Summary
इंट्रा-ट्यूमरल विषमता ट्यूमर की एक अंतर्निहित विशेषता है, जिसमें ग्लियोमास भी शामिल है। हमने एक सरल और कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया है जो एकल नाभिक आरएनए और एटीसी अनुक्रमण अध्ययनों के लिए ताजा जमे हुए ग्लियोमा ऊतकों से एकल नाभिक को अलग करने के लिए बफ़र्स और ढाल अपकेंद्री के संयोजन का उपयोग करता है।
Abstract
वयस्क फैलाना ग्लियोमास अंतर और इंट्रा-ट्यूमर विषमता का प्रदर्शन करते हैं। हाल ही में जब तक, बड़े पैमाने पर आणविक प्रोफाइलिंग प्रयासों के बहुमत थोक दृष्टिकोण है कि मस्तिष्क ट्यूमर के आणविक वर्गीकरण के लिए नेतृत्व पर ध्यान केंद्रित किया है । पिछले पांच वर्षों में, एकल सेल अनुक्रमण दृष्टिकोणों ने ग्लियोमा की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं पर प्रकाश डाला है। इन अध्ययनों के बहुमत ताजा ब्रेन ट्यूमर नमूनों का उपयोग किया है प्रवाह साइटोमेट्री या एंटीबॉडी आधारित जुदाई तरीकों का उपयोग कर एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए । आगे बढ़ते हुए, बायोबैंकों से ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों का उपयोग एकल सेल अनुप्रयोगों के लिए अधिक लचीलापन प्रदान करेगा । इसके अलावा, एकल सेल क्षेत्र अग्रिम के रूप में, अगली चुनौती या तो एक ही सेल या बेहतर ट्यूमर जटिलता जानने के लिए एक ही नमूना तैयारी से बहु-omics डेटा उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा । इसलिए, सरल और लचीला प्रोटोकॉल जो एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-seq) और ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमेटिन के लिए उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एसएनएटीसी-seq) के साथ एकल नाभिक परख जैसे विभिन्न तरीकों के लिए डेटा उत्पादन की अनुमति देते हैं, क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण होंगे।
एकल सेल क्षेत्र में हाल ही में प्रगति जैसे 10x जीनोमिक्स मंच जैसे सुलभ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ मिलकर अनुसंधान प्रयोगशालाओं में एकल सेल अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान की है । ब्रेन ट्यूमर विषमता का अध्ययन करने के लिए, हम ताजा जमे हुए ग्लियोमा से एकल नाभिक के अलगाव के लिए एक बढ़ाया प्रोटोकॉल विकसित की है । यह प्रोटोकॉल मौजूदा एकल सेल प्रोटोकॉल को विलीन कर देता है और एक समरूपता कदम को जोड़ती है जिसके बाद निस्पंदन और बफर मध्यस्थता ढाल अपकेंद्रित्र होता है। परिणामस्वरूप नमूने शुद्ध एकल नाभिक निलंबन है कि एक ही नाभिक तैयारी से एकल नाभिक जीन अभिव्यक्ति और क्रोमेटिन पहुंच डेटा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
वयस्कों में सबसे आम प्राथमिक ब्रेन ट्यूमर, डिफ्यूज लोअर ग्रेड ग्लियोमास (एलजीजी), घुसपैठ करने वाले नियोप्लाज्म्स होते हैं जो अक्सर मस्तिष्क गोलार्द्ध में उत्पन्न होते हैं। एलजीजी अंतर-और अंतर-ट्यूमर विषमता दोनों का प्रदर्शन करते हैं, जो न केवल ट्यूमर की आबादी से प्रेरित होता है बल्कि ट्यूमर विकास और प्रगति1, 2,3,4,5में जटिल रूप से शामिल गैर-घातक कोशिकाओं द्वारा भी होता है।
पिछले एक दशक में, ग्लियोमास के क्षेत्र में एकत्र जीनोमिक आंकड़ों का हिमस्खलन हुआ है । ये आंकड़े मुख्य रूप से थोक ट्यूमर अनुक्रमण अध्ययनों से आते हैं और आणविक लक्षण वर्णन और ब्रेन ट्यूमर के वर्तमान वर्गीकरण 5 ,6,6,8,9,10, 11में काफी योगदान दिया है। हालांकि, भले ही इन अध्ययनों से ग्लियोमास से जुड़े व्यापक आणविक परिदृश्य का पता चला, फिर भी चिकित्सीय हस्तक्षेप के बारे में प्रगति की निराशाजनक कमी है। ब्रेन ट्यूमर में उपचार प्रतिरोध के लिए बाधाओं में से एक इंट्रा-ट्यूमर विषमता है। इस मुद्दे के समाधान के लिए,विभिन्न अध्ययन एक ही कोशिका स्तर12, 13, 14, 15,16, 17पर ट्यूमर के भीतर मौजूद जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टॉमिक, प्रोटेओमिकऔरएपिजेनेटिक विषमता पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।
यद्यपि पिछले कुछ वर्षों में एकल कोशिका क्षेत्र में उल्लेखनीय तकनीकी प्रगति हुई है, लेकिन प्रमुख सीमित कारकों में से एक कोशिकाओं को अलग करने और इन प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक ताजा नमूनों की उपलब्धता है। इस सीमा को दूर करने के लिए,18, 19कोशिकाओं के बजाय नाभिक का उपयोग करके, जमे हुए ऊतकों से snRNA-seq और snATAC-seq जैसे परख प्रदर्शन करने में कई सफल प्रयासकिएगए हैं। इनमें से अधिकांश विधियां या तो फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) या निस्पंदन रणनीतियों पर भरोसा करती हैं। एकल कोशिका और एकल नाभिक दोनों दृष्टिकोणों में उनकी ताकत और कमियां हैं। एकल सेल दृष्टिकोण माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट बनाए रखते हैं, जो हालांकि जानकारीपूर्ण हो सकते हैं, उनकी उच्च बहुतायत के कारण ट्रांसक्रिप्टोम कवरेज को भी कम कर सकते हैं। एकल नाभिक अलगाव दृष्टिकोण माइटोकॉन्ड्रियल अंश के उच्च प्रतिशत को खत्म करते हैं, जिससे परमाणु प्रतिलिपियों20के अधिक गहराई से कवरेज की अनुमति होती है।
आरएनए-सेक्यू और एटीएसी-सेक्यू सहित एकल सेल जीनोमिक्स डेटा को परखने के लिए हाल के वर्षों में उपयोग किए गए विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफार्म हैं। सबसे प्रमुख प्लेटफार्मों में से एक एकल सेल जीन अभिव्यक्ति और एकल सेल ATAC प्रोफाइलिंग के लिए 10x जीनोमिक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म है। चूंकि प्लेटफ़ॉर्म माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों की मदद से काम करता है, इसलिए कोई भी मलबा या समुच्चय सिस्टम को रोक सकता है जिससे डेटा, रिएजेंट्स और मूल्यवान नैदानिक नमूनों की हानि होती है। इसलिए, एकल कोशिका अध्ययनों की सफलता काफी हद तक एकल कोशिकाओं/नाभिक के सटीक अलगाव पर निर्भर करती है ।
प्रोटोकॉल है कि हम यहां प्रदर्शित करेगा DroNc-seq और ओमनी-ATAC-seq प्रोटोकॉल का एक थोड़ा संशोधित संयोजन है, और हाल के अध्ययनों के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करता है जोमानव मस्तिष्क18, 19, 21,22,23,24में न्यूरोलॉजिकल विकारों और न्यूरोनल सेल प्रकारों को समझने के लिए snRNA-seq का उपयोग करता है । प्रोटोकॉल फ्रोल्ट्रेशन और ढाल अपकेंद्रित्र के बाद जमे हुए नमूनों के एंजाइमेटिक/यांत्रिक वियोजन के संयोजन का उपयोग करता है और ताजा जमे हुए ग्लियोमा ऊतकों से एकल नाभिक के तेजी से और सटीक अलगाव के लिए अनुमति देता है । हमने ब्रेन ट्यूमर के नमूनों से एक ही नाभिक की तैयारी से snRNA-seq और snATAC-seq डेटा उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है।
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Protocol
जर्मनी के हीडलबर्ग में नेशनल सेंटर फॉर ट्यूमर डिजीज (एनसीटी)- टिश्यू बैंक से ताजा फ्रोजन ग्लियोमा नमूने प्राप्त किए गए । रोगी सामग्री के उपयोग को हीडलबर्ग के चिकित्सा संकाय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और अध्ययन में शामिल सभी रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी ।
1. प्रायोगिक तैयारी
- बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी कदम प्रदर्शन करें।
- प्री-चिल ट्यूब, व्यंजन, रेजर ब्लेड, डूनर्स और कीट 4 डिग्री सेल्सियस तक।
- सभी बफर पहले से तैयार करें। ये बफ़र्स कमरे के तापमान पर स्थिर हैं। बाँझ निस्पंदन की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से सुक्रोज के लिए। स्टॉक की तैयारी को कॉर्सेस एट अल19से संशोधित किया गया है। टेबल 1-7देखें ।
- तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण से नमूने निकालें और चरण 2.1 तक सूखी बर्फ पर रखें।
2. ऊतक विच्छेदन और वियोजन
- ताजा जमे हुए ऊतक नमूना (10-60 मिलीग्राम) को पूर्व-ठंडा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। कीमा/बर्फ पर छोटे टुकड़ों के लिए एक रेजर ब्लेड के साथ ताजा जमे हुए ऊतक काट ।
- एक पूर्व ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब के लिए ठंडा नाभिक लाइसिस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। ऊतक के टुकड़ों को नाभिक लाइसिस बफर युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में रखें, और एक Douncer(सामग्री की तालिका) मेंस्थानांतरित करें।
नोट: दो डोउन्स होमोजेनाइजर मूसल हैं: प्रारंभिक नमूना कटौती के लिए "ढीला" या "ए" मूसल और पूर्ण नमूना समरूपता के लिए "तंग" या "बी" मूसल। - ऊतक के टुकड़ों को लगभग 20 स्ट्रोक के लिए "ढीले" मूसल के साथ Dounce, जब तक घर्षण कम हो जाता है। यदि मलबा मौजूद है, तो नमूना 100 मिमी छलनी के साथ छानने से पूर्व-निकासी हो सकती है।
- पूर्ण ऊतक समरूपता प्राप्त करने के लिए 20 स्ट्रोक के लिए "तंग" मूसल के साथ Dounce।
- समरूप (लगभग 500 माइक्रोल) को पूर्व-ठंडा 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ठंडा लाइसिस बफर के 1 मिलीएल जोड़ें। धीरे-धीरे मिलाएं और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। धीरे-धीरे एक चौड़े बोर पिपेट टिप के साथ मिलाएं और इनक्यूबेशन के दौरान 1-2 बार दोहराएं।
- 30 माइक्रोन छन्नी जाल का उपयोग करके पूरे समरूप को फ़िल्टर करें, 15 एमएल फाल्कन ट्यूब में एकत्र करें और एक नए पूर्व-ठंडा 2 एमएल ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें। एक भी छलनी आमतौर पर पूरे समरूप के लिए पर्याप्त है।
- बड़े मलबे को हटाने और परमाणु झिल्ली की बरकरारता को सत्यापित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें। नाभिक को गोल करने की जरूरत है और परमाणु झिल्ली को विकृत नहीं किया जाना चाहिए । यदि मलबा मौजूद है, तो नाभिक को फिर से फ़िल्टर किया जा सकता है।
- एक बेंच टॉप सेंट्रलाइज पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर नाभिक को सेंट्रलाइज करें। नाभिक युक्त गोली के साथ ~ 50 माइक्रोन को पीछे छोड़ते हुए, सुपरनैंट निकालें। धीरे-धीरे न्यूक्लिय लाइसिस बफर के एक और 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें और बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नाभिक को अपकेंद्रित्र करें। बिना किसी परेशान गोली के सुपरनैंट निकालें, 1x समरूपता बफर (एचबी)(टेबल 4)के 500 एमएल जोड़ें और बिना किसी खर्च के 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, 1x एचबी के एक और 1.0 एमएल में नाभिक को फिर से खर्च करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर नाभिक को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट निकालें और धीरे-धीरे 1x एचबी के 200 माइक्रोन में नाभिक को एक नई 2.0 एमएल ट्यूब में फिर से खर्च करें।
3. रेडिएंट सेंट्रलाइजेशन
- 25% iodixanol की अंतिम एकाग्रता देने के लिए 50% iodixanol समाधान(तालिका 5)के 200 माइक्रोन जोड़ें। 300 एमएल पर पिपेट सेट के साथ 10 बार अच्छी तरह से मिलाएं।
- 25% मिश्रण के तहत 29% iodixanol समाधान(टेबल 6)के 300 माइक्रोल जोड़ें। परतों के मिश्रण से बचने के लिए एक P1000 ठीक टिप का प्रयोग करें।
- 29% मिश्रण के तहत 35% Iodixanol समाधान(तालिका 7)के 300 माइक्रोन जोड़ें। परतों के मिश्रण से बचने के लिए एक P1000 ठीक टिप का प्रयोग करें।
सावधानी: इस कदम के लिए अत्यधिक मात्रा विस्थापन से बचने के लिए पाइपिंग के दौरान पिपेट टिप को धीरे-धीरे हटाने की आवश्यकता होती है। - एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में नमूनों प्लेस, ब्रेक ऑफ के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,५०० एक्स ग्राम पर 20 मिनट के लिए स्पिन ।
- धीरे-धीरे हल्के और प्रकाश के तहत निरीक्षण के बिना नमूनों को हटा दें। 95% शुद्ध नाभिक का एक स्पष्ट सफेद बैंड दूसरी और तीसरी परत(चित्रा 1)के बीच दिखाई देना चाहिए।
4. नाभिक का अलगाव
- 29%-35% के इंटरफेज पर सफेद नाभिक बैंड तक शीर्ष परतों को एस्पिरेट करें।
- एक 200 एमएल की मात्रा में नाभिक बैंड ले लीजिए, एक ताजा ट्यूब और एक 20 माइक्रोन फिल्टर(सामग्री की मेज) केसाथ फिल्टर करने के लिए हस्तांतरण।
नोट: नाभिक को छानने से पहले फिर से निलंबित करने की आवश्यकता नहीं है। - बड़े मलबे को हटाने और परमाणु झिल्ली की बरकरारता को सत्यापित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें। नाभिक को गोल करने की जरूरत है और परमाणु झिल्ली को विकृत नहीं किया जाना चाहिए ।
- एक हीमोसाइटोमीटर पर ट्राइपैन ब्लू धुंधला का उपयोग करके नाभिक की गणना करें और snRNA-seq/snATAC-seq के लिए एलिकोट नाभिक।
5. एकल नाभिक आरएनए और ATAC seq
- तुरंत एकल सेल जीन अभिव्यक्ति और एकल सेल ATAC अभिवाक किट(सामग्री की मेज)का उपयोग कर नाभिक प्रक्रिया ।
नोट: 10x जीनोमिक्स प्रणाली के लिए नाभिक नमूना सांद्रता snRNA-seq के लिए प्रति माइक्रोन 1500-3000 नाभिक हैं, और snATAC-seq के लिए 3500-7000 नाभिक प्रति मीटर μL । नाभिक को 1x पीबीएस का उपयोग करके पतला किया जा सकता है। - जीनोमिक्स कोर सुविधा में परिणामी पुस्तकालयों अनुक्रम।
- डेटा का गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण करें। नाभिक को आगे के विश्लेषण के लिए शामिल किया जाता है यदि उनमें अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूआईयूआई) >1000, जीन >500 की संख्या और माइटोकॉन्ड्रियल जीन का प्रतिशत <5% है, और यूपीआई और जीन के तीन मानक विचलन के भीतर हैं।
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Representative Results
एकल नाभिक जीनोमिक्स सीमित डेटा और प्रोटोकॉल के साथ एक विकसित क्षेत्र है। एक महत्वपूर्ण कारक जो एकल नाभिक परख के परिणाम को प्रभावित करता है, शुद्ध और अक्षुण्ण नाभिक का अलगाव है। हमने अपेक्षाकृत कम समय में ताजा जमे हुए ग्लियोमा ऊतक ब्लॉकों से उच्च गुणवत्ता वाले और शुद्ध नाभिक को अलग करने के लिए दो प्रकाशित प्रोटोकॉल (ड्रोन-सेक्यू और ओमनी-एटीक्यू-एसईक्यू प्रोटोकॉल) को संयुक्त किया जिससे ट्रांसक्रिप्ट्स(चित्रा 1)की स्थिरता बनाए रखी जा सके।
iodixanol/सुक्रोज ढाल का उपयोग कर ढाल अपकेंद्रित्र के साथ विभिन्न निस्पंदन कदमों का उपयोग मलबे के बहुमत के साथ शुद्ध नाभिक के अलगाव के लिए अनुमतिदेता है (चित्रा 2)। एक ही अलग नाभिक तैयारी दोनों snRNA-seq और snATAC-seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि चूंकि उपयोग किए गए नाभिक एक ही नमूने से हैं, इसलिए क्लस्टर उत्पन्न करने और बहु-ओमिक्स परिप्रेक्ष्य25 (चित्रा 3)प्रदान करने के लिए सेराट जैसे पैकेजों का उपयोग करके उत्पन्न डेटा को सह-एम्बेडेड किया जा सकता है।
यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटोकॉल प्रकाशित snRNA-seq डेटासेट के बराबर है, हमने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से संबंधित चार सार्वजनिक रूप से उपलब्ध snRNA-seq अध्ययनों के साथ प्रक्रिया का उपयोग करके प्राप्त डेटा की तुलना की: Slyper एट अल20,झील एट अल26,जक्कल एट अल24 और हबीब एट अल ।18। गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स की तुलना करने के लिए, हम जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही (जियो): GSE104525 (हबीब डेटासेट, २०१७), GSE97930 (झील डेटासेट, २०१८), GSE118257 (जकील डेटासेट, २०१९) और GSE140819 (Slyper डेटा, २०२०) से निम्नलिखित गिनती मैट्रिस डाउनलोड किया । झील डेटासेट के लिए, सेरिबेलर गोलार्द्ध, ललाट प्रांतस्था और दृश्य प्रांतस्था के लिए व्यक्तिगत मैट्रिस को मिलाकर एक आम कच्चे काउंट मैट्रिक्स बनाया गया था। स्लीपर डेटासेट के लिए, नमूना HTAPP-443-SMP-5491 (उच्च ग्रेड बाल चिकित्सा ग्लियोमा) के लिए कच्चे गिनती का चयन किया गया था ।
निष्पक्ष तुलना करने के लिए, जेकल डेटासेट को छोड़कर सभी नमूनों को एक सामान्य मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित किया गया था। सबसे पहले, हमने प्रत्येक कच्चे मैट्रिक्स27की सेराट ऑब्जेक्ट बनाने के लिए सेराट आर-सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग किया। इसके बाद दो कदम: 1) संभावित बूंदों को हटाने के लिए, निम्नलिखित कटऑफ का उपयोग किया गया - 1000 से कम यूआईयूआई, 500 से कम जीन या माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए के 5% से अधिक विश्लेषण से बाहर रखा गया था और 2) आउटलियर्स को बाहर करने के लिए, नाभिक जो यूएमआई और जीन के वितरण के लिए मतलब प्लस तीन मानक विचलन के बाहर गिर गया था। जेकल डेटासेट के लिए, यह दूसरा कदम नहीं किया जा सका, क्योंकि सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटासेट को कम कठोर गुणवत्ता नियंत्रण कदम के साथ पूर्वप्रसंस्करण किया गया था।
नमूनों में UMIs और जीन के वितरण की तुलना करने के लिए, हमने सभी डेटासेट को मिला दिया और वायलिन प्लॉट(चित्र 4)का उपयोग करके यूएमआई और जीन की संख्या के वितरण की कल्पना की। इस परिणाम ने संकेत दिया कि विधि स्लीपर एट अल20में वर्णित नवीनतम snRNA-seq प्रोटोकॉल के बराबर है।
यहां सचित्र प्रोटोकॉल ग्लियोमा नमूनों से संबंधित है, लेकिन एक ही दृष्टिकोण गैर-सीएनएस ट्यूमर और ऊतकों के लिए व्यवहार्य रूप से लागू किया जा सकता है। फिर भी, इसके लिए लाइसिस बफर रचनाओं और इनक्यूबेशन समय के अनुकूलन की आवश्यकता होगी।
चित्रा 1: नाभिक अलगाव के लिए प्रवाह चार्ट। प्रवाह चार्ट एक ताजा जमे हुए ग्लियोमा ऊतक से एकल नाभिक के अलगाव में शामिल कदमों पर एक संक्षिप्त दृष्टिकोण प्रदान करता है । ट्यूमर के नमूने के लिए प्रतिनिधि छवियां और Iodixanol के बाद परमाणु बैंड/सुक्रोज ढाल (लाल बिंदीदार लाइन के साथ परिक्रमा) दिखाया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: ढाल अपकेंद्रित्र से पहले और बाद में नाभिक के उदाहरण। (क)ढाल अपकेंद्रित्र और निस्पंदन करने से पहले नमूने की छवि बड़ी मात्रा में मलबे (बी) को दर्शाती है कि ढाल अपकेंद्रित्र और निस्पंदन कदम के बाद नमूने की छवि मलबे की न्यूनतम मात्रा के साथ अक्षुण्ण नाभिक को दर्शाती है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: एक ही नाभिक तैयारी का उपयोग कर snRNA-seq और snATAC-seq से सह-एम्बेडेड डेटा का उदाहरण। सेराट आर-सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग snRNA-seq और snATAC-seq डेटा27को एकीकृत करने के लिए किया गया था। (A)snRNA-seq और snATAC-seq डेटा(बी)समूहों की सह-एम्बेडेड छवि जो snRNA-seq और snATAC-seq डेटा के सह-एम्बेडिंग द्वारा उत्पादित की गई है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: विभिन्न मानव मस्तिष्क snRNA-seq डेटासेट के गुणवत्ता नियंत्रण मापदंडों UMI (ए) की व्यक्तिगत संख्या और जीन की संख्या (बी) प्रति नाभिक दिखा । गुणवत्ता फिल्टर पारित करने वाले नाभिक की संख्या इस प्रकार थी: स्लीपर डेटासेट से 3527 नाभिक, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न नारायणन डेटासेट से 14636 नाभिक, जेकल डेटासेट से 7369 नाभिक, झील डेटासेट से 16494 नाभिक, और हबीब डेटासेट से 4652 नाभि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| 6x समरूपता बफर स्थिर मास्टर मिक्स | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | 100 के लिए Vol (एमएल) |
| 1 एम सीएसीएल2 | 30 mm | 3.0 |
| 1 एम एमजी (एसी)2 | 18 mM | 1.8 |
| 1 एम ट्रिस पीएच 7.8 | 60 एमएमएम | 6.0 |
| एच2ओ | 89.2 | |
| कमरे के तापमान पर रखें, प्रकाश के लिए सीधे जोखिम से बचें | ||
तालिका 1: 6x समरूपता बफर स्थिर मास्टर मिक्स की तैयारी।
| 1 एम सुक्रोज |
| 34.23 ग्राम सुक्रोज |
| 78.5 एमएल पानी में घुलें |
| पानी के साथ 100 एमएल तक भरें |
तालिका 2: 1 एम सुक्रोज की तैयारी।
| 6x होमोजेनाइजेशन बफर अस्थिर समाधान (प्रति नमूना 650 एमएल) | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) |
| 6x होमोजेनाइजेशन बफर स्थिर | 6x | 648.84 |
| 100 mM पीएमएसएफ (फिनाइलमिथाइलसुल्फोनाइल फ्लोराइड) | 0.1 mm | 1.08 |
| 14.3 मीटर β-मर्केप्टोथेनॉल | 1 mm | 0.08 |
तालिका 3: 6x समरूपता बफर अस्थिर समाधान (प्रति नमूना 650 μL) की तैयारी।
| 1x होमोजेनाइजेशन बफर अस्थिर समाधान (प्रति नमूना 2 एमएल) | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) |
| 6x समरूपता बफर अस्थिर | 1x | 333.33 |
| 1 एम सुक्रोज | 320 एमएमएम | 640.00 |
| 50 एमएमएम एडटा | 0,1 mM | 4.00 |
| 10% NP40 | 0.1% | 20.00 |
| एच2ओ | 1006.27 | |
तालिका 4: 1x होमोजेनाइजेशन बफर अस्थिर समाधान (प्रति नमूना 2 एमएल) की तैयारी।
| 50% इओडिक्सनॉल सॉल्यूशन (प्रति सैंपल 200 माइक्रोन) | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) |
| 6x समरूपता बफर अस्थिर | 1x | 66.67 |
| 60% इओडिक्सनॉल सॉल्यूशन | 50% | 333.33 |
तालिका 5: 50% आयोडिक्सनॉल सॉल्यूशन (प्रति नमूना 200 माइक्रोन) की तैयारी।
| 29% Iodixanol समाधान (प्रति नमूना 300 माइक्रोन) | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) |
| 6x समरूपता बफर अस्थिर | 1x | 100 |
| 1 एम सुक्रोज | 160 एमएमएम | 96 |
| 60% इओडिक्सनॉल सॉल्यूशन | 29% | 290 |
| एच2ओ | 114 | |
तालिका 6: 29% आयोडिक्सनॉल सॉल्यूशन (प्रति नमूना 300 माइक्रोन) की तैयारी।
| 35% iodixanol समाधान (प्रति नमूना 300 माइक्रोन) | ||
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अंतिम कॉन। | प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) |
| 6x समरूपता बफर अस्थिर | 1x | 100 |
| 1 एम सुक्रोज | 160 एमएमएम | 96 |
| 60% इओडिक्सनॉल सॉल्यूशन | 35% | 350 |
| एच2ओ | 54 | |
तालिका 7: 35% आयोडिक्सनॉल सॉल्यूशन (प्रति नमूना 300 माइक्रोन) की तैयारी।
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Discussion
अंतर-ट्यूमर विषमता का क्षेत्र एक रोमांचक चरण में है, जिसमें उपन्यास की परख और मंच मौजूदा ज्ञान को चुनौती देने और विस्तारित करने के लिए विकसित किए जा रहे हैं। इंट्रा-ट्यूमरल विषमता एक महत्वपूर्ण कारक है जो ग्लियोमास28में वर्तमान उपचार के तौर-तरीकों के लिए रोग प्रगति और प्रतिरोध में योगदान देता है। ब्रेन ट्यूमर पर हाल के अध्ययनों में एकल कोशिका प्रतिलेखन और एपिजेनोमिक परख का उपयोग करके इस महत्वपूर्ण पहलू पर ध्यान केंद्रित किया गया है ताकि एक ही ट्यूमर29,31, 32केभीतर सेलुलर विषमता को बेहतर ढंग से चित्रित किया जा सके । मस्तिष्क ट्यूमर में एकल कोशिका परख के साथ वर्तमान बाधाओं में से एक, और अन्य ठोस ट्यूमर, ताजा नैदानिक नमूनों की उपलब्धता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, विभिन्न अध्ययनों से पता चला है कि ताजा जमे हुए ऊतकों से नाभिक का उपयोग ताजा नमूनों का विकल्प हो सकता है और इसका उपयोग सेलुलर विषमता18,33से पूछताछ करने के लिए सफलतापूर्वक किया जा सकता है।
यहां, हम सादगी, लंबाई, बहुतायत और नाभिक की गुणवत्ता के मामले में पिछले एकल नाभिक अलगाव विधियों में सुधार करते हैं। यह दृष्टिकोण आगे एक ही नाभिक तैयारी से स्नैना-सेक्यू और snATAC-seq प्रोफाइलिंग का लाभ लाता है, जो बहु-ओमिक्स अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इस प्रक्रिया में, हमने गैर-आयनिक आयोडेक्सनॉल आधारित माध्यम का उपयोग करके ढाल पृथक्करण की एक अतिरिक्त प्रक्रिया जोड़कर मौजूदा प्रोटोकॉलों को संशोधित किया है । यह दृष्टिकोण FACS छंटाई की आवश्यकता के बिना शुद्ध नाभिक के अलगाव के लिए अनुमति देता है, और नाभिक की गुणवत्ता एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन किया जाता है। नाभिक के एक अच्छी गुणवत्ता निलंबन कोई झुरमुट, न्यूनतम मलबे, और बरकरार नाभिक होना चाहिए। हालांकि निराला, नाभिक के झुरमुट अलगाव कदम के दौरान हो सकता है, जो व्यापक बोर P200 पिपेट युक्तियों का उपयोग कर प्रकाश पाइपिंग द्वारा या एक 20 मिमी फिल्टर के माध्यम से नाभिक तनाव द्वारा हल किया जा सकता है । एकल नाभिक जीनोमिक्स में सबसे महत्वपूर्ण कारक शुद्ध और बरकरार एकल नाभिक प्राप्त करने की क्षमता है। मलबे या समुच्चय की उपस्थिति एकल सेल प्लेटफार्मों के भीतर माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के एक ब्लॉक का कारण बन सकती है, जिससे या तो कम गुणवत्ता वाले डेटा या प्रयोग की संभावित विफलता हो सकती है। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के बाद विभिन्न चरणों में फिल्टर का उपयोग करने का उद्देश्य ऐसी घटनाओं को रोकना है।
सामग्री शुरू करने की मात्रा और गुणवत्ता (उदाहरण के लिए, ताजा जमे हुए ट्यूमर) भी महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। हम सफलतापूर्वक 10 मिलीग्राम से ६० मिलीग्राम से लेकर मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक ब्लॉक के साथ यहां वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है । इन नमूनों के लिए, नाभिक लाइसिस बफर (चरण 1) का 500 माइक्रोन एकल नाभिक अनुक्रमण के लिए पर्याप्त अच्छी गुणवत्ता वाले नाभिक प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। गौरतलब है कि बड़ा ट्यूमर ब्लॉक जिसमें 60-70% से अधिक ट्यूमर की मात्रा होती है, छोटे टुकड़ों में कटा जा सकता है, और टुकड़ों को या तो तुरंत तरल नाइट्रोजन या -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में वापस रखा जा सकता है या एकल नाभिक अलगाव के लिए ट्यूबों में विभाजित किया जा सकता है और एक बार लाइसिस कदम पूरा होने के बाद मिश्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऊतक की गुणवत्ता और ट्यूमर की मात्रा का आकलन हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन (एचएंडई) स्टेनिंग द्वारा किया जाना चाहिए जिसके बाद एक पैथोलॉजिस्ट से पुष्टि की जानी चाहिए ।
विचार करने के लिए अगले महत्वपूर्ण कारक तापमान और प्रसंस्करण का समय हैं। अनुचित ऊतक भंडारण, नमूना हैंडलिंग, और लंबा प्रोटोकॉल अंतिम जीनोमिक्स डेटा की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। नमूनों को बर्फ पर रखने की जरूरत है, और नमूना प्रसंस्करण के लिए समय नाभिक के क्षरण को रोकने के लिए जल्दी की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल के साथ एक नमूने के लिए औसत प्रसंस्करण 45-60 मिनट है, और चार नमूनों को संसाधित करने में लगभग 2 घंटे लगते हैं। अनुचित ऊतक भंडारण भी नाभिक अलगाव और डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । हमने आकलन किया कि क्या -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण समय की लंबाई ने वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित किया। 1 से 14 वर्ष (2006-2019) के बीच बैंक में जमे हुए नमूनों से प्राप्त अनुक्रमण परिणामों की तुलना में भंडारण समय के संबंध में डेटा गुणवत्ता में कोई अंतर नहीं दिखा । इसलिए, ठीक से जमे हुए और संग्रहीत ताजा जमे हुए ऊतक नमूनों का उपयोग इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पूर्वव्यापी अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
एकल नाभिक प्रोटोकॉल के साथ कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, सेल सतह मार्कर के आधार पर विभिन्न सेल प्रकारों को हल नहीं किया जा सकता है, और साइटोप्लाज्मिक ट्रांसक्रिप्ट का पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अलावा, हम माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्ट को छोड़ देते हैं इसलिए ट्यूमर मेटाबोलिज्म से संबंधित कुछ जैविक जानकारी पर हार जाते हैं। इसके अलावा, विभिन्न ऊतक प्रकारों के लिए अलग-अलग लाइसिस बफ़र्स की आवश्यकता हो सकती है, जिससे प्रत्येक नए प्रयोगात्मक सेटअप के साथ प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल सरल है, नमूना प्रसंस्करण समय को कम करता है, और उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक की पैदावार करता है। एक छंटाई कदम की कमी नाभिक पर तनाव को कम करती है और एक सेल सॉर्टर की आवश्यकता को समाप्त करती है। माइटोकॉन्ड्रियल आरएनए की अनुपस्थिति परमाणु टेप की अनुक्रमण गहराई को बढ़ाती है। महत्वपूर्ण बात, अन्य एकल नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल के समान, यह बढ़ाया प्रोटोकॉल पूर्वव्यापी विश्लेषण के लिए संग्रहीत जमे हुए नमूनों के उपयोग की सुविधा प्रदान करता है। हमने बफ़र्स को बदलने की आवश्यकता के बिना ब्रेन ट्यूमर से एक ही नाभिक की तैयारी का उपयोग करके snRNA-seq और snATAC-seq प्रदर्शन करने के लिए इस कार्यप्रवाह को सफलतापूर्वक लागू किया है। इसलिए, यह दृष्टिकोण एक ही नमूने से बहु-ओमिक्स अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
अंत में, यहां वर्णित एकल नाभिक अलगाव विधि एक बेहद प्रभावी, सटीक और तेजी से तकनीक है जिसे एकल-नाभिक अनुक्रमण अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम सहायक चर्चाओं के लिए जर्मन कैंसर सेंटर (DKFZ) में सिंगल सेल ओपन लैब (scOpenLab) का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को जर्मन कैंसर एड, मैक्स-ईडर प्रोग्राम ग्रांट नंबर 70111964 (एसटी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Dounce Homogenizer | Active motif | 40401 | |
| EDTA (0.5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Pre-Separation Filters (20 µm) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Safe lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Safe lock tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Single Cell Gene Expression | 10x Genomics | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Wide Bore pipette tips (1000 µL) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Wide Bore pipette tips (200 µL) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
References
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