Summary
Este trabajo introduce un método de eclosión sin utilizar una cáscara de huevo para estudios toxicológicos de contaminantes de partículas como los microplásticos.
Abstract
Los microplásticos son un tipo de contaminante global emergente que representa una gran amenaza para la salud de los animales debido a su absorción y translocación en los tejidos y órganos de los animales. Se conocen los efectos ecotoxicológicos de los microplásticos en el desarrollo de embriones de aves. El huevo de ave es un sistema completo de desarrollo y nutrición, y todo el desarrollo del embrión se produce en la cáscara de huevo. Por lo tanto, un registro directo del desarrollo de embriones de aves bajo el estrés de contaminantes como los microplásticos está altamente limitado por la cáscara de huevo opaca en la eclosión tradicional. En este estudio, los efectos de los microplásticos sobre el desarrollo de embriones de codorniz fueron monitoreados visualmente por eclosión sin cáscara de huevo. Los pasos principales incluyen la limpieza y desinfección de los huevos fertilizados, la incubación antes de la exposición, la incubación a corto plazo después de la exposición y la extracción de la muestra. Los resultados muestran que en comparación con el grupo de control, el peso húmedo y la longitud corporal del grupo expuesto a los microplásticos mostraron una diferencia estadística y la proporción hepática de todo el grupo expuesto aumentó significativamente. Además, se evaluaron los factores externos que afectan la incubación: temperatura, humedad, ángulo de rotación de huevos y otras condiciones. Este método experimental proporciona información valiosa sobre la ecotoxicología de los microplásticos y una nueva forma de estudiar los efectos adversos de los contaminantes en el desarrollo de embriones.
Introduction
La producción de residuos plásticos fue de aproximadamente 6300 Mt en 2015, una décima parte de los cuales se recicló, y el resto se quemó o enterró bajo tierra. Se estima que alrededor de 12.000 Mt de residuos plásticos estarán enterrados bajo tierra para 20501. Con la atención de la comunidad internacional a los residuos plásticos, Thompson propuso por primera vez el concepto de microplásticos en 20042. Los microplásticos (MPs) se refieren a plásticos de partículas pequeñas con un diámetro de partícula inferior a 5 mm. En la actualidad, los investigadores han detectado la presencia ubicua de diputados en la costa de varios continentes, las islas atlánticas, los lagos interiores, el Ártico y los hábitats de aguas profundas3,4,5,6,7. Por lo tanto, más investigadores han comenzado a estudiar los peligros ambientales de los diputados.
Los organismos podrían ingerir diputados en el medio ambiente. Se encontraron MPs en el tracto digestivo de 233 organismos marinos en todo el mundo (incluyendo 100% especies de tortugas, 36% especies de focas, 59% especies de ballenas, 59% especies de aves marinas, 92 tipos de peces marinos y 6 tipos de invertebrados)8. Además, los diputados pueden bloquear el sistema digestivo de los organismos, acumularse y migrar en sus bobies9. Se ha encontrado que los MPs pueden ser transferidos a través de la cadena alimentaria, y su ingesta difiere con los cambios de hábitat, etapa de crecimiento, hábitos de alimentación y fuentes de alimento10. Algunos investigadores informaron de la existencia de diputados en los excrementos de las aves marinas11, lo que significa que las aves marinas actúan como portadoras de los diputados. Además, la ingestión de MPs puede afectar la salud de algunos organismos. Por ejemplo, los diputados pueden enredarse en el tracto gastrointestinal, aumentando así la mortalidad de los cetáceos12.
Los diputados por sí solos tienen efectos tóxicos sobre los organismos, así como efectos tóxicos conjuntos sobre los organismos con otros contaminantes. La ingestión de concentraciones de desechos plásticos relacionadas con el medio ambiente puede perturbar la función del sistema endocrino de los peces adultos13. El tamaño de los microplásticos es uno de los factores importantes que afectan su absorción y acumulación por parte de los organismos14,15. Los plásticos de pequeño tamaño, especialmente los plásticos de tamaño nanosize, son propensos a la interacción con células y organismos con alta toxicidad16,17,18,19. Aunque los efectos nocivos de los microplásticos de tamaño de nanopartícula en los organismos superan el nivel de investigación actual, la detección y cuantificación de microplásticos con tamaños inferiores a varios micrómetros, especialmente los submicrón/nanoplásticos en el medio ambiente, sigue siendo un gran desafío. Además, los nanoplásticos también tienen algunos efectos sobre los embriones. El poliestireno puede dañar el desarrollo de embriones de erizo de mar mediante la regulación de perfiles proteicos ygénicos 20.
Para explorar el impacto potencial de los MPs en los organismos, realizamos este estudio. Debido a la similitud entre los embriones de aves y los embriones humanos, generalmente se utilizan en la investigación de biología del desarrollo21, incluyendo angiogénesis y antiangiogénesis, ingeniería de tejidos, implantes de biomateriales y tumores cerebrales22,23,24. Los embriones de aves tienen las ventajas de bajo costo, un ciclo de cultivo corto y fácil operación25,26. Por lo tanto, elegimos embriones de codorniz con un ciclo de crecimiento corto como el animal de experimentación en este estudio. Simultáneamente, podemos observar directamente los cambios morfológicos de los embriones de codorniz expuestos a los MPs durante la etapa de desarrollo embrionario utilizando una tecnología de eclosión sin cáscara de huevo. Los materiales experimentales utilizados fueron el polipropileno (PP) y el poliestireno (PS). Debido a que el PP y la PS27 representan la mayor proporción de tipos de polímeros obtenidos en sedimentos y cuerpos de agua en todo el mundo, los tipos de polímeros más comunes extraídos de organismos marinos capturados son el etileno y el propileno28. Este protocolo experimental describe todo el proceso de evaluación visual de los efectos toxicológicos de las MPs sobre los embriones de codorniz expuestos a MPs. Podemos ampliar fácilmente este método para examinar la toxicidad de otros contaminantes para el desarrollo embrionario de otros animales ovíparos.
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Protocol
1. Preparación antes de la exposición
- Seleccione los huevos de codorniz fertilizados nacidos el mismo día para la prueba de exposición.
- Seleccione huevos de codorniz con pesos similares. Cada huevo de codorniz fertilizado es de aproximadamente 10-12 g.
- Limpie completamente todos los huevos de codorniz fertilizados de las heces externas y otros desechos.
- Esterilizar cada huevo de codorniz fertilizado pre-eclosionado y los huevos a utilizar (Elegir huevos con forma de cáscara similar, especialmente la punta del huevo) con una solución antibiótica (penicilina y estreptomicina, 1:1000, temperatura ambiente). Esterilizar la incubadora con etanol al 75%.
- Abra los huevos con el extremo romo de un taladro dental, dejando la cáscara de huevo en la punta para su uso posterior. Antes de transferir los óvulos fertilizados, se vierte el contenido de los huevos. Esto es para mantener la humedad de la cáscara de huevo. El diámetro de apertura del huevo era de unos 3 cm.
NOTA: Para reducir el daño al embrión de codorniz, utilice un taladro dental para abrir el extremo romo del huevo y hacer que la grieta sea lo más suave posible. - Después de la esterilización, coloque los huevos de codorniz fertilizados en una incubadora de 38 °C con un 60% de humedad durante 24-48 h. Asegúrese de que el extremo romo del huevo de codorniz mira hacia arriba.
- Durante la incubación de huevos de codorniz fertilizados, esterilizar las herramientas necesarias en los experimentos posteriores en una olla de esterilización. Estas herramientas incluyen una envoltura de plástico, un castor, agua estéril, puntas de pipeta, tijeras rectas quirúrgicas, pinzas y una cuchara.
NOTA: Utilice una película con una tolerancia a la temperatura lo suficientemente alta como para evitar problemas con la esterilización a alta temperatura.
2. Eclosionar el huevo de codorniz sin cáscara
- Transfiera los huevos de codorniz fertilizados pre-eclosionados de la incubadora a un banco limpio y tírrelos planos en el recipiente para estabilizarlos durante aproximadamente 1-2 min.
- Utilice tijeras (tijera recta quirúrgica de 12,5 cm) para hacer un pequeño agujero (diámetro 3 mm) en el eje central de los huevos de codorniz fertilizados pre-eclosionados y para cortar 1-2 cm de abertura pequeña. Transfiera cuidadosamente la clara de huevo y la yema de los huevos de codorniz fertilizados a la cáscara de huevo cortada.
NOTA: Al cortar una pequeña abertura con tijeras, evite tocar la yema de los huevos de codorniz. - Añadir la solución de control (sin MPs) y la solución expuesta de diferentes masas (0,1, 0,2 y 0,3 mg) de microplásticos con tres tamaños de partícula (100, 200 y 500 nm) al contenido de huevo por pipeta. Al mismo tiempo, agregue 1 gota de penicilina y 1 gota de estreptomicina con una jeringa de 1 ml.
- Cubra la abertura de la cáscara de huevo con la película esterilizada (paso 1.6).
- De acuerdo con el paso 2.1-2.4, tratar todos los huevos de codorniz fertilizados.
- Coloque los embriones de codorniz transferidos en la incubadora de 38 °C con un 60% de humedad durante el período necesario. En este experimento, utilice un ángulo de rotación de huevos de ±30°. Gire los huevos una vez por hora.
NOTA: La transferencia debe ser lo más rápida posible, lo que requiere más práctica en la etapa temprana.
3. Recogida de muestras
- Después de siete días de cultivo, retire los embriones bien desarrollados observados a simple vista de la yema y lávese con solución tamponada de fosfato (PBS).
- Seque el excedente de la solución fuera del embrión limpiado con papel absorbente y pese en una placa de Petri limpia.
- Abra toda la cavidad torácica, separe el hígado y el corazón de las vísceras con alicates de aguja y coloque en tubos centrífugos de 1,5 mL inmediatamente después de la limpieza.
- Registre rápidamente el peso en una balanza electrónica y calcule el índice hepatosomático (HIS = peso hepático / peso corporal x 100). Mida la longitud del esternón y el cuerpo.
- Sobre la base de los indicadores anteriores, evaluar el impacto de los diputados en el desarrollo embrionario.
NOTA: La calidad del embrión aquí se refiere a la calidad de la eliminación de la yema.
4. Análisis de datos
- Informe los datos experimentales en forma de error estándar de ± medio (SEM).
- Utilice el análisis de varianza monofactorial para comparar las medias de varios grupos de muestras. El valor de diferencia significativa fue α = 0,05.
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Representative Results
Para el análisis de los datos experimentales, se comparó el peso húmedo, la longitud corporal, la longitud del esternón y el cambio del índice hepatosomático entre el grupo control y los 6 grupos experimentales, midiendo y reflejando el crecimiento y desarrollo de los embriones de codorniz desde una perspectiva macro. Detectamos seis embriones normales de la codorniz en cada grupo. Cada embrión alcanzó la etapa requerida de Hamburger y Hamilton (HH).
En la Figura 1,transferimos el contenido de huevos de codorniz fertilizados pre-eclosionados a las cáscaras de huevo hemisféricas y los colocamos en la incubadora. Luego registramos el desarrollo de embriones en el período medio de incubación durante tres días. Como se muestra en la Figura 2,A-A2 es el grupo control, y B-B2 es un grupo de tratamiento. Desde la perspectiva del desarrollo macroscópico del embrión, los embriones se desarrollaron normalmente sin los efectos adversos de los microplásticos.
La Tabla 1 y la Tabla 2 son la media ± SEM de peso húmedo, longitud corporal y longitud del esternón del embrión de codorniz después de una semana de exposición. Las tablas muestran que el peso húmedo y la longitud corporal cambian significativamente en diferentes grupos de exposición. El peso y la longitud corporal de los grupos tratados con 0,1 mg, 0,3 mg, 100 nm y 500 nm MPs disminuyeron ligeramente. El peso corporal y la longitud corporal del magnesio 0,2 de los grupos tratados microplásticos de 200 nanómetro aumentaron levemente (P < 0,05).
El índice hepatosomático (HIS) muestra la proporción de hígado en el embrión de codorniz, que es un signo importante para juzgar el grado de desarrollo del hígado. Por otra parte, HSI desempeña un papel importante en la patogenesia de lesión de la membrana de célula de hígado y de la infiltración inflamatoria. Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4,en comparación con el grupo control, la proporción de hígado en todo el grupo de tratamiento aumentó significativamente después de la exposición a microplásticos. Sin embargo, no había diferencia significativa entre el magnesio 0,2 y el magnesio 0,3 de los grupos del tratamiento de 100 nanómetro MPs y el grupo de control.
Figura 1:Incubación de huevos de codorniz sin cáscara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El desarrollo embrionario de codorniz en el día 6, 7 y 8 en la etapa media de eclosión sin cáscara de huevo. La flecha verde apunta a los ojos; la flecha azul apunta a las extremidades. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Índice hepatosomático de embriones de codorniz después de la exposición a MPs (nm) durante 7 días. Las diferencias significativas entre los grupos de control y tratamiento se indican por * P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Índice hepatosomático de embriones de codorniz después de la exposición a MPs (μm) durante 7 días. Las diferencias significativas entre los grupos de control y tratamiento se indican por * P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Tratamiento de los diputados | Peso (g) | Longitud (cm) | Longitud del esternón |
| Control | 2,509±0,324 | 5,425±0,477 | 1,025±0,094 |
| 100 nm | 1,812±0,155* | 4,632±0,315* | 0,950±0,152 |
| 200 nm | 2,272±0,368 | 5,297±0,268 | 1,025±0,076 |
| 500 nm | 1,785±0,127* | 4,892±0,154* | 1,017±0,082 |
Tabla 1: Peso húmedo, longitud corporal y longitud del esternón de los embriones de codorniz después de la exposición a MPs (nm) durante 7 días
| Tratamiento | Peso (g) | Longitud (cm) | Longitud del esternón |
| Control | 2,161±0,166 | 5,23±0,26 | 1,10±0,04 |
| 0,1 mg | 1,960±0,338* | 4,82±0,75* | 1,04±0,04 |
| 0,2 mg. | 2,410±0,366* | 5,25±0,26 | 1,07±0,10 |
| 0,3 mg | 1,901±0,759 | 4,95±0,15* | 1,02±0,09 |
Tabla 2: Peso húmedo, longitud corporal y longitud del esternón de los embriones de codorniz después de la exposición a MPs (μm) durante 7 días. Comparado con el grupo de control, * indica P < 0,05, ** indica P < 0,01.
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Discussion
Este trabajo proporciona un esquema experimental eficaz para evaluar el desarrollo de embriones de codorniz mediante la detección de los índices básicos de desarrollo. Sin embargo, todavía hay algunas limitaciones a este experimento.
En primer lugar, la mortalidad de los embriones de codorniz en la última etapa de la eclosión es mayor debido a la eclosión sin cáscara. Hay factores artificialmente incontrolables como la destrucción de la proporción normal de proteínas en el proceso experimental. Se limitó el tiempo de exposición de los embriones para garantizar la precisión del experimento. La investigación de la embriotoxicidad sólo puede tener lugar en las fases temprana y media del desarrollo embrionario. En segundo lugar, el estudio de los diputados sobre el desarrollo de embriones de codorniz sólo se produce a nivel de análisis morfológico básico. Por lo tanto, las conclusiones son relativamente simples y pueden existir defectos. Al mismo tiempo, los requisitos para las condiciones experimentales y el funcionamiento son relativamente altos en el proceso de este experimento. Por lo tanto, algunos puntos dignos de mención se enumeran a continuación:
Es muy importante desinfectar y esterilizar los huevos de codorniz fertilizados en el trabajo preparatorio debido a los microorganismos patógenos dañinos en la superficie de los huevos de codorniz fertilizados. Si se desinfectan, los microbios pueden entrometerse en los huevos de codorniz fertilizados durante la incubación, lo que resulta en la muerte de los embriones de codorniz. Incluso si la transferencia es exitosa, la tasa de mortalidad será mayor. Por lo tanto, se debe hacer un buen trabajo en la desinfección y esterilización para reducir la mortalidad experimental.
Cuando las aves eclosionan huevos, a menudo cambian la posición de los huevos y mantienen la circulación del aire para mantener una temperatura constante para los huevos y la posición correcta para el feto. Este experimento utilizó película para sellar la cáscara de huevo. Si el ángulo de rotación del huevo es demasiado grande, entonces la clara de huevo fluirá hacia fuera. Si es demasiado pequeño, entonces la adhesión entre la película del embrión y la película de la cáscara de huevo puede ocurrir, dando por resultado embriones muertos. Por lo tanto, establezca el ángulo de rotación de acuerdo con la situación real.
Durante la transferencia de embriones de codorniz, los huevos de codorniz pre-fertilizados se colocan horizontalmente y luego se cortan en el medio de la cáscara de huevo. De esta manera, una pequeña parte de la clara de huevo fluye fácilmente hacia fuera, lo que destruye la proporción normal y la distribución de la clara de huevo gruesa y delgada. Esto hace que la yema, que debería haber estado en la parte superior, se incline hacia un lado, haciendo que el embrión muera. Por lo tanto, tenga cuidado de hacer que toda la clara de huevo fluya en la nueva cáscara de huevo hemisférica para asegurar la proporción y distribución normales durante la transferencia.
Después de la transferencia exitosa, el experimentador debe tener cuidado de no dejar caer el líquido directamente. El líquido debe depender de la pared de la cáscara de huevo para que fluya lentamente durante la adición de contaminantes y antibióticos.
Además de los cuatro puntos mencionados anteriormente, controlar estrictamente las condiciones de incubación. Coordine el equilibrio de la temperatura, de la humedad, y de la ventilación. Mantenga el laboratorio de incubación tranquilo y oscuro para lograr el mejor ambiente de incubación.
En conclusión, este experimento proporciona un protocolo básico para estudiar los efectos de los contaminantes ambientales en el desarrollo de embriones de codorniz. También hay otros tipos de indicadores en el estudio del crecimiento y desarrollo embrionario, incluyendo el desarrollo vascular, el estrés oxidativo y el daño celular. El experimento anterior es sólo una simple evaluación macroscópica del desarrollo embrionario desde el aspecto morfológico. Por último, la idea y el protocolo de investigación mejorados en el futuro podrían proporcionar un nuevo método para el estudio toxicológico del crecimiento y desarrollo de embriones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar. Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia conocidos o relaciones personales que pudieran haber parecido haber influenciado en el trabajo de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por proyectos clave de investigación y desarrollo en la Región Autónoma de Xinjiang Uygur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
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