Summary
자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.
Abstract
면역조직화학은 특정 조직 구조와 단백질 발현 및 국소화를 시각화하는 데 널리 사용되는 기술입니다. 염색 절차 동안 조직 섹션을 처리하기 위해 두 가지 대체 접근법이 널리 사용되며, 한 가지 접근법은 유리 슬라이드에 직접 섹션을 장착하는 것으로 구성되며, 두 번째 접근 방식 인 자유 부유는 용액에 현탁 된 동안 고정 된 섹션을 유지하고 염색 할 수 있습니다. 슬라이드 장착 및 자유 부동 접근법은 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 자유 부유 기술은 더 나은 항체 침투를 허용하므로 실험의 초점이 뇌 영역의 수지상 및 축삭 투영에 대한 정보를 얻는 것과 같이 조직의 3D 재구성에 더 두꺼운 섹션을 사용해야 할 때 선택 방법이어야 합니다. 또한, 섹션이 용액에 보관되기 때문에, 단일 부분 표본은 30 내지 40 개의 섹션을 쉽게 수용 할 수 있으며, 특히 대규모 생물 의학 연구에서 취급이 덜 힘들다. 여기에서는 뇌 절편에 중점을 둔 형광 면역조직화학 염색에 자유 부유 방법을 적용하는 방법을 설명합니다. 또한 조직 샘플이 일반적으로 파라포름알데히드 또는 포르말린으로 적절하게 고정되는 한 자유 부동 기술을 연구자의 개별 요구에 맞게 쉽게 수정하고 헤마톡실린, 에오신 및 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학 기반 염색뿐만 아니라 다른 조직에 적용할 수 있는 방법에 대해서도 논의할 것입니다.
Introduction
면역 염색은 130 년 전 1890 년 Von Behring1에 의해 혈청 항체가 발견되면서 시작된 인기있는 연구 관행입니다. 20세기 초에는 반응1을 정량화하고 시각화하는 방법으로 항원에 염료가 부착되었고 나중에는 항체에 부착되었으며, 1941년 Albert Coons는 광학 현미경 2,3에 혁명을 일으킨 최초의 형광 항체 라벨을 개발했습니다. 용어 "면역염색"은 웨스턴 블롯, 유세포분석, ELISA, 면역세포화학, 및 면역조직화학3,4를 포함하여, 이 원리를 사용하여 개발된 많은 기술을 포함한다. 웨스턴 블롯은 조직 또는 세포 추출물에서 특정 단백질의 존재를 감지합니다5. 단백질은 겔 전기 영동을 사용하여 크기별로 분리되고, 막으로 옮겨지고, 항체를 사용하여 프로빙됩니다. 이 기술은 단백질의 존재와 단백질의 양을 나타냅니다. 그러나 세포 나 조직 내에서 단백질의 국소화에 대한 정보는 밝히지 않습니다. 또 다른 방법인 면역세포화학(ICC)은 세포 내의 단백질, 일반적으로 시험관 내에서 배양된 세포를 표지합니다. ICC는 세포 구획 내에서 단백질 발현과 국소화를 모두 보여줍니다6. 조직 수준에서 특정 단백질을 검출하고 시각화하기 위해 면역 조직 화학 (IHC)이 사용됩니다.
IHC는 연구자들이 면역계의 화학적 특성을 이용하여 조직 내의 특정 항원을 표적으로 삼는 데 사용하는 방법입니다 7,8. 효소 또는 형광 염료에 연결된 특정 1차 및 2차 항체를 생성함으로써 관심 항원을 표지하고 대부분의 조직에서 밝힐 수 있습니다(Mepham 및 Britten에서 검토됨)9. 용어 "면역조직화학" 자체는 관심있는 항원을 밝히기 위해 사용되는 표지 방법을 특정하지 않는다; 따라서이 용어는 종종 표지 방법을 명확하게 묘사하기 위해 검출 기술과 결합됩니다 : 2 차 항체가 퍼 옥시다아제와 같은 효소에 접합 될 때를 나타내는 발색 면역 조직 화학 (CIH); 또는 2차 항체가 형광단에 접합되는 경우를 나타내기 위해 형광 IHC, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 또는 테트라메틸로다민 (TRITC). IHC의 선택성을 통해 임상의와 연구원은 다양한 건강 및 질병 상태에 걸쳐 조직 전반에 걸쳐 단백질 발현 및 분포를 시각화할 수 있습니다10. 임상 영역에서 IHC는 일반적으로 암을 진단하고 다양한 유형의 암의 차이를 결정하는 데 사용됩니다. IHC는 또한 B형 간염 또는C11형 간염과 같은 신체 내 다양한 유형의 미생물 감염을 확인하는 데 사용되었습니다. 생물 의학 연구에서 IHC는 종종 조직에서 단백질 발현을 매핑하는 데 사용되며 질병 상태에서 보이는 비정상적인 단백질을 식별하는 데 중요합니다. 예를 들어, 신경 퇴행은 종종 알츠하이머 병의 Αβ 플라크 및 신경 섬유 엉킴과 같은 뇌의 비정상적인 단백질 축적을 동반합니다. 동물 모델은 종종 이러한 병리학 적 상태를 모방하기 위해 개발되며, IHC는 연구자가 관심있는 단백질을 찾고 정량화하기 위해 사용하는 한 가지 방법입니다10,12,13. 차례로, 우리는 이러한 질병의 원인과 그로 인해 발생하는 합병증에 대해 더 많이 배울 수 있습니다.
IHC 수행에는 많은 단계가 포함됩니다. 먼저, 관심있는 조직을 수집하고 염색을 준비합니다. 틀림없이 대부분의 연구자들은 고정 조직 샘플을 준비하며, 순환계를 통한 고정 제의 관류는 형태를 보존하기 때문에 최적입니다14,15. 조직 샘플의 사후 고정도 사용할 수 있지만 이상적인 결과보다 적을 수 있습니다16. 가교 고정제, 예를 들어 포름알데히드는 조직 내의 단백질 사이에 화학 결합을 생성함으로써 작용한다(17). 그런 다음 고정 조직은 마이크로톰을 사용하여 매우 얇은 층 또는 섹션으로 절단되며 많은 연구자들은 저온 유지 장치를 사용하여 냉동 섹션을 수집하는 것을 선호합니다. 거기에서 조직을 수집하여 현미경 슬라이드에 직접 장착하거나(슬라이드 장착 방법) 인산염 완충 식염수(PBS)18과 같은 용액에 현탁합니다(자유 부유 방법). 사용 된 수집 방법은 연구자의 요구에 따라 미리 결정되며,이 두 가지 방법 각각은 고유 한 장점과 단점을 나타냅니다.
슬라이드 장착 방법이 가장 일반적으로 사용되며, 예를 들어 단백질-단백질 상호 작용을 조사하는 데 중요한 매우 얇은 섹션(10-14μm)을 준비할 수 있다는 중요한 이점이 있습니다. 또한 시편의 취급이 최소한이며, 이는 조직(19)의 구조적 완전성에 대한 잠재적 손상을 감소시킨다. 연구원들은 종종 신선한 냉동 조직(드라이아이스, 이소펜탄 등을 사용하여 즉시 냉동되는 조직)에 이 기술을 사용하는데, 이는 고정 조직에 비해 매우 섬세하며 샘플의 해동을 방지하기 위해 많은 주의를 기울여야 합니다. 슬라이드 장착 섹션을 사용하는 또 다른 이점은 염색을 위한 많은 양의 용액이 일반적으로 필요하지 않다는 것입니다4. 따라서 연구자들은 소량의 값 비싼 항체 또는 기타 화학 물질을 사용하여 염색을 완료 할 수 있습니다. 또한 여러 실험 그룹의 섹션을 동일한 슬라이드에 장착할 수 있으며, 이는 특히 이미지 획득 중에 유리할 수 있습니다. 다른 한편으로, 슬라이드 장착 섹션을 사용하는 데에는 몇 가지 단점이 있는데, 가장 두드러지게 조직 섹션이 슬라이드에 부착되어 섹션의 한쪽으로 항체 침투를 제한하여 섹션의 섹션 두께 및 3D 표현을 제한한다는 것입니다. 또한 세척 중에 조직의 가장자리와 전체 섹션이 슬라이드에서 분리되어 전체 실험이 쓸모 없게 될 수 있습니다. 더욱이, IHC는 전형적으로 -20 또는 -80°C에서 저장되고, 종종 커버슬립되어 수평으로 또는 슬라이드 박스에 저장되는 항원 에피토프(20,21)의 분해를 피하기 위해 슬라이드-장착 접근법을 사용할 때 비교적 신속하게 수행되어야 하며, 이는 상대적으로 큰 저장 풋프린트를 초래한다. 마지막으로, 슬라이드 장착 기술은 연구자가 많은 수의 조직 섹션을 처리하기 위해 많은 수의 슬라이드를 처리해야 하는 경우에도 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
슬라이드 장착 방법을 사용하는 이러한 문제 중 일부로 인해 자유 부동 방법이라는 수정이 인기 있는 대안이 되었습니다. 이 기술은 1960-70 년대 22,23,24 년에 문헌에 등장하여 1980 년대 25,26,27,28,29에서 인기를 얻었으며 이제는 슬라이드 12,30,31에 부착되지 않고 현탁액으로 수집 된 섹션에 염색을 수행하는 잘 확립 된 방법입니다. . 자유 부동 방법은 조직 절편이 20μm 미만인 경우 권장되지 않습니다. 그러나 우리의 경험상 더 두꺼운 (40-50 μm) 섹션을 염색 할 때 선택하는 접근 방식입니다. 한 가지 뚜렷한 이점은 항체가 모든 각도에서 자유 부유 섹션을 관통하고 보다 효과적인 세척으로 인해 배경 염색을 덜 생성할 수 있어 이미징 시 더 나은 신호 전달을 얻을 수 있다는 것입니다. 또한 가공 후 섹션이 슬라이드에 장착되므로 조직 분리 가능성을 제거하고 저온 유지 장치를 차지하는 시간을 줄일 수 있습니다. 자유 부동 방법은 특히 대규모 생물 의학 연구의 경우 노동 집약적 인 경우가 훨씬 적습니다. 예를 들어, 동일한 웰에서 동일한 샘플의 많은(18-40) 섹션을 함께 염색할 수 있으므로 세척 및 항체 배양 단계를 모두 수행하는 데 시간을 절약할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근법을 사용하여 슬라이드당 더 많은 수(12-16)의 섹션을 장착할 수 있기 때문에, 연구자가 섹션을 보고 이미지화하는 것이 더 편리하고 빠른 경우가 많다. 특히, 슬라이드에 조직 슬라이스를 장착하는 동안 원하는 방향이 얻어질 때까지 섹션을 부착 및 분리할 수 있습니다. 연구원들은 또한 자유 부유 방법을 사용하여 약간 더 낮은 농도의 항체를 사용하는 경우가 많으며, 배양이 미세 원심 분리 튜브에서 수행되기 때문에 항체를 쉽게 수집하고 재사용을 위해 아지드 화 나트륨으로 보존 할 수 있습니다 (5.1 단계 참조). 또 다른 장점은 절편을 -80°C에서 동결방지제 용액(32)을 갖는 작은 미세원심분리 튜브에 직접 저장할 수 있어 저장 공간을 최소화하고 샘플(33)의 수명을 최대화할 수 있다는 것이다. 이 기술을 사용할 때의 단점은 섹션이 많이 처리되어 손상되기 쉽다는 것입니다. 그러나 이는 낮은 흔들림과 회전 속도를 사용하고 연구자에게 샘플을 옮기고 섹션을 슬라이드에 장착하는 방법을 적절하게 교육함으로써 완화할 수 있습니다.
종합하면, IHC는 임상 및 생물 의학 연구 분야 모두에서 단백질 발현을 시각화하고 국소화하기위한 확립 된 필수 도구입니다. 자유 부동 IHC는 특히 대규모 조직학 연구를 수행할 때 효율적이고 유연하며 경제적인 방법입니다. 여기에서는 발색 IHC 및 헤마톡실린 및 에오신 또는 크레실 바이올렛 염색과 같은 기타 염색에 적절하게 적용할 수 있는 과학계를 위한 신뢰할 수 있는 자유 부동 형광 IHC 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
1. 냉동 절제를위한 조직 준비
- 적절한 매립 몰드(재료 표 참조)에 고정 조직을 삽입하여 적절한 표본 매트릭스(재료 표 참조)를 사용하여 표본 블록을 만들고 드라이아이스에서 얼립니다. 절단할 준비가 될 때까지 시편 블록을 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 고정 조직은 일반적으로 사용 가능한 윤리적 허가에 따라 성인(약 2.5 – 30개월) 수컷 또는 암컷 설치류(마우스 또는 쥐)34를 적절한 고정제(예: 10% 포르말린)로 관류한 다음 동일한 고정액에 4°C에서 12시간 동안 고정 후 조직을 1x PBS로 3회 세척하여 준비합니다. 조직을 1x PBS에 15% 및 30% 슈크로스에 밤새 또는 조직이 가라앉을 때까지35에 배치합니다. 연구원은이 일반 프로토콜을 다른 개발 단계에 적용하려고 할 수 있습니다.
2. 냉동 제거
- 절편할 준비가 되면 절편 전에 최소 1-2시간 동안 저온 유지 장치에서 샘플을 순응시켜 조직의 산산조각이 나지 않도록 합니다.
- 저온 유지 장치를 사용하여 조직을 섹션(20-50μm)으로 절단하고 1x PBS 용액으로 채워진 6웰 또는 12웰 삽입물( 재료 표 참조)에 수집합니다.
참고: 섹션 두께, 수집할 조직의 양 및 사용된 웰 삽입물의 수에 따라 각 웰에는 웰에 대해 약 10개에서 40개의 슬라이스에 이르는 다양한 수의 섹션이 포함됩니다. 예를 들어, 전체 뇌가 40μm로 절단된 경우 12웰 삽입물을 사용하여 각 웰에서 약 18-24개의 섹션이 수집됩니다. 또한 20μm 섹션은 처리하기가 다소 어려울 수 있으므로 벌크 염색에는 40μm가 권장됩니다(토론 참조).
3. 섹션 저장
- 수집되면 새로 준비한 1x PBS로 5분 동안 섹션을 세척합니다. 3 번 반복하십시오.
- 섹션을 1-1.5mL의 저장 용액으로 채워진 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다(250mL의 경우 자당 70g, 에틸렌 글리콜 75mL를 혼합하고 0.1M 인산염 완충액으로 부피를 만듭니다).
- 염색 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
4. 염색의 날 I
- 냉동실에서 샘플을 꺼내 실온(RT)에서 10 - 20분 동안 평형을 이룹니다.
- 6웰 플레이트의 웰 인서트에 섹션을 부어 저장 용액을 섹션에서 분리합니다.
- 웰 삽입물을 약 6mL의 1x TBS가 들어 있는 다른 웰로 이동합니다. RT에서 저속을 사용하여 오비탈 셰이커에서 각각 5분 동안 1x TBS로 3회 세척합니다.
- 절편을 세척하는 동안 0.3% Triton X-100과 3% 정상 혈청(예: 정상 말 혈청)이 포함된 1x TBS로 구성된 차단 투과 용액 7mL(샘플당)를 준비합니다. 저속을 사용하여 궤도 셰이커의 RT에서 30분 동안 섹션을 차단합니다.
참고: 혈청으로 차단하면 항체가 조직 또는 비특이적 Fc 수용체에 비특이적으로 결합하는 것을 방지할 수 있습니다 – 2차 항체 종과 일치하는 혈청이 권장되지만, 사용할 수 없는 경우 1차 항체 숙주 동물과 다른 종의 정상 혈청을 사용할 수 있습니다. 세제 Triton X-100은 조직을 투과시켜 항체 침투를 향상시킵니다. - 0.3% Triton X-100 및 1% 정상 혈청이 포함된 1x TBS에서 선택된 1차 항체(적절하게 희석됨)로 구성된 1차 항체 용액 샘플당 1mL를 준비합니다(단계 4.4 참고 참조). 웰 삽입물의 섹션을 관심 항원에 결합하기 위해 1차 항체 용액이 들어 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 다수의 1차 항체가 사용될 수 있다(상이한 숙주 종에서 생성됨). - 섹션이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브를 저속(예: 속도 7rpm)을 사용하여 회전 믹서에 놓고 4°C에서 12-16시간 동안 밤새 배양합니다.
5. 염색의 날 II
- 다음 날, 6웰 플레이트의 웰 삽입물에 절편을 부어 1차 항체 용액에서 절편을 분리합니다.
참고: 항체 용액을 수집하여 재사용할 수 있습니다. 미생물 성장을 억제하기 위해 0.02%(w/v) 아지드화 나트륨을 첨가합니다. - RT에서 3x TBS로 섹션을 1번 세척합니다(처음 30회 세척의 경우 2초, 최종 세척의 경우 10분).
- 0.3% 트리톤 X-100 및 1% 정상 혈청(빛으로부터 차폐 용액)이 있는 1x TBS에서 적절한 2차 항체(그에 따라 희석됨)로 구성된 2차 항체 용액 샘플당 1mL를 준비합니다.
참고: 접합된 2차 항체를 사용한 간접 표지는 신호를 증폭하고 단백질 표적의 비색 또는 형광 시각화를 허용합니다. - 2차 항체 용액이 들어 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 섹션을 옮깁니다. 저속 (빛으로부터 차폐 용액)을 사용하여 궤도 셰이커의 RT에서 2 시간 동안 배양하십시오.
- 6웰 플레이트의 웰 삽입물에 섹션을 부어 2차 항체 용액에서 섹션을 분리합니다.
- 샘플을 빛으로부터 계속 보호하면서 RT에서 30 초 동안 1x TBS로 2 번 세척하십시오. 그런 다음 1x TBS에서 15분 동안 세척하고 원하는 경우 DAPI(1-0.1μg/ml)를 추가합니다.
6. 설치
- 1x TBS로 4분의 3을 채운 유리의 직사각형 조직학적 챔버에 섹션을 붓습니다.
- 유리 슬라이드를 1x TBS에 담그고 가는 붓을 사용하여 섹션을 슬라이드 쪽으로 감언이설합니다.
- 슬라이드의 섹션을 부드럽게 두드려 주름이나 주름이 없는지 확인합니다.
- 모든 섹션이 슬라이드에 장착될 때까지 반복합니다.
참고: 예를 들어, 전체 뇌가 40μm로 절편화되는 경우, 18-24개의 섹션을 포함하는 하나의 분취량이 있는 12웰 삽입물에 수집됩니다. 슬라이스는 일반적으로 1-2개의 슬라이드에 장착되지만 연구자의 선호도에 따라 슬라이드당 더 적은 수의 섹션을 장착할 수도 있습니다.
7. 커버슬립
- 섹션을 슬라이드에 건조시킨 후 RT에서 약 10-15분 동안 또는 섹션이 불투명하게 보일 때까지(슬라이드를 빛으로부터 보호하는 것을 잊지 마십시오) 적절한 수성 장착 매체(경화 또는 비경화)를 적용합니다. 항변색은 형광 접합된 2차 항체를 사용하는 경우에 바람직하다.
알림: 경화 장착 매체를 사용할 때 형광 품질이 떨어질 수 있지만 슬라이드는 더 오래 지속되어야 합니다. - 핀셋을 사용하여 매체 위에 커버 슬립을 놓습니다. 여과지로 덮고 아래로 단단히 눌러 과도한 장착 매체를 제거합니다.
알림: 경화되지 않는 마운트를 사용하는 경우 덮개가 미끄러진 슬라이드의 가장자리를 투명한 매니큐어로 칠하여 밀봉하십시오. - 적절한 현미경을 사용한 이미지 섹션. 4 ° C의 어두운 슬라이드 상자에 보관하십시오.
참고: 레이저 스캐닝 컨포칼 및 역 또는 직립 광시야 형광과 같은 다양한 현미경을 사용하여 연구자의 필요에 따라 배율(예: 10x, 20x, 40x)로 단면을 이미지화할 수 있습니다.
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Representative Results
자유 부유 방법을 사용하여 형광 면역조직화학 분석을 수행하는 전체 도식이 도 1에 예시되어 있다. 마우스 뇌에서 자유 부유법을 이용한 형광 IHC의 대표적인 예는 신경교섬유산성 단백질(GFAP) 발현을 조사하여 염색의 전반적인 품질을 설명하기 위해 더 낮은 배율 및 높은 배율 모두에서 도 2에 나타내었다. 이 접근법은 그림 3에 표시된 GFP 저발현 형질전환 마우스 뇌의 예와 같이 저발현 단백질을 드러내는 데에도 적합합니다. 자유 부동 방법은 프로토콜의 1단계부터 4.3단계까지 수행한 다음 6단계에 표시된 대로 섹션을 장착하여 그림 4와 같이 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학적 염색 프로토콜에서도 사용할 수 있습니다. 그 후, 섹션은 슬라이드 장착 섹션이 필요한 임의의 염색을 사용하여 처리될 수 있다. 발색 IHC에 이 프로토콜을 사용하는 경우 1단계부터 5.6단계까지의 프로토콜을 따르고(마지막 세척에 DAPI를 추가하지 않음) 증폭 단계(예: 아비딘-비오틴 복합체)를 사용하는 경우 그에 따라 조정합니다. 완충액을 크로마겐/기질 시약으로 교체하고 조직이 원하는 색이 될 때까지 5-20분 동안 배양합니다. 반응은 저전력 현미경으로 주기적으로 조직을 검사하여 모니터링 할 수 있습니다. 섹션이 있는 웰 삽입물을 새로운 완충액으로 옮기고 각각 최소 5분 동안 3회 세척하여 반응을 종료합니다. 6단계로 진행하여 섹션을 유리 슬라이드에 장착하여 섹션을 슬라이드 워머에서 최소 3-4시간 동안 건조시킵니다. 에탄올 농도가 증가하여 슬라이드를 탈수(즉, 각각 70%, 90%, 95%, 99.5%, 2-5분)한 다음 크실렌(5-10분)을 수행한 다음 하드 장착 매체(예: Entellan)로 커버슬립하여 슬라이드가 통풍이 잘되는 곳에서 최소 1-2시간 건조되도록 합니다. 배경이 너무 높으면, 1x TBS에서 3 % H 2 O2로 RT에서 15 분 동안 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 켄칭 한 후, 블로킹하기 전에 각각 15-20 분씩 3 회 완충액 세척을 실시한다 (단계 4.4). 여러 말초 조직도 프로토콜의 수정 없이 이 기술을 사용할 수 있으며, GFP 발현 마우스의 간 절편의 예가 그림 5에 나와 있습니다.
그림 1: 자유 부동 형광 면역조직화학 분석의 흐름도. 관심 기관(바람직하게는 고정 조직)을 해부하고 표본 매트릭스(재료 표 참조)를 사용하여 매립 몰드(재료 표 참조)에 조직을 매립한 다음 드라이아이스에서 동결하고 -80°C에서 보관합니다. 절편 조직은 20-50 μm의 저온 유지 장치를 사용하여 1x PBS로 채워진 웰 삽입물(재료 표 참조)에서 슬라이스를 수집합니다. 저속에서 오비탈 셰이커를 사용하여 1x PBS에서 각각 5분 동안 섹션을 3회 세척합니다. 이 시점에서 필요할 때까지 -80 ° C의 보관 버퍼에 추가 섹션을 보관하십시오. 나머지 부분을 3x TBS로 5분 동안 1번 세척합니다. 저속에서 RT 흔들림으로 30분 동안 섹션을 차단합니다. 1차 항체 용액을 준비하고 4°C(12-14시간)의 미세 원심분리 튜브에서 밤새 절편을 배양합니다. 다음 날, 1x TBS 3x로 섹션을 세척하고, 처음 두 번 30 초 동안 세척하고, 세 번째 세척은 10 분 동안 세척합니다. RT에서 2시간 동안 미세 원심분리 튜브의 2차 항체 용액에서 절편을 배양하고 이 단계에서 가능하면 빛으로부터 절편을 보호해야 합니다. 그런 다음 1x TBS로 3 번 세척하고, 처음 두 번 30 초 동안 세척하고, 세 번째 세척은 15 분 동안 세척합니다. 원하는 경우 그리고 장착 매체에 없는 경우 마지막 세척에 DAPI를 추가합니다. 섹션을 챔버 상자에 붓고 3/4이 1x TBS로 가득 차 있고 붓을 사용하여 섹션을 슬라이드에 부착합니다. 선택한 장착 매체로 커버슬립하기 전에 슬라이드를 건조(~10-15분)시키십시오. 적절한 현미경을 사용한 이미지 섹션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자유 부동 뇌 절편을 사용한 형광 면역조직화학. 성인 마우스에서 GFAP 발현을 조사한 해마 뇌 영역을 나타내고 토끼에서 키운 항-GFAP 1차 항체와 당나귀에서 키운 항-토끼 Alexa568 2차 항체를 사용하여 표지했습니다. DAPI는 핵을 표지하기 위해 마지막 세척에 사용되었습니다. 조직은 저온 유지 장치를 사용하여 40 μm에서 절편되었다. 이미지는 레이저 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 10x(위쪽) 및 40x(아래쪽) 배율로 촬영되었습니다. 10x 이미지 스케일 바 = 400μm. 40x 이미지 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 자유 부동 방법을 사용한 저발현 단백질에 대한 형광 면역조직화학. 해마 뇌 영역은 GFP 형질전환 저발현 성인 마우스에서 나타낸다. GFP를 발현하는 뉴런은 염소에서 자란 항 GFP 1차 항체와 당나귀에서 키운 항염소 Alexa488 2차 항체를 사용하여 표지되었습니다. DAPI는 핵을 표지하기 위해 마지막 세척에 사용되었습니다. 조직은 저온 유지 장치를 사용하여 40 μm에서 절편되었다. 이미지는 레이저 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 40배 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자유 부동 뇌 절편을 사용한 Cresyl 보라색 염색. 저온 유지 장치를 사용하여 성인 마우스 후각 구근에서 소뇌까지 40μm 섹션을 수집, 세척, 슬라이드에 장착하고 크레실 바이올렛으로 염색하고 커버슬립했습니다. 이미지는 도립 광시야 현미경을 사용하여 10배 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 자유 부유 간 절편을 사용한 형광 면역조직화학. 낮은 수준의 GFP를 발현하는 형질전환 성인 마우스의 저온 유지 장치를 사용하여 40μm에서 채취한 간 절편이 표시됩니다. 염소에서 키운 항 GFP 1차 항체와 당나귀에서 키운 항염소 Alexa488 2차 항체를 사용하여 GFP를 발현하는 세포를 표지했습니다. DAPI는 핵을 표지하기 위해 마지막 세척에 첨가되었다. 이미지는 40x 배율에서 레이저 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 수집되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
면역조직화학(IHC)은 조직 절편 내에서 단백질 발현 및 국소화를 식별하는 데 중요한 역할을 하는 다목적 기술입니다. 이 분석은 질병 상태에 대한 정상 기능 단계에 걸쳐 조직의 특성을 더 깊이 이해하기 위해 과학계 전체에서 사용됩니다. IHC는 암과 같은 질병의 임상 진단에서 전임상 연구10,36의 초기 발견에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 사용됩니다.
IHC를 수행하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 기술은 슬라이스된 후 섹션이 슬라이드에 즉시 부착되는 슬라이드 장착 방법입니다. 이 기술을 사용하면 연구원이 단백질 공동 국소화 연구에 필요한 매우 얇은 섹션을 처리하고 슬라이드 당 섹션을 염색하는 데 거의 용액을 사용할 수 없다는 장점이 있습니다. 항체는 종종 비싸다. 따라서 이 접근 방식은 처리해야 하는 섹션이 거의 없는 경우 경제적인 옵션이 될 수 있습니다. 이것은 또한 조직의 취급이 최소화되어 조직의 구조적 무결성이 보호되기 때문에 신선 냉동 표본을 사용하는 연구자들이 선택하는 방법입니다. 슬라이드 장착 접근법을 사용하는 것은 임상 병리학의 경우와 같이 몇 개의 섹션만 수집하고 즉시 염색해야 하는 경우에도 적절할 것입니다. 반면에, 염색 중에 조직의 노출된 면에만 접근하는 것과 같은 몇 가지 단점이 있으며, 따라서 불량한 항체 침투 및 효과적인 세척으로 인해 섹션 두께가 제한됩니다. 또 다른 단점은 일단 조직이 절편화되고 슬라이드에 수집되면, IHC는 일반적으로 많은 냉동고 공간을 차지하는 처리되지 않은 슬라이드의 저장과 함께 다소 빨리 완료되어야 한다는 것이다. 더욱이, 더 큰 실험(예를 들어, 염색될 다수의 대표 수준을 갖는 여러 뇌 영역)을 처리할 때, 이 접근법은 실제로 더 많은 시약을 사용할 수 있고, 오히려 시간이 많이 소요되며, 종종 실험당 처리될 슬라이드의 수를 제한할 수 있다.
슬라이드 장착 방법과 관련된 몇 가지 제한 사항은 더 두꺼운 섹션으로 작업 할 때 점점 더 인기있는 대안이 된 자유 부동 염색 기술로 극복 할 수 있습니다. 이 방법은 새로운 접근 방식은 아니지만 경험상 특히 조직 샘플을 대량으로 염색하는 데 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 유연한 접근 방식이므로 대규모 연구를 효율적으로 처리할 수 있습니다. 연구원은 또한 이 방법으로 동시에 여러 개의 대규모 IHC 실험을 효과적으로 실행할 수 있습니다. 또한 샘플은 현탁액으로 염색되므로 용액이 모든 각도에서 섹션을 관통 할 수 있으며, 특히 두꺼운 섹션에 중요하여 종종 더 높은 품질의 얼룩으로 이어집니다 (그림 2, 그림 3 및 그림 5). 자유 부동 섹션은 두께37에서 20-50 μm의 어느 곳에서나 슬라이스 할 수 있으며, 두꺼운 섹션은 연구자가 다른 평야에서 구조 나 세포를 볼 수 있도록 유용합니다. 예를 들어, 뇌 조직에서 두꺼운 부분을 통해 연구자들은 샘플 전체에서 수상 돌기와 축삭의 구조를 볼 수 있습니다. 더 얇은 슬라이스(20μm)를 수집하는 기능은 응용 분야의 스펙트럼을 훨씬 더 넓혀줍니다. 그러나 더 얇은 슬라이스는 다루기 어려울 수 있으며 손상을 최소화하기 위해 더 많은 시간과 노력이 필요한 경우가 많으므로 벌크 염색을 위해 섹션이 40μm보다 얇아서는 안됩니다. 자유 부동 방법의 한 가지 주요 이점은 연구자가 전체 뇌 (또는 다른 조직)를 신속하게 절편화하여 모든 다른 뇌 영역에 대한 대표 슬라이스를 갖는 각 부분 표본으로 작은 튜브에 모든 섹션을 수집하여 연구자가 전체 뇌를 빠르게 염색 할 수 있다는 것입니다. 슬라이스가 포함 된 튜브는 -80 ° C에서 몇 년 동안 동결 방지제에 보관할 수 있습니다33, 분취량은 많은 냉동고 공간을 차지하지 않으므로 연구원이 효과적으로 "조직 라이브러리"를 생성 할 수 있습니다. 이 방법은 또한 슬라이드, 커버 슬립, 특히 항체를 포함하여 낭비되는 재료의 양을 줄여 재사용을 위해 쉽게 회수하고 보존 할 수있을뿐만 아니라 사용자가 선택한 기간 동안 섹션을 저장하고 저장할 수 있기 때문에 귀중한 동물 조직을 줄입니다.
자유 유동 접근 방식과 여기에 제시된 프로토콜은 연구자에게 프로토콜을 쉽게 수정하거나 리소스를 용도 변경할 수 있는 옵션도 제공합니다. 예를 들어, 수집된 절편은 발색 IHC, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), 크레실 바이올렛(그림 4) 및 RNAscope38과 같은 간단한 프로토콜 수정을 통해 면역형광법 외에도 다양한 조직화학적 염색에 사용할 수 있습니다. 발색 IHC는 가용성 기질이 2차 항체에 접합된 효소에 의해 불용성 발색 생성물로 전환될 때 항원 발현의 시각화를 허용합니다. 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 효소는 3,3' 디아미노벤지딘(DAB)을 짙은 갈색 최종 생성물로 전환시키는 양 고추냉이 과산화효소(HRP)와 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC) 기질을 적색 생성물(39)로 전환시키는 알칼리성 포스파타제(AP)입니다. 우리는 일상적으로 크레실 바이올렛 염색을 수행하고 전체 뇌 조직과 형태를 검사하기 위해 자유 부동 섹션을 사용합니다40. 우리는 또한 이 프로토콜을 뇌, 간, 심장, 신장 및 비장을 포함한 다양한 조직에 성공적으로 적용했습니다(그림 5). 다른 연구자들은 간, 신장 및 난소22,23,24를 포함한 말초 조직에이 기술을 성공적으로 사용했습니다.
자유 부동 기술을 사용할 때 주요 관심사는 조직 절편, 특히 뇌 절편에 구조적 손상이 발생할 가능성이 있다는 것인데, 이는 프로토콜 전반에 걸쳐 샘플이 고르게 세척, 차단 및 염색되도록 거의 모든 단계에서 셰이커와 회전근에 있기 때문입니다. 때때로, 특정 뇌 영역은 특히 소뇌 수준에서 분리 될 수 있습니다. 그러나 장착 과정에서 뇌 지도책과 보석상의 램프와 같은 확대 형태를 사용하면 섹션을 연결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 문제는 일반적으로 샘플을 부드럽게 취급하고 회전 기계를 정확하고 낮은 설정으로 유지함으로써 예방할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 다양한 조직의 조직 구조뿐만 아니라 단백질 발현 및 국소화를 시각화하는 데 정기적으로 사용하는 필수 불가결하고 신뢰할 수 있으며 유연하고 효율적인 양식으로 입증된 확립된 자유 부동 IHC 기술을 제시합니다. 여기에 있는 프로토콜은 개별 연구 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있어 과학계에 가치가 있습니다.
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Disclosures
공개할 내용 없음
Acknowledgments
우리는 국립 노화 연구소 (K99 / R00 AG055683에서 JMR), George and Anne Ryan 신경 과학 연구소 (EP, GC, JMR), 로드 아일랜드 대학의 약학 대학 (EP, GC, JMR) 및 Konung Gustaf V : s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR)를 인정하고 싶습니다. 하버드 의과 대학 유전학과의 Susan Dymecki 교수와 함께 훈련 한 박사 과정 학생 Rebecca Senft에게 자유 부동 방법을 소개 해 주셔서 감사합니다. 그림 1에 사용된 일부 이미지는 마우스 및 마이크로 원심분리기 튜브(Pixabay), 마우스 뇌(Jonas Töle, 위키미디어 공용), 저온 유지 장치 및 마우스 뇌 섹션(DataBase Center for Life Science, 위키미디어 커먼즈), 유리 용기(OpenClipart, FreeSvg.org) 및 현미경(Theresa Knott, Open Clip Art Library)과 같은 "상업적으로도 자유롭게 사용, 공유 또는 수정할 수 있는" 출처에서 얻은 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
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