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Biology

Generación de bibliotecas de inserción Transposon en bacterias Gram-negativas para secuenciación de alto rendimiento

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Describimos un método para generar saturación de bibliotecas mutantes transposon en bacterias Gram-negativas y la posterior preparación de bibliotecas de amplicón de ADN para la secuenciación de alto rendimiento. Como ejemplo, nos centramos en el patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, pero este protocolo es susceptible a una amplia gama de organismos Gram-negativos.

Abstract

La secuenciación de Transposon (Tn-seq) es un método potente que combina la mutagénesis transposon y la secuenciación paralela masiva para identificar genes y vías que contribuyen a la aptitud bacteriana bajo una amplia gama de condiciones ambientales. Las aplicaciones de Tn-seq son extensas y no sólo han permitido examinar las relaciones genotipo-fenotipo a nivel de organismo, sino también a nivel de población, comunidad y sistemas. Las bacterias gramnegativas están altamente asociadas con fenotipos de resistencia a los antimicrobianos, lo que ha aumentado los incidentes de fracaso del tratamiento con antibióticos. La resistencia a los antimicrobianos se define como crecimiento bacteriano en presencia de antibióticos letales. La colistina antimicrobiana de "última línea" se utiliza para tratar las infecciones bacterianas Gram-negativas. Sin embargo, varios patógenos Gram-negativos, incluyendo Acinetobacter baumannii pueden desarrollar resistencia a la colistina a través de una gama de mecanismos moleculares, algunos de los cuales se caracterizaron usando Tn-seq. Además, las vías de transducción de señales que regulan la resistencia a la colistina varían dentro de las bacterias Gram-negativas. Aquí proponemos un método eficiente de mutagénesis transposon en A. baumannii que agiliza la generación de una biblioteca de inserción de transposon saturante y la construcción de la biblioteca de amplicon eliminando la necesidad de enzimas de restricción, ligadura de adaptador y purificación de gel. Los métodos descritos en este documento permitirán un análisis en profundidad de los determinantes moleculares que contribuyen a la aptitud de A. baumannii cuando se enfrentan al desafío con colistina. El protocolo también es aplicable a otros patógenos GRAM-negativos ESKAPE, que se asocian principalmente con infecciones adquiridas en hospitales resistentes a losmedicamentos.

Introduction

El descubrimiento de antibióticos es sin duda uno de los eventos más impactantes relacionados con la saluddel siglo XX. Los antibióticos no solo resuelven rápidamente las infecciones bacterianas graves, sino que también desempeñan un papel fundamental en la medicina moderna. Las cirugías mayores, los trasplantes y los avances en la medicina neonatal y la quimioterapia dejan a los pacientes susceptibles a infecciones potencialmente mortales y estas terapias no serían posibles sin antibióticos1,2. Sin embargo, el rápido desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos humanos ha disminuido significativamente la eficacia de todas las clases clínicamente importantes de antibióticos3. Muchas infecciones bacterianas que una vez fueron fácilmente despejadas con tratamiento con antibióticos, ya no responden a los protocolos de tratamiento clásicos, causando una grave amenaza a la salud pública mundial1. La resistencia a los antimicrobianos (AMR) es donde las células bacterianas crecen en concentraciones letales de antibióticos, independientemente de la duración del tratamiento4,5. Es urgente comprender los factores moleculares y bioquímicos que regulan la resistencia a los antimicrobianos, lo que ayudará a guiar el desarrollo antimicrobiano alternativo. Específicamente, los patógenos de ESKAPE son problemáticos en entornos clínicos y asociados con una amplia ERM. Estos incluyen Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp. Mientras que varios mecanismos contribuyen a la AMR en patógenos ESKAPE, estos últimos cuatro organismos son Gram-negativos.

Las bacterias Gram-negativas ensamblan una membrana externa definitoria que las protege de condiciones ambientales adversas. La membrana externa sirve como una barrera de permeabilidad para restringir la entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, en la célula. A diferencia de otras membranas biológicas, la membrana externa es asimétrica. El prospecto exterior está enriquecido con lipopolisacárido expuesto a la superficie, mientras que el prospecto interno es una mezcla de fosfolípidos6. Las moléculas de lipopolisacárido están ancladas a la membrana externa por una mitad de lípido conservada Una incrustada dentro de la bica procapa lipídica7. El lípido canónico Un dominio de Escherichia coli lipopolisacárido es necesario para el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-negativas y es sintetizado por una vía enzimática de nueve pasos que es una de las vías más fundamentales y conservadas en organismos Gram-negativos6,,7,,8.

Las polimixinas son péptidos antimicrobianos catiónicos que se dirigen al lípido Un dominio de lipopolisacárido para perturbar la membrana externa y izar la célula. La interacción electrostática entre los residuos cargados positivamente de polimixinas y los grupos de fosfato A de lípidos cargados negativamente interrumpen la membrana celular bacteriana, lo que en última instancia conduce a la muerte celular9,10,11,12,13. La colistina (polimixina E) es un antimicrobiano de último recurso utilizado para tratar infecciones causadas por patógenos nosocomiales Gram-negativos multirresistentes, como Acinetobacter baumannii14,15,16. Descubiertas por primera vez en 1947, las polimixinas son producidas por las bacterias del suelo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Las polimixinas se recetaron para tratar las infecciones Gram-negativas durante años antes de que su uso clínico fuera limitado debido a los informes de nefro- y neurotoxicidad significativa20,21.

A. baumannii es un patógeno Gram-negativo nosocomial que ha aumentado drásticamente la morbilidad y mortalidad de los resultados de los pacientes en las últimas décadas22. Lo que antes se consideraba un patógeno de baja amenaza, ahora supone un riesgo significativo para la infección adquirida en el hospital en todo el mundo debido a su increíble capacidad para adquirir AMR y alto riesgo de epidemia23,,24. A. baumannii representa más del 10% de las infecciones nosocomiales en los Estados Unidos. La enfermedad se manifiesta como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de la piel y de los tejidos blandos, meningitis y endocarditis25. Las opciones de tratamiento para las infecciones por A. baumannii han disminuido debido a la resistencia contra casi todas las clases de antibióticos, incluyendo lactamos β, fluoroquinolonas, tetraciclina y aminoglucósidos23,,24. La prevalencia de aislados multirresistentes, ampliamente resistentes a los medicamentos y pan-drogas resistentes a A. baumannii ha dado lugar a un resurgimiento del tratamiento con colistina, que se pensaba que era una de las pocas opciones terapéuticas restantes que todavía eran eficaces contra A. baumanniimultirresistente. Sin embargo, el aumento de la resistencia a la colistina entre los aislados de A. baumannii ha amplificado aún más su amenaza para la salud pública mundial10,11,12,13,27,30,31.

Los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, como la secuenciación de transposon (Tn-seq), han proporcionado herramientas importantes para avanzar en nuestra comprensión de la aptitud bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq es una poderosa herramienta que se puede aprovechar para estudiar las interacciones genotipo-fenotipo en bacterias. Tn-seq es ampliamente aplicable entre patógenos bacterianos, donde combina la mutagénesis de transposon tradicional con la secuenciación paralela masiva para mapear rápidamente sitios de inserción, que se pueden utilizar para vincular mutaciones de ADN a variantes fenotípicas en una escala genómica32,,33,,34,,35. Si bien los métodos de mutagénesis de transposon se han descrito previamente, los pasos generales son similares33. En primer lugar, se genera una biblioteca de inserción utilizando la mutagénesis transposon, donde cada célula bacteriana dentro de una población está restringida a una sola inserción de transposon dentro del ADN genómico (GDNA). Después de la mutagénesis, los mutantes individuales se agrupan. GDNA se extrae de la piscina mutante de inserción y las uniones transposon se amplifican y se someten a secuenciación de alto rendimiento. Las lecturas representan sitios de inserción, que se pueden asignar al genoma. Las inserciones de Transposon que reducen la condición física se caen rápidamente de la población, mientras que las inserciones beneficiosas se enriquecen. Tn-seq ha sido fundamental para avanzar en nuestra comprensión de cómo los genes afectan la aptitud bacteriana en el estrés33.

El sistema de transposión de marinero Himar1 codificado en pJNW684 fue construido y optimizado específicamente para el propósito de mutagénesis transposon. Incluye un marinertransposón marinero -familia que flanquea el gen de resistencia a la kanamicina, que se utiliza para la selección de mutantes de inserción transposon en A. baumannii. También codifica un promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión del gen codificante transposasa36. El transposon basado en marinerostambién contiene dos terminadores traslacionales aguas abajo del gen de resistencia a la kanamicina, que impide la lectura aguas abajo de la inserción37. pJNW684 también lleva un origen de replicación condicional RP4/oriT/oriR6K que requiere que el gen -pir aportado por la cepa del donante se replique38. En ausencia del gen de lospir, el vector pJNW684 que transporta la maquinaria de transposición no podrá replicarse en la cepa receptora A. baumannii 10,36,38. Por lo tanto, durante la conjugación bacteriana, sólo se inserta el transposón en el genoma receptor sin la inserción de fondo del plásmido, que transporta el gen de la transposasa. Esto es significativo porque la pérdida de actividad transposasa junto con el plásmido da como resultado un evento de transposición único y estable que impide que el transposón se mueva a diferentes lugares una vez que se inserta en el genoma receptor.

pJNW648 también ha sido probado para la actividad en otro organismo Gram-negativo, E. coli. El éxito en el montaje de una saturación de la biblioteca Tn-seq en la cepa de E. coli W3110 indicó que el sistema es susceptible de realizar mutagénesis en una amplia gama de patógenos, incluyendo Enterobacteriaceae. Además, el promotor específico de A. baumannii que impulsa la expresión transposasa puede intercambiarse rápidamente con un promotor específico de la especie. Por último, el gen de resistencia a la kanamicina se puede cambiar por otros casetes de resistencia, dependiendo del fenotipo AMR del organismo que se está estudiando.

Un factor que contribuye a la resistencia a la colistina en A. baumannii es la administración de dosis insuficientes, donde las bacterias están expuestas a la presión selectiva a niveles no letales39. Varios informes mostraron que las concentraciones antimicrobianas subinhibitorias pueden inducir respuestas reguladas que alteran la fisiología celular para reducir la susceptibilidad de toda la población bacteriana11,12,30,31. Usando Tn-seq, descubrimos factores que regulan la resistencia a la colistina en la cepa de A. baumannii ATCC 17978 después de la exposición a concentraciones inhibitorios10 y subinhibitorias de colistina. Este ejemplo detalla un método Tn-seq que agiliza la construcción y el enriquecimiento de una biblioteca mutante transposon saturada utilizando la familia basada en marinerosde transposones40,,41. Mientras que varios protocolos Tn-seq generan 20.000 - 100.000 mutantes35,42,43,44,45,46, el protocolo descrito en este documento puede generar rápidamente una biblioteca de transposonía de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a una inserción de transposon cada 10 pares de bases en A. baumannii10. Además, el tamaño de la biblioteca se puede escalar verticalmente sin un esfuerzo adicional significativo. Este método también elimina el requisito de endonucleos de restricción, ligaduras de adaptador y purificación de gel, lo que puede reducir la diversidad final de la biblioteca.

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Protocol

1. Preparación de tensión bacteriana

  1. Rayar la cepa "donante" (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani complementado con 600 M de ácido diaminopélico (DAP), 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante la noche a 37oC. Utilizando una sola colonia aislada, inocular 50 ml de caldo de Luria (LB) complementado con DAP de 600 m, 100 mg/L de ampicilina y 25 mg/L de kanamicina en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y etiquetarlo como "donante".
  2. Rayar la cepa "receptora" (A. baumannii cepa ATCC 17978, Tabla de materiales) para colonias aisladas en agar Luria-Bertani. Incubar durante la noche a 37oC. Usando una sola colonia aislada, inocular 50 mL de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y etiquetarlo como "receptor".
  3. Incubar ambos cultivos ("donante" y "receptor") durante la noche a 37 oC con temblores.

2. Apareamiento bacteriano

  1. Transfiera cultivos nocturnos a tubos cónicos de 50 ml.
  2. Cultivos de pellets tanto receptores como donantes utilizando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  3. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet de cepa "donante" en 35 ml de LB complementado con DAP para lavar los antibióticos residuales.
  4. Pele las células de cepa "donante" utilizando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de cepa "donante" en 4.5 mL de LB complementado con DAP. Utilice una pipeta serológica de 10 ml.
  6. Transfiera la cepa resuspendida "donante" en el tubo de cepa "receptor", que contiene las células peletadas del "receptor". Utilice la misma pipeta serológica de 10 ml del paso 2.5 para mezclar los cultivos. Pase inmediatamente al siguiente paso.
    NOTA: El volumen total de la suspensión final debe ser de 5 ml.
  7. Distribuir la suspensión de acoplamiento como gotas individuales de 100 l en placas de agar LB suplementadas con DAP (5-7 gotas por placa) (Figura 1A).
  8. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 min.
  9. Sin perturbar las gotas, transfiera cuidadosamente las placas a una incubadora de 37oC y permita que los cultivos se apareen durante 1h.
    NOTA: Los períodos de incubación superiores a 1 h corren el riesgo de la generación de mutantes hermanos.
  10. Después de la incubación, añadir 1,5 ml de LB en cada plato y cosechar resuspendiendo bacterias de las placas. Utilice una micropipeta de 1 ml para la resuspensión. El volumen final debe ser de aproximadamente 12 - 15 ml.
  11. Combine las células cosechadas en un tubo cónico de 50 ml.
  12. Pele el pelado de las células acopladas usando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  13. Deseche las células sobrenadantes y resuspendidas en 50 ml de LB para eliminar el DAP residual.
  14. Pele el apareamiento usando centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  15. Repita el paso de lavado (pasos 2.13 y 2.14).
  16. Usando una pipeta serológica de 10 ml, resuspender el pellet en 10 ml de LB complementado con 25% de glicerol.
  17. Usando células lavadas, haga cinco diluciones en serie en caldo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Esparce 100 l de cada dilución en 4 placas diferentes utilizando cuentas de vidrio estériles: Agar Luria-Bertani complementado con kanamicina, agar complementado con ampicilina, agar complementado con DAP y agar solamente.
  19. Incubar las placas a 37oC durante la noche.
  20. Aliquot el apareamiento restante en 1 mL alícuotas y almacenar a -80 oC.

3. Determinar la dilución adecuada de la biblioteca transposon

  1. Registre las unidades formadoras de colonias (CFU) de placas nocturnas.
  2. Imagen de una placa con colonias con recuento para cada condición de placa diferente (Figura 2A).
    NOTA: Tanto las cepas de "donante" como las "receptoras" deben crecer en placas de agar suplementadas con DAP, por lo que la mayoría de las diluciones chapadas producirán un césped. Sólo la cepa "receptora" puede crecer en las placas de agar. Ni el "donante" ni la cepa "receptora" pueden crecer en placas de agar suplementadas con ampicilina, por lo que no debe haber ningún crecimiento/mínimo. Sólo las células de deformación unitaria objetivo que codifican la inserción del transposon pueden crecer en placas de agar suplementadas con kanamicina. Las colonias deben variar en tamaño, lo que indica inserciones de transposon en genes que contribuyen a la aptitud en el agar complementado con kanamicina.
  3. Calcular el número de mutantes transposon en el apareamiento congelado contando el número de colonias en placas de agar LB complementadas con kanamicina.
    NOTA: Para el genoma de A. baumannii (aproximadamente 4 Mbps), el objetivo era obtener alrededor de 400.000 colonias con el fin de generar una biblioteca mutante de alta resolución (aproximadamente una inserción de transposon/10 pares base). Sin embargo, este número debe optimizarse en función del tamaño del genoma de la especie objetivo).

4. Generación de la biblioteca mutante bacteriana final

  1. Descongelar una alícuota del apareamiento congelado sobre hielo.
  2. Acoplamiento de placas en placas de agar Luria-Bertani de 150 mm suplementadas con kanamicina basada en UFC calculadas en el paso 3.1. Ajuste el volumen con LB para producir 13.333 colonias por 150 ml antes del enchapado.
    NOTA: Se determinó que el recuento de UFC era de unos 105 CFU/ml, por lo que el volumen de acoplamiento se ajustó para obtener 13,333 colonias por placa, ya que esto proporcionaría un número óptimo de colonias en 30 placas para una biblioteca mutante de alta resolución sin hacinamiento de las placas.
  3. Utilice perlas de vidrio estériles para esparcir 150 l de la dilución por placa en placas de agar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complementadas con kanamicina para obtener 400.000 colonias(Figura 1C).
    NOTA: Se pueden utilizar varillas estériles o cualquier tipo de herramienta de esparcidor estéril (es decir, cuentas de vidrio) para esparcir las bacterias en las placas.
  4. Deseche el tubo usado que contiene el exceso de apareamiento.
    NOTA: Los ciclos de congelación/descongelación añaden presiones selectivas sobre el cultivo bacteriano, que pueden sesgar los resultados del experimento Tn-seq. Use una alícuota fresca cada vez.
  5. Incubar las placas a 37oC durante 14 h.
    NOTA: El tiempo de incubación está optimizado para evitar el crecimiento excesivo (colonias que se tocan). Se sugiere minimizar el crecimiento reduciendo el tiempo de incubación.

5. Estimación de la densidad de la biblioteca y agrupación para el almacenamiento

  1. Cuenta las UFC en cada plato para estimar el total de mutantes en la biblioteca de transposones. Contar el 20% de al menos 3 placas para determinar la estimación del recuento de colonias para todo el grupo de placas (Figura 2A). Asegúrese de que las colonias no toquen otra colonia.
  2. Después de calcular el rendimiento estimado de la colonia, agregue 3-5 mL de LB (o más si es necesario) a cada plato y raspe las bacterias usando una herramienta de raspado estéril.
    NOTA: Se utilizaron bucles de inoculación estériles para raspar placas de manera eficiente.
  3. Agrupación de suspensiones bacterianas de todas las placas en tubos cónicos de 50 ml(Figura 1D). Esto requerirá múltiples tubos cónicos de 50 ml, al menos 3.
  4. Suspensión bacteriana agrupada con pellets mediante centrifugación a 5.000 x g durante 7 min.
  5. Deseche el sobrenadante y el pellet resuspend en 5 ml de LB complementado con 30% de glicerol.
  6. Aliquot 1 mL de la biblioteca transposon en criooviales y almacenar a -80 oC.

6. Identificación de factores que regulan la resistencia a la colistina en A. baumannii

  1. Preparar matraces Erlenmeyer de 4 x 250 ml con cada uno de los que contengan caldo y etiqueta LB de 50 ml como (Figura 2B)
    1. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_1
    2. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (-) colistin_2
    3. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_1
    4. A. baumannii cepa ATCC 17978 Tn-seq biblioteca; (+) colistin_2
      NOTA: En el crecimiento del desafío descrito aquí, cada condición, (-) control de colistina y (+) desafío de colistina, se está probando por duplicado. Por lo tanto, la configuración requiere matraces Erlenmeyer de 4 x 250 ml, dos por condición.
  2. Añadir 50 ml de 0,5 mg/L de colistina a (+) matraces de colistina (6.1.3 y 6.1.4) y 50 ml de agua a (-) frascos de colistina (6.1.1 y 6.1.2).
  3. Descongelar una alícuota de la biblioteca Tn-seq congelada del paso 5 sobre hielo.
  4. Pipetear 1 l de la biblioteca descongelada en 1 ml de PBS.
  5. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600)y multiplique por 1.000.
    NOTA: Esto determina el OD600 de 1 l de la biblioteca Tn.
  6. Basándose en el cálculo del paso 6.5, inocular cada matraz que contenga 50 ml de LB a un OD final600 0.001.
  7. Cultivar cultivos en una incubadora de temblores a 37 oC aOD 600 0.5.
    NOTA: Es importante que las culturas permanezcan en fase de crecimiento logarítmico, por lo que si su cepa está en un OD600 diferente durante el crecimiento exponencial, el OD600 debe ajustarse para garantizar que el cultivo se replique tantas veces como sea posible dentro de la fase de crecimiento logarítmico. Si la cultura sólo se replica 3 veces, el poder de detectar defectos de aptitud en mutantes se limita a diferencias de 3 veces, en teoría. Dado que las diferentes bacterias tienen diferentes tiempos de duplicación, es importante sembrar los cultivos en un OD600 fijo para normalizar el inóculo inicial. Esto garantiza una representación coherente de toda la biblioteca en todas las referencias culturales.
  8. Cultivos de cosecha utilizando centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 7 min.
  9. Retire el sobrenadante y lávelo con 50 ml de PBS.
  10. Pellets que utilizan centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 7 min.
  11. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de PBS. Alícuota a 200 ml en 5 tubos de microcentrífuga.
  12. Pellet usando centrifugación a 5.000 x g a 4oC durante 5 min. Retire todo el sobrenadante con una punta de pipeta.
  13. Almacene los pellets a -20 oC o proceda con la extracción de gDNA.

7. extracción de gDNA

  1. Descongelar un pellet de celda sobre hielo.
  2. Añadir 0,6 ml de tampón de lísis(Tabla de materiales)y vórtice para resuspender completamente el pellet.
  3. Incubar a 37oC durante 1 h.
  4. Añadir 0,6 ml de alcohol fenol/cloroformo/isoamilo a la muestra y vórtice vigorosamente.
  5. Separe las fases utilizando centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad a temperatura de la habitación durante 5 minutos.
  6. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Evite perturbar la interfaz de fase durante la transferencia.
  7. Añadir un volumen igual de cloroformo a la fase acuosa obtenida arriba y vórtice vigorosamente.
  8. Separe las fases utilizando centrifugación en microcentrífuga a máxima velocidad a temperatura de la habitación durante 5 min.
  9. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
    NOTA: Asegúrese de evitar perturbar la interfaz durante la transferencia.
  10. Añadir 2,5 veces el volumen de fase acuosa de etanol frío al 100 % y mezclar suavemente. El ADN precipitado será visible.
  11. Colocar el tubo a -80 oC durante al menos 1 h.
  12. ADN de pellets utilizando centrifugación a velocidad máxima a 4 oC durante 30 min.
  13. Retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de ADN y lave con 150 ml de etanol al 70 % por pipeteo.
  14. ADN de pellets utilizando centrifugación a velocidad máxima a 4 oC durante 2 min.
  15. Retire con cuidado el sobrenadante.
  16. Repita el paso 7.14 una vez. Retire con cuidado todo el etanol restante.
  17. Seque el ADN incubando en la temperatura de la habitación durante 5-10 min.
  18. Resuspend PELLET de ADN en tampón de 100 l TE por pipeteo.

8. Cizallamiento del ADN (Figura 3A)

  1. Diluir el gDNA con tampón TE a una concentración de 250 ng/ml en un volumen total de 200 l.
  2. Coloque los tubos en un sonicador de baño de agua.
  3. Sonicar ADN para producir fragmentos de aproximadamente 300 nucleótidos. Potencia: 60 %, Tiempo total: 20 min, Ciclos: 10 s ON y 10 s OFF a 4oC(Figura 3A).
  4. Confirmar que el ADN se corta adecuadamente separando 10 ml de ADN sin alinear y 10 ml de ADN cizallado en un gel de agarosa al 1%. Repita la sonicación u optimice según sea necesario(Figura 3B).

9. Adición de cola poly-C al extremo 3'(Figura 3A)

  1. Configure la reacción de poli-C de acuerdo con la Tabla 1.
  2. Incubar la reacción a 37oC durante 1 h.
  3. Purifique la reacción de poli-C con 40 ml de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (Figura 3A) siguiendo los pasos a continuación.
    1. Añadir 40 l de perlas paramagnéticas de selección de tamaño a cada muestra. Vórtice a 5 s o pipeta arriba y abajo.
    2. Incubar muestras a temperatura ambiente durante 5 min.
    3. Brevemente, tubos centrífugos para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    4. Transfiera los tubos a un bastidor magnético e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos hasta que la solución esté limpia.
    5. Con los tubos en el bastidor magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante.
    6. Con tubos en rack magnético, agregue 200 l de etanol 80% recién preparado (no moleste perlas).
    7. Incubar muestras durante al menos 30 s hasta que la solución esté clara.
    8. Con los tubos en el bastidor magnético, retire cuidadosamente el sobrenadante.
    9. Repita el paso de lavado (pasos 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Recoger el líquido en la parte inferior del tubo utilizando un breve paso de centrifugación (2 s).
    11. Transfiera los tubos al bastidor magnético y retire el líquido restante.
    12. Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 min para secar las muestras. No secar demasiado.
    13. Retire los tubos del bastidor magnético y añada 25 ml de agua a cada uno. Vórtice para 5 s o pipeta arriba y abajo.
    14. Brevemente, tubos centrífugos para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    15. Transfiera los tubos al bastidor magnético y deje reposar durante 2 minutos hasta que la solución esté clara.
    16. Con los tubos en el bastidor magnético, retire el líquido sin alterar las perlas y transfiera a un tubo nuevo (23 l de ADN).

10. Amplificación de la unión Transposon (Figura 3A)

  1. Configuración de PCR 1 como se describe en el Cuadro 1 para el primer PCR anidado (Tabla 2).
  2. Realice el PCR 1 utilizando las condiciones descritas en el Cuadro 1.
  3. Productos de PCR de purificación con 40 ml de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (pasos 9.3.1 – 9.3-12). Eluido en 50 l de agua (pasos 9.3.13 – 9.3.16). En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 oC.
  4. Preparar cuentas paramagnéticas acopladas a Streptavidin:
    1. Resuspend Streptavidin cuentas agitando vigorosamente.
    2. Añadir 32 l de perlas por muestra a un tubo de microcentrífuga fresco.
      NOTA: Las perlas para 6 + muestras se pueden preparar en un solo tubo.
    3. Transfiera el tubo a un bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté clara.
    4. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    5. Retire el tubo del bastidor magnético. Lave las perlas resuspending en 1 ml 1x B&W buffer pipetting arriba y abajo.
    6. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté clara.
    7. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    8. Repita el paso de lavado con 1 ml de tampón en blanco y en blanco (pasos 10.4.5 – 10.4.7) dos veces más para un total de 3 lavados.
    9. Retire el tubo del bastidor magnético y los perlas resuspendidas en 52 ml de tampón en blanco y en blanco 2 veces por muestra.
  5. Combine 50 l de las perlas preparadas con 50 ml de PCR1 purificado (del paso 10.3). Pipeta para mezclar.
  6. Gire a temperatura ambiente durante 30 min.
  7. Lavar el ADN sin ataduras:
    1. Brevemente, centrífuga para recoger líquido en la parte inferior del tubo (2 s).
    2. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté transparente.
    3. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    4. Retire el tubo del bastidor magnético, lave las perlas resuspendiendo en un tampón de 100 l 1x B&W y pipeteando arriba y abajo.
    5. Transfiera el tubo al bastidor magnético. Incubar durante 2 min hasta que la solución esté transparente.
    6. Con el tubo en el bastidor magnético, retire el sobrenadante.
    7. Repita los pasos de lavado con 100 l de LoTE (pasos 10.7.4 – 10.7.6) dos veces más para un total de 3 lavados.
  8. Configure PCR 2 como se describe en la Tabla 1 para amplificar los cruces de transposon y añadir un único código de barras a cada muestra(Tabla 2 y Tabla 3).
  9. Realice el PCR 2 utilizando las condiciones descritas en el Cuadro 1.
  10. Purificar con 40 l de perlas paramagnéticas de selección de tamaño (pasos 9.3.1 – 9.3.12). Eluuto en 17 l de agua (pasos 9.3.13 – 9.3.16), recoger a 15 l.
  11. Cuantificar la concentración de ADN utilizando un fluorómetro. Las concentraciones finales deben ser de 50 a 250 ng/l.
  12. Evaluar la calidad del ADN mediante electroforesis capilar a base de virutas (Figura 4A).

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Representative Results

Los métodos descritos describen la generación de una biblioteca transposon de alta densidad en la cepa A. baumannii ATCC 17978 a través de la conjugación bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica el plásmido pJNW684 (Figura 4B). El protocolo detallado utiliza la conjugación bacteriana bi-parental para la transferencia de pJNW684 de la cepa de donante E. coli ápir+ a la cepa receptora de A. baumannii. Este es un método eficiente y barato para generar densas bibliotecas mutantes transposon. Las bacterias se mezclaron en proporciones optimizadas y los apareamientos se detectaron en placas de agar Luria-Bertani durante 1 h(Figura 1A). Durante el apareamiento, el transposon se transfirió del donante a la cepa receptora, donde se insertó en el gDNA (Figura 1B). Se recogieron acoplamientos, se calcularon aproximadamente10 5 UFC/ml y se encasinaron en placas de agar de 150 mm x 15 mm suplementadas con kanamicina.. Después de 14 horas de crecimiento a 37 oC, las placas contenían miles de colonias de diferente tamaño (Figura 1C) que indicaban la generación exitosa de una biblioteca mutante transposon. Los mutantes de inserción transposon fueron agrupados(Figura 1D)y congelados en alícuotas para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que podría agregar presión selectiva en la biblioteca de inserción.

La biblioteca mutante A. baumannii transposon agrupada se utilizó para identificar factores de aptitud importantes para la resistencia a la colistina bajo concentraciones subinhibitorias del antimicrobiano (Figura 2B). La biblioteca mutante se creció a fase logarítmica en ausencia/presencia de 0,5 mg/L de colistina en duplicado para agotar las células mutantes codificando inserciones en genes que contribuyen a la resistencia a la colistina. El gDNA total de la agrupación de bibliotecas restante se aisló de los cultivos de control y experimentales y se procesó para preparar el ADN para la secuenciación (Figura 3A).

El gDNA aislado se fragmentó mediante cizallamiento mecánico y se añadió una cola de poli-C en los fragmentos de ADN (Figura 3A). Tras la adición de la cola de poli-C, se purificó el ADN y se enriquecieron las uniones transposon-genoma utilizando la imprimación específica de poli-C seguida de una segunda ronda de PCR utilizando otra imprimación específica de poli-C que introdujo el sitio de secuenciación P7 que es necesario para unir la célula de flujo Illumina y la generación de racimos, y un código de barras de seis bases que se utiliza para demultiplexar bibliotecas post secuenciación37,,47. Se calcularon las concentraciones de ADN y se analizaron las muestras utilizando electroforesis capilar basada en virutas para confirmar las construcciones exitosas de la biblioteca(Figura 4A),que están listas para la secuenciación de alto rendimiento.

Las bibliotecas de ADN se secuenciaron mediante la secuenciación de próxima generación. Se realizó una carrera de un solo extremo de 50 ciclos, que produjo 30 millones de lecturas/muestras de alta calidad, proporcionando una cobertura de 62,5 veces la biblioteca transposon. Las uniones transposon (lecturas) se asignaron al genoma de referencia48,utilizando software de análisis bioinformático disponible comercialmente. El número de lecturas en cada sitio de inserción en las muestras de entrada, (-) condición de control de colistina, se comparó con el número de lecturas en las muestras de salida, (+) condición experimental de colistina y se calcularon las puntuaciones de aptitud para cada sitio de inserción. Las puntuaciones de acondicionamiento físico se agruparon por gen. Los genes que demostraban puntuaciones reducidas cuando la biblioteca se cultivaba en presencia de colistina en relación con las muestras de entrada se consideraron determinantes de aptitud para la supervivencia de A. baumannii en concentraciones subinhibitorias de colistina. Por ejemplo, las inserciones de transposon dentro del sistema de dos componentes PmrAB estaban presentes en la muestra de entrada, pero no se encontraron en la muestra de salida. PmrAB regula directamente la expresión de pmrC,que transfiere fosfoetanolamina a lípido A para neutralizar la carga en la superficie celular12,31. Se cree que la neutralización de la carga superficial bacteriana reduce el potencial electrostático necesario para la matanza mediada por colistina. La identificación de genes agotados conocidos por contribuir al fenotipo de resistencia validó el método.

Figure 1
Figura 1: Esquema de construcción de la biblioteca mutante transposon. (A) Conjugación bacteriana. La cepa "donante", que codifica la maquinaria de transposición, se mezcló con la cepa "receptora". La mezcla fue manchada en placas de agar LB y se le permitió aparearse durante 1 h. (B) Generación de la biblioteca transposon. El plásmido que transportaba la maquinaria de transposición se transfirió de la cepa "donante" a la cepa "receptora" y el transposon se insertó aleatoriamente en todo el genoma de la cepa "receptora". (C) Selección. Las células resultantes fueron chapadas en placas de agar suplementadas con kanamicina para seleccionar mutantes de inserción transposon. (D) Biblioteca agrupada. Las colonias fueron raspadas de las placas, resuspendidas en LB y agrupadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de conjugación bacteriana y un esquema del experimento colistina Tn-seq. (A) Placa de selección de kanamicina representativa. La placa se divide en cinco secciones iguales. Los puntos azules representan colonias contando para la estimación de los mutantes de inserción de A. baumannii transposon. Se contaron al menos tres placas separadas para calcular la estimación final. (B) Identificación de los factores de aptitud en las concentraciones subinhibitorias de colistina. La biblioteca de transposon agrupada se creció a la fase de crecimiento logarítmico, ya sea en ausencia (control) o en presencia (experimental) de colistina. Una vez que los cultivos alcanzaron la densidad óptica adecuada, las células fueron peletadas y el gDNA fue extraído de cada muestra. Cada condición se probó por duplicado para un total de cuatro muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama de flujo de la biblioteca de amplificación de ADN construido para la secuenciación paralela masiva y gDNA cizallado representativo. (A) Esquema de compilación de la biblioteca de ADN Tn-seq. Después de la extracción, el gDNA se fragmentó mediante cizallamiento mecánico. La desoxinucleótito transferasa terminal se utilizó para añadir una cola poli-C al extremo 3' del ADN fragmentado antes de la amplificación PCR de las uniones transposon-genoma y la adición de código de barras. (B) 1% gel de agarosa de bibliotecas mutantes A. baumannii sin esquear y cizallado después del paso de cizallamiento de gDNA. Se utilizó una escalera de 1 Kb como marcador de ADN. El frotis de gDNA cizallado oscila principalmente entre 100 y 500 pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados del control de calidad representativo (QC) y mapa del plásmido que lleva los genes de transposición. (A) Seguimiento de control de calidad para una compilación de biblioteca de ADN. Hay un pico en 350 pares base, lo que indica la compilación correcta de la biblioteca. Si se detectó algo de ADN más grande en los resultados de control de calidad, las muestras se pueden limpiar aún más para eliminar fragmentos de ADN grandes. (B) Plásmido pJNW684 consiste en un transposon marino Himar1 (verde) con un casete de resistencia a la kanamicina (púrpura) para la selección mutante, un gen que codifica el marino hiperactivo Himar1 C9 transposasa (rojo) bajo el control de un promotor específico de A. baumannii 17978 (azul), un gen de resistencia a la ampicilina(bla,naranja) y un origen de replicación condicional RP4/oriT/oriR6K (amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reacción Configuración Condiciones
Reacción Poly-C 30 l de gDNA cizallado
2,5 l de 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 l de 5X Terminal desoxinucleótito transferasa (Tdt) buffer de reacción
1.25 l de rTdt
6,25 l de agua a 50 l		 Incubar a 37oC durante 1 hora
PCR 1 23 l de ADN purificado de 3'-poli-C (muestra completa del paso anterior)
Mezcla de reacción de adn polimerasa de alta fidelidad de 10 l de 10 l
2 l 10 mM dNTPP
2 l 50 mM MgSO4
1 l 30 m olj 510 biotina
3 l 30 m olj 376
0,5 l de polimerasa de ADN de alta fidelidad
8,5 l de agua pura a 50 l en total		 1 ciclo: 2 min 94 oC
15 ciclos: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 ciclo: 4 min 68 oC
Sostener: ∞ 4 oC
PCR 2 Cuentas enlazadas al ADN del paso anterior
Mezcla de reacción de adn polimerasa de alta fidelidad de 10 l de 10 l
2 l 10 mM dNTP
2 l 50 mM MgSO4
1 L 30 m olj 511
Imprimación de código de barras de 1 L de 30 m (Tabla 2)
0,5 l de polimerasa de ADN de alta fidelidad
33,5 l de agua pura a 50 l		 1 ciclo: 2 min 94 oC
15 ciclos: 15 s 94 oC
30 s 60 oC
2 min 68 oC
1 ciclo: 4 min 68 oC
Sostener: ∞ 4 oC

Tabla 1: Configuración de la reacción. Configuración y condiciones para reacciones de poli-C, PCR 1 y PCR 2.

Propósito Nombre Secuencia
Anneals a transposon olj510-Biotin Biotina-GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACTACCTGCAGGGCGCG
Anneals a la cola poli-C olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGTGTTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGG
Anidado al adaptador transposon + P5:
Sitio de captura P5 – sitio de secuenciación P5– N5 –Tn		 olj511 AATGATACGGGACCACCGAGATCTACACTCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Anidado a olj376: sitio de secuenciación P7
– código de barras XXXXXX – sitio de captura P7)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
ver Tabla 2 para códigos de barras específicos***

Tabla 2: Imprimaciones de amplificación de PCR. Imprimaciones de amplificación de PCR utilizadas en el protocolo para amplificar las uniones transposon. El propósito de cada uno se enumera en la primera columna.

Cartilla Leer Barras Secuencia
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAC
ATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC4 TGACCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CACTACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC7 CAGATC GATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC17 GTAGAG CTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC30 CACCGG CCGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
CCGGTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabla 3: Imprimaciones de código de barras. Las imprimaciones de código de barras se utilizan en el segundo paso pcR para amplificar los cruces de transposon mientras se añade un sitio de secuenciación P7 y códigos de barras al amplicon. No todos los imprimadores de código de barras son necesarios para generar una biblioteca. Solo se requieren imprimaciones de código de barras para el número de muestras.

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Discussion

A. baumannii es una amenaza emergente para la salud pública mundial debido a la rápida adquisición de AMR contra las terapias de "última línea", como la colistina10,,11,12,23,24,30,31. En las últimas décadas, Tn-seq ha desempeñado un papel fundamental en el esclarecer las interacciones genotipo-fenotipo a través de numerosas especies bacterianas y ampliar nuestra comprensión de la genética bacteriana34,,35,,42,,43. Los protocolos Tn-seq han sido fundamentales para identificar genes esenciales en diversas especies bacterianas como Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, el patógeno periodontal Porphyromonas gingivalis,e incluso Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. Más allá de la identificación de genes esenciales, Tn-seq se ha utilizado para identificar genes de resistencia a antibióticos en Pseudomonas aeruginosa,varios genes condicionalmente esenciales en Salmonella typhimurium, y numerosas relaciones genotipo-fenotipo en Streptococcus pneumoniae52,53,54. Más recientemente, la secuenciación transposon de Vibrio cholerae se empleó en el modelo de conejo infantil de cólera para identificar genes que son importantes para la aptitud in vivo durante la infección47. Estos estudios demuestran la versatilidad de Tn-seq, ya que se puede utilizar para estudios in vitro e in vivo.

La principal ventaja de Tn-seq sobre otros métodos, como las tecnologías de microarray, la electroforesis de gel 2D y qPCR, es que no requiere conocimiento previo del genoma o información genómica55. Por lo tanto, la mutagénesis transposon junto con la secuenciación masiva paralela permite el estudio de genes y genomas conocidos, así como el descubrimiento de interacciones genéticas novedosas. Aquí hemos presentado un método integral para generar una biblioteca mutante transposon altamente densa en A. baumannii para identificar factores que son esenciales para la aptitud bacteriana cuando se exponen a concentraciones subinhibitorias de colistina. El método descrito también se ha utilizado con éxito en E. coli (datos no publicados), demostrando que el sistema es susceptible de realizar análisis Tn-seq en otros patógenos Gram negativos, incluyendo Enterobacteriaceae.

El uso de transposones marinos para la mutagénesis insercional tiene varias ventajas. La familia transposon se originó a partir de huéspedes eucariotas y han sido ampliamente utilizados para generar saturación de bibliotecas mutantes en diversas poblaciones bacterianas. Los transposones marinos son independientes del host, lo que significa que se pueden lograr inserciones aleatorias estables en ausencia de factores de host específicos40,,41. Además, los transposones marinos tienen un número definido de eventos de inserción porque se insertan preferentemente en motivos de timina-adenina ("TA"), lo que reduce el sesgo de inserción y conduce a un análisis estadístico más robusto37,,56,,57,,58.

Varios métodos Tn-seq basados en marinerosutilizan la digestión de restricción MmeI para la fragmentación de gDNA32,42,43. Si bien la fragmentación del ADN enzimático es un método popular y exitoso, añade pasos innecesarios al procedimiento y aumenta el sesgo potencial37. Estas técnicas no sólo requieren grandes cantidades de materiales de partida, sino que también pueden conducir a una representación desigual de las secuencias de inserción en los análisis posteriores37,,59. Al igual que algunos otros métodos que no se basan en la actividad de la nucleasa MmeI 52,60,61, el método descrito en este documento se basa en el cizallamiento mecánico para fragmentar gDNA, y TdT para agregar una cola de poli-C al extremo 3' de los fragmentos de ADN. En comparación con los métodos de fragmentación enzimática del ADN y la ligadura de adaptadores, este enfoque requiere cantidades significativamente menores de ADN inicial, al tiempo que proporciona resultados más consistentes, también reduce el riesgo de contaminación cruzada del ADN y reduce la pérdida de muestras debido al confinamiento en un tubo sellado37,,59,,62. Además, este método produce lecturas de secuenciación más largas y de alta calidad de 50 nucleótidos que ayudan a un mapeo más eficaz y preciso de las secuencias y a un análisis descendente más robusto37,,59. La adición de una cola sintética de poli-C no tiene en cuenta los voladizos potenciales que pueden resultar de la fragmentación, ya que este método se basa en la cola de poli-C añadida exógenamente como sitio de reconocimiento para la imprimación inversa, que contiene 16 dG nucleótidos en su extremo de 3' y una secuencia específica para la secuenciación de próxima generación (por ejemplo, secuenciación de Illumina) en el extremo 5', a la síntesis de47,59. El uso de una cola de nucleótido sintético amplía la aplicación de este método a muchos genomas distintos independientemente de su contenido nativo59. Posteriormente, las uniones transposon-genoma se amplifican utilizando la imprimación específica de poli-C37. Esta alternativa simplifica el procedimiento al eliminar la necesidad de enzimas de restricción costosas, ligadura de adaptador, formación de dimers de adaptador y pasos de purificación de gel. Hemos optimizado aún más el protocolo para generar eficientemente bibliotecas de inserción transposon altamente saturadas en varios patógenos ESKAPE Gram-negativos, incluyendo Acinetobacter baumannii y se puede utilizar para estudiar interacciones genéticas bajo diversas condiciones in vitro e in vivo 10.

Una limitación de la mutagénesis Tn es que se basa en los marcadores de resistencia a los antibióticos para la selección. Sin embargo, muchos patógenos Gram-negativos ESKAPE son multifármacos o ampliamente resistentes a los medicamentos, lo que significa que el usuario puede necesitar intercambiar el casete de resistencia de acuerdo con el patógeno específico de interés. Además, algunos aislados clínicos no son susceptibles a la mutagénesis transposon utilizando el transposón marino.

Un paso crítico del protocolo es calcular el número de mutantes Tn a la placa. La chapado en demasiadas colonias resultará en un césped que puede complicar el análisis posterior. Si las colonias están demasiado cerca o tocando, pueden agregar presión selectiva no deseada sobre la biblioteca que puede dar lugar a artefactos. Idealmente, las colonias no estarían tocando y espaciadas uniformemente a través de la placa, como se demuestra (Figura 2A). Por el contrario, si hay muy pocas colonias chapadas, será difícil aislar múltiples inserciones de Tn en cada gen.

También es importante realizar los controles enumerados en el paso 2.18. Como se indica en la Nota de la sección de 3. 2, ni la cepa de "donante" o "receptor" deben crecer en placas suplementadas con Ampicilina. Dado que se requiere DAP exógeno para el crecimiento de la cepa del "donante", cualquier crecimiento indicaría que la cepa "receptora" replica pJNW684. Este es un problema significativo porque si el transposon no se integra en el gDNA, las lecturas de secuenciación sólo se asignarán al plásmido, no a un sitio de integración. En este caso, es probable que el experimento no produzca datos utilizables.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional de Salud (Grant AI146829 a J.M.B.) y es reconocido con gratitud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Número 161 transposon secuenciación de alto rendimiento Gram-negativo Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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