Summary

Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct

Published: May 11, 2020
doi:

Summary

Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.

Abstract

L’enregistrement intracellulaire des motoneurones spinaux in vivo fournit une « norme d’or » pour déterminer les caractéristiques électrophysiologiques des cellules dans le réseau spinal intact et détient des avantages significatifs par rapport aux techniques classiques d’enregistrement in vitro ou extracellulaire. Un avantage des enregistrements intracellulaires in vivo est que cette méthode peut être effectuée sur des animaux adultes avec un système nerveux entièrement mature, et donc de nombreux mécanismes physiologiques observés peuvent être traduits à des applications pratiques. Dans cet article méthodologique, nous décrivons cette procédure combinée avec la stimulation de courant constant appliquée à l’extérieur, qui imite les processus de polarisation se produisant dans les réseaux neuronaux spinaux. La stimulation trans-spinale à courant continu (tsDCS) est une méthode novatrice de plus en plus utilisée comme intervention neuromodulatoire en réadaptation après diverses lésions neurologiques ainsi que dans le sport. L’influence du tsDCS sur le système nerveux reste mal comprise et les mécanismes physiologiques derrière ses actions sont largement inconnus. L’application du tsDCS simultanément avec des enregistrements intracellulaires nous permet d’observer directement les changements des propriétés de la membrane du motoneuron et les caractéristiques de la cuisson rythmique en réponse à la polarisation du réseau neuronal de la colonne vertébrale, ce qui est crucial pour la compréhension des actions tsDCS. En outre, lorsque le protocole présenté inclut l’identification du motoneuron en ce qui concerne un muscle innervé et sa fonction (fléchisseur contre extenseur) ainsi que le type physiologique (rapide par rapport à lent), il fournit l’occasion d’étudier sélectivement l’influence de tsDCS sur les composants identifiés des circuits rachidiens, qui semblent être affectés différemment par la polarisation. La procédure présentée se concentre sur la préparation chirurgicale pour les enregistrements intracellulaires et la stimulation en mettant l’accent sur les étapes qui sont nécessaires pour atteindre la stabilité de préparation et la reproductibilité des résultats. Les détails de la méthodologie de l’application anodal ou cathodal tsDCS sont discutés tout en prêtant attention aux questions pratiques et de sécurité.

Introduction

La stimulation trans-spinale à courant direct (tsDCS) gagne en reconnaissance comme méthode puissante pour modifier l’excitabilité du circuit spinal dans la santé et la maladie1,2,3. Dans cette technique, un courant constant est passé entre une électrode active située au-dessus de segments de la colonne vertébrale sélectionnés, avec une électrode de référence située soit ventrally ou plus rostrally4. Plusieurs études ont déjà confirmé que tsDCS peut être utilisé dans la gestion de certaines conditions pathologiques, telles que la douleur neuropathique5, spasticité6, lésion de la moelle épinière7 ou pour faciliter la réadaptation8. Les chercheurs suggèrent que le tsDCS évoque des altérations de la distribution des ions entre l’espace intracellulaire et l’espace extracellulaire à travers la membrane cellulaire, ce qui peut faciliter ou inhiber l’activité neuronale en fonction de l’orientation actuelle9,10,11. Cependant, jusqu’à récemment, il manquait une confirmation directe de cette influence sur les motoneurons.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mener l’enregistrement intracellulaire in vivo des potentiels électriques des motoneurones lombaires spinaux dans le rat anesthésié avec application simultanée de tsDCS, afin d’observer des changements dans la membrane de motoneuron et les propriétés de tir en réponse à la polarisation anodale ou cathodale du réseau neuronal spinal. Les enregistrements intracellulaires ouvrent plusieurs domaines d’investigation des propriétés des neurones, non disponibles pour les techniques extracellulaires précédemment utilisées9,12. Par exemple, il est possible de mesurer avec précision la réponse de la tension de la membrane motoneuron au flux de courant direct induit par tsDCS, d’indiquer le seuil de tension pour la génération de pointes ou d’analyser les paramètres potentiels d’action. En outre, cette technique nous permet de déterminer les propriétés de la membrane passive motoneuron, telles que la résistance aux entrées, et d’observer la relation entre le courant de stimulation intracellulaire et la fréquence de tir rythmique des motoneurons. L’identification antidromique du motoneuron enregistré, basée sur la stimulation des nerfs fonctionnellement identifiés (c.-à-d. les nerfs fournissant des efferents aux fléchisseurs ou aux extenseurs) nous permet d’identifier en outre les types d’unités motrices innervés (rapides ou lentes), ce qui donne l’occasion de tester si la polarisation influence différemment les éléments individuels du système neuronal rachidien mature. En raison d’une intervention chirurgicale étendue précédant l’enregistrement et des exigences élevées en matière de stabilité et de fiabilité des enregistrements, cette technique est très difficile, mais permet une évaluation directe et à long terme des caractéristiques électrophysiologiques d’un motoneuron : avant, pendant et après l’application de tsDCS, ce qui est crucial pour déterminer à la fois ses actions aiguës et ses effets persistants13. Comme un motoneuron active directement les fibres musculaires extrafusales14 et prend part au contrôle de rétroaction d’une contraction musculaire et a développé la force15,16 toute influence observée de tsDCS sur l’unité motrice ou les propriétés contractiles musculaires peuvent être liées à des modulations de l’excitation motoneuron ou des caractéristiques de tir.

Protocol

Toutes les procédures liées à ce protocole ont été acceptées par les autorités compétentes (par exemple, comité local d’éthique) et respectent les règles nationales et internationales relatives au bien-être et à la gestion des animaux. REMARQUE : Chaque participant à la procédure doit être correctement formé aux interventions chirurgicales de base et doit avoir une licence valide pour effectuer des expériences sur des animaux. 1. Anesthésie et pr?…

Representative Results

Les paramètres des potentiels d’action et plusieurs propriétés membranaires peuvent être calculés sur la base d’enregistrements intracellulaires lorsque des conditions stables de pénétration cellulaire sont assurées. La figure 1A présente un potentiel d’action orthodrémique typique évoqué par la stimulation intracellulaire, qui répond à tous les critères d’inclusion des données (le potentiel de membrane de repos d’au moins -50 mV, et l’amplitude des pointes supér…

Discussion

S’il est exécuté correctement, la partie chirurgicale du protocole décrit doit être complétée dans un délai d’environ trois heures. Il faut prendre un soin particulier dans le maintien des conditions physiologiques stables d’un animal pendant la chirurgie, en particulier la température corporelle et la profondeur de l’anesthésie. Outre les considérations éthiques évidentes, un manque d’anesthésie appropriée peut entraîner des mouvements excessifs des membres pendant la dissection nerveuse ou lami…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par la subvention du National Science Center no 2017/25/B/NZ7/00373. Les auteurs souhaitent reconnaître le travail de Hanna Drzymała-Celichowska et Włodzimierz Mrówczyński, qui ont tous deux contribué à la collecte et à l’analyse des données des résultats présentés dans cet article.

Materials

Durgs and solutions
Atropinum sulfuricum Polfa Warszawa
Glucose Merck 346351
NaHCO3 Merck 106329
Pancuronium Jelfa PharmaSwiss/Valeant Neuromuscular blocker
Pentobarbital sodium Biowet Puławy Sp. z o.o Main anesthetic agent
Pottasium citrate Chempur 6100-05-06
Tetraspan Braun HES solution
Surgical equipment
21 Blade FST 10021-00 Scalpel blade
Cauterizer FST 18010-00
Chest Tubes Mila CT1215
Dumont #4 Forceps FST 11241-30 Muscle forceps
Dumont #5 Forceps FST 11254-20 Dura forceps
Dumont #5F Forceps FST 11255-20 Nerve forceps
Dumont #5SF Forceps FST 11252-00 Pia forceps
Forceps FST 11008-13 Blunt forceps
Forceps FST 11053-10 Skin forceps
Hemostat FST 13013-14
Rongeur FST 16021-14 For laminectomy
Scissors FST 15000-08 Vein scissors
Scissors FST 15002-08 Dura scissors
Scissors FST 14184-09 For trachea cut
Scissors FST 104075-11 Muscle scissors
Scissors FST 14002-13 Skin scissors
Tracheal tube Custom made
Vein catheter Vygon 1261.201
Vessel cannulation forceps FST 18403-11
Vessel clamp FST 18320-11 For vein clamping
Vessel Dilating Probe FST 10160-13 For vein dissection
Sugrgical materials
Gel foam Pfizer GTIN 00300090315085 Hemostatic agent
Silk suture 4.0 FST 18020-40
Silk suture 6.0 FST 18020-60
Equipment
Axoclamp 2B Molecular devices discontinued Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A
CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor CWE 11-10000 Gas analyzer
Grass S-88 A-M Systems discontinued Constant current stimulator
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe Harvard Apparatus 507222F Heating system
ISO-DAM8A WPI 74020 Extracellular amplifier
Microdrive Custom made/replacement IVM/Scientifica
P-1000 Microelectrode puller Sutter Instruments P-1000 Microelectrode puller
SAR-830/AP Small Animal Ventilator CWE 12-02100 Respirator
Support frame Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting
Spinal clamps Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting
TP-1 DC stimulator WiNUE tsDCS stimulator
Miscellaneous
1B150-4 glass capillaries WPI 1B150-4 For microelectrodes production
Cotton wool
flexible tubing For respirator and CO2 analyzer connection
MicroFil WPI MF28G67-5 For filling micropipettes
Silver wire For nerve electrodes

References

  1. Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
  2. Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
  3. Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neuroscience. 393, 150-163 (2018).
  4. Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
  5. Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
  6. Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
  7. de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
  8. de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
  9. Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
  10. Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
  11. Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
  12. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
  13. Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
  14. Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
  15. Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
  16. Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
  17. Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
  18. Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
  19. Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
  20. Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
  21. Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
  22. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
  23. Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
  24. Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
  25. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  26. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
  27. Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
  28. Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).

Play Video

Cite This Article
Bączyk, M., Krutki, P. In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation. J. Vis. Exp. (159), e61439, doi:10.3791/61439 (2020).

View Video