Summary
Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.
Abstract
İmmünohistokimya, spesifik doku yapılarının yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Boyama prosedürü sırasında doku kesitlerini işlemek için iki alternatif yaklaşım yaygın olarak kullanılmaktadır, bir yaklaşım bölümleri doğrudan cam slaytlara monte etmekten oluşurken, ikinci bir yaklaşım olan serbest yüzen, çözelti içinde askıya alınırken sabit bölümlerin korunmasına ve boyanmasına izin verir. Slayta monte edilmiş ve serbest yüzen yaklaşımlar benzer sonuçlar verebilse de, serbest yüzen teknik daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir ve bu nedenle dokuların 3D rekonstrüksiyonu için daha kalın bölümler kullanılacaksa, örneğin deneyin odak noktası beyin bölgelerindeki dendritik ve aksonal projeksiyonlar hakkında bilgi edinmek olduğunda tercih edilen yöntem olmalıdır. Ek olarak, bölümler çözelti içinde tutulduğundan, tek bir aliquot, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalarda, kullanımı daha az zahmetli olan 30 ila 40 bölümü kolayca barındırabilir. Burada, serbest yüzen yöntemin floresan immünohistokimya boyamasına nasıl uygulanacağını ve beyin bölümlerine odaklanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, serbest yüzen tekniğin, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl kolayca değiştirilebileceğini ve doku örnekleri tipik olarak paraformaldehit veya formalin ile düzgün bir şekilde sabitlendiği sürece, hematoksilin ve eozin ve cresyl violet gibi diğer histokimyasal bazlı boyamaların yanı sıra diğer dokulara nasıl uyarlanabileceğini de tartışacağız.
Introduction
İmmünoboyama, 130 yıl önce 1890 yılında Von Behring1 tarafından serum antikorlarının keşfi ile başlayan popüler bir araştırma uygulamasıdır. 20. yüzyılın başlarında, boyalar reaksiyonları ölçmenin ve görselleştirmenin bir yolu olarak antijenlere ve daha sonra antikorlara bağlandı1 ve 1941'de Albert Coons, ışık mikroskobu 2,3'te devrim yaratan bir keşif olan ilk floresan antikor etiketlerini geliştirdi. "İmmünoboyama" terimi, Western blot, flow cytometry, ELISA, immünositokimya ve immünohistokimya 3,4 dahil olmak üzere bu prensip kullanılarak geliştirilen birçok tekniği kapsar. Western blot, doku veya hücre ekstraktlarından spesifik proteinlerin varlığını tespit eder5. Proteinler jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır, bir zara aktarılır ve antikorlar kullanılarak incelenir. Bu teknik, proteinin varlığını ve ne kadar protein bulunduğunu gösterir; Bununla birlikte, proteinin hücreler veya dokular içindeki lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi ortaya koymaz. Başka bir yöntem olan immünositokimya (ICC), hücrelerdeki proteinleri, tipik olarak in vitro olarak yetiştirilen hücreleri etiketler. ICC, hücresel bölmelerde hem protein ekspresyonunu hem de lokalizasyonu gösterir6. Doku düzeyinde spesifik bir proteini tespit etmek ve görselleştirmek için immünohistokimya (IHC) kullanılır.
IHC, araştırmacıların bağışıklık sisteminin kimyasal özelliklerinden yararlanarak doku içindeki spesifik antijenleri hedeflemek için kullandıkları bir yöntemdir 7,8. Bir enzime veya floresan boyaya bağlı spesifik birincil ve ikincil antikorlar üretilerek, ilgilenilen antijenler çoğu dokuda etiketlenebilir ve ortaya çıkarılabilir (Mepham ve Britten'de gözden geçirildiği gibi)9. "İmmünohistokimya" terimi tek başına, ilgilenilen antijeni ortaya çıkarmak için kullanılan etiketleme yöntemini belirtmez; Bu nedenle, bu terminoloji genellikle etiketleme yöntemini açıkça tanımlamak için tespit tekniği ile birleştirilir: ikincil antikorun peroksidaz gibi bir enzime ne zaman konjuge olduğunu belirtmek için kromojenik immünohistokimya (CIH); veya ikincil antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) veya tetrametilrodamin (TRITC) gibi bir florofora konjuge olduğunu belirtmek için floresan IHC. IHC'nin seçiciliği, klinisyenlerin ve araştırmacıların dokular boyunca, çeşitli sağlık ve hastalık durumlarında protein ekspresyonunu ve dağılımını görselleştirmelerini sağlar10. Klinik alanda, IHC yaygın olarak kanseri teşhis etmek ve çeşitli kanser türlerindeki farklılıkları belirlemek için kullanılır. IHC ayrıca Hepatit B veya C11 gibi vücuttaki farklı mikrobiyal enfeksiyon türlerini doğrulamak için de kullanılmıştır. Biyomedikal araştırmalarda, IHC genellikle dokulardaki protein ekspresyonunu haritalamak için kullanılır ve hastalık durumlarında görülen anormal proteinleri tanımlamada önemlidir. Örneğin, nörodejenerasyona genellikle Alzheimer hastalığında Αβ plakları ve nörofibriler yumaklar gibi beyinde anormal proteinlerin birikmesi eşlik eder. Hayvan modelleri genellikle bu patolojik durumları taklit etmek için geliştirilir ve IHC, araştırmacıların ilgilendikleri proteinleri bulmak ve ölçmek için kullandıkları bir yöntemdir10,12,13. Buna karşılık, bu hastalıkların nedenleri ve onlarla ortaya çıkan komplikasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
IHC'nin gerçekleştirilmesinde birçok adım vardır. İlk olarak, ilgilenilen doku toplanır ve boyama için hazırlanır. Muhtemelen çoğu araştırmacı sabit doku örnekleri hazırlar, fiksatifin dolaşım sistemi yoluyla perfüzyonu, morfolojiyi koruduğu için optimal 14,15'tir. Doku örneklerinin fiksasyonu sonrası da kullanılabilir, ancak ideal sonuçlardan daha az sonuç verebilir16. Formaldehit gibi çapraz bağlanan fiksatörler, dokudaki proteinler arasında kimyasal bağlar oluşturarak hareket eder17. Sabit doku daha sonra bir mikrotom kullanılarak çok ince tabakalara veya bölümlere dilimlenir, birçok araştırmacı bir kriyostat kullanarak dondurulmuş bölümleri toplamayı tercih eder. Buradan doku toplanır ve ya doğrudan bir mikroskop slaydına (slayta monte edilmiş yöntem) monte edilir ya da fosfat tamponlu salin (PBS) 18 gibi bir çözelti içinde askıya alınır (serbest yüzen yöntem). Kullanılan toplama yöntemi, araştırmacının ihtiyaçlarına göre önceden belirlenir ve bu iki yöntemin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar.
Kızağa monte edilen yöntem açık ara en yaygın kullanılanıdır, önemli bir yararı çok ince kesitlerin (10-14 μm) hazırlanabilmesidir, bu da örneğin protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemlidir. Ayrıca, numunenin minimum düzeyde işlenmesi vardır, bu da dokunun yapısal bütünlüğüne potansiyel hasarı azaltır19. Araştırmacılar genellikle bu tekniği sabit dokuya kıyasla çok hassas olan taze dondurulmuş doku (kuru buz, isopentan vb. kullanılarak hemen dondurulan doku) ile kullanırlar ve numunenin çözülmesini önlemek için çok özen gösterilmesi gerekir. Kızağa monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bir diğer avantajı, boyama için büyük hacimli çözeltilerin genellikle gerekli olmamasıdır4. Böylece, araştırmacılar lekeyi tamamlamak için daha az miktarda pahalı antikor veya diğer kimyasalları kullanabilirler. Ek olarak, birkaç farklı deney grubundan bölümleri aynı slayta monte etmek mümkündür, bu da özellikle görüntü yakalama sırasında avantajlı olabilir. Öte yandan, slayda monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır, özellikle doku bölümünün slayda yapıştırılması, böylece bölümün bir tarafına antikor penetrasyonunu kısıtlaması, bu da kesit kalınlığını ve dokunun 3D gösterimini sınırlar. Ayrıca, yıkama sırasında, dokunun kenarlarının ve tüm bölümlerin slayttan ayrılabileceği ve tüm deneyi işe yaramaz hale getirebileceği de olabilir. Dahası, tipik olarak -20 veya -80 ° C'de saklanan, genellikle örtülmüş ve yatay olarak veya slayt kutularında saklanan işlenmemiş slaytlarla antijen epitop 20,21'in bozulmasını önlemek için slayta monte edilmiş yaklaşım kullanıldığında IHC genellikle nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, bu da nispeten büyük bir depolama ayak izi ile sonuçlanır. Son olarak, slayta monte tekniği, araştırmacıların çok sayıda doku bölümünü işlemek için çok sayıda slaytı ele almaları gerekiyorsa da zaman alıcı olabilir.
Slayta monte edilmiş yöntemi kullanan bu zorlukların bazıları nedeniyle, serbest yüzen yöntem adı verilen bir değişiklik popüler bir alternatif haline gelmiştir. Bu teknik 1960-70'lerde literatüre girdi 22,23,24, 1980'lerde popülerlik kazandı 25,26,27,28,29 ve şimdi 12,30,31 numaralı slayta yapışmak yerine süspansiyonda toplanan bölümlerdeki lekeyi gerçekleştirmeyi içeren köklü bir yöntemdir. . Doku kesitleri 20 μm'den az olduğunda serbest yüzen yöntem önerilmez; Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, daha kalın (40-50 μm) kesitlerin boyanması gerektiğinde tercih edilen yaklaşımdır. Belirgin bir yararı, antikorların serbest yüzen bölümlere tüm açılardan nüfuz edebilmesi ve daha etkili yıkama nedeniyle daha az arka plan lekelenmesi üretebilmesidir, bu da görüntüleme sırasında daha iyi sinyal vermeyle sonuçlanır. Ek olarak, bölümler işlemden sonra slaytlara monte edilir, böylece doku dekolmanı olasılığını ortadan kaldırır ve kriyostatı işgal eden süreyi azaltır. Serbest yüzen yöntem, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalar için çok daha az emek yoğun olabilir. Örneğin, aynı numuneden birçok (18-40) bölümün aynı kuyuda bir araya getirilmesi mümkündür, bu da hem yıkama hem de antikor inkübasyon adımlarının gerçekleştirilmesinde zaman kazandırır. Ayrıca, bu yaklaşım kullanılarak slayt başına daha fazla sayıda (12-16) bölüm monte edilebildiğinden, araştırmacının bölümleri görüntülemesi ve görüntülemesi genellikle daha uygun ve daha hızlıdır. Özellikle, doku dilimlerinin slaytlara montajı sırasında, istenen yön elde edilene kadar bölümler takılabilir ve ayrılabilir. Araştırmacılar ayrıca serbest yüzen yöntemi kullanarak genellikle biraz daha düşük antikor konsantrasyonları kullanırlar ve inkübasyonlar mikrosantrifüj tüplerinde gerçekleştirildiğinden, antikorlar yeniden kullanım için sodyum azid ile kolayca toplanabilir ve korunabilir (bakınız Adım 5.1). Diğer bir avantaj, kesitlerin kriyoprotektan çözeltisi32 ile küçük mikrosantrifüj tüplerinde -80 ° C'de doğrudan saklanabilmesidir, böylece depolama alanını en aza indirir ve numunelerin ömrünü en üst düzeye çıkarır33. Bu tekniği kullanmanın bir dezavantajı, bölümlerin çok fazla ele alınması ve bu nedenle hasara yatkın olmasıdır. Bununla birlikte, bu, düşük sallanma ve dönme hızları kullanılarak ve ayrıca araştırmacıları numunelerin nasıl aktarılacağı ve bölümlerin slaytlara nasıl monte edileceği konusunda uygun şekilde eğiterek hafifletilebilir.
Birlikte ele alındığında, IHC hem klinik hem de biyomedikal araştırma alanlarında protein ekspresyonunu görselleştirmek ve lokalize etmek için yerleşik, gerekli bir araçtır. Serbest yüzen IHC, özellikle büyük ölçekli histolojik çalışmalar gerçekleştirirken verimli, esnek ve ekonomik bir yöntemdir. Burada, bilimsel topluluk için kromojenik IHC ve hematoksilin ve eozin veya cresyl violet boyama gibi diğer boyamalar için uygun şekilde uyarlanabilen güvenilir bir serbest yüzen floresan IHC protokolü sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kriyoseksiyon için doku hazırlığı
- Uygun bir numune matrisi kullanarak bir numune bloğu oluşturmak için sabit dokuları uygun bir gömme kalıbına gömün (bkz. Malzeme Tablosu) ve kuru buz üzerinde dondurun. Numune bloklarını kesitlenmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Sabit dokular tipik olarak, yetişkin (yaklaşık 2,5 – 30 aylık) erkek veya dişi kemirgenlerin (fare veya sıçan)34, mevcut etik izne uygun olarak, uygun bir fiksatif (örneğin% 10 formalin) ile perfüze edilmesiyle, ardından 4 ° C'de 12 saat boyunca aynı fiksatif içinde sabitleme sonrası dokular, 1x PBS ile üç kez yıkanarak hazırlanır. ve dokuları% 15 ve% 30 oranında sakkaroz, gece boyunca veya dokular batana kadar 1x PBS'desakkaroz 35. Araştırmacılar bu genel protokolü farklı gelişim aşamalarına uyarlamaya çalışabilirler.
2. Kriyoseksiyon
- Kesitlemeye hazır olduğunda, dokunun parçalanmasını önlemek için kesitlemeden önce kriyostattaki numuneleri en az 1-2 saat iklimlendirin.
- Bir kriyostat kullanarak, dokuyu bölümlere ayırın (20-50 μm) ve 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş 6 veya 12 delikli eklerde toplayın (bkz.
NOT: Kesit kalınlığına, ne kadar doku toplanacağına ve kullanılan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak, her kuyu kuyu için yaklaşık 10 ila 40 dilim arasında değişen sayıda kesit içerecektir. Örneğin, tüm beyin 40 μm'de kesitlenirse, 12 delikli ekler kullanılarak her bir kuyuda yaklaşık 18-24 bölüm toplanacaktır. Ayrıca, 20 μm kesitlerin kullanımı biraz zor olabilir, bu nedenle toplu boyama için 40 μm önerilir (bkz.
3. Bölümlerin depolanması
- Toplandıktan sonra, bölümleri taze hazırlanmış 1x PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
- Bölümleri 1-1.5 mL depolama çözeltisi ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın (250 mL için, 70 g sakaroz, 75 mL etilen glikol karıştırın ve 0.1 M fosfat tamponu ile hacme getirin).
- Boyama için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
4. Boyama Günü I
- Numuneleri dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika boyunca dengeleyin.
- Depolama solüsyonunu bölümlerden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu ucuna dökün.
- Kuyu ucunu yaklaşık 6 mL 1x TBS içeren başka bir kuyuya taşıyın. RT'de düşük hız kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 1x TBS ile 3 kez yıkayın.
- Bölümler yıkanırken,% 0.3 Triton X-100 ve% 3 normal serum (örneğin, normal at serumu) ile 1x TBS'den oluşan bir bloke geçirgenlik çözeltisinden 7 mL (numune başına) hazırlayın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca bölümleri engelleyin.
NOT: Sera ile blokaj, antikorların dokuya veya spesifik olmayan Fc-reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını önler – ikincil antikor türleriyle eşleşen bir serum önerilir, ancak mevcut değilse, birincil antikor konakçı hayvandan farklı bir türden herhangi bir normal serum kullanılabilir. Deterjan Triton X-100, dokuyu geçirgenleştirerek daha iyi antikor penetrasyonu sağlar. - % 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum ile 1x TBS'de seçilmiş birincil antikordan (uygun şekilde seyreltilmiş) oluşan primer antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın (bakınız Adım 4.4 Not). Kuyu girişinden kesitleri, ilgilenilen antijen (ler) e bağlanmak için birincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
NOT: Birden fazla primer antikor kullanılabilir (farklı konakçı türlerde üretilir). - Düşük hız (örneğin, 7 rpm hız) kullanan döner bir karıştırıcı üzerine kesitli 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
5. Boyama Günü II
- Ertesi gün, bölümleri birincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.
NOT: Antikor çözeltisi toplanabilir ve tekrar kullanılabilir; mikrobiyal büyümeyi inhibe etmek için% 0.02 (w / v) sodyum azid ekleyin. - RT'de 1x TBS ile bölümleri 3 kez yıkayın (ilk 2 yıkama için 30 s ve son yıkama için 10 dakika).
- % 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum (ışıktan kalkan çözeltisi) ile 1x TBS'de uygun sekonder antikordan (buna göre seyreltilmiş) oluşan ikincil antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın.
NOT: Konjuge sekonder antikor ile dolaylı etiketleme, sinyali yükseltir ve protein hedefinin kolorimetrik veya floresan görselleştirmesine izin verir. - Kesitleri ikincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan kalkan çözeltisi).
- Bölümleri ikincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.
- Numuneleri ışıktan korumaya devam ederek, RT'de 30 s için 1x TBS ile 2 kez yıkayın. Daha sonra 1x TBS'de 15 dakika yıkayın, isterseniz DAPI (1-0.1 μg / ml) ekleyin.
6. Montaj
- Bölümleri bir bardağa dökün, dikdörtgen histolojik oda dörtte üçünü 1x TBS ile doldurun.
- Bir cam slaytı 1x TBS'ye batırın ve bölümleri slayda doğru koaksiyel hale getirmek için ince bir boya fırçası kullanın.
- Bölümlere slaytın üzerine hafifçe dokunarak kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olun.
- Tüm bölümler slayt(lar)a monte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Örneğin, tüm bir beyin 40 μm'de kesitlendiğinde, 18-24 bölüm içeren bir aliquot ile 12 kuyucuklu eklerde toplandığında; dilimler tipik olarak 1-2 slayta monte edilir, ancak araştırmacının tercihine bağlı olarak slayt başına daha az bölüm de monte edilebilir.
7. Kapak kaydırma
- Kesitler slayt(lar)ın üzerine kurutulduktan sonra, RT'de yaklaşık 10-15 dakika veya kesitler opak görünene kadar (slaytları ışıktan korumayı unutmayın), uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın (sertleştirme veya sertleştirmeyen). Antifading, floresan konjuge sekonder antikor kullanılıyorsa tercih edilir.
NOT: Sertleştirme montaj ortamı kullanılırken floresan kalitesi daha düşük olabilir, ancak kızaklar daha uzun süre dayanmalıdır. - Cımbız kullanarak, ortamın üstüne bir kapak parçası yerleştirin. Kapağı filtre kağıdıyla örtün ve fazla montaj ortamını çıkarmak için sıkıca bastırın.
NOT: Sertleşmeyen bir montaj parçası kullanıyorsanız, kapağın kaydırılmış sürgüsünün kenarlarını sızdırmaz hale getirmek için şeffaf oje ile boyayın. - Uygun bir mikroskop kullanarak görüntü bölümleri. 4 °C'de karanlık bir slayt kutusunda saklayın.
NOT: Bölümler, lazer tarama konfokal ve ters veya dik geniş alan floresansı gibi çeşitli mikroskoplar kullanılarak, araştırmacının ihtiyaçlarına göre büyütmelerde (örneğin, 10x, 20x, 40x) görüntülenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir floresan immünohistokimyasal tahlil gerçekleştirmek için serbest yüzen yöntemin kullanılmasının genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ekspresyonunu inceleyen fare beyninde serbest yüzen yöntemi kullanan floresan IHC'nin temsili örneği, boyamanın genel kalitesini göstermek için Şekil 2'de hem daha düşük hem de daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Bu yaklaşım, Şekil 3'te gösterilen GFP düşük ekspresyonlu transgenik fare beyninden bir örnekle, düşük eksprese eden proteinleri ortaya çıkarmak için de uygundur. Serbest yüzen yöntem, Şekil 4'te gösterildiği gibi cresyl violet gibi diğer histokimyasal boyama protokollerinde, protokolün 1 ila 4.3 arasındaki Adımlarını izleyerek ve ardından bölümleri Adım 6'da belirtildiği gibi monte ederek de kullanılabilir. Bundan sonra, bölümler slayta monte edilmiş bölümler gerektiren herhangi bir boyama kullanılarak işlenebilir. Bu protokolü kromojenik IHC için kullanırken, bir amplifikasyon adımı (örneğin, avidin-biyotin kompleksi) kullanıyorsanız, protokolü Adım 1'den 5.6'ya kadar izleyin (son yıkamaya DAPI eklemeyin). Tamponu kromajen/substrat reaktifi ile değiştirin, doku istenen renge dönene kadar 5-20 dakika inkübe edin. Reaksiyon, düşük güçlü bir mikroskopla dokuyu periyodik olarak kontrol ederek izlenebilir. Kuyu ekini kesitlerle birlikte taze tampona hareket ettirerek, her biri en az 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayarak reaksiyonu sonlandırın. Bölümleri cam slaytlara monte etmek için Adım 6 ile devam edin, böylece bölümlerin en az 3-4 saat boyunca bir slayt ısıtıcısında kurumasını sağlayın. Slaytları artan etanol konsantrasyonlarıyla (yani,% 70,% 90,% 95,% 99,5,2-5 dakika) ardından ksilen (5-10 dakika) ile dehidre edin ve ardından sert monte edilmiş bir ortamla (örneğin, Entellan) örtün, slaytların havalandırılan bir alanda en az 1-2 saat kurumasını sağlayın. Arka plan çok yüksekse, endojen peroksidaz aktivitesini RT'de 15 dakika boyunca 1x TBS'de% 3H2O2 ile söndürün ve ardından bloke etmeden önce her biri 15-20 dakika olmak üzere üç tampon yıkama yapın (Adım 4.4). Birkaç periferik doku da, protokolde herhangi bir değişiklik yapılmadan, Şekil 5'te gösterilen GFP eksprese eden bir fareden karaciğer kesitlerinin bir örneği ile bu tekniği kullanmaya uygundur.
Şekil 1: Serbest yüzen floresan immünohistokimyasal tahlilin akış şeması. İlgilenilen organı (tercihen sabit doku) inceleyin ve bir numune matrisi kullanarak dokuyu gömme kalıplarına gömün (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın. 20-50 μm'de bir kriyostat kullanarak doku kesitleyin ve 1x PBS ile doldurulmuş kuyu uçlarındaki dilimleri toplayın (bkz. Düşük hızda yörüngesel bir çalkalayıcı kullanarak, bölümleri 1x PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın. Bu noktada, ekstra bölümleri ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de depolama tamponunda saklayın. Kalan bölümleri 1x TBS ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın. Düşük hızda RT sallanırken bölümleri 30 dakika boyunca bloke edin. Birincil antikor çözeltisi hazırlayın ve bölümleri gece boyunca 4 ° C'de (12-14 saat) mikrosantrifüj tüplerinde inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri 1x TBS 3x ile yıkayın, ilk iki yıkamayı 30 sn, üçüncüsü 10 dakika yıkayın. İkincil antikor çözeltisindeki bölümleri RT'de 2 saat boyunca mikrosantrifüj tüplerinde inkübe edin ve bu adımdan itibaren mümkün olduğunda bölümleri ışıktan koruduğunuzdan emin olun. Daha sonra 3x'i 1x TBS ile yıkayın, ilk iki yıkamayı 30 sn ve üçüncü yıkamayı 15 dakika boyunca yıkayın. İstenirse ve montaj ortamında mevcut değilse son yıkamaya DAPI ekleyin. Bölümleri, dörtte üçü 1x TBS ile dolu bir hazne kutusuna dökün ve bölümleri slaytlara yapıştırmak için bir boya fırçası kullanın. Tercih edilen montaj ortamıyla örtülmeden önce kızakların kurumasını bekleyin (~10-15 dakika). Uygun bir mikroskop kullanarak görüntü bölümleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Serbest yüzen beyin bölümlerini kullanan floresan immünohistokimya. Yetişkin farede GFAP ekspresyonunu inceleyen hipokampal beyin bölgeleri gösterilmiştir ve tavşanda yetiştirilen bir anti-GFAP primer antikoru ve eşekte yetiştirilen bir anti-tavşan Alexa568 sekonder antikoru kullanılarak etiketlenmiştir. DAPI, çekirdekleri etiketlemek için son yıkamada kullanıldı. Doku bir kriyostat kullanılarak 40 μm'de kesitlendi. Görüntüler, lazer nokta taramalı konfokal mikroskop kullanılarak 10x (üst) ve 40x (alt) büyütmede çekildi. 10x görüntü ölçek çubuğu = 400 μm. 40x görüntü ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Serbest yüzen yöntemi kullanarak düşük eksprese proteinler üzerinde floresan immünohistokimya. Düşük ekspresyonlu GFP transgenik yetişkin fareden hipokampal beyin bölgeleri gösterilmiştir. GFP'yi eksprese eden nöronlar, keçide yetiştirilen bir anti-GFP primer antikoru ve eşek içinde yetiştirilen bir anti-keçi Alexa488 sekonder antikoru kullanılarak etiketlendi. DAPI, çekirdekleri etiketlemek için son yıkamada kullanıldı. Doku bir kriyostat kullanılarak 40 μm'de kesitlendi. Görüntüler, lazer nokta taramalı konfokal mikroskop kullanılarak 40x büyütmede çekildi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Serbest yüzen beyin bölümlerini kullanarak Cresyl violet boyama. Bir kriyostat kullanılarak, yetişkin fare koku ampulünden beyinciğe, 40 μm kesitler toplandı, yıkandı, slaytlara monte edildi, cresyl violet ile boyandı ve örtüldü. Görüntüler, ters çevrilmiş geniş alan mikroskobu kullanılarak 10x büyütmede çekildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Serbest yüzen karaciğer kesitlerini kullanan floresan immünohistokimya. Düşük GFP seviyelerini ifade eden transgenik bir yetişkin fareden bir kriyostat kullanılarak 40 μm'de alınan karaciğer bölümleri gösterilmiştir. GFP'yi eksprese eden hücreleri etiketlemek için keçide yetiştirilen bir anti-GFP primer antikoru ile eşek içinde yetiştirilen bir anti-keçi Alexa488 sekonder antikoru kullanıldı. DAPI, çekirdekleri etiketlemek için son yıkamaya eklendi. Görüntüler, 40x büyütmede lazer nokta taramalı konfokal mikroskop kullanılarak toplandı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İmmünohistokimya (IHC), doku kesitlerinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tanımlamada çok önemli hale gelen çok yönlü bir tekniktir. Bu tahlil, normal fonksiyon aşamalarından hastalık durumlarına kadar dokunun özelliklerini daha iyi anlamak için bilimsel topluluk genelinde kullanılır. IHC, kanser gibi hastalıkların klinik teşhisinden klinik öncesi araştırmalardaki ilk keşiflere kadar çeşitli alanlarda kullanılmaktadır10,36.
IHC'yi gerçekleştirmek için en yaygın kullanılan teknik, bölümlerin dilimlendikten hemen sonra slayda yapıştırıldığı slayda monte edilen yöntemdir. Bu tekniği kullanmanın bazı avantajları, araştırmacıların protein kolokalizasyon çalışmaları için gereken çok ince kesitleri işleyebilmeleri ve slayt başına kesitleri boyamak için çok az çözelti kullanabilmeleridir. Antikorlar genellikle pahalıdır; bu nedenle, birkaç bölüm işlenecekse bu yaklaşım ekonomik bir seçenek olabilir. Bu aynı zamanda taze dondurulmuş örnekleri kullanan araştırmacılar için tercih edilen yöntemdir, çünkü dokunun kullanımı minimumdur, böylece dokunun yapısal bütünlüğü korunacaktır. Slayta monte edilmiş yaklaşımın kullanılması, klinik patolojide olduğu gibi, sadece birkaç bölümün toplanması ve hemen boyanması durumunda da uygun olacaktır. Öte yandan, boyama sırasında dokunun sadece maruz kalan tarafına erişilmesi gibi bazı dezavantajlar vardır, bu nedenle zayıf antikor penetrasyonu ve etkili yıkama nedeniyle kesit kalınlığını sınırlar. Diğer bir dezavantaj, doku kesitlendikten ve slaytlara toplandıktan sonra, IHC'nin normalde işlenmemiş slaytların depolanması ile çok fazla dondurucu alanı kaplayarak oldukça hızlı bir şekilde tamamlanması gerektiğidir. Ayrıca, daha büyük deneyleri işlerken (örneğin, boyanacak çoklu, temsili seviyelere sahip birkaç beyin bölgesi), bu yaklaşım aslında daha fazla reaktif kullanabilir, oldukça zaman alıcı olabilir ve genellikle deney başına işlenecek slayt sayısını sınırlayabilir.
Kızağa monte edilen yöntemle ilişkili bazı sınırlamalar, daha kalın kesitlerle çalışırken giderek daha popüler bir alternatif haline gelen serbest yüzen boyama tekniği ile aşılabilir. Bu yöntem yeni bir yaklaşım olmasa da, deneyimlerimize göre, özellikle doku örneklerinin toplu olarak boyanması için güvenilir, tekrarlanabilir ve esnek bir yaklaşım olmuştur, böylece daha büyük ölçekli çalışmaların verimli bir şekilde işlenmesine izin vermiştir. Araştırmacılar ayrıca bu yöntemle aynı anda birden fazla, büyük IHC deneylerini etkili bir şekilde yürütebilirler. Dahası, numuneler süspansiyonda boyanır, böylece çözeltiler kesitlere her açıdan nüfuz edebilir, özellikle daha kalın bölümler için önemlidir, bu da genellikle daha yüksek kaliteli bir lekeye yol açar (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 5). Serbest yüzen bölümler,37 kalınlığında 20-50 μm arasında herhangi bir yerde dilimlenebilir, daha kalın bölümler araştırmacıların farklı görüş alanlarındaki yapıları veya hücreleri görmeleri için yararlıdır. Örneğin, beyin dokusunda, daha kalın bölümler, araştırmacıların örnekleri boyunca dendritlerin ve aksonların yapısını görmelerini sağlar. Daha ince dilimleri (20 μm) toplama yeteneği, uygulama yelpazesini daha da genişletir; Bununla birlikte, daha ince dilimlerin işlenmesi zor olabilir ve genellikle hasarı en aza indirmek için daha fazla zaman ve çaba gerektirir, bu nedenle bölümler dökme boyama için 40 μm'den daha ince olmamalıdır. Serbest yüzen yöntemin en önemli yararlarından biri, araştırmacıların tüm beyinleri (veya diğer dokuları) hızlı bir şekilde kesebilmeleri, tüm bölümleri küçük tüplerde toplayabilmeleri, her bir alikotun tüm farklı beyin bölgeleri için temsili bir dilime sahip olmaları ve böylece araştırmacıların tüm beyni hızlı bir şekilde boyamalarına izin vermeleridir. Dilimler içeren tüpler, birkaç yıl boyunca -80 ° C'de kriyoprotektanda saklanabilir33, alikotlar fazla dondurucu alanı kaplamaz ve araştırmacıların etkili bir şekilde bir "doku kütüphanesi" oluşturmasına izin verir. Bu yöntem aynı zamanda slaytlar, kapak kaymaları ve özellikle yeniden kullanım için kolayca geri kazanılabilen ve korunabilen antikorlar da dahil olmak üzere atık malzemelerin miktarını ve ayrıca bölümler kullanıcıların seçtiği sürece saklanıp saklanabildiğinden değerli hayvan dokularını azaltır.
Serbest yüzen yaklaşım ve burada sunulan protokol, araştırmacılara protokolü kolayca değiştirme veya kaynakları yeniden kullanma seçeneği de sunar. Örneğin, toplanan kesitler, kromojenik IHC, hematoksilin ve eozin (H & E), cresyl violet (Şekil 4) ve RNAscope38 gibi basit protokol modifikasyonları ile immünofloresansa ek olarak birçok farklı histokimyasal leke için kullanılabilir. Kromojenik IHC, çözünür bir substrat, çözünmeyen bir kromojenik ürüne ikincil bir antikora konjuge edilmiş bir enzim tarafından dönüştürüldüğünde antijen ekspresyonunun görselleştirilmesine izin verir. En yaygın olarak kullanılan iki enzim, 3,3' diaminobenzidine (DAB) koyu kahverengi bir son ürüne dönüştüren yaban turpu peroksidaz (HRP) ve 3-amino-9-etilkarbazol (AEC) substratını kırmızı bir ürüne dönüştüren alkali fosfatazdır39. Rutin olarak cresyl violet boyama yapıyoruz ve brüt beyin organizasyonunu ve morfolojisini incelemek için serbest yüzen bölümler kullanıyoruz40. Bu protokolü beyin, karaciğer, kalp, böbrek ve dalak dahil olmak üzere birçok farklı dokuya da başarıyla uyguladık (Şekil 5). Diğer araştırmacılar da bu tekniği karaciğer, böbrek ve yumurtalık22,23,24 dahil olmak üzere periferik dokular için başarıyla kullanmışlardır.
Serbest yüzen tekniği kullanırken en büyük endişe, doku bölümlerine, özellikle beyin dilimlerine yapısal hasar verme potansiyelidir, çünkü protokol boyunca, numuneler eşit şekilde yıkanmalarını, bloke edilmelerini ve lekelenmelerini sağlamak için hemen hemen her adımda çalkalayıcılar ve rotatörler üzerindedir. Bazen, belirli beyin bölgeleri, özellikle serebellar seviyelerde ayrılabilir; Bununla birlikte, montaj işlemi sırasında bir beyin atlası ve kuyumcu lambası gibi bir büyütme şekli kullanmak, bölümleri bir araya getirmek için yararlı olabilir. Bu zorluk genellikle numunelerin nazik bir şekilde işlenmesi ve dönen makinelerin doğru, düşük ayarda tutulmasıyla önlenebilir.
Sonuç olarak, protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu ve çeşitli dokulardaki doku yapısını görselleştirmek için düzenli olarak kullandığımız vazgeçilmez, güvenilir, esnek ve verimli bir yöntem olduğu kanıtlanmış yerleşik bir serbest yüzen IHC tekniği sunuyoruz. Buradaki protokol, bilimsel topluluk için değerli kılan bireysel araştırma ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklanacak bir şey yok
Acknowledgments
Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ne (K99/R00 AG055683'ten JMR'ye), George ve Anne Ryan Sinirbilim Enstitüsü'ne (EP, GC, JMR), Rhode Island Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne (EP, GC, JMR) ve Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse'ye (JMR) teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi Genetik Bölümü Profesörü Susan Dymecki ile eğitim alan doktora öğrencisi Rebecca Senft'e, bizi serbest yüzen yöntemle tanıştırdığı için teşekkür ederiz. Şekil 1'de kullanılan bazı görüntüler "kullanımı ücretsiz, paylaşması veya değiştirmesi, hatta ticari olarak bile ücretsiz" kaynaklardan elde edilmiştir: fare ve mikrosantrifüj tüpü (Pixabay), fare beyni (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kriyostat ve fare beyni bölümü (DataBase Yaşam Bilimleri Merkezi, Wikimedia Commons), cam kap (OpenClipart, FreeSvg.org) ve mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
- Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
- Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
- Schacht, V., Kern, J. S.
- Coons, A. H.
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Li, A., Yang, D. H.
- Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
- Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
- Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- van der Loos, C.
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
- Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
- Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
- Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
- Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
- Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
- Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
- Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
- Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
- Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
- Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
- Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
- Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
- Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).
