de plasmide (ongeveer 20 kb). Primaire gekweekte hippocampale neuronen hebben een smal venster voor transfectie, dat is tussen 3-5 dagen. De accumulatie van ankyrine-G bij het AIS begint vanaf 3 div. Wanneer we Cre-BFP transfecteren bij 3 div, werd er geen AIS-formatie waargenomen in getransfecteerde neuronen (Figuur 4A). We kunnen 10-20 neuronen transfecten met 480 kDa ankyrine-G van een 18 mm coverslip. Ook voor het co-transfectiereddingsexperiment moet al het DNA onder dezelfde promotor worden gegenereerd en moet de verhouding van Cre-BFP en 480 kDa ankyrine-G-GFP worden geëvenaard. In dit experiment gebruikten we kip bèta-actine promotor.
Een andere cruciale stap is de aanpassing aan de bankierscultuur. De Banker-cultuur is ontwikkeld voor het cultiveren van embryonale rattenneuronen. Om het meer gevoelige postnatale hippocampale neuron van muizen beter te ondersteunen, nemen we een stap op van het hakken van hippocampi in kleinere stukken om de trypsinisatie-efficiëntie te verbeteren. Het toevoegen van KOH-behandeling na de salpeterzuurbehandeling verminderde de toxiciteit van de glasafdekkingslips verder, waardoor neuronen zich beter hechten en groeien.
Een resterende uitdaging is hoe het expressieniveau van ankyrine-G te beheersen. Een doseringsscherm hielp bij het bepalen van de optimale hoeveelheid plasmide die wordt gebruikt voor transfectie. In de toekomst is het beter om een neuron-specifieke promotor te gebruiken om het expressieniveau te regelen. De huidige gegevensanalyse heeft de positie van AIS niet gemeten. Deze functie moet in de toekomst worden opgenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Dr. Gary Banker voor suggestie over neuronaal cultuur protocol. Dit werk wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute, een beurs van NIH, en een George Barth Geller begiftigd hoogleraarschap (V.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
References
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G.
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
