Summary
Dieser Artikel stellt eine Methode des Schlüpfens ohne Verwendung einer Eierschale für toxikologische Untersuchungen von Partikelschadstoffen wie Mikroplastik vor.
Abstract
Mikroplastik ist ein aufstrebender globaler Schadstofftyp, der aufgrund seiner Aufnahme und Translokation in tierischen Geweben und Organen eine große Gesundheitsbedrohung für Tiere darstellt. Ökotoxikologische Wirkungen von Mikroplastik auf die Entwicklung von Vogelembryonen sind nicht bekannt. Das Vogelei ist ein komplettes Entwicklungs- und Ernährungssystem, und die gesamte Embryoentwicklung findet in der Eierschale statt. Daher ist eine direkte Aufzeichnung der Entwicklung von Vogelembryonen unter dem Stress von Schadstoffen wie Mikroplastik durch die undurchsichtige Eierschale beim traditionellen Schlüpfen stark eingeschränkt. In dieser Studie wurden die Auswirkungen von Mikroplastik auf die Entwicklung von Wachtelembryonen visuell überwacht, indem sie ohne Eierschale schlüpften. Die Hauptschritte umfassen die Reinigung und Desinfektion befruchteter Eier, die Inkubation vor der Exposition, die kurzfristige Inkubation nach der Exposition und die Probenextraktion. Die Ergebnisse zeigen, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe das Nassgewicht und die Körperlänge der mikroplastikexponierten Gruppe einen statistischen Unterschied auften und der Leberanteil der gesamten exponierten Gruppe signifikant anstieg. Darüber hinaus haben wir externe Faktoren bewertet, die die Inkubation beeinflussen: Temperatur, Feuchtigkeit, Drehwinkel der Eier und andere Bedingungen. Diese experimentelle Methode liefert wertvolle Informationen über die Ökotoxikologie von Mikroplastik und eine neuartige Möglichkeit, die nachteiligen Auswirkungen von Schadstoffen auf die Entwicklung von Embryonen zu untersuchen.
Introduction
Die Produktion von Kunststoffabfällen betrug im Jahr 2015 etwa 6300 Mt, von denen ein Zehntel recycelt wurde und der Rest verbrannt oder unter der Erde vergraben wurde. Es wird geschätzt, dass bis 2050 etwa 12.000 Tonnen Plastikmüll unterirdisch vergraben würden1. Mit der Aufmerksamkeit der internationalen Gemeinschaft für Kunststoffabfälle schlug Thompson erstmals 2004 das Konzept des Mikroplastiks vor2. Mikroplastik (MPs) bezieht sich auf kleine Partikelkunststoffe mit einem Partikeldurchmesser von weniger als 5 mm. Derzeit haben Forscher die allgegenwärtige Präsenz von Abgeordneten an der Küste verschiedener Kontinente, der Atlantikinseln, der Binnenseen, der Arktis und der Tiefseelebensräume3,4 ,5,6,7festgestellt . Daher haben mehr Forscher begonnen, die Umweltgefahren von Abgeordneten zu untersuchen.
Organismen könnten Abgeordnete in der Umwelt aufnehmen. MPs wurden im Verdauungstrakt von 233 Meeresorganismen weltweit gefunden (darunter 100% Schildkrötenarten, 36% Robbenarten, 59% Walarten, 59% Seevogelarten, 92 Arten von Seefischen und 6 Arten von Wirbellosen)8. Darüber hinaus können Abgeordnete das Verdauungssystem der Organismen blockieren, sich ansammeln und in ihren Bobies migrieren9. Es wurde festgestellt, dass Abgeordnete über die Nahrungskette übertragen werden können und ihre Aufnahme sich mit den Veränderungen des Lebensraums, des Wachstumsstadiums, der Ernährungsgewohnheiten und der Nahrungsquellen unterscheidet10. Einige Forscher berichteten über die Existenz von Abgeordneten im Kot von Seevögeln11, was bedeutet, dass Seevögel als Träger von Abgeordneten fungieren. Darüber hinaus kann die Einnahme von Abgeordneten die Gesundheit einiger Organismen beeinträchtigen. Zum Beispiel können Abgeordnete im Magen-Darm-Trakt verwickelt sein, wodurch die Mortalität von Walen erhöht wird12.
Abgeordnete allein haben toxische Wirkungen auf Organismen sowie gemeinsame toxische Wirkungen auf Organismen mit anderen Schadstoffen. Die Einnahme von umweltbedingten Konzentrationen von Kunststoffabfällen kann die Funktion des endokrinen Systems erwachsener Fische stören13. Die Größe von Mikroplastik ist einer der wichtigen Faktoren, die ihre Aufnahme und Akkumulation durch Organismen beeinflussen14,15. Die kleinen Kunststoffe, insbesondere die nanogroßen Kunststoffe, sind anfällig für Wechselwirkungen mit Zellen und Organismen mit hoherToxizität 16,17,18,19. Obwohl die schädlichen Auswirkungen von Mikroplastik in Nanopartikelgröße auf Organismen das aktuelle Forschungsniveau übersteigen, ist der Nachweis und die Quantifizierung von Mikroplastik mit Größen unter mehreren Mikrometern, insbesondere der Submikron-/Nanokunststoffe in der Umwelt, nach wie vor eine große Herausforderung. Darüber hinaus haben Nanokunststoffe auch einige Auswirkungen auf Embryonen. Polystyrol kann die Entwicklung von Seeigelembryonen schädigen, indem es Protein- und Genprofile reguliert20.
Um die möglichen Auswirkungen von Abgeordneten auf Organismen zu untersuchen, haben wir diese Studie durchgeführt. Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen Vogelembryonen und menschlichen Embryonen werden sie normalerweise in der entwicklungsbiologischen Forschung21 verwendet, einschließlich Angiogenese und Antiangiogenese, Tissue Engineering, Biomaterialimplantat und Hirntumoren22,23,24. Vogelembryonen haben die Vorteile von niedrigen Kosten, einem kurzen Kulturzyklus und einfacher Bedienung25,26. Daher haben wir wachtelembryonen mit einem kurzen Wachstumszyklus als Versuchstier in dieser Studie ausgewählt. Gleichzeitig können wir die morphologischen Veränderungen von Wachtelembryonen, die während der Embryonalentwicklungsphase den MPs ausgesetzt sind, mit einer eierschalenfreien Bruttechnologie direkt beobachten. Die verwendeten Versuchsmaterialien waren Polypropylen (PP) und Polystyrol (PS). Da PP und PS27 den größten Anteil an Polymertypen haben, die weltweit in Sedimenten und Gewässern gewonnen werden, sind ethylen und propylen28die häufigsten Polymertypen, die aus gefangenen Meeresorganismen gewonnen werden. Dieses experimentelle Protokoll beschreibt den gesamten Prozess zur visuellen Bewertung der toxikologischen Wirkungen von Abgeordneten auf Wachtelembryonen, die Den Abgeordneten ausgesetzt sind. Wir können diese Methode leicht erweitern, um die Toxizität anderer Schadstoffe für die Embryonalentwicklung anderer oviparer Tiere zu untersuchen.
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Protocol
1. Vorbereitung vor der Exposition
- Wählen Sie befruchtete Wachteleier, die am selben Tag geboren wurden, für den Expositionstest aus.
- Wählen Sie Wachteleier mit ähnlichen Gewichten. Jedes befruchtete Wachtelei ist etwa 10-12 g.
- Reinigen Sie alle befruchteten Wachteleier vollständig von äußerem Kot und anderen Ablagerungen.
- Sterilisieren Sie jedes vorgeschlüpfte befruchtete Wachtelei und die zu verwendenden Eier (Wählen Sie Eier mit ähnlicher Schalenform, insbesondere die Spitze des Eies) mit einer antibiotischen Lösung (Penicillin und Streptomycin, 1:1000, Raumtemperatur). Sterilisieren Sie den Inkubator mit 75% Ethanol.
- Öffnen Sie die Eier mit dem stumpfen Ende eines Zahnbohrers und lassen Sie die Eierschale an der Spitze für die weitere Verwendung. Vor der Übertragung der befruchteten Eier wird der Inhalt der Eier ausgegossen. Dies dient dazu, die Feuchtigkeit der Eierschale zu halten. Der Öffnungsdurchmesser des Eies betrug etwa 3 cm.
HINWEIS: Um die Schädigung des Wachtelembros zu reduzieren, verwenden Sie einen Zahnbohrer, um das stumpfe Ende des Eies zu öffnen und den Riss so glatt wie möglich zu machen. - Nach der Sterilisation die befruchteten Wachteleier für 24-48 h in einen 38 °C Inkubator mit 60% Luftfeuchtigkeit geben. Stellen Sie sicher, dass das stumpfe Ende des Wachteleis nach oben zeigt.
- Sterilisieren Sie während der Inkubation von befruchteten Wachteleiern die werkzeuge, die in den nachfolgenden Experimenten benötigt werden, in einem Sterilisationstropf. Zu diesen Werkzeugen gehören Plastikfolie, ein Becherglas, steriles Wasser, Pipettenspitzen, chirurgische gerade Scheren, Pinzetten und ein Löffel.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Folie mit einer Temperaturtoleranz, die hoch genug ist, um Probleme mit der Hochtemperatursterilisation zu vermeiden.
2. Wachteleier ohne Schale ausbrüten
- Die vorgeschlüpften befruchteten Wachteleier aus dem Inkubator auf eine saubere Bank geben und flach auf den Behälter legen, um sie für ca. 1-2 min zu stabilisieren.
- Verwenden Sie eine Schere (12,5 cm chirurgische gerade Schere), um ein kleines Loch (Durchmesser 3 mm) in die Mittelachse der vorgeschlüpften befruchteten Wachteeleier zu stechen und 1-2 cm kleine Öffnung zu schneiden. Das Eiweiß und Eigelb der befruchteten Wachteleier vorsichtig in die geschnittene Eierschale geben.
HINWEIS: Wenn Sie eine kleine Öffnung mit einer Schere schneiden, vermeiden Sie es, das Eigelb von Wachteleiern zu berühren. - Die Kontrolllösung (ohne MPs) und die exponierte Lösung verschiedener Massen (0,1, 0,2 und 0,3 mg) Mikroplastik mit drei Partikelgrößen (100, 200 und 500 nm) werden per Pipette in den Eiinhalt geben. Fügen Sie gleichzeitig 1 Tropfen Penicillin und 1 Tropfen Streptomycin mit einer 1 ml Spritze hinzu.
- Die Öffnung der Eierschale mit dem sterilisierten Film abdecken (Schritt 1.6).
- Behandeln Sie gemäß Schritt 2.1-2.4 alle befruchteten Wachteleier.
- Legen Sie die übertragenen Wachtelembryonen für die notwendige Zeit in den 38 °C Inkubator mit 60% Luftfeuchtigkeit. Verwenden Sie in diesem Experiment einen Eidrehwinkel von ±30 °. Drehen Sie die Eier einmal pro Stunde.
HINWEIS: Der Transfer sollte so schnell wie möglich erfolgen, was in der frühen Phase mehr Übung erfordert.
3. Probenentnahme
- Nach sieben Tagen Kultur gut entwickelte Embryonen, die mit bloßem Auge beobachtet wurden, aus dem Eigelb entfernen und mit phosphatgepufferter Lösung (PBS) waschen.
- Trocknen Sie die überschüssige Lösung außerhalb des gereinigten Embryos mit saugfähigem Papier und wiegen Sie sie in einer sauberen Petrischale.
- Öffnen Sie die gesamte Brusthöhle, trennen Sie die Leber und das Herz mit einer Nadel-Nasen-Zange von den Eingeweiden und legen Sie sie unmittelbar nach dem Reinigen in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
- Erfassen Sie schnell das Gewicht auf einer elektronischen Waage und berechnen Sie den hepatosomatischen Index (HIS = Lebergewicht / Körpergewicht x 100). Messen Sie die Länge des Brustbeins und des Körpers.
- Bewerten Sie anhand der oben genannten Indikatoren den Einfluss von Abgeordneten auf die Embryonalentwicklung.
HINWEIS: Die Embryoqualität bezieht sich hier auf die Qualität der Eigelbentfernung.
4. Datenanalyse
- Melden Sie die experimentellen Daten in Form von mittleren ± Standardfehler (REM).
- Verwenden Sie die Einzelfaktoranalyse der Varianz, um die Mittelwerte mehrerer Stichprobengruppen zu vergleichen. Der signifikante Differenzwert betrug α = 0,05.
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Representative Results
Für die Analyse experimenteller Daten verglichen wir Nassgewicht, Körperlänge, Brustbeinlänge und die Veränderung des hepatosomatischen Index zwischen der Kontrollgruppe und den 6 experimentellen Gruppen, wobei wir das Wachstum und die Entwicklung der Wachtelembryonen aus einer Makroperspektive maßen und reflektieren. Wir entdeckten sechs normale Wachtelembryonen in jeder Gruppe. Jeder Embryo erreichte das erforderliche Hamburger und Hamilton (HH) Stadium.
In Abbildung 1haben wir den vorgeschlüpften befruchteten Wachteleiinhalt in die hemisphärischen Eierschalen übertragen und in den Inkubator gegeben. Dann zeichneten wir die Entwicklung der Embryonen in der mittleren Inkubationszeit für drei Tage auf. Wie in Abbildung 2dargestellt, ist A-A2 die Kontrollgruppe und B-B2 eine Behandlungsgruppe. Aus der Perspektive der makroskopischen Embryonalentwicklung entwickelten sich die Embryonen normal ohne die nachteiligen Auswirkungen von Mikroplastik.
Tabelle 1 und Tabelle 2 sind die mittleren ± REM von Nassgewicht, Körperlänge und Brustbeinlänge des Wachtelembros nach einwöchiger Exposition. Die Tabellen zeigen, dass sich das Nassgewicht und die Körperlänge in verschiedenen Expositionsgruppen signifikant ändern. Das Gewicht und die Körperlänge der mit 0,1 mg, 0,3 mg, 100 nm und 500 nm MPs behandelten Gruppen nahmen leicht ab. Das Körpergewicht und die Körperlänge von 0,2 mg der mit 200 nm Mikroplastik behandelten Gruppen nahmen leicht zu (P < 0,05).
Der hepatosomatische Index (HIS) zeigt den Leberanteil im Wachtelembryo, was ein wichtiges Zeichen ist, um den Grad der Leberentwicklung zu beurteilen. Darüber hinaus spielt HSI eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Leberzellmembranverletzungen und entzündlichen Infiltrationen. Wie in Abbildung 3 und Abbildung 4gezeigt, stieg der Leberanteil in der gesamten Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe nach Exposition gegenüber Mikroplastik signifikant an. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen den 0,2 mg und 0,3 mg der 100 nm MPs Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe.
Abbildung 1: Ausbrüten von Wachteleiern ohne Schale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die Embryonalentwicklung der Wachtel am 6., 7. und 8. Tag im mittleren Stadium des Schlüpfens ohne Eierschale. Der grüne Pfeil zeigt auf die Augen; der blaue Pfeil zeigt auf die Gliedmaßen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hepatosomatischer Index von Wachtelembryonen nach 7-tägiger Exposition gegenüber MPs (nm). Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen werden durch * P < 0,05 angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Hepatosomatischer Index von Wachtelembryonen nach 7-tägiger Exposition gegenüber MPs (μm). Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen werden durch * P < 0,05 angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Behandlung von Abgeordneten | Gewicht (g) | Länge (cm) | Brustbeinlänge |
| Steuerung | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0,950±0,152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
Tabelle 1: Nassgewicht, Körperlänge und Brustbeinlänge von Wachtelembryonen nach 7-tägiger Exposition bei MPs (nm)
| Behandlung | Gewicht (g) | Länge (cm) | Brustbeinlänge |
| Steuerung | 2.161±0.166 | 26.05±23± | 1.10±0.04 |
| 0,1 mg | 1.960±0.338* | 4,82±0,75* | 1.04±0.04 |
| 0,2 mg | 2.410±0.366* | 26.00±5.25± | 1.07±0.10 |
| 0,3 mg | 1.901±0.759 | 4,95±0,15* | 1.02±0.09 |
Tabelle 2: Nassgewicht, Körperlänge und Brustbeinlänge von Wachtelembryonen nach 7-tägiger Exposition gegenüber MPs (μm). Im Vergleich zur Kontrollgruppe steht * für P < 0,05, ** für P < 0,01.
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Discussion
Dieses Papier bietet ein effektives experimentelles Schema zur Bewertung der Entwicklung von Wachtelembryonen durch den Nachweis der grundlegenden Entwicklungsindizes. Es gibt jedoch noch einige Einschränkungen für dieses Experiment.
Erstens ist die Mortalität von Wachtelembryonen im späteren Stadium des Schlüpfens aufgrund des schalenlosen Schlüpfens höher. Es gibt künstlich unkontrollierbare Faktoren wie die Zerstörung des normalen Proteinverhältnisses im experimentellen Prozess. Wir haben die Expositionszeit der Embryonen begrenzt, um die Genauigkeit des Experiments zu gewährleisten. Die Erforschung der Embryotoxizität kann nur in den frühen und mittleren Stadien der Embryonalentwicklung erfolgen. Zweitens findet die Untersuchung von Abgeordneten zur Entwicklung von Wachtelembryonen nur auf der Ebene der grundlegenden morphologischen Analyse statt. Somit sind die Schlussfolgerungen relativ einfach und es können Mängel vorliegen. Gleichzeitig sind die Anforderungen an Versuchsbedingungen und Betrieb im Prozess dieses Experiments relativ hoch. Daher sind einige bemerkenswerte Punkte wie folgt aufgeführt:
Es ist sehr wichtig, befruchtete Wachteleier in den Vorbereitungsarbeiten aufgrund der schädlichen pathogenen Mikroorganismen auf der Oberfläche von befruchteten Wachteleiern zu desinfizieren und zu sterilisieren. Bei Desinfektion können die Mikroben während der Inkubation in die befruchteten Wachteleier eindringen, was zum Tod der Wachtelembryonen führt. Selbst wenn die Übertragung erfolgreich ist, ist die Sterberate höher. Daher sollte bei der Desinfektion und Sterilisation gute Arbeit geleistet werden, um die experimentelle Mortalität zu reduzieren.
Wenn Vögel Eier ausbrüten, ändern sie oft die Position der Eier und halten die Luftzirkulation aufrecht, um eine konstante Temperatur für die Eier und die richtige Position für den Fötus aufrechtzuerhalten. Dieses Experiment verwendete Film, um die Eierschale zu versiegeln. Wenn der Winkel der Eidrehung zu groß ist, fließt das Eiweiß heraus. Wenn es zu klein ist, kann es zu einer Adhäsion zwischen dem Embryofilm und dem Eierschalenfilm kommen, was zu toten Embryonen führt. Stellen Sie daher den Drehwinkel entsprechend der tatsächlichen Situation ein.
Beim Transfer von Wachtelembryonen werden die vorbefruchteten Wachteleier horizontal platziert und dann in der Mitte der Eierschale geschnitten. Auf diese Weise fließt leicht ein kleiner Teil des Eiweißes aus, was den normalen Anteil und die Verteilung des dicken und dünnen Eiweißes zerstört. Dadurch neigt sich das Eigelb, das oben hätte sein sollen, zur Seite, wodurch der Embryo stirbt. Achten Sie daher darauf, dass das gesamte Eiweiß in die neue hemisphärische Eierschale fließt, um den normalen Anteil und die normale Verteilung während des Transfers zu gewährleisten.
Nach dem erfolgreichen Transfer muss der Experimentator darauf achten, die Flüssigkeit nicht direkt fallen zu lassen. Die Flüssigkeit sollte sich auf die Eierschalenwand verlassen, damit sie während der Zugabe von Schadstoffen und Antibiotika langsam fließt.
Zusätzlich zu den vier oben genannten Punkten sollten Sie die Inkubationsbedingungen streng kontrollieren. Koordinieren Sie das Gleichgewicht von Temperatur, Feuchtigkeit und Belüftung. Halten Sie das Inkubationslabor ruhig und dunkel, um die beste Inkubationsumgebung zu erreichen.
Zusammenfassend bietet dieses Experiment ein grundlegendes Protokoll für die Untersuchung der Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf die Entwicklung von Wachtelembryonen. Es gibt auch andere Arten von Indikatoren in der Untersuchung des embryonalen Wachstums und der Entwicklung, einschließlich vaskulärer Entwicklung, oxidativem Stress und Zellschäden. Das obige Experiment ist nur eine einfache makroskopische Bewertung der Embryonalentwicklung unter morphologischen Aspekten. Schließlich könnte die verbesserte Forschungsidee und das verbesserte Forschungsprotokoll in Zukunft eine neue Methode für die toxikologische Untersuchung des Wachstums und der Entwicklung von Embryonen bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben. Alle Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die Arbeit dieses Papiers hätten beeinflussen können.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch wichtige Forschungs- und Entwicklungsprojekte in der Uigurischen Autonomen Region Xinjiang unterstützt (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
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