Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Spårning av enskilda översättningshändelser möjliggör högupplösta kinetiska studier av cap-beroende översättningsmekanismer. Här demonstrerar vi en in vitro-analys med en molekyl baserad på bildinteraktioner mellan fluorescerande märkta antikroppar och epitopmärkta gryende peptider. Denna metod möjliggör karakterisering av initiering och peptidförlängningskinetik under aktiv in vitro-cap-beroende översättning.

Abstract

Cap-beroende proteinsyntes är den dominerande översättningsvägen i eukaryota celler. Medan olika biokemiska och genetiska metoder har tillåtit omfattande studier av cap-beroende översättning och dess reglering, saknas fortfarande högupplöst kinetisk karakterisering av denna översättningsväg. Nyligen utvecklade vi en in vitro-analys för att mäta cap-beroende översättningskinetik med enmolekylupplösning. Analysen är baserad på fluorescerande märkt antikroppsbindning till gryende epitopmärkt polypeptid. Genom att avbilda bindning och dissociation av antikroppar till och från gryende peptid-ribosom-mRNA-komplex kan översättningsprogressionen på enskilda mRNAs spåras. Här presenterar vi ett protokoll för att fastställa denna analys, inklusive mRNA och PEGylated glidpreparat, realtidsavbildning av översättning och analys av enmolekylbanor. Den här analysen möjliggör spårning av enskilda cap-beroende översättningshändelser och löser viktiga översättningskinetik, till exempel initierings- och förlängningshastigheter. Analysen kan tillämpas i stor utsträckning på distinkta översättningssystem och bör i stort sett gynna in vitro-studier av cap-beroende översättningskinetik och translationella kontrollmekanismer.

Introduction

Översättning i eukaryota system sker främst genom 7-metylguanosin (m7G) cap-beroende vägar1. Studier visar att initieringssteget för eukaryota översättningar är räntebegränsande och ett gemensamt mål förförordning 2,3,4. Mekanismer för cap-beroende översättning har studerats utförligt med hjälp avgenetiska 5,biokemiska 6,7, 8,strukturella 9, ochgenomiska 10 bulk metoder. Även om dessa metoder har identifierat olika mekanismer som reglerar cap-beroende initiering, begränsar deras upplösning dem till ensemble genomsnitt av signaler från heterogena och asynkrona inledande händelser. På senare tid har enskilda in vivo-översättningshändelser visualiserats med metoder som mäter fluorescerande antikroppsbindning till epitoper på gryende polypeptider11,12,13,14. Men dessa nya metoder är också begränsade i sin förmåga att lösa enskilda initieringshändelser eftersom flera fluorescerande antikroppar måste binda en gryende peptid för att tillåta enstaka översättningshändelser att lösas från en hög intracellulär fluorescensbakgrund. I många biologiska interaktioner har lösta enskilda kinetiska händelser gett kritiska insikter om att förstå komplexa multisteg och repetitiva biologiska processer som inte är möjliga att synkronisera på molekylär nivå. Nya metoder som kan spåra dynamiken i enskilda översättningshändelser behövs för en bättre förståelse av cap-beroende initiering och reglering.

Vi utvecklade nyligen en in vitro-analys som mäter cap-beroende initieringskinetik med enmolekylsupplösning15. Med tanke på det stora antalet kända och okända proteinfaktorer som är involverade i denna initieringsväg3,16, utvecklades enmolekylsanalysen för att vara kompatibel med befintliga in vitro-cellfria översättningssystem för att dra nytta av deras bevarande av cellulära faktorer och robustöversättningsaktivitet 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dessutom möjliggör användningen av cellfria översättningssystem mer kompatibla jämförelser mellan observationer med en molekyl och tidigare bulkresultat. Detta tillvägagångssätt ger en rak integration av nya kinetiska insikter med en molekyl i den befintliga mekanistiska ramen för cap-beroende initiering. För att fastställa enmolekylsanalysen modifieras det traditionella cellfria översättningssystemet på tre sätt: en epitopkodningssekvens sätts in i början av den öppna läsramen (ORF) hos en reporter mRNA; 3′ änden av reporter mRNA är biotinylerad för att underlätta mRNA end-tthering till enmolekyl detektionsyta; och fluorescerande märkta antikroppar kompletteras med översättningsextraktet. Dessa modifieringar kräver endast grundläggande molekylärbiologiska tekniker och allmänt tillgängliga reagenser. Dessutom bevarar dessa modifieringar och enmolekylsavbildningsförhållandena översättningskinetiken för bulkcellfria översättningsreaktioner15.

I denna analys (figur 1), är 5′-end kapsejsad och 3′-end biotinylerad reporter mRNA immobiliserad till en streptavidinbelagd detektionsyta i en flödeskammare. Flödeskammaren fylls sedan med en cellfri översättningsblandning kompletterad med fluorescerande märkta antikroppar. Efter mRNA översättning har inträffat för cirka 30-40 kodon nedströms epitopsekvensen26,27, epitopen framträder från ribosomutgångstunneln och blir tillgänglig för att interagera med fluorescerande märkt antikropp. Denna interaktion är snabb och dess detektion med enmolekyls fluorescensavbildningstekniker möjliggör spårning av översättningskinetik med enmolekylupplösning under aktiv cellfri översättning. Denna analys bör i stort sett gynna in vitro-studier av cap-beroende översättningskinetik och dess reglering, särskilt för system med en fungerande bulk in vitro-analys.

En förutsättning för att fastställa denna enmolekylsanalys är en fungerande bulkcellfri översättningsanalys, som kan uppnås med hjälp av översättningsextrakt som antingen är kommersiellt tillgängligt eller förberett enligt tidigare beskrivna metoder28. Eukaryotic översättning extrakt kan erhållas från olika celler, inklusive svamp, däggdjur och växt28. För avbildning kräver denna analys ett TIRF-mikroskop utrustat med tunabel laserintensitet och infallsvinkel, ett motoriserat provstadium, ett motoriserat fluidiksystem och provtemperaturregleringsanordning. Sådana krav är generiska för moderna TIRF-experiment in vitro och kan uppnås på olika sätt. Experimentet som presenteras här använder ett TIRF-system av objektiv typ som består av kommersiellt tillgängligt mikroskop, programvara och tillbehör som alla anges i materialförteckningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generation av reporter mRNA

  1. Ändra en DNA-transkriptionsmall som kodar en massanalys "untagged" reporter mRNA genom att infoga en N-terminus epitop taggkodningssekvens för att generera en DNA-transkriptionsmall för en "taggad" reporter mRNA (Figur 2A).
    OBS: 3xFLAG/anti-FLAG interaktion rekommenderas för denna analys på grund av dess överlägsna känslighet och den korta 3xFLAG tagglängden. Analysen är dock kompatibel med andra epitop-/antikroppspar.
  2. Syntetisera otaggade och taggade RNAs med linjäriserade DNA-mallar och ett in vitro-transkriptionskit (se Materialförteckning ). Vanligtvis är 10–20 pmol in vitro transkriberat RNA tillräckligt för efterföljande RNA-bearbetning för att möjliggöra en systematisk enmolekylstudie.
  3. Kapa RNA 5′ änden(figur 2B)med ett m7G kapningssats (se materialförteckning)enligt tillverkarens rekommendation.
  4. Biotinylera RNA 3′ änden(figur 2B)med hjälp av ett biotinyleringskit (se Materialförteckningen)enligt det protokoll som medföljer satsen. Rena RNAs genom fenolkloridextraktion följt av rening med en spinnkolonn. Elute RNA i 10–20 μL RNase-fritt vatten. Ungefär 40–50% av det oappade indata-RNA återvinns.
  5. Utvärdera RNA integritet och koncentration genom att denaturera akrylamid gel elektrofores och RNA färgning, som beskrivits tidigare29.
  6. Utför bulkcellfri översättning30 med den 3′-end-biotinylerade taggade reporter mRNA för att bekräfta att det modifierade mRNA bevarar de översättningsegenskaper som är av intresse. Till exempel kan cap-beroende översättning bekräftas genom att mäta och jämföra reporteraktiviteter i bulkcellfria översättningsreaktioner med oappade och begränsade reporter mRNAs (se representativa resultat).

2. Förberedelse av flödeskammare

  1. Välj en lämplig täckliptjocklek, enligt vad som anges i specifikationsbladet för mikroskopmål. Välj en glas- eller kvartsbild för objektiv- eller prisma-typ totala interna reflektionsfluorescens (TIRF)bildsystem 31,respektive.
  2. Utför rengöring, försaltning, PEGylation och kammarmontering av täckslip och skjut enligt det protokoll som beskrivs av Chandradoss et al.32 med följande ändringar.
    1. Tvätta diabilder som innehåller borrade hål i 10% alkaliskt flytande tvättmedel (v/v) i 20 min med ultraljudsbehandling. Kombinera bilderna och täckena för alla återstående rengöringssteg.
    2. Hoppa över acetontvättsteget. Förläng Piranha etsning inkubationstid från 20 min till 1 h. Inkubera första omgångens PEGylation i 3 timmar. Inkubera pegylation i andra omgången med MS(PEG)4 i 3 timmar.

3. Förberedelse av utrustning

  1. Minst 3 timmar innan du utför ett experiment med en molekyl, slå på mikroskopinkubatorn och minska luftflödet till en låg hastighet för att undvika överdriven akustisk störning av experiment. Ställ in inkubatortemperaturen på optimal temperatur för det cellfria översättningssystemet.
    OBS: Översättningen är extremt temperaturkänslig. Den optimala reaktionstemperaturen är specifik för varje cellextraktsystem. Reaktionstemperatur karakterisering är ett viktigt steg i utvecklingen av ett bulk cellfritt översättningssystem. Denna enmolekylsanalys bör utföras under samma optimala temperatur som motsvarande bulköversättningstillstånd.
  2. Minst 1 timme innan du utför ett experiment med en molekyl slår du på lasern genom att trycka på laserströmbrytaren bakom laserboxen, vrida på lasersäkerhetsknappen och trycka på startknappen. slå på mikroskopet och tryck på pekskärmens kontrollpanel för att välja bildläge, mål och filteruppsättning.
  3. Slå på EMCCD-kameran, styrenheten före scenen och sprutpumpen genom att trycka på strömknapparna. Slå på datorn och öppna programvaran Andor Solis (programvara 1) för att styra EMCCD-kameran, TirfCtrl (programvara 2) för att styra lasern, PriorTest (programvara 3) för att styra det motoriserade stadiet och Coolterm för att styra sprutpumpen. Låt kameran svalna och stabiliseras till den angivna arbetstemperaturen innan datainsamlingen påbörjas.
  4. I programvara 2, bekräfta att rätt parametrar är inställda för laservåglängd, objektiv typ och brytningsindex för glas och prov. Klicka på knappen Anslut. Om du vill ställa in laserintensiteten klickar du på kontrollknappen bredvid laservåglängden och drar sedan intensitetsreglaget i fönstret för laserkontroll. Ställ in lasern i önskad vinkel genom att dra i fiberpositionsreglaget eller mata in motsvarande penetrationsdjup. Kontrollera att rutan Slutare är markerad för att hålla lasern i avstängt läge när den inte avbildas.
    OBS: Öppna och stäng laserluckan genom att markera slutarboxen. Vid fastställandet av analysen bör olika laserintensiteter och infallsvinklar testas för optimal enmolekyldetektering. Den optimala laserintensiteten balanserar ljus fluorescens med en molekyl och snabb fotoblekning av fluorforerna. Infallsvinkeln bör ökas bortom den kritiska vinkeln för att minska den höga fluorescerande bakgrunden från de diffuserande märkta antikropparna tills mRNA-bundna antikroppar är tydligt lösta. Som referens var en 532 nm laser inställd på 10 μW vid målet med laserincidentvinkeln inställd på 71,5° i en studie15 med Cy3-märkt anti-FLAG med ett märkningsförhållande på 2-7 färgämnen per antikropp.
  5. I programvara 1 väljer du Kinetic under förvärvsläget, matar in parametrarna för exponeringstid, kinetisk serielängd och EM-förstärkningsvärde. Välj katalogen och tilldela filnamn för att spara databildfilen.
  6. Ställ in sprutpumpen på ett blygsamt till snabbt flöde för det efterföljande slangtvättsteget.
    Pipett en alikvot på 70% etanol i ett mikrofugerör, sätt in sprutpumpens slangslut i etanollösningen och använd Coolterm för att växla sprutpumpen mellan utdragnings- och dispenseringslägen tre gånger för att tvätta slangen. Upprepa med RNase-fritt vatten.
    OBS: Slanglängden måste vara tillräckligt lång för att översättningsblandningen ska kunna dispenseras i steg 5 för att endast kontakt med slangen, inte sprutan. Sköljvolymen här bör vara större än volymen dispenserad översättningsmix för att säkerställa att översättningsmixen i steg 5 förblir i kontakt med sanerade slangar.
  7. När den slutliga vattensköljningen har dispenserats, ta bort kvarvarande vatten från insidan av slangen genom att dabbing slangänden på en ren vävnadsservett. Håll slangen torr genom att ställa in den i ett rent mikrofugerör.

4. Immobilisering av 3′-end biotinylerat mRNA

  1. Underhåll cellextraktet och översättningsblandningen fryst på torr is tills strax före användning. Tina de återstående frysta reagenserna och håll dem på is.
  2. Placera flödeskammaren i mikroskopprovhållaren med täcksidan vänd nedåt och fäst den på plats med tejp. Använd tejp för att täcka inlopp och utlopp för flödeskanaler som inte används.
  3. Pipett en volym på 1,5x (i förhållande till kanalvolymen; gäller även andra steg i steg 4 och steg 5) på 0,2 mg/mL streptavidin i flödeskanalen och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
  4. För att avlägsna obunden streptavidin, tvätta kanalen tre gånger genom att pipetting i en 3x volym T50 tvättbuffert (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U/μL RNase hämning reagens) per tvätt.
    OBS: Det är viktigt att förhindra att flytande avfall strömmar tillbaka in i kanalen. Om flödeskanalens utlopp inte är anslutet till ett avfallsinsamlingsrör, placera ett vikt vävnadspapper nära utloppet för att absorbera vätskan som strömmar ut ur kanalen.
  5. Överför översättningsextraktet och blanda från torris till is och låt dem tina.
  6. Sätt en droppe nedsänkningsolja på målet. Placera mikroskopprovhållaren med flödeskammaren i mikroskopstadiet. För målet nära täckglaset tills nedsänkningsoljan på målet kommer i kontakt med täckglaset. Flytta provsteget så att flödeskanalens position är direkt ovanför objektivet.
  7. Öppna laserluckan i programvara 2 och justera laserintensitetsnivån.
  8. På pekskärmen för pekskärmen för mikroskopkontrollen väljer du fliken Fokus och klickar på knappen Fokussökning och Start. Ett pip hörs när ett fokusplan framgångsrikt uppnås.
  9. Avbilda flödeskanalytan i liveläge i programvara 1. Optimera fokus för en skarpare bild genom att justera objektivpositionen med den fina stegkontrollen på pekskärmen.
  10. I programvara 3, flytta scenen för att utvärdera nivån av fluorescensbakgrund på olika områden av flödeskanalens detekteringsyta. Om fluorescensen är låg, fortsätt med experimentet. Om fluorescensbakgrunden är alltför hög bör du överväga att kassera flödeskanalen.
  11. Stäng laserluckan i programvara 2.
  12. Pipett ut T50 tvättbuffert från flödeskanalen och omedelbart pipett i en 2x volym biotinylerad mRNA-lösning till flödeskanalen. Inkubera i 15 minuter.
    OBS: För varje sats mRNA-preparat bör mRNA-koncentrationer och inkubationstider testas för att uppnå den mRNA-yttäthet som krävs för enmolekylsdetektering. Lämplig mRNA-ytdensitet förmedlar antikroppsbindning som visar fluorescerande fläckar med högst ~5% överlappning (se representativa resultat). Som utgångspunkt rekommenderas biotinylerat mRNA vid en koncentration av 2–20 nM.
  13. Tvätta kanalen tre gånger genom att pipetting en 3x volym översättningskompatibel buffert per tvätt.

5. Översättningsblandningsmontering och leverans till en flödeskanal för detektion av enmolekyler

  1. På is, montera 3x volymer av översättningsblandningen30 i ett mikrocentrifugrör enligt bulköversättningsprotokollet från steg 1.7, förutom utelämna mRNA och komplettera med en optimerad koncentration av fluorescerande märkta antikroppar. Snurra kort mikrocentrifugröret för att samla översättningsblandningen längst ner på röret.
    OBS: Vid fastställandet av analysen testas olika antikroppskoncentrationer. Den optimala koncentrationen visar låga mängder ospecificerad antikroppsbindning till detektionsytan och snabb antikroppsbindning till den gryende peptiden (se steg 7.1 respektive 7.2 för analyskalibreringsdetaljer).
  2. Överför översättningsblandningen till insidan av ett 0,7 ml mikrofugerörslock. Ställ in sprutpumpen i uttagsläge. Sätt i pumpslangens ände i översättningsmixen. Starta sprututtaget för att samla in översättningsblandningen i pumpslangen. Ställ in sprutpumpsinställningen i dispenseringsläge och ställ in flödet på en optimal hastighet för leverans av översättningsblandningar.
    OBS: Undvik att generera bubblor i översättningsmixen när du överför den till pumpslangen. Undvik att dra tillbaka översättningsblandningen för djupt in i den del av slangen som inte sanerades och sköljdes i steg 3.6. Vid fastställandet av analysen testas olika leveransflöden för att bestämma den optimala hastigheten (se steg 6.2 för detaljer om analyskalibrering).
  3. Om det finns ett mellanrum mellan slangens ände och översättningsblandningen, starta sprutpumpen och låt översättningsblandningen nå slangens ände och stoppa sedan sprutpumpen.
  4. För in pumpslangens ände i flödeskanalens inlopp. Undvik att införa luftbubblor i översättningsmixen när du utför anslutningen. Stabilisera anslutningen genom att skruva fast det specialtillverkade metallfästet på mikroskopprovhållarplattan. Utvärdera mikroskopfokus och bildområdesfluorescens.
    OBS: Slangen kan spännas fast i flödeskammaren med en anpassad del som tidigare beskrivits33. Andra typer av fluidiksystem kan också användas för denna analys34. Synfältet ska se likadant ut före och efter anslutning av slangen. Om fler fluorescerande fläckar dyker upp efter anslutningen läcker översättningsmixen troligen från leveransslangen. Beroende på applikationen kan kanalen med läckt översättningsmix behöva kasseras.
  5. Bekräfta att parametrarna för filmförvärv är korrekta och att lämpligt filnamn och lämplig katalog har angetts för att spara filer.
  6. Flytta scenen för att avbilda ett område i mitten av flödeskanalidentifieringsytan. På pekskärmen för pekskärmen för mikroskopkontrollen väljer du fliken Kontinuerlig AF och klickar på knappen Fokussökning och Start för att behålla fokuspositionen under experimentet. Ett pip hörs när ett fokusplan framgångsrikt uppnås.
  7. Öppna laserluckan i programvara 2. I programvara 1 klickar du på knappen Ta signal för att starta inspelningen. Efter cirka 5 s inspelning anger du kommandot Kör i Coolterm för att leverera översättningsmixen till flödeskanalen. Rekord för upp till 2 h med en tidsupplösning på 0,5–2 s/ram.
    OBS: Det maximala datainsamlingsintervallet beror på hur snabbt översättningsextraktet förlorar aktivitet över tid, vilket bekvämt kan karakteriseras genom att utföra bulkcellfri översättning med luciferase reporter mRNA och mäta luciferasaktivitet i översättningsreaktionerna vid olikatidpunkter 35.
  8. När datainsamlingen är klar stänger du av lasern, stänger av kontinuerlig AF på pekskärmen för mikroskopkontrollen och demonterar slangarna från flödeskammaren.
  9. Pipetten ut översättningsblandningen från flödeskanalens inlopp, överför den till ett mikrofugerör och snäpper av lösningen genom att placera röret i flytande kväve. Senare butik vid -80 °C.
  10. Tvätta sprutpumpsslangen tre gånger med RNase-fritt vatten, sedan tre gånger med 70% etanol. Dra tillbaka 70% etanol i sprutpumpsslangen för förvaring.
  11. Stäng av mikroskopet och alla tillbehör. Städa upp.

6. Dataanalys

OBS: Dataanalys för denna analys kräver vanliga metoder i biofysiska studier med en molekyl. Alla beräkningsintensiva steg kan uppnås med befintliga algoritmer och programvara (referenser ingår nedan i motsvarande steg).

  1. Valfritt: Om tillämpligt konverterar du den förvärvade bildseriefilen till ett format som är kompatibelt med den valda bildbehandlingsprogramvaran eller programmeringsspråket.
  2. Bestäm startpunkten för översättningsreaktionen och reagensutbytestiden.
    OBS: På grund av de diffusa fluorescerande antikropparna i översättningsmixen kommer bakgrundsfluorescensintensiteten i ett avbildat område att öka under utbytet av reagens i kanalen från översättningskompatibel buffert till översättningsmix. Utgångspunkten för översättningsreaktionen anges som den tidpunkt då reagensutbytet är klart. Denna kompletteringspunkt hittas genom att mäta bakgrundsfluorescensintensiteten under översättningsmixleveransen och identifiera den tidpunkt då de ökande fluorescensintensitetsplatåerna15, som beskrivs nedan.
    1. Beräkna det totala antalet fluorescenser per bildram och rita motsvarande tidsprofil. Identifiera den plötsliga ökningen av den totala fluorescensen i tidsprofildiagramt.
      OBS: Den totala fluorescensökningen beror på den ökande koncentrationen av fluorescerande märkt antikropp under reagensutbytet.
    2. Identifiera slutpunkten för den totala fluorescensökningsfasen och ställ in denna tidpunkt som utgångspunkt (dvs. tid 0) för översättningsreaktionen. Identifiera både start- och slutpunkterna för den totala fluorescensökningsfasen och ställ in tidsskillnaden som reagensutbytestid.
      OBS: Den totala tidsrymden för reagensutbyte beror på flödeskanaldimensionerna och det valda flödet. Det är möjligt att vissa översättningsfaktorer kan börja binda till mRNA innan reagensutbytet slutförs, vilket kan minska upplösningen av den fastställda första omgångens initieringstid. Det rekommenderas därför att testa olika flödeshastigheter när du ställer in analysen och väljer flödeshastigheter som gör det möjligt att slutföra reagensutbytet inom 3–4 s för datainsamlingshastigheter på 0,5–2 s/ram.
  3. Valfritt: Utför korrigering av filmdrift.
    OBS: Positionerna för bundna antikroppar i databilden kan förändras med tiden på grund av drift av mikroskopdelar och tillbehör. Drift som är visuellt märkbar i en film kräver korrigering innan du fortsätter med dataanalys. Flera rumsliga driftkorrigeringsalgoritmer ochskript är tillgängliga 36,37,38.
    1. I varje bild hittar du den lokala maximan i pixelantal för att bestämma positionerna för bundna antikroppar i varje bildruta med noggrannhet på pixelnivå. Ange ett tröskelvärde för pixelantalet så att endast fläckar som ligger klart ovanför bakgrundsbruset är markerade.
    2. Beräkna ändringarna av enskilda antikroppspositioner i varje riktning mellan två på varandra följande bildramar.
    3. Rita histogrammet av antikroppspositionella förändringar mellan två på varandra följande ramar och gör det separat för varje riktning. Gaussian passar varje histogram och ställer in topparnas mittposition som riktningsdrift mellan två på varandra följande ramar.
    4. För att motverka den observerade avdriften, flytta varje bildram i motsatt riktning med den beräknade driftmängden.
  4. Konstruera enmolekylsbanor.
    OBS: Detekterings-/spårningsprogram är tillgängligt för att identifiera ljusa punkter och extrahera deras intensiteter från databildserier39,40.
    1. Identifiera antikroppspositioner enligt beskrivningen i steg 6.3.1.
      OBS: Okulärbesiktning rekommenderas för att säkerställa att den valda tröskeln inte ger upphov till överdriven över- eller underplockning av partiklar. Visuell inspektion kan uppnås genom att de identifierade centroidpositionerna överläggs över varje bildram och visuellt bedöma deras samtycke (se representativa resultat).
    2. Kombinera de plockade partiklarna från alla ramar och ta bort de redundanta partikelpositionerna.
    3. Inspektera bilderna av bundna antikroppar visuellt och välj ett fyrkantigt område som omsluter pixlarna med räkningar som är klart över bakgrunden och representativa för individuellt bundna antikroppar.
      OBS: Punktspridningsfunktionen (dvs. kvadratens storlek för en enda molekyl) bestäms av den optiska inställningen och detektorns pixelstorlek.
    4. För varje partikelposition konstruerar du en enmolekylsbana genom att beräkna den totala intensiteten för alla pixlar i det fyrkantiga området runt partikelpositionen. Banor är konstruerade för varje position, bildruta för bildruta och för hela datafilmen.
  5. Tillval: Använd ett icke-linjärt framåtriktad filter41 för att minska bakgrundsljudet i enmolekylsbanor.
  6. Valfritt: Digitalisera banor med befintliga stegdetekteringsalgoritmer42,43,44,45.
    Valet av stegdetekteringsalgoritm beror på komplexiteten i dynamiken med en molekyl. För det enklaste scenariot med endast isolerad ribosomöversättning (dvs. ingen polysomebildning) och bra signal-till-brusförhållande är en tröskelapplikation på fluorescensräkningen tillräcklig för att identifiera tidpunkten för antikroppsbindning och dissociationshändelser i enmolekylens banor. Visuell inspektion av minst 100 banor för varje tillstånd rekommenderas för att säkerställa att bansteg har valts på lämpligt sätt genom en stegdetekteringsstrategi.
  7. Bestäm tiden för den första antikroppsbindningshändelsen för varje bana (dvs. första ankomsttiden, t1), antingen med hjälp av digitaliserade banor eller tillämpning av ett tröskelvärde på osmälta banor.
    OBS: Medianvärdet för den första ankomsttidsfördelningen kan jämföras mellan olika översättningsvillkor. Alternativt kan den första fördelningen av ankomsttid monteras på en skiftad (3-parameter) loggnormal funktion för att bestämma medelvärdet15 <t1>. Eftersom den första ankomsttidsfördelningen vanligtvis är skev och har en lång svans, beräkna inte medelvärdet genom att direkt i genomsnitt över de observerade första ankomsttiderna.
  8. Valfritt: Uppehåll tidsanalys och beräkning av genomsnittlig peptidsynteshastighet.
    1. Använd digitaliserade banor för att identifiera monosoma (en ribosom) översättningshändelser i varje bana och beräkna den enda bindningshändelsen som tidsskillnaden mellan motsvarande antikroppsbindnings- och dissociationshändelser.
      OBS: Stegdetekteringsalgoritmer för digitalisering av banor är i allmänhet mindre tillförlitliga när flera molekylära händelser överlappar varandra i tid. Exklusive polysome händelser från uppehåll tid analys rekommenderas därför. För mycket aktiva översättningssystem som berikas med polysomehändelser och sällan visar monosome händelser, kan en blandning av märkta och omärkta antikroppar användas för att öka risken för att observera isolerade översättningshändelser i enmolekylsbanor.
    2. Anpassa fördelningen till en log-normal funktion och använd den monterade funktionen för att beräkna den genomsnittliga uppehållstiden.
      OBS: Att beräkna medelvärdet direkt genom att beräkna de observerade uppehållstiderna rekommenderas inte eftersom fördelningarna av uppehållstiden vanligtvis är skeva med långa svansar.
    3. Bestäm antalet aminosyror som översätts under antikroppsbindningstiden genom att subtrahera summan av epitopens aminosyralängd och 35 (den genomsnittliga aminosyralängden för gryende peptiden i ribosomutgångstunneln) från det totala antalet ORF-kodoner.
    4. För att bestämma den genomsnittliga peptidsynteshastigheten, dividera antalet översatta aminosyror med den genomsnittliga uppehållstiden.
  9. Valfritt: Beräkning av den genomsnittliga initieringstiden i första omgången (<t1_I>).
    OBS: Initierings- och förlängningsförhållanden, såsom initieringsplatsens sekvenssammanhang och kodningssekvensen, bevaras i allmänhet avsiktligt för studier av initieringskinetik. Därför är den genomsnittliga första ankomsttiden <t1> från steg 6.7. kan användas direkt för att beräkna förändringen i första omgångens initieringskinetik mellan olika förhållanden. Följande korrigering är endast nödvändig för att fastställa det faktiska värdet av första omgångens initieringstid.
    1. Dividera summan av epitoplängden och 35 (den genomsnittliga aminosyralängden för gryende peptiden i ribosomutgångstunneln) med den genomsnittliga peptidsynteshastigheten(frånsteg 6.8.4.) för att beräkna den genomsnittliga peptidförlängningstiden för denna N-terminalregion (<t1_tag >).
    2. Eftersom den första ankomsttiden är summan av första omgångens initieringstid och t1_tag, subtrahera <t1_tag> från den genomsnittliga första ankomsttiden <t1> för att beräkna den genomsnittliga initieringstiden i första omgången <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. Kalibrering av analyser

OBS: Utför följande kalibreringssteg när du först upprättar analysen.

  1. För att undersöka antikroppsbindningsspecifikiteten utför du protokollstegen i avsnitten 4 och 5 separat för oupptäppta och märkta mRNAs (figur 2). Antikroppsbindningsnivåerna i kanaler med dessa respektive mRNAs representerar omfattningen av ospecificerad antikroppsbindning till detektionsytan och specifik antikroppsbindning till gryende peptid.
    OBS: Det specifika till ospecificerade bindningsförhållandet rekommenderas att vara >10 och kan ökas med olika ytaktiveringsstrategier, lägre antikroppskoncentration eller högre mRNA-yttäthet.
  2. Om du vill mäta antikroppsbindningshastigheten utför du protokollet med ett extra steg mellan steg 4 och steg 5.
    1. Efter steg 4, inkubera kanalen med översättningsblandning som saknar antikroppar för att för generera mRNA / ribosom / peptidkomplex.
    2. Fortsätt sedan till steg 5 och flöda antikropps-kompletterad översättningsblandning till kanalen.
    3. Kvantifiera den genomsnittliga antikroppsbindningshastigheten till förgenererad gryende peptid med exponentiell montering till histogrammet för första ankomsttid.
      OBS: Antikroppsbindningen till förgenererad peptid bör vara snabb, i storleksordningen sekunder, och bör vara snabbare än översättningskinetiken. En högre antikroppskoncentration kan användas för att öka antikroppsbindningshastigheten.
  3. Fotostabilitet av fluoroformärkt antikropp.
    1. Förbered en bild enligt protokollet i steg 2 men hoppa över PEGylation-steget. Montera flödeskammaren efter försaltningssteget. Silanbeläggningen möjliggör effektiv ospecificerad antikroppsbindning till detektionsytan.
    2. Tillsätt fluorescerande märkta antikroppar i kanalen för att uppnå enmolekylstäthet av ospecificerad antikroppsbindning till detektionsytan. Börja med att tillsätta fluorescerande märkt antikropp som är mycket utspädd i T50 tvättbuffert och gradvis öka antikroppskoncentrationen tills önskad enmolekyltäthet uppnås.
    3. Avbilda detekteringsytan tills det mesta av antikroppsfluorescensen inte längre kan upptäckas.
    4. Plotta det totala antalet synliga antikroppar över tid för att bedöma frekvensen av antikroppsfluorescensförlust på grund av fluoroforfotoblekning.
      OBS: Antikroppsmärkning ger vanligtvis flera fluorforer per antikropp. Enskilda antikroppar förblir detekterbara tills alla konjugerade fluorforer fotobleach.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enligt det beskrivna protokollet möjliggör avbildning av enskilda antikroppsinteraktioner med begynnande N-terminalmärkta polypeptider med enmolekylupplösning under aktiv cellfri översättning av 3' end-tthered reporter mRNA (Figur 1). Ett minimalt demonstrationsexperiment rapporteras med användning av tre syntetiska mRNAs: LUC (kodning av orolig luciferas), LUCFLAG (kodning 3xFLAG-märkt luciferas) och hp-LUCFLAG (LUCFLAG med en stabil stamslinga i 5' leader-regionen) (Figur 2C). Användningen av luciferas-kodning mRNA möjliggör jämförelser mellan enmolekyl observationer och bulk luminescence mätningar. Integriteten hos 3' biotinylerade mRNA bedömdes genom denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) och RNA färgning. MRNA av god kvalitet visar ett enda rent band och bör inte visa ytterligare snabbare migrerande signaler(figur 3A). Saccharomyces cerevisiae översättning extrakt användes här och utarbetats enligt ett protokoll som tidigarebeskrivits 30 ochändrats 15. Bulkmätningar av luciferasaktivitet i cellfria översättningsreaktioner med jästextrakt och biotinylerat LUCFLAG mRNA som antingen saknar eller innehåller ett m7G-lock visar kepsstimulering av LUCFLAG mRNA-översättning (Figur 3B).

För enmolekylsavbildning kompletterades översättningsextraktet med 67 nM Cy3-märkt anti-FLAG-antikropp (Cy3-αFLAG). Denna antikropp hade ett högt märkningsförhållande på 2-7 färgämnen per antikropp. Lasern på 532 nm var inställd på 10 μW vid målet. Laserincidentvinkeln var inställd på 71,5°, vilket var större än den kritiska vinkeln på 63,8° för vår uppsättning. En låg fluorescens avbildades från detektionsytor som innehåller mRNA men saknar översättningsblandning (Figur 4A). För kanalmått på cirka 2 mm (bredd) x 50 μm (djup) x 24 mm (längd) gav en flödestillförselhastighet på 150 μl/min en reagensväxlingstid på 3 – 4 s. Inom 5 s av översättningsblandningsleveransen ökar bakgrundsfluorescensnivån på grund av de spridande fluorescerande antikropparna. Ungefär 2 min efter leverans av översättningsblandning till LUCFLAG mRNA-innehållande kanaler började Cy3-fläckar dyka upp i ett synfält och fortsatte att ackumuleras i ~ 30 min (Figur 4B). Den ospecificerade antikroppsbindningen till ytan, mätt med luc mRNA (figur2C)som saknade 3xFLAG, låg kvar på en mycket låg nivå15. Signalerna från mRNA/ribosom/peptidbunden Cy3- αFLAG var tydligt synliga med den optimerade laserincidentvinkeln men kunde maskeras av en hög fluorescensbakgrund med lägre laserincidentvinklar (Figur 4C).

För att analysera Cy3-αFLAG-bindningshändelser beräknades fluorescensintensiteterna hos valda Cy3-αFLAG-fläckar (figur 5A) bild för bild för hela filmen och kopplades sedan till en intensitetsbana (figur 5B). Råa banor kan verka bullriga och kan kräva förfining med ett icke-linjärt framåtriktat bakåtfilter för att minska bakgrundsljudet41. Ytterligare förfining kan uppnås med hjälp av stegdetekteringsalgoritmer för att digitaliserabanor 42. För alla banor visas en universell ökning av bakgrundsfluorescensnivån under reagensutbytet på grund av de diffuserande fluorescerande antikropparna i översättningsmixen (figur 5B). Antikroppsbindning till en begynnande polypeptid orsakade en omedelbar ökning av fluorescens medan antikropp/polypeptid dissociation från mRNA orsakar en momentan fluorescensminskning (Figur 5B).

Uppehållstiden för antikroppsbindning kan användas för att mäta den totala avkodningstiden för en öppen läsram. Uppehållstiden histogram för LUCFLAG mRNA passar till en log-normal fördelning (Figur 6A) och gav en peptidsynteshastighet på 2,5 ± 0,1 aminosyror per sekund15. Den första ankomsttiden histogram passar till en skiftad (3-parameter) log-normal funktion (Figur 6B). Den breda spridningen av den första ankomsttiden histogram visar den höga graden av heterogenitet i enda mRNA översättningsaktivitet. Histogrammet indikerade att den första peptidsynteshändelsen på enstaka LUCFLAG mRNA-molekyler kunde börja så tidigt som 2 min, och så sent som 20 min, efter leverans av översättningsblandning (Figur 6B). Jämfört med översättning med LUCFLAG mRNA visade den första ankomsttiden histogram med hp-LUCFLAG mRNA översättning långsammare antikroppsbindning ( Figur7A). Att använda massluminscensmätningar från cellfria översättningsreaktioner med samma mRNA löser dock inte skillnader i översättningskinetik (figur 7B,C). Dessa resultat visar den högre upplösningen av vår metod jämfört med bulk kinetic luciferase aktivitet mätningar för att upptäcka små förändringar i inledande kinetik.

Figure 1
Figur 1: Protokollflödesschema. Schematiska framställningar av omslagslip och glidberedning, enmolekylskammare, TIRF-avbildning och datainsamling samt dataanalyssteg visas. TIRF-bildsteget innehåller schematiska skildringar av mRNA-immobilisering och översättning i en flödeskanal. Detektionsytans komponenter, fluorescerande märkta antikroppar och cellextraktkomponenter anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: mRNA-konstruktioner för enmolekylsanalysen. (A) För att anpassa en bulköversättningsanalys till enmolekylsanalysen ändrades DNA-mallen för bulkreportern ORF med en N-terminal epitop tag-sekvensinsättning för att generera en taggad reporterkodning ORF. ORF- och N-terminaltaggarkodningsregioner anges. (B) mRNAs var 5′-m 7 Gcappedför att tillåta cap-beroende översättning och 3′-biotinylated för deras immobilisering till enmolekyl detektion yta. 5′-m7G lock och 3′-biotin anges på obandade och märkta ORF RNAs. C)Luciferase-kodning mRNAs användes för att demonstrera enmolekylsanalysen. LUC och LUCFLAG mRNAs kodar luciferas som saknar och innehåller en N-terminal 3xFLAG-tagg. hp-LUCFLAG mRNA innehåller en extra insättning som introducerar en hårnål sekundär struktur i LUCFLAG mRNA 5′-ledare. Hårnålen termostabilitet, 3′-poly (A) svans och 3′-biotin anges. Alla tre mRNAs inkluderade en 30 nt 3′-poly (A) svans för effektivare cap-beroende översättning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Enmolekylsreporter mRNA-integritet och bulköversättning. (A) Representativ denaturering SIDA imaging av enmolekyl reporter mRNA. 5′-m7G kapsejsad och 3′-biotinylerad LUCFLAG mRNA laddades på en denaturerande 10% polyakrylamidgel bredvid en RNA-stege. (B) Enmolekylsreporter mRNA bevarade 5' cap-beroende i bulk cell-fria översättningsreaktioner. 3′-biotinylerad LUCFLAG mRNA som antingen saknade (-cap) eller innehöll (+ lock) översattes en 5′-m7G keps i S. cerevisiae översättningsextrakt i 30 min vid 25 °C. Luciferase aktivitet mättes från två oberoende reaktioner och normaliserades till aktiviteten med -cap mRNA, som godtyckligt sätts till 1,0. Standardavvikelser från medelvärden indikeras av felstaplar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av detektionsytor som innehåller immobiliserat mRNA. A)Bakgrundsfluorescens i avsaknad av översättningsmix. (B) Cy3 fluorescerande fläckar i ett synfält 30 min efter leveransen av översättningsblandningen och med en optimerad laserincidentvinkel. (C) Avbildat synfält 30 min efter leverans av översättningsblandning och med låg laserincidentvinkel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5: Bildanalys. A)Cy3-fläckar i ett synfält utan (vänster panel) eller med (höger panel) dekorfärgsmarkering. (B) Exempel på enmolekylsbana för en vald Cy3-fläck. Den svarta pilen indikerar ökningen av bakgrundsfluorescens på grund av diffus antikropp under leverans av översättningsblandningar. Den gröna pilen indikerar den plötsliga ökningen av fluorescensintensiteten på grund av Cy3-αFLAG-bindning. Den röda pilen indikerar den plötsliga minskningen av fluorescensintensiteten på grund av cy3-αFLAG/gryende peptid dissociation från mRNA. Uppehållstiden för en Cy3-αFLAG-bindningshändelse indikeras med en dubbelhövdad pil. Råa, filtrerade och digitaliserade data anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Kinetisk analys av Cy3-αFLAG-bindning med LUCFLAG mRNA-översättning. A)Cy3-αFLAG-bindningen uppehåller tiden histogrammet passar till en log-normal fördelning. B)Cy3-αFLAG-bindningen första ankomsttid histogrammet passar till en skiftad (3-parameter) log-normal funktion. Anpassad från Wang et al.15 med tillstånd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Enmolekylstestet har högre upplösning för initieringskinetik än bulkluminescensanalysen. (A) Första ankomsttid histogram för Cy3-αFLAG bindning med översättning av LUCFLAG och hp-LUCFLAG mRNAs visade långsammare inledande orsakad av en liten hårnål struktur i mRNA 5′-ledaren. N = 10650-banor(LUCFLAG),kombinerade från 3 datamängder och N = 4079-banor (hp-LUCFLAG), kombinerade från 2 datauppsättningar. B,C) Bulk luciferase aktivitetsanalys kinetiska mätningar löste inte skillnader i inledande kinetik för LUCFLAG (N = 9 datauppsättningar) och hp-LUCFLAG (N = 6 datauppsättningar) mRNA översättning. B)Kinetik i bulkluminetik. C)Spridningsdiagram över översättningstider i första omgången som bestäms av gaussiska anpassning till det andra derivatet av luminescence kinetikkurvorna iB,enligt beskrivningen av Vassilenko m.fl. 46. De röda cirklarna och staplarnai ( C) representerar medelvärdet och standardavvikelsen för den beräknade översättningstiden i första omgången. Anpassad från Wang et al.15 med tillstånd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I jämförelse med typiska in vitro TIRF enmolekylsexperiment är enmolekylsavbildning med den analys som beskrivs här dessutom komplex på grund av användning av cellextrakt och en hög koncentration av fluorescerande märkt antikropp. Jämfört med den vanligare metoden med en omgång yt PEGylation minskar en andra omgång PEGylation (steg 2) kraftigt den ospecificerade antikroppsbindningen till detektionsytan15. Den höga koncentrationen av diffusa fluorescerande antikroppar orsakar en extremt hög fluorescerande bakgrund som maskerar enmolekylsdetektering av antikroppsbindning. För att minska denna fluorescerande bakgrund ökas laserincidentvinkeln långt över den kritiska vinkeln (steg 3.4.). Antikroppsdetektering minskar också av överdriven fluoroforinstabilitet, vilket kan begränsa förmågan att kvantifiera uppehållstiden. När du stöter på detta problem, byt ut fluorforen mot en mer fotobar fluorofor, till exempel de som konjugeras till en triplet-state quencher47, eller sänk laserbelysningsintensiteten. Även om syrereningssystem ofta används i in vitro-experiment med enmolekyl för att undertrycka fluorforfotoblekning48,49, kan analysen som beskrivs här ge ett mycket generöst detektionsfönster utan att implementera några syrereningssystem15. Dessutom kan syrerensningssystem kraftigt minska eukaryota cellfria översättningseffektivitet. Därför bör syrerensningssystem noggrant utvärderas innan de används med denna analys.

Det är viktigt att påpeka att små variationer i reagenspreparat detekteras av analysen på grund av dess enmolekylupplösning. Förberedelser för replikeringsöversättningsextrakt kan till exempel visa olika aktiviteter som kan upptäckas med massmetoder. Dessutom kan frys-tina cykler av översättningsextrakt och andra reagenser snabbt försämra översättningsaktiviteten. Vi rekommenderar att du gör småskaliga pilotexperiment med lättillgängligt material för att testa förhållanden innan du planerar för en systematisk studie. För en systematisk studie rekommenderas storskaliga preparat av översättningsreagenser, engångs alikvoter för frys-/tökänsliga reagenser och konsekvens i utförandet av protokollsteg. Översättningsextrakt som blixtfryses i flytande kväve och lagras vid -80 °C visar minimal aktivitetsförlust i minst två år. Tillämpning av dessa åtgärder kan effektivt undertrycka experimentella variationer och öka robustheten hos enmolekylsanalysen.

Eftersom denna metod kombinerar befintliga bulkcellfria översättningssystem och in vitro-avbildningstekniker med en molekyl, diskuteras inte felsökning av generiska problem inom dessa två områden här. Exempel på sådana generiska problem inkluderar låg kvalitet preparat av reporter mRNA eller PEGylated coverslip och låg översättning verksamhet av cell extrakt. Här kommer vi att fokusera på frågor som är specifika för den här metoden. Förutom de flera tekniska problem som har diskuterats i protokollet kan ett annat potentiellt problem vara låg eller ingen antikroppsbindning i flödeskanalen för ett översättningsvillkor som förväntas ha god aktivitet. Det finns flera möjligheter att felsöka. Effektiviteten av biotinylerad mRNA immobilisering till detektion ytan kan bedömas genom glödgning kompletterande och fluorophore-konjugerade DNA oligomers till immobiliserade mRNA och imaging fluorescerande DNA: RNA duplex. Kvaliteten på översättningsmixen och biotinylerade reporter mRNAs kan kontrolleras genom att köra bulköversättningsanalysen. Dessutom, efter att ha utfört en översättningsreaktion i en mRNA-immobiliserad flödeskanal, kan översättningsreaktionslösningen pipetted ut ur kanalen och användas i en reporteraktivitetsanalys för att bekräfta förekomsten av översättning i kanalen. Vid behov kan en alltför hög mRNA-yttäthet användas för översättningsreaktionen i kanalen för att möjliggöra enklare detektion av reporteraktivitetsanalysen.

Den största begränsningen av denna analys är dess upplösning för initieringskinetik. I denna analys innehåller den direkta experimentella produktionen, första ankomsttiden, både första omgångens initieringstid och peptidförlängningstiden för översättning av epitopen och 35 ytterligare kodoner. Även om bidraget från peptidförlängningstiden kan korrigeras (steg 6.9.), är denna analys följaktligen mest känslig för att mäta initieringskinetik som uppstår i storleksordningen minuter, vilket verkar vara en generisk egenskap hos cap-beroendeinitiering 15. Experimentellt är det lätt att anpassa denna analys för att studera andra initieringsmekanismer. Men om en initieringsmekanism inträffar betydligt snabbt i storleksordningen sekunder är det osannolikt att denna analys löser initieringskinetiken.

Den enmolekylära metod som beskrivs här kombinerar enmolekylsavbildning och extraktbaserad översättning för att möjliggöra mätningar av enskilda cap-beroende översättningshändelser i realtid och under aktiv cellfri översättning. Analysen möjliggör enkel övergång från en bulköversättningsanalys till en enmolekylsanalys, samtidigt som bulköversättningskinetiken bevaras. Således kan kinetiska observationer med en molekyl tolkas direkt med hänvisning till motsvarande bulkresultat. Tidigare metoder, inklusive nyligen utvecklade in vivo-metoder 11,12,13,14, saknar upplösning för kinetiska mätningar av enskilda översättningsinitieringshändelser och kräver antaganden om översättningsmekanismer för att extrahera initieringstidsgenomsnitt från experimentella observerbara ämnen. Metoden med en molekyl som presenteras här ger det första hypotesfria tillvägagångssättet för kvantifiering av den genomsnittliga initieringstiden för aktiv cap-beroende översättning. Även om kinetiska bulkmätningar med en luminescence-analys har använts för att tillhandahålla de mest kvantitativa och systematiska bulkkarakteriseringarna av cap-beroende översättningskinetik hittills46,50, mäter den enmolekylsanalys som beskrivs här genomsnittliga initieringskinetiska förändringar med större känslighet än bulkanalysen ( figur7). Dessutom bevarar enmolekylsdata enkel mRNA-översättnings stokastiskhet och heterogenitet, egenskaper som är genomsnittliga i bulkmätningar. Enmolekylsupplösningen av översättningskinetik kan användas för systematiska kinetiska analyser för att avslöja insikter om översättningsmekanismer som inte kan uppnås med andra metoder.

Denna analys är kompatibel med befintliga biokemiska och genetiska metoder som ofta används för översättningsstudier. Till exempel kan den translationella funktionen hos en viss faktor studeras genom att generera faktor-utarmat extrakt och komplettera det med vild typ eller mutant faktor. Dessutom, genom att komplettera fluorescerande märkt faktor, studier kan potentiellt undersöka det kinetiska förhållandet mellan faktorbindning och progressionen av översättning. Med hjälp av två distinkta epitop/antikroppspar kan detta protokoll potentiellt utökas från en enfärgsanalys till en tvåfärgsanalys som möjliggör samtidig detektering av två distinkta kodningssekvenser. Denna anpassning skulle göra det möjligt att spåra översättningen av olika läsramar och skulle kunna tillämpas på ramskiftnings- och startplatsvalsstudier. Alternativt kan ett tvåfärgssystem användas för att upptäcka antikroppsinteraktioner med taggade polypeptider kodade av öppna läsramar uppströms och nedströms för att övervaka både uppströms och nedströms översättningshändelser på enskilda mRNAs. Dessa expansioner kan möjliggöra ett brett spektrum av mekanistiska studier som undersöker cap-beroende översättning och dess reglering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); och MSKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Biokemi nummer 163 cellfri eukaryota översättning enmolekyls translationskinetik in vitro-fluorescensavbildning cap-beroende initiering translationell kontroll in vitro-analys
En <em>in vitro-analys</em> för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter