Summary
BRCA1 mutasyonu olan kişilerin kansere yakalanma riski daha yüksektir, bu da BRCA1 varyantlarının işlevinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini garanti eder. Burada, brca1 varyantlarının canlı hücrelerde hedeflenen C:G ila T:A dönüşümünü sağlayan CRISPR aracılı sitozin baz editörleri kullanılarak işlevsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol açıkladık.
Abstract
Son çalışmalar, floresan muhabir tahlilleri, embriyonik kök hücre canlılık tahlilleri ve terapötik ilaç bazlı duyarlılık tahlilleri gibi çeşitli fonksiyonel değerlendirme yöntemlerini kullanarak BRCA1 gen mutasyonları ile ilişkili riskleri araştırmıştır. Birçok BRCA1 varyantını açıklığa kavuşturmuş olmalarına rağmen, eksojen olarak ifade edilen BRCA1 varyantlarının kullanımını içeren bu tahliller aşırı ifade sorunlarıyla ilişkilidir ve transkripsiyon sonrası düzenlemeye uygulanamaz. Bu sınırlamaları çözmek için, daha önce CRISPR aracılı sitozin baz editörü aracılığıyla BRCA1 varyantlarının fonksiyonel analizi için canlı hücrelerde hedefli nükleotid ikamesine neden olan bir yöntem bildirdik. Bu yöntemi kullanarak, işlevleri belirsiz kalan varyantlar belirledik, c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T ve c.4986+5G>A dahil olmak üzere, CRISPR aracılı temel editörlerin BRCA1'debelirsiz öneme sahip varyantları yeniden sınıflandırmak için yararlı araçlar olduğunu doğruladı. Burada, CRISPR tabanlı sitozin baz editörü kullanarak BRCA1 varyantlarının işlevsel analizi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hedef sitelerin seçimi, BRCA1 varyantlarının işlevsel analizi ve değerlendirilmesi için yönergeler sağlar.
Introduction
Meme kanseri tip 1 duyarlılık geni (BRCA1) yaygın olarak bilinen bir tümör baskılayıcı gendir. BRCA1 geni DNA hasarının onarımı ile ilgili olduğundan, bu gendeki mutasyonlar bireyde daha fazla kanser gelişme riskine yol açacaktır1. Meme, yumurtalık, prostat ve pankreas kanserleri BRCA1 geninin kalıtsal fonksiyon kaybı (LOF) mutasyonları ile bağlantılıdır2. BRCA1 varyantlarının fonksiyonel olarak değerlendirilmesi ve tanımlanması, çeşitli hastalıkların önlenmesine ve teşhisine yardımcı olabilir. BRCA1 varyantlarının işlevini ele almak için, embriyonik kök hücre canlılık tahlilleri, floresan muhabir tahlilleri ve terapötik ilaç bazlı duyarlılık tahlilleri 3 ,4,5,6gibi BRCA1 varyantlarının patojenitesini araştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler birçok BRCA1 varyantının işlevini değerlendirmiş olsa da, eksojen olarak ifade edilen BRCA1 varyantlarını içeren yöntemler, aşağı akış regülasyonunu, gen dozajını ve protein katlamayı etkileyebilecek aşırı ekspresyon açısından sınırlamalar oluşturur7. Ayrıca, bu tahliller mRNA birleştirme, transkript stabilitesi ve çevrilmemiş bölge8,9'unetkisi gibi posttranscriptional düzenlemeye yararlanılamaz.
CRISPR-Cas9 sistemi canlı hücrelerde ve organizmalarda hedefli genom düzenlemesini sağlar10. Tek kılavuzlu bir RNA aracılığıyla Cas9, iki DNA onarım yolunu etkinleştirmek için belirli genomik locide kromozomal DNA'da çift iplikçik kırılmalarına (DSB' ler) neden olabilir: hataya eğilimli nonhomologous end-joining (NHEJ) yolu ve hatasız homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu11. HDR hassas bir onarım mekanizmasıdır; bununla birlikte, HDR için Cas9 çekirdeği tarafından indüklenen DSB'ler genellikle istenmeyen ekleme ve silme (indel) mutasyonuna neden olur. Ek olarak, DNA hasarını onarmak için homolog donör DNA şablonlarına ihtiyaç duyar ve nispeten düşük verimliliğe sahiptir. Son zamanlarda, Cas9 nickase (nCas9), homolog DNA şablonlarına ve DNA çift iplik kırılmalarına gerek kalmadan C:G'den T:A'ya hedeflemek için sitidin deaminaz alan adlarıyla kaynaşmıştır12,13,14,15. Sitozin baz editörunu kullanarak, BRCA1 varyantlarının fonksiyonel analizi için yeni bir yöntem geliştirdik16.
Bu çalışmada, BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesini uygulamak için verimli C:G ila T:A nokta mutasyonlarına neden olan CRISPR aracılı sitozin baz editörü BE314'ükullandık ve birkaç BRCA1 varyantının işlevlerini başarıyla tanımladık (Şekil 1).
Şekil 1: İşlevsel değerlendirme için iş akışına genel bakış. (A) BRCA1'inişlevsel değerlendirmesini gösteren şematik . BRCA1 LOF'si hücre canlılığını etkilediğinden, BRCA1 mutasyonu patojenik olduğunda, geçiş sayısı arttıkça hücreler ölür. (B) BRCA1fonksiyonel değerlendirme aşamaları . Noktalı kutu isteğe bağlıdır. GRNA ekspresyonunun ko-transfeksiyon ve plazmid DNA'ları ifade eden BE3 ile değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Yöntem 1 (HAP1-BE3 hücre hatlarının üretimi) isteğe bağlıdır. BE3'ü ifade eden bir hücre hattı oluşturmak yerine, BE3 kodlu plazmid DNA'sı gRNA kodlayıcı plazmid DNA ile birlikte transkred olabilir. BE4max gibi sitozin temel editörlerinin diğer varyantları da yüksek verimli baz düzenleme için kullanılabilir.
1. HAP1-BE3 hücre hatlarının üretimi
- Plazmid DNA yapımı
- Lentivirüs üretimi için lentiBE3-blast plazmid DNA'sını oluşturmak için, yüksek kaliteli polimeraz kullanarak PCR tarafından pCMV-BE3(Malzeme Tablosu)be3 kodlama dizilerini güçlendirin. PCR astarını, izotermal montaj için sindirilen vektörün üst üste binen dizilerini (adım 1.1.2'den itibaren) aşağıdaki gibi tasarlayın17:
astar-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCATGAGCTCAGAG-3',
astar-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGGG-3'
NOT: Altı çizili olarak gösterilen nükleotitler sindirilen vektörle örtüşür ve bu diziler kullanıcı tarafından seçilen hedef vektöre özgü olacaktır. - 37 °C'de 1 saat boyunca kısıtlama enzimleri, XbaI ve BamHI (1 μg başına 1 birim) ile lentiCas9-blast(Malzeme Masası)plazmid DNA'sını sindirin. Sindirilen ürünü% 0,8 agarose jel üzerinde çalıştırın ve ticari jel çıkarma kiti(Malzeme Masası)kullanarak uygun büyüklükteki bantları (8,6 kb) saflaştırın.
- Güçlendirilmiş BE3 PCR ürününü ve sindirilmiş lentiCas9-Blast vektörü izotermal montaj kiti(Malzeme Masası)kullanarak klonlayın. Toplam 0.02-0.5 pmol DNA parçası ve 1:3 vektör:insert oranı kullanın. Montaj ürününü DH5 alfa yetkin hücrelerine dönüştürün18. Transformantları ampisilin (100 μg/mL) içeren bir agar plakasına ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Birkaç koloni seçin ve ampisilin (100 μg / mL) içeren 4 mL LB (lysogeny et suyu) ortamında aşılayın ve kültürü 180 rpm'de sallanan bir inkübatörde büyütün.
- Plazmid DNA'yı, üreticinin protokollerine göre ticari bir plazmid DNA saflaştırma kiti (Malzeme Masası)kullanarak saflaştırın.
- DNA klonlama başarısını doğrulamak için, sanger dizileme ile her saflaştırılmış plazmid DNA'nın BE3 dizilerini (adım 1.1.5'ten itibaren) standart ve BE3'e özgü astarlar (Tamamlayıcı Tablo 1)kullanarak analiz edin ve tam klonlanmış lentiBE3-blast yapıyı seçin.
NOT: Sanger diziliminin sonuçlarını analiz etmek için BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ve CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) gibi çeşitli araçlar önerdik.
- Lentivirüs üretimi için lentiBE3-blast plazmid DNA'sını oluşturmak için, yüksek kaliteli polimeraz kullanarak PCR tarafından pCMV-BE3(Malzeme Tablosu)be3 kodlama dizilerini güçlendirin. PCR astarını, izotermal montaj için sindirilen vektörün üst üste binen dizilerini (adım 1.1.2'den itibaren) aşağıdaki gibi tasarlayın17:
- HAP1-BE3 hücre hatlarının hücre kültürü ve üretimi
- Hücreleri sağlıklı bir durumda ve aktif olarak bölünen bir durumda tut. Iscove'un modifiye Dulbecco ortamındaki Kültür HAP1 hücreleri (Malzeme Tablosu) % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içerir. Kültür HEK293T/17 Hücreleri Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium(Malzeme Tablosu)%10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içerir.
NOT: HAP1 hücresi genetik araştırmalar için yararlıdır, çünkü neredeyse haploid hücrelerdir. Bununla birlikte, hücreler hücre kültüründe kendiliğinden diploid durumuna dönebilir. Zenginleştirme Hoechst 34580 lekeli 1n- akış sumetrisi kullanarak popülasyon HAP1 hücrelerinin haploidy bakımı için yardımcı olacaktır19. - Tohum 5 x 106 HEK293T/17 hücreleri 100 nm çanak üzerinde 1 gün önce transfection. Transfeksiyon gününde, plazmid DNA'sını (15 μg lentiBE3-blast, viral ambalaj için 9 μg psPAX2 ve 2nd nesil lentiviral paketleme sisteminin şişe zarfı için 6 μg pMD2.G) üreticinin protokollerine göre ticari transfeksiyon reaktiflerini kullanarak transfectected (Malzeme Tablosu)20. Ortamı 6 saat transfeksiyon sonrası değiştirin ve 48 saat veya 72 saat transfection sonrası virüs içeren ortamı hasat edin. 0,45 μm filtre kullanarak süpernatantı filtreleyin.
- BE3'ün lentiviral parçacıklarını 0,1 MOI'de (enfeksiyonun çokluğu) HAP1 hücrelerine aktarın. Uygun bir MOI için ayarlamak için seri olarak seyreltilmiş virüs konsantrasyonları kullanın. Ortamı çıkarın ve ayarlanmış viral süpernatant ve taze kültür ortamı ile değiştirin.
- Transdüksiyondan bir gün sonra, ortamı 10 μg / mL blasticidin(Malzeme Tablosu- içeren ortamla değiştirin ve 3 gün boyunca dönüştürücü hücreleri blasticidin ile seçin. Blasticidin seçiminden sonra, bir sonraki adım için hayatta kalan hücrelerin ~ % 10'una sahip bir kuyu seçin.
- Blasticidin seçiminden sonra, transdüklenmiş hücreleri tek klonları izole etmek için 0,5 hücre / kuyu yoğunluğunda 96 kuyu plakalarına tohumlayın (örneğin, 20 mL'de 50 hücreyi seyreltin (200 μL başına 0,5 hücre) kültür ortamı ve 96 kuyuda kuyu başına 200 μL aliquot). 96 kuyu plakalarını 2 hafta boyunca kuluçkaya yatırın ve BE3 aktivitesini doğrulamak için tek kolonileri seçin.
- Tek kolonileri, biri BE3 aktivitesini test etmek için, diğeri bakım için olmak üzere iki kümeye bölün. GRNA'ların lentiviral parçacıklarını BE3 aktivitesini doğrulamak için kümelerden birine dönüştür. T7 endonuclease I (T7E1, Malzeme Tablosu)testini kullanarak veya hedeflenen derin sıralama tekniğini (adım 4)21gerçekleştirerek her koloninin mutasyon sıklığını analiz edin. Sağlıklı ve son derece aktif bir BE3'e sahip uygun tek klonları seçin.
NOT: Tam mutasyon frekanslarını doğrulamak için, hedeflenen derin sıralamayı T7E1 testine göre öneririz. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) BE3 için iyi onaylanmış bir hedef sitedir.
- Hücreleri sağlıklı bir durumda ve aktif olarak bölünen bir durumda tut. Iscove'un modifiye Dulbecco ortamındaki Kültür HAP1 hücreleri (Malzeme Tablosu) % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içerir. Kültür HEK293T/17 Hücreleri Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium(Malzeme Tablosu)%10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içerir.
2. GRNA'ları hedefleyen BRCA1'in tasarımı ve inşası
Şekil 2: GRNA plazmid DNA örneği. (A) Hedef sırasını BE3 ile etkili bir şekilde düzenlemek için, hedef C'yi (hedef G) beş nükleotid penceresine yerleştiren bir NGG PAM (CCN PAM) gerekir. NGG PAM kırmızı renkte gösterilir ve temel düzenleme penceresi gri bir kutuyla temsil edilir. (B) C.8047C>T (H1283Y) temel düzenlemesi için gRNA sırası gösterilir ve etkin pencere gri bir kutuyla vurgulanırken hedef C:G çiftleri kırmızı renkte gösterilir. gRNA klonlama için, kalın olarak gösterilen çıkıntı dizileri her iki uçta 5ʹ. gRNA şablonları, iki tamamlayıcı oligonükleotid tavlanarak oluşturulmuştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
NOT: BRCA1 varyantlarının pozitif ve negatif kontrolleri esastır. Bu çalışmada iyi huylu kontroller olarak c.5252G>A (R1751Q) ve c.4527C>T (Y1509Y) kullanılmaktadır. patojenik kontroller olarak c.191G>A (C64Y), 81-1G>A ve c.3598C>T (Q1200*) kullanılır. Her gRNA'nın hedef dizileri Tamamlayıcı Tablo 1'de listelenmiştir.
- BRCA1 genom dizisini GenBank'tan NCBI22'dealın.
- İlginin mutasyonu etrafında Protospacer Adjacent Motif (PAM) dizisi "NGG" ve "CCN" ile 20 bp hedef siteleri arayın. İlginin mutasyonu, gRNA hedef dizilerinin PAM-distal ucunda 4-8 nükleotitte bulunmalıdır, çünkü BE3'ün aktif penceresi gRNA hedef dizilerinin PAM-distal ucunda4-8nükleotittir 14 . C.8047C>T (H1283Y)- ve c.5252G>A (R1751Q) hedefleme gRNA'ları söz konusu olduğunda, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ ve 5ʹ-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, kalın diziler etkin pencerelerdir. C'den T'ye ve G'den A'ya dönüşümler sırasıyla NGG ve CCN PAM ile gerçekleşir (Şekil 2A).
NOT: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23, gRNA tasarımı için kullanışlı web tabanlı araçlardır. - GRNA başına iki tamamlayıcı oligonükleotid sipariş edin; ileri oligonükleotidler için, kılavuz dizisinin 5ʹ ucuna "CACCG" ekleyin ve ters oligonükleotidler için 5' uca "AAAC" ve 3' uca "C" ekleyin. Bu ek sıralar, bu protokol için kullanılan hedef gRNA ifade vektörüne (adım 2.5'ten itibaren) özgüdür ve kullanıcılar alternatif gRNA ifade vektörleri için ayarlanmalıdır (Şekil 2B).
- Oligonükleotidleri damıtılmış suda 100 μM'lik son konsantrasyonda yeniden depolayın.
- Kısıtlama enzimini kullanarak pRG2'yi sindirin, BsaI (1 μg başına 1 birim) 37 °C'de 1 saat(Malzeme Tablası). Sindirilen ürünü% 1 agarose jel üzerinde çalıştırın ve uygun büyüklükteki bandı (2,5 kb) saflaştırın.
NOT: Klasik bir sindirim ve ligasyon yöntemi kullanmak yerine Golden Gate klonlama gibi diğer klonlama yöntemi kullanılabilir. - Tavlanmış oligonükleotid dubleksi, satın alınan DNA ligazını(Malzeme Tablosu) üreticininprotokolüne göre kullanarak vektör DNA'sına bağlayın ve dh5 alfa yetkin hücrelere dönüştürün (alt panelleme için yaygın olarak kullanılan diğer E. coli suşları da kullanılabilir).
- Transformantları ampisilin (100 μg/mL) içeren bir agar plakasına ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Plazmid DNA'sını çeşitli dönüştürücülerden arındırın ve U6 promotöründe(Malzeme Masası)astarları kullanarak Sanger dizileri ile gRNA dizilerini analiz edin.
3. CRISPR aracılı temel düzenleme araçları kullanılarak BRCA1 varyantlarının oluşturulması
NOT: HAP1-BE3 hücre hatları kullanılmazsa, BE3 kodlayıcı plazmid DNA BRCA1-hedefleme gRNA ile birlikte transkripte edilebilir. BE3 ve gRNA plazmidlerinin eş transfeksiyon ile karşılaştırıldığında, gRNA plazmidinin HAP-BE3 hücrelerine transfeksiyon, elimizdeki hedef lokusta 3 kata kadar verimli baz düzenlemeye neden olur.
- Tohum 5 x 105 HAP1-BE3 hücreleri (veya ko-transfeksiyon yöntemleri durumunda HAP1 hücreleri) transfeksiyondan 1 gün önce 24 kuyu plakalarında kuyu başına. Transeksiyon sırasında, kültür hücreleri uygun bir yoğunluğa ulaşır (%70-%80 izdiham).
- Üreticinin protokolüne göre satın alınan transfeksiyon reaktiflerini (Malzeme Masası)kullanarak gRNA'ları hedefleyen BRCA1'itransfect. BRCA1hedef sahalarında C:G'den T:A'ya dönüşüm sağlamak için 1 μg BRCA1 hedefleme gRNA'ları (ortak transfeksiyon yöntemleri durumunda 1 μg BE3 kodlayıcı plazmid DNA ile) kullanın. Hücreleri 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve her 3-4 günde bir alt kültür.
- Baz düzenleme verimliliklerini analiz etmek için transfeksiyondan 3, 10 ve 24 gün sonra hücre peletlerini hasat edin (Transfeksiyondan sonraki 3 günlük numuneler, 0. gün örnekleri olarak yeniden derecelendirme olarak analiz edilir).
- Genomik DNA saflaştırma kitini ( Malzeme Tablosu ) kullanarak genomikDNA'larıçıkarın.
NOT: Transfeksiyon koşullarının reaktifin DNA'ya değişken oranıyla optimize edilmesi tavsiye ederiz. HAP1 transfeksiyonunun en uygun durumu elimizdeki DNA'ya reaktifin 4:1 rasyondur.
4. Illumina yeni nesil dizileme (NGS) için örnek hazırlık
Şekil 3: Yeni nesil sıralama için hazırlık. 1st PCR astarı, BRCA1 hedef bölgesini genomik DNA'da güçlendirmek için tasarlanmıştır. 2nd PCR astar, dizileri 1st PCR astar dizilerinden daha içeride yer olacak şekilde tasarlanmıştır. Yeni nesil sıralama gerçekleştirmek için gerekli dizileri eklemek için 2nd PCR astarının her iki ucuna sarı çubuk olarak gösterilen ek diziler eklendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- BRCA1 hedef sahalarını güçlendirmek için 1st PCR astarları tasarlayın. 1st PCR ürününün boyutunda herhangi bir kısıtlama olmamasına rağmen, belirli bir bölgeyi verimli bir şekilde yükseltmek için <1 kb ürün boyutu önerilir (Şekil 3).
- 1st PCR ürününün içinde bulunan 2nd PCR astarları tasarlayın. Amplicon'un NGS okuma uzunluğuna göre boyutunu göz önünde bulundurun (Örneğin, amplicon ürününün boyutu, her okumayı birleştirmek için 2 × 150 bp eşleştirilmiş uç çalışması için 300 bp'den küçük olmalıdır). NGS analizi için gerekli dizileri eklemek için, 2nd PCR astarlarının 5' ucuna aşağıdaki gibi ek diziler ekleyin: ileri astarlar için, 5' ucuna 5'-ACACTCTTTCCACACACGACGCTTCCGATCT-3' dizileri ekleyin ve ters astarlar için 5' sonuna 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTTCTTCCTCCG ATCT-3' dizileri ekleyin.
NOT: Astarların hedef olmayan sıraya bağlanmasını önleyerek spesifik olmayan bağlamanın amplikonını azaltmak için iç içe PCR kullandık. - Üç zaman noktasından elde edilen genomik DNA'daki BRCA1 hedef bölgelerini güçlendirin. PCR hatalarını en aza indirmek için üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli polimeraz kullanın. 1st PCR reaksiyonu için, 15 döngüde amplifikasyon için 100 ng genomik DNA kullanın. 2nd PCR reaksiyonu için, 20 döngü boyunca amplifikasyon için 1st PCR ürününün 1 μL'sini kullanın. 2nd PCR ürününün 5 μL'sini% 2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve boyutunu onaylayın.
- NGS analizi için gerekli dizileri eklemek için, aşağıda listelenen astarları kullanarak2 nd PCR ürününü güçlendirin. PCR reaksiyonu için, 2 nd PCRürününün 1 μL'si, yüksek kaliteli polimeraz kullanılarak 30 döngüye kadar amplifikasyon için kullanılır.
- Aynı anda havuza alınacak ve sıralanacak çok sayıda kitaplık için çoklama sıralaması gerçekleştirmek için, benzersiz dizin sırasına(Tamamlayıcı Tablo 1)sahip ileri (D501 – D508) ve ters (D701 – D712) primer'ları kullanın. Benzersiz çift dizin oluşturma stratejisini yürütmek için farklı astar setleri kullanarak her örneği güçlendirin.
- Boyutu doğrulamak için PCR ürününün 5 μL'sini% 2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve amplicon'u ticari bir PCR temizleme kiti(Malzeme Masası)kullanarak arındırın. Ngs kitaplığı oluşturmak için her örneği eşit miktarlarda karıştırın.
- Spektrofotometreler kullanarak NGS kütüphanesini 260 nm dalga boyunda ölçün ve NGS kütüphanesini resüspenzyon tamponu veya 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 kullanarak 1 nM konsantrasyonuna seyreltin. Kütüphane türlerine bağlı olarak uygun yükleme konsantrasyonuna seyreltilmiş 100 μL kütüphane hazırlayın (Örneğin, Nextera DNA Flex için kütüphanenin 200 pM'ini hazırlayın).
- Kontrol olarak, phiX'i kit türüne uygun seyreltilmiş örnekle birleştirin.
- Kitaplığı kartuşa yükleyin ve üreticinin protokolüne göre NGS'yi çalıştırın. Illumina iSeq 100 veya Miseq sistemleri, tek okumalı veya eşleştirilmiş uç için çeşitli uzunluklardaki ampliconları 300 bp'ye kadar sıralayabilir. Temel düzenleme verimliliğinin derinlemesine analizi için hedef amplicon başına 10.000'den fazla okuma önerdik.
5. BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmesi için temel düzenleme verimliliğinin analizi
- MAUND24kullanarak temel düzenleme verimliliklerini analiz edin. Temel düzenleme verimliliği aşağıda açıklandığı gibi hesaplanır.
BE3 etkin penceresinde birden çok sitozin varsa, yalnızca BRCA1 varyantını değerlendirmek için hedeflenen C'den T'ye dönüştürme dikkate alınır. Örneğin, BE3 etkin pencerenin dizileri "C4A5T 6 C7T8,"ise,temel düzenleme tarafından oluşturulan olası diziler "T 4 A5T6C7T8", "C 4 A5T6T 7 T8" ve "T4A 5 T6T7T8"dir. Şu anda, konum 4 istenen BRCA1 varyantı için hedeflenen konumsa, temel düzenleme verimliliğini hesaplamak için yalnızca ""T4A5T6C7T8" dizisi kabul edilir.
NOT: CRISPResso225ve BE-analyzer23gibi temel düzenleme etkinliğinin analizi için diğer web araçlarını da öneririz. - BRCA1 varyantlarının pozitif ve negatif kontrollerini kullanarak sonuçları doğrulayın. İyi huylu denetimin temel düzenleme verimlilikleri aynı kalmalı, patojenik kontrolünkiler ise zamanla azalmalıdır.
- BRCA1 varyantlarının göreli temel düzenleme verimliliğini hesaplayın ve patojenitelerini belirleyin. 0. Gün ve 21. gün örnekleri arasındaki anlamlı farklar t-test gibi uygun istatistiksel analizler analiz edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşımlar, CRISPR tabanlı sitozin baz editörleri tarafından oluşturulan endojen BRCA1 varyantlarının işlevsel olarak değerlendirilmesini sağlar. BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi için uygun hücre hatlarını seçmek için araştırmacılar BRCA1'in hedeflenen hücre hatlarında temel gen olduğunu doğrulamalıdır. Örneğin, BRCA1'i bozmak için cas9 ve gRNA'ları hap1 hücre hatlarına dönüştürdük ve mutasyon frekanslarını hedeflenen derin dizileme ile analiz ettik. HAP1 hücre hatlarında mutasyon frekanslarının zaman içinde önemli ölçüde azaldığını tespit ettik (Şekil 4A). Bu sonuçlar BRCA1'in HAP1 hücre hatlarında hücre canlılığı için gerekli gen olduğunu göstermiştir. C:G ila T:A ikame varyantlarının BRCA1'inişlevini etkileyip etkilemediğini araştırmak için, her mutasyonu indükleyebilen plazmid DNA kodlama gRNA'ları HAP1-BE3 hücre hatlarına trans enfekte edildi ve ikame frekansları analiz edildi. Patojenik bir varyant olan c.3598C>T'nin (p. Q1200*) göreli ikame frekansları önemli ölçüde azalırken, iyi huylu bir varyant olan c.4527C>T 'nin (p.Y1509Y) frekansları zamanla benzer kalmıştır (Şekil 4B). ClinVar veritabanında, BRCA1'in c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) ve c.5056C>T (p.H1686Y) belirsiz öneme sahip varyantları olarak bildirilmektedir. Yukarıda belirtilen yöntemleri kullanarak bu varyantların işlevini analiz ettik ve bu üç varyantın nükleotid ikame frekanslarının zamana bağlı bir şekilde azaldığını gördük (Şekil 4B). Bu sonuçlardan, üç ikame BRCA1 işlevini değiştirdi ve patojenik mutasyonlar olarak kategorize edilebilir.
Şekil 4: CRISPR-Cas9 sistemleri kullanılarak BRCA1'in fonksiyonel çalışmasının temsili sonuçları. (A) BRCA1 bozulması hücre canlılığını etkiler. HAP1 hücreleri sırasıyla BRCA1'ihedefleyen plazmid kodlama spCas9 ve iki gRNA ile transkripsiyon edildi ve hücre canlılığı analizi için hedeflenen derin dizileme yapıldı. BRCA1'in mutasyon frekansları iki bağımsız gRNA ile transfected hücrelerde zamana bağlı bir şekilde azaldı ve negatif kontrol olarak kullanılan CCR5'in mutasyon frekansları zamanla aynı kaldı. (B) Beş BRCA1 çeşidinin fonksiyonel değerlendirmeleri. HAP1-BE3 hücreleri sırasıyla BRCA1 mutasyonlarına neden olan gRNA'larla transkoma edildi ve hücre canlılığı analizi için hedeflenen derin dizileme yapıldı. C.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T ve c.5056C>T hücrelerinde göreli değiştirme frekansları zamana bağlı olarak azaldı ve c.4527C>T hücreleri aynı kaldı. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını gösterir. Yıldız işaretleri farklı P değerlerini gösterir: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, CRISPR meditasyonlu sitozin baz editörü kullanılarak BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmeleri için basit bir yöntemi açıklar. Protokol, hedef lokusta gRNA'ların tasarımı ve ifade edildikleri plazmid DNA'ların yapımı için yöntemleri açıklar. Sitozin temel editörleri aktif bir pencerede nükleotid dönüşümüne neden olur (BE3 durumunda, gRNA hedef dizilerinin PAM-distal ucunda nükleotidler 4-8). Araştırmacı hedef dizileri dikkatlice seçmelidir, çünkü aktif penceredeki tüm sitozinler timinlerle değiştirilebilir. Ayrıca, Adım 5'te açıklandığı gibi, BRCA1 varyantlarının işlevini değerlendirmek için aktif bir penceredeki birden fazla sitozin dikkatlice analiz edilmelidir.
En önemli adımlardan biri, BRCA1 fonksiyonel değerlendirmeleri için başlangıç mutasyon sıklığını etkileyen hedef hücre hattındaki transfeksiyondur. İlk mutasyon sıklığını iyileştirmek için araştırmacılar, hücre hattına teslim yöntemlerini optimize etmelidir. Adım 1'de açıklandığı gibi, BE3 ifade eden hücre çizgilerinin üretimi, ilk mutasyon sıklığını artırmak için yararlı bir seçenektir. GRNA'nın HAP1-BE3 hücrelerine lentiviral transdüksiyonunu önermiyoruz, çünkü BE3 ve gRNA'nın konsültasyonel ekspresyasyonu akümülatif nükleotid dönüşümüne neden olabilir ve bu sonuçlar BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesini engelleyebilir.
Bu protokolde sunulan BE3 aracılı yöntemlere ek olarak, BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmelerini daha da genişletmek için çeşitli tamamlayıcı yöntemler önerilir. İlk olarak, yukarıda açıklandığı gibi, BRCA1 varyantlarının kendinden emin sonuçlarını elde etmek için ilk numunedeki mutasyon sıklığı önemlidir. Temel düzenleme verimliliğini artırmak için, BE4max gibi sitozin temel editörlerinin varyantları önerilir. İkinci olarak, BE3 hedef DNA dizisini 5'-NGG-3' PAM dizileri aracılığıyla tanır, bu da çeşitli BRCA1 varyantları oluşturmada bir sınırlamadır. Son zamanlarda geliştirilen CAS9 varyantları değiştirilmiş PAM dizileri ile bu durumda hedeflenebilir BRCA1 varyantları26 , 27,28genişletmek için yararlı bir seçenektir. Üçüncüsü, BE3 istenmeyen sitelerde önemli temel düzenlemeye neden olur ve hedef dışı etki BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmesini etkileyebilir29,30,31. BE3'ün hedef dışı etkisini azaltmak için, genomda benzer diziler olmadan gRNA'ların hedef bölgeleri dikkatlice seçilmelidir. Genom ve transkriptomdaki istenmeyen baz düzenlemeyi azaltmak için geliştirilen SECURE-BE3 veya YE1 yararlı seçenek32,33. Forth, Cas9 aracılı HDR tabanlı bir doygunluk genom düzenleme (SGE) yöntemi de BRCA1 varyantlarının fonksiyonel analizi için harika seçenekler19. Yöntemin BRCA1 varyantlarının hedef dizilerini ve nükleotid pozisyonlarını seçmek için herhangi bir sınırlaması yoktur. Bununla birlikte, HDR tabanlı yaklaşım temel editörlerden nispeten daha az verimlidir ve ayrıca donör şablonlarının tasarım ve sentezini gerektirir14. Son olarak, hasta türevi BRCA1 varyantları nokta mutasyonları, eklemeler ve silmeler gibi çeşitli mutasyonları içerir. Bunlardan, nokta mutasyonları BRCA1 varyantlarının sadece C:G'den T:A'ya değil, aynı zamanda A:T'den G:C'ye, C:G'den G:C'ye ve A:T'den T:A dönüşümlerine kadar olan başlıca popülasyonudur. Bu tür dönüşümlerin işlevsel değerlendirmeleri için CRISPR aracılı adenozin taban editörleri ve Prime Editors değerli seçeneklerdir34,35. Hızla gelişen genom mühendisliği teknolojileri, daha çeşitli BRCA1 varyantlarının işlevsel değerlendirmelerini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı tarafından desteklendi (2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 ve 2018R1A5A2020732'yi Y.K.'ye verir).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
References
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
- Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
- Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
- Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
- Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A.
- Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
- Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
- Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
- Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
- Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
- Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
- Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
- Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
- Sayers, E. W., et al.
- Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
- Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
- Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
- Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
- Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
- Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
- Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
- Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
- Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
- Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
