Medicine

新生児腸管の発達に及ぼす急性絨毛膜炎の影響を研究する母体炎症への胎児暴露のマウスモデル

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464

Brian A. Juber¹, Timothy G. Elgin¹, Erin M. Fricke², Huyiu Gong¹, Jeffrey Reese³, Steven J. McElroy^1,4

¹Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, ²Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, ³Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, ⁴Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

生きた生物の合併症を伴わない胎児の母体炎症(FEMI)をシミュレートする絨毛膜炎のモデルを開発し、子孫の腸管の発達に及ぼすFEMIの影響を調べた。これは、絨毛膜炎後の腸の損傷の発症のための機械化原因の研究を可能にする。

Abstract

絨毛膜炎は早産の一般的な沈殿物であり、壊死性腸炎(NEC)を含む多くの未熟児の罹患率に関連している。しかし、これら2つの条件間の機械的なリンクはまだ発見されていない。我々は、リポ多糖(LPS)誘発胎児の母体炎症(FEMI)を含む絨毛膜炎のマウスモデルを採用した。FEMIのこのモデルは、生殖不能、胎盤、および胎児の炎症性カスケードを誘発し、臨床絨毛膜炎の多くの症例にも存在する。生きた細菌を利用し、より正確に絨毛膜炎をもたらす上昇感染の病態生理を模倣するモデルが存在するが、これらの方法は、未熟な腸管および関連する開発マイクロバイオームの発達に間接的な影響を及ぼす可能性がある。このプロトコルを用いて、LPS誘導FEMIが妊娠喪失および早産の用量依存的増加、ならびに子孫における正常な腸の発達の中断をもたらすことを実証した。さらに、FEMIは子孫の腸損傷および血清サイトカインを有意に増加させる一方で、腸の炎症に対する先天性免疫の第1行を提供するゴブレットおよびパネス細胞を減少させることが実証された。LPS誘導FEMIの同様のモデルは、絨毛膜炎とその後の中枢神経系の異常との関連をモデル化するために使用されてきたが、このプロトコルは、絨毛膜炎と後の腸内発達の間の機械化リンクを発育する最初の試みである。

Introduction

絨毛膜は哺乳類の妊娠に不可欠な役割を果たす。これらは、複数の機能を提供する絨毛と羊膜が含まれています。それらは胎児を取り囲んで保護し、母体と胎児の区画¹間のパラクリンシグナル伝達を促進し、そして分化の開始に関与し得る絨毛膜内に局所的なフィードバックループを作り出す^。膜の現在の理解は、羊膜が構造的なバリア機能を提供することを示し、そして絨毛膜は、主に母親の免疫系²から発達中の胎児を保護するために免疫学的緩衝液を提供する。これらの膜の炎症は、絨毛膜炎として知られています。歴史的に、臨床絨毛膜炎の診断は、母体熱に加えて1つ以上の胎児または母親の臨床所見^3,4の存在に続いて行われた。しかし、この定義は臨床的に有用であるが、その精度の欠如は、絨毛膜炎の研究を困難にしている。2015年、診断を明らかにしようとして、ユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健人間開発研究所による専門家パネルワークショップは、子宮内炎症、または感染症、またはその両方(トリプル^I)3として絨毛膜炎を定義した。微生物誘発感染は子宮/羊膜炎症の重要な原因であるが、滅菌子宮/羊膜炎症^5、6、7よりも一般的に起こらないので^、この明確化は重要である。全体として、絨毛膜炎は、定期出産の2\u20124%および早産期期の25\u201230%8,9に見られるように^、依然として重大な公衆衛生上の問題である。

絨毛膜炎は胎児および新生児に重大な影響を及ぼす可能性がある。絨毛膜炎は、気管支肺異形成10、脳白器損傷^11、脳内出血^12、前産児¹³の網膜症、および早期発症新生児敗血症^14、15を含む多くの未熟児罹患率のリスクの増加に関連することが文献に十分に文書化されている。未熟腸管の損傷や修復機構に関心を持つため、絨毛膜炎は壊死性腸炎^(NEC)15,16の後の発症にも関連していることに注意することが重要である。NECは早産児の壊滅的な胃腸疾患であり、炎症およびその後の腸壊死に対する調節不全宿主応答^{をもたらす。}毎年、NECは米国で4000人以上の乳児に影響を及ぼし、これらの乳児の3分の1までは¹⁸の病気で死亡する。NECの病因は、腸の未熟さ、未熟免疫系の調節不変性、腸内炎症、細菌転位¹⁹の組み合わせを含み、腸壊死の最終的な共通経路で最高潮に達する可能性が高い。重要なことに、NECの発症は出生後数週間および絨毛膜炎への潜在的な暴露によってしばしば起こり、絨毛膜炎とその後のNECの発症との間の機械論的なつながりを²⁰に不明瞭にする。絨毛膜炎がNECの病態生理学に寄与する可能性のあるメカニズムの1つは、母親の免疫系のアップレギュレーションを通じて、その後、正常な胎児発達パターン^21、22、23を破壊する可能性のある強い胎児炎症反応を生じさせる。

絨毛膜炎の複数の哺乳類モデルは、げっ歯類および羊24、25、26、27、28、29、30、31、32に存在する。しかし、絨毛膜炎誘発性胎児の母体炎症(FEMI)への初期の新生児期を超えて腸管の発達に関するデータはほとんど存在しない。FEMIとそれに伴う未熟腸管の損傷の発症との関係を探るため、我々はリポ多糖(LPS)誘導型FEMIモデルを適応させました。リポ多糖は、グラム陰性細菌上の細胞外表面の主要な成分であり、ヒト³³を含む複数の真核生物種の自然免疫系の強力な刺激剤である。母体LPS注射は、生きた細菌の交感作用を伴わない無菌炎症カスケードをもたらし、早産³⁴の誘導のための確立されたモデルであり、また、最も重篤な形態の絨毛膜炎^24、35である急性絨毛膜炎および胎児炎症反応症候群(FIRS)のモデルである。また、羊モデル³⁶とマウスモデル^{37、38、39、40}の脳白と灰色物質の両方の傷害を誘発することが示されている。しかし、我々の知る限りでは、この絨毛膜炎とFEMIのモデルを使用して、過去の出生時の胃腸管の発達への影響を調べるとともに、絨毛膜炎と後にNEC^41,42の発症との間の可能な機械化の関連を調査する。

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Protocol

すべての動物の手順は、アイオワ大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されました (プロトコル#8041401).すべての動物は、アイオワ大学でラボ動物ケアの評価と認定協会(AALAC)承認されたビバリウムに収容されました。全てのマウスは野生型株C57Bl/6Jであった。

1. 妊娠中マウスにおけるFEMIの確立

LPSの準備
1. 大腸菌O55:B5(ストック濃度2mg/mL)に由来するLPSを使用してください。
2. LPSストック濃度1:100、滅菌生理食塩水を使用して、作業濃度20μg/mLを使用します。
母体LPS注射
1. 妊娠日e15で妊娠中のダムを注入します。この時点は、マウスの妊娠を通じて約75%であり、このモデルは、絨毛膜炎による早産の大部分が発生するヒト妊娠の第3学期の初期に発達的に似ています。
2. 注射の直前に妊娠中のマウスの体重を量り、適切なLPS投与を決定する。
3. 100 μg/kg の LPS の総投与量の 5 μL x グラム体重 (gbw) を使用して、作業濃度の線量を計算します。コントロール動物の場合は、通常の生理液剤の同等の量を注射に使用します。
4. 各注射の前に高い15秒間の渦LPS溶液を3回。
5. LPSのボリュームを1mLのシリンジに引き上げる。
6. 擦り傷の技術で妊娠中のマウスを拘束します。後回しの不用な位置に保持し、注射を行います.
  1. 30ゲージ8mmの針を、腹部の右下象限(膀胱および腹部の血管を避けるために)上に30\u201240°の角度で挿入します。針の長さを約1/4~1/2に挿入します。
  2. 注射器プランジャーを引き戻し、注入する前に負圧を確保します。負圧が存在する場合は、射出を続行します。
  3. 注射後、マウスを約30分間監視し、残りの妊娠のためにケージに戻します。

2. 子孫の出産とケア、腸の収穫

e20で膣分娩を介して正常に子犬を送達する。
注:このモデルは 、図1 で見ることができる予想用量依存性胎児の損失率を有し、以下の結果で議論されている。
子犬が母親と一緒に残り、アドリビタムフィードを受け取ることを許可します。
収穫日には、通常、出生後14日目(P14)、制度的動物ケアと使用委員会のプロトコルに従って子宮頸部脱臼を介して子犬を安楽死させます。
はさみと鉗子を使用して、腹部の全長に対して、皮膚と腹腹を通して、腹部の正中線を垂直に切開する。胃からセカムに小腸をはさみで切除し、鉗子で腸間腸を取り除きます。
小腸の遠位1/3(ヒトの回腸を代表するセクション)を分離して保持し、近位小腸、盲腸、結腸を捨てる。
はさみを使用して、回腸部分を半分に分割します。
後でRNA定量を行うため、RNA安定化液に近位半分を入れる。
スライド準備のために10%中性緩衝ホルマリンに遠位半分を入れます。

3. 腸の損傷スコアリング

パラフィン埋め込まれた組織を5μmの厚いスライスに入れ、ガラススライドに取り付けます。

注:パラフィンの埋め込み、切り離し、スライドへの取り付けのために、標本をヒストロジーコアに送ります。
標準的な手順に従ってスライドを分離します。
標準的な手順に従ってヘマトキシリンおよびエオシンの染色切片。
前述の^42、43のように腸の損傷のための3ポイントスケールでセクション^をスコア。
1. 軽顕微鏡を用いて、2人の別々の盲検研究者による一般化された腸損傷を評価し、villus完全性および基原膜⁴³ からの分離を評価する3ポイントスケールで(補足図1)。腸の損傷は、20倍の倍率および数値開口0.50で最もよく評価される。
2. 通常の粘膜を表す0のスコアを割り当てます。
3. 1のスコアを割り当てると、上皮下グルエンハーゲンの空間、空胞化または上皮下持ち上げの発達を包含する軽度の傷害を説明する。
4. 上皮持ち上げおよび空胞化が絨毛の半分以上、絨毛の歪み、または粘膜潰瘍および層の崩壊によって示される重篤な傷害を記述するために2のスコアを割り当てる。

4. パネス細胞とゴブレット細胞の定量化

脱パラフィン後、ステップ2.8からの組織切片の染色スライドは、アルシアンブルー/周期酸シフ染色を用いて、前述の^44,45のゴブレットおよびパネス細胞の両方を示す。
注:アルシアンブルー/周期酸シフ染色はパネス細胞またはゴブレット細胞に固有ではありませんが、私たちの経験では、盲目の経験豊富な研究者は、この染色を使用して、細胞標的抗体と比較して同等の細胞定量を有し、バックグラウンド染色が大幅に少ない^46.
脱パラフィン、染色、脱水スライドは以下の通りである。
1. 10分間、キシレンにスライドを2回沈めます。
  注意:キシレンはヒュームフードに使用する必要があります。
2. 100%EtOHでリンス。
3. 3分間100%EtOHでスライドを水没させ、その後90%のEtOHで3分間、次いで3分間70%のEtOHを、最後に3分間50%のEtOHでスライドを水没させます。
4. 水道水を流して5分間洗います。
  注意:組織サンプルの損失を防ぐために、流水から離れてセクションを向けます。
5. 標準的なコーヒーフィルターとフィルターアルシアンブルー染色液。
6. アルシアブルーのステインで15分間滑り、水道水を流して2分間洗います。
7. 200mLの二重蒸留水で1mgの周期酸を希釈する。このソリューションのスライドを5分間水没させます。その後、水道水を流して1分間洗います。
8. シフの試薬を10分間染色する。水道水を流して5分間洗います。
9. スライドをヘマトキシリンで1分間染色し、水道水を流して2分間洗います。
10. 酸性アルコール(塩酸1mLを99mLで70%EtOHに混合)に1分間沈める。
11. スコットの水道水(水道水中のNaHCO₃ 濃度0.1%)に1分間水没し、水道水を流して1分間洗います。
12. スライドを退避します。
  1. 各スライドを70%のEtOHに10回浸し、その後90%のEtOHで10回、100%EtOHで10回浸します。
  2. 100%EtOHで10分間滑液を沈め、続いてフレッシュキシレンに2回3分間沈水します。
13. 取り付け培地を試料に一滴置き、その上にカバースリップを置きます。
ゴブレットセルカウント
1. 光顕微鏡を使用して、ゴブレット細胞をカウントする(補足図2)。腸組織の各部分について、ゴブレット細胞と500の上皮細胞の数を数え、100上皮細胞あたりの比率としてゴブレット細胞比を発現する。ゴブレット細胞は、20倍の倍率と開口数0.5で最もよくカウントされます。
パネスセルの棚卸
1. 光顕微鏡を使用して、パネス細胞を数える(補足図2)。腸組織の各部分について、腸内窩当たりのパネス細胞の比率として表現する。腸組織の各部分ごとに100腸の納骨堂を数えます。パネスセルは、20x-60倍の倍率と数値絞り0.50-1.30で最もよくカウントされます。

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Representative Results

胚性15日目にFEMIに曝露すると、用量依存性の妊娠喪失と早産率の用量依存率(図1)42に至^る。実験では、妊娠の喪失と未熟児(未熟児と子宮内胎児の終焉の間の50%の損失)を最小限に抑えながら、有意な炎症性侮辱にさらすために100μg/kgのLPS用量を使用することを選択しました。

このアプローチを用いて、次に、FEMIが子孫のその後の傷害に及ぼす影響を調べた。3点の組織学的尺度を用いて一般化された腸の損傷を測定し、出生時(P0)および成人期(P56または8週の生後)に重大な傷害を発見した(図2)。この傷害は、FEMI以外の動物に対する追加の刺激がない場合に起こったことに注意することが重要であり、FEMIだけが新生児マウス腸管の正常な恒常性を破壊することを示唆している。マウスは、生後⁴週間の間に発達し続ける比較的未熟な腸を持って生まれるため^、これは未熟な腸管を有する早産児にも関連する。

腸上皮の正常な発達と未熟な腸管の防御機構の両方に及ぼすFEMIの影響をさらに理解するために、ヒトの腸管の遠位3分の1の小腸管内のムチン産生ゴブレット細胞と抗菌ペプチド産生パネス細胞の数を定量化した。FEMIは、FEMIを持たない動物と比較して、ゴブレット細胞とパネス細胞の両方の損失を誘発することによって腸上皮の正常な組成を破壊することを発見した(図3)。

新生児炎症反応に対するFEMIの影響を調べるには、ELISAを用いて電気化学発光を用いて、IL-1β、IL-10、KC-GRO(IL-8に相当するマウス)、およびIL-6を含む様々な血清炎症マーカーを、FEMIの有無にかかわらず子犬の血清から定量した(図4)。FEMIは、P0ですべてのサイトカインの炎症カスケードを有意に増加させることがわかった。後の年齢における炎症カスケード(P7\u2012P56)は、タイムポイントとサイトカインに基づいて異なった。最も興味深いことに、IL-6の場合、FEMI群と偽群ではP7\u2012P28でも同様のレベルがあったが、二次的介入はなかったにもかかわらず、P56のFEMI群では有意に高いレベルがあった。これは、IL-6がFEMIモデルにおける出生後腸損傷の発症にとって重要なサイトカインであることを実証したので、特に重要である。

図1:妊娠転帰に及ぼすFEMI投与量の影響妊娠のごみの生存は、より高い用量で用量依存性が高く、妊娠喪失率(A)および早産率(B)が高くなる。図は、Frickeら⁴²からの許可を得て適合される。100 μg/kg の LPS 線量を使用した FEMI は、生後 1 週間の子犬の生存率を 50% にします。各データポイントは、n>8個の妊娠および少なくとも3つの個別の実験を代表する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:時間の経過に対する遠位小腸損傷パターンに及ぼすFEMIの影響腸管サンプルは、FEMI(LPSの100 μg/kg)またはシャムコントロールにさらされたマウスから、生後1週間、生後2週間、および8週間の生後採取した。試料は、盲検研究者^42、43によって3点傷害尺度を用いて採点した。それ以上の侮辱のないFEMIだけでは、出生時にかなりの量の傷害、1週間の生後1週間、そして8週間の人生を引き起こした。図は、Frickeらから⁴²の許可を得て適応されています。各データポイントは、少なくとも3つの妊娠ダムから10匹の子犬と少なくとも3つの個々の実験を>nを代表する。マン・ホイットニー非パラメトリックT検定は、各時点で腸の傷害スコアを比較するために使用された。アスタリスクは、p < 0.05 を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:FEMIは、発達中に小腸における正常なゴブレットおよびパネス細胞量の変化を誘発する。腸管サンプルは、FEMI(100 μg/kg LPS)またはシャムコントロールにさらされたマウスから生後1、2、4、および8週の生後に採取した。サンプルをアルシアンブルー/周期酸シフ染色で染色し、ゴブレット細胞とパネス細胞の両方を検出し、これらは盲目の研究者によって定量化された。FEMIを有する動物由来のゴブレット細胞とパネート細胞の両方が、すべての年齢における偽のコントロールと比較して、傾向または有意な減少を示した。エルギンら⁴¹の許可を得て適応した図。各データポイントは、10匹の子犬と少なくとも3つの個別の実験>nを代表する。誤差範囲は平均の標準誤差を表します。学生のT検定を使用して、各時点でゴブレットとパネス細胞の量を比較しました。アスタリスクは、p < 0.05 を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:FEMIは、P0で出生直後にすべてのサイトカインに対して世界的な新生児炎症サージを誘発し、P56でIL-6の後期サージを有する。血清サイトカインを、メーカーの指示に従ってELISAを用いてP0、P7、P14、P28で定量し、プレートを620nmで読み取った。サイトカインの値はレーダープロットでここに表され、すべてのサイトカインは最大値のパーセントとしてプロットされます。対照群と比較して、全サイトカイン(IL-1β、IL-10、KC-GROおよびIL-6)において、対照群のP0(全p<0.05)において有意な増加があった。また、FEMIを持たない子犬のP56でIL-6レベルが復活しました(非パラメトリッククルスカルウォリス試験によるp<0.05)は、この遅い時点での対照と比較してFEMI群で有意に上昇した唯一のサイトカインでした。エルギンら⁴¹の許可を得て適応した図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:H&E染色されたイレラル組織の腸損傷スコアリング。 傷害スコアは、ビリ空転の程度、粘膜潰瘍、層内の重症管損傷、および前述の⁴³の内出血の存在に基づいて、3点の腸損傷スコアリングスケール(0=正常、1=軽度の傷害、2=重傷)によって決定される。エルギンら⁴¹の許可を得て適応した図。こちらをダウンロードしてください。

補足図2:ゴブレットおよびパネス細胞のアルシアンブルー/PAS染色の代表的な外観 腸組織のアルシアンブルー/PAS染色は、腸絨毛(白い矢印でマークされた上部パネル、20倍の拡大で撮影された画像)と、ラミナプロプリアの腸絨毛の下に位置するリーバークーンの納骨堂に存在するパネス細胞(黄色い矢印でマークされた下のパネル、60倍の倍率で撮影された画像)に存在するゴブレット細胞の明確な視覚化を可能にする。こちらをダウンロードしてください。

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Discussion

絨毛膜炎は、2\u20124%の期間および25\u201230%の早産^8,9に影響を及^ぼす。しかしながら、絨毛膜炎の影響は、胎児および新生児^{10、11、12、13、14、15、16}に有意な影響を及ぼすことを示しているので、過去の出生を長く延長することができる。重要なことに、絨毛膜炎は、NEC^15,16のその後の発達に関連することが示されている。まだ不完全に理解されているが、NECの病因は、腸の未熟さ、未熟免疫系の調節不全、腸内炎症、細菌転位の組み合わせを伴い、腸壊死^の最終的な共通経路で最高潮に達する可能性が高い。しかし、絨毛膜炎とその後のNECの発症との間の機械関連は不明である^が20、以前の動物モデルの絨毛膜炎はこの関係を調べるには不十分であった。この知識のギャップに対処するために、我々は新生児の誕生と生存を可能にするために、絨毛膜炎および早産34、37、38、39、40の一般的に使用されるLPS誘発マウスモデルを変更した。その際、絨毛膜炎⁴²に見られる炎症性疾患に近似したモデルを作成し、胎児の母親の炎症(FEMI)への胎児暴露がその後の腸の発達に及ぼす影響を調べた。

このプロトコルにより、LPS誘発FEMIを用いたこの絨毛膜炎のマウスモデルは、短期的および長期的な腸損傷の両方を引き起こし、正常な腸の発達、特にゴブレット細胞とパネス細胞の両方のダウンレギュレーションをもたらし、どちらも腸の炎症に対する先天性免疫の第一線を提供することを実証した。このモデルで見られる腸の損傷および組織学的細胞変化は、NECで見られる傷害を模倣する有効なモデルであることを示している。これは主に、パネス細胞とゴブレット細胞のダウンレギュレーションが共にNECの病因に関与しており、組織学的傷害のパターンは^{、NEC41、42、49}のヒト症例に見られるものと類似しているためである。したがって、このLPS誘発性絨毛膜炎のFEMIモデルは、絨毛膜炎とそれ以降の腸損傷との間の機械化的な関連、特にNECの発症、ならびに生きた細菌を利用する既存のモデルでは不可能な発育微生物叢炎の潜在的な影響を調査するための理想的なモデルである。

生体内では、絨毛膜炎は、しばしば膜の早産破裂や絨毛膜炎の臨床表現型を引き起こし、この病態生理学^{25、28、30、32}をより正確に反映する絨毛膜炎の動物モデルが存在する上昇性細菌感染^を伴う。しかし、我々の研究室では、マイクロバイオームの開発を含む腸の発達を研究しているので、絨毛膜炎のモデルにおける生きた細菌の存在は、マイクロバイオーム分析を混乱させるだろう。したがって、生きた細菌を利用した絨毛膜炎の既存のモデルは、絨毛膜炎と後にNECの発症との間の機械化的なリンクを調査するためには実用的ではない。また、LPSによる絨毛膜炎のモデルは、既に出生後白及び灰色物質の脳損傷³⁶のモデル化に有効であり、この方法が出生時の絨毛膜炎への曝露に関連する未熟児の罹患率をモデル化する有効な方法であることを実証した。

また、このモデルは、FEMIを誘導するために使用されるLPSの用量に大きく依存していることに注意することも重要です。このプロトコルの主要な重要なステップは、LPSの腹腔内注入を伴う妊娠ダムにおけるFEMIの誘導である。したがって、当然のことながら、我々は、これらの実験の結果において、FEMIを誘導するために使用されるLPSの用量が非常に重要であることを発見した。最初の実験では、LPSの用量は、母親の死亡率と関連しておらず、およそ50%の新生児生存と子孫^41、42の重大な腸損傷をもたらしたので^、LPSの100 μg/kgの用量が使用された。

LPSはトール様受容体4(TLR4)複合体に結合し、細胞内シグナル伝達タンパク質の凝集、サイトカイン産生、および炎症促進シグナル伝達⁵⁰の開始をもたらす。TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、およびTLR9を含むトール様受容体(TLR)は、ウイルス、細菌、真菌⁵¹などの様々な病原体および微生物と共に見られる炎症反応の誘導において重要である。興味深いことに、TLR3のアップレギュレーションは、新生児マウスロタウイルスモデルにおける組織学的な腸の損傷およびウイルス脱落の増加と相関することも示されている。さらに、TLR3のノックアウトは、これらの効果⁵²を改善しました。したがって、モデルはTLR4経路を利用するが、他のTRRの刺激が同様の知見を与えるかもしれないと仮定するのが妥当である。

この方法論を用いて、妊娠ダムでのLPS注入が羊水を温めながら母体、胎盤、および胎児の炎症マーカーの増加を引き起こし、胎盤⁴²に直接損傷を誘発することを示すことができた。興味深いことに、この方法論は子宮動脈の抵抗の変化を示さなかった。FEMIモデルはまた、露出した子犬がIL-6依存経路⁴¹を介して有意な腸損傷42を有し、ゴブレット細胞およびパネス細胞⁴¹のような腸の重要な防御機構に影響を与えることができることを示しているので、子孫に大きな影響を与える。この傷害は、新生児の子孫が原因で、その後のLPS誘発腸損傷および炎症⁴¹の影響を受けやすくなり、絨毛膜炎にさらされた乳児がNECを発症する感受性が高まる理由を説明することができる。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

この研究は、国立衛生研究所(DK097335&T32AI007260)とアイオワ大学ステッド家族小児科を通じて部分的に支援されました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056