In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Summary

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

Abstract

Tumorigenese is een proces in meerdere stappen waarin cellen mogelijkheden verwerven die hun groei, overleving en verspreiding onder vijandige omstandigheden mogelijk maken. Verschillende tests zijn gericht op het identificeren en kwantificeren van deze kenmerken van kankercellen; echter, ze richten zich vaak op een enkel aspect van cellulaire transformatie en, in feite, meerdere tests nodig zijn voor hun juiste karakterisering. Het doel van dit werk is om onderzoekers te voorzien van een reeks instrumenten om cellulaire transformatie in vitro vanuit een breed perspectief te beoordelen, waardoor het mogelijk is om goede conclusies te trekken.

Een aanhoudende proliferative signaling activatie is het belangrijkste kenmerk van tumorweefsels en kan gemakkelijk worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door het berekenen van het aantal populatieverdubbelingen bereikt in de tijd. Bovendien maakt de groei van cellen in 3D-culturen hun interactie met omringende cellen mogelijk, die lijkt op wat er in vivo gebeurt. Dit maakt de evaluatie van cellulaire aggregatie mogelijk en, samen met immunofluorescente etikettering van onderscheidende cellulaire markers, om informatie te verkrijgen over een ander relevant kenmerk van tumorale transformatie: het verlies van een goede organisatie. Een ander opmerkelijk kenmerk van getransformeerde cellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix, die kan worden geëvalueerd met de verankeringstest.

Gedetailleerde experimentele procedures om de groei van cellen te evalueren, om immunofluorescente etikettering van cellijnmarkers in 3D-culturen uit te voeren en om verankering-onafhankelijke celgroei in zachte agar te testen, worden verstrekt. Deze methoden zijn geoptimaliseerd voor borst primary epitheelcellen (BPEC) vanwege de relevantie ervan bij borstkanker; Na enkele aanpassingen kunnen echter procedures worden toegepast op andere celtypen.

Introduction

Meerdere opeenvolgende gebeurtenissen zijn vereist voor de ontwikkeling van het neoplasma. In 2011 beschreven Hanahan en Weinberg 10 vermogens die de groei, overleving en verspreiding van getransformeerde cellen mogelijk maken: de zogenaamde "Hallmarks of Cancer"¹. De hier beschreven methodologie stelt drie verschillende instrumenten samen om in vitro cellulaire transformatie te evalueren door zich te concentreren op enkele onderscheidende kenmerken van de tumorcellen. Deze technieken beoordelen de celproliferatiesnelheid, het gedrag van cellen wanneer gekweekt in 3D en hun vermogen om kolonies met ankerveronafhankelijkheid te vormen.

Celmodellen zijn cruciaal om hypothese in vitro te testen. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om experimentele modellen van cellulaire transformatie te genereren voor de studie van kanker^2,3,4. Aangezien borstkanker is de meest voorkomende kanker onder vrouwen wereldwijd en is verantwoordelijk voor ongeveer 15% van de sterfgevallen door kanker onder vrouwen⁵, het verstrekken van geschikte cellulaire modellen van borstepitheelcellen is van het grootste belang voor verder onderzoek. In dit artikel hebben we het potentieel van drie technieken geïllustreerd om cellulaire transformatie te evalueren met behulp van een experimenteel model van borstwerkelijke epitheelcellen (BPC's) transformatie aanvankelijk beschreven door Ince en collega's in 2007⁶ en later geïmplementeerd in ons laboratorium⁷. Dit experimentele model is gebaseerd op de sequentiële wijziging van drie gerichte genen (SV40 Large T en kleine t-antigenen hierin aangeduid als Ttag, hTERTen HRAS) op het genoom van niet-getransformeerde BBC's. Bovendien, de methode die wordt gebruikt voor BPECs afleiding bevordert het behoud van borstepileliale cellen met luminale of myoepithelial markers, wat resulteert in een heterogene celcultuur die een aantal van de borstklier fysiologische eigenschappen behoudt.

In de borstklier bevinden zich borstlichaamcellen, die verantwoordelijk zijn voor de melkproductie, in de buurt van het lumen, terwijl myoepitheliale cellen rond luminale cellen worden verwijderd en zorgen voor samentrekkingsbewegingen die de melk naar de tepel leiden. Het verlies van de juiste organisatie tussen deze cellijnen is een kenmerk van tumorale transformatie⁸ die in vitro kan worden beoordeeld na immunofluorescente detectie van onderscheidende afstammingmarkers in 3D-celculturen. Een ander belangrijk kenmerk van tumorcellen is hun vermogen om te groeien zonder gehechtheid aan andere cellen en aan de extracellulaire matrix¹. Wanneer gezonde cellen worden gedwongen om te groeien in suspensie, mechanismen zoals anoikis \u2012 een soort celdood geïnduceerd in reactie op detachement van de extracellulaire matrix \u2012 worden geactiveerd⁹. De ontduiking van celdood is een van de kenmerkende kenmerken van kanker en dus zijn getransformeerde cellen in staat om anoikis te activeren en op een ankeronafhankelijke manier te overleven. Deze capaciteit kan in vitro worden geëvalueerd met de verankering-onafhankelijke test met behulp van zachte agar. Bovendien is een inherent kenmerk van tumorweefsels hun aanhoudende proliferative signaleringscapaciteit, die gemakkelijk kan worden gecontroleerd onder in vitro omstandigheden door de toename van het aantal cellen langs de tijd te meten, niet alleen in suspensietesten, maar ook door het toezicht op de groeisnelheid van monolaagaanhangende culturen.

Ondanks het beste model om tumorigenic potentieel te testen is de inenting van tumorcellen in murinemodellen en evaluatie van tumorontwikkeling in situ, is het belangrijk om het aantal dieren dat in experimentele procedures wordt aangewend zo veel mogelijk te minimaliseren. Daarom is het hebben van geschikte tests om transformatie in vitro te beoordelen een topprioriteit. Hier bieden we een reeks tools om het tumorigenic potentieel van gedeeltelijk en volledig getransformeerde borsteptropelial cellen te evalueren die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria die werken met cellulaire transformatiemodellen.

Protocol

Menselijke monsters gebruikt in de volgende experimenten werden verkregen uit vermindering mammoplasties uitgevoerd bij Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelona) onder standaard procedure toestemming. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse II Biological Safety Cabinet, tenzij anders vermeld.

1. In vitro cultuur van menselijke borstpitheelcellen en groeicurve plot opbouw

1. In vitro cultuur van borst primaire epitheelcellen (BPC's): cel doorgeven
   OPMERKING: Voor BPEC afleiding en celcultuur volgen instructies beschreven door Ince et al., 2007⁶.
   1. Gemiddelde voorbereiding.
      1. Supplement WIT basaal gedefinieerd medium met P of T supplementen, verstrekt door de fabrikant, afhankelijk van de vraag of primaire of getransformeerde BBC's zijn gekweekt.
      2. Voeg choleratoxine toe aan het bijgevulde WIT-medium tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng/mL voor primaire of 25 ng/mL voor getransformeerde BBC's.
         LET OP: Cholera toxine is fataal bij inslikken. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd de afgifte ervan aan het milieu.
   2. Celcultuur onderhoud en passaging.
      OPMERKING: Houd er bij de volgende stappen rekening mee dat cellen groeien in een T25-kolf. Niettemin kunnen volumes worden aangepast aan andere celkweekformaten, waarbij de evenredigheid in termen van oppervlakte behouden blijft.
      1. Controleer de cel samenvloeiing elke dag. Wanneer de cultuur is 90% confluent, uit te voeren cel passaging.
      2. Verkrijg 1x PBS, 3x trypsine, medium en een 15 mL conische buis met 2 ml Foetale Runderserum (FBS) voor elke kolf.
      3. Haal het medium uit de kolf en bewaar het in de 15 mL conische buis met FBS.
      4. Spoel cellen af met 1x PBS.
      5. Maak cellen los van het oppervlak door 1 mL van 3x trypsine toe te voegen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
      6. Controleer of de cellen zijn losgemaakt. Breng krachtig schudden als de cellen niet volledig los.
      7. Activeer trypsine door het gereserveerde medium aangevuld met FBS toe te voegen.
      8. Oogst de cellulaire suspensie en plaats deze in de 15 mL conische buis.
      9. Centrifuge op 500 x g gedurende 5 min, elimineren van de supernatant, en resuspend de pelleted cellen door flicking de onderkant van de buis met een vinger.
      10. Voeg 1-2 mL verse media toe aan de pellet en meet de celconcentratie met behulp van een automatische celteller of een hemocytometer. Deze gegevens zullen later worden gebruikt om de bevolkingsverdubbelingen te berekenen en de groeicurve te trekken. Zaad 12.000 cellen/cm² (bijvoorbeeld 300.000 cellen voor een T25-kolf) in gemodificeerde celkweekoppervlakkolven (zie Tabel van materialen).
          OPMERKING: Verdun de celsuspensieoplossing als de concentratie te hoog is om een goede kwantificering te garanderen.
      11. Voeg medium toe aan een eindvolume van 5 mL en broed de cellen uit bij 37 °C en 5% CO₂ atmosfeer.
      12. Vervang het celkweekmedium om de 48 uur.
2. Populatieverdubbelingsberekening en gegevensvisualisatie
   1. Met behulp van gegevens van het aantal cellen dat in stap 1.1.2.10 is verkregen, past u de volgende formule toe om de geaccumuleerde populatieverdubbeling (PD)-waarden te verkrijgen:
      
      Wanneer PD_i het aantal populatieverdubbelingen aangeeft dat de cellen tot de vorige subcultuur hebben bereikt (het verwijst naar de PD die zich op de vorige subcultuur heeft verzameld), is N_h het aantal geoogste cellen en N_s is het aantal gezaaide cellen.
   2. Gegevens vertegenwoordigen voor een specifiek tijdsinterval met behulp van een XY-grafiek waarin het aantal dagen in cultuur(x-as)en de geaccumuleerde PD(y-as)worden weergegeven.
   3. Krijg de best passende lijn en de passende vergelijking:
      
      OPMERKING: Een verhoogde helling (b) betekent een verhoogd proliferatiepercentage.

2. Driedimensionale (3D) cultuur in keldermembraanmatrix en immunofluorescente eiwitdetectie

1. 3D-cultuur in keldermembraanmatrix
   LET OP: Dit protocol is aangepast van Debnath et al., 2003¹⁰ en is geoptimaliseerd voor 24 putplaten (zie Tabel van Materialen).
   1. Bereid het materiaal een dag voor het experiment: pre-chill kelder membraan matrix 's nachts bij 4 °C en laat pipet tips, microcentrifuge buizen, en goed platen afkoelen in de vriezer.
      LET OP: De matrix moet op -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag. Maak aliquots om te voorkomen dat meerdere vries-dooi cycli.
   2. Plaats op de dag van het experiment voorgekoeld materiaal op ijs.
   3. Spoel putten met koude steriele 1x PBS om de oppervlaktespanning te verminderen.
   4. Bedek de bodem van elke put met 100 μL keldermembraanmatrix.
      LET OP: Doe de matrix langzaam af en verspreid deze over de put; het is van cruciaal belang om bellenvorming in de onderste laag te voorkomen om de groei van de monolaagcelkweek af te wenden.
   5. Plaats de plaat in de couveuse, op 37 °C, om de matrixlaag te laten stollen.
      LET OP: Het duurt meestal ongeveer 20 minuten om te stollen.
   6. Probeer cellen ondertussen zoals eerder uitgelegd in stap 1.1. Centrifugeren de cellen op 500 x g gedurende 5 min en resuspend in medium. Bereid een 400.000 cellen / mL suspensie en voorzichtig uiteen elke cel klomp door pipetten.
   7. Bereid het medium met 8% keldermembraanmatrix en meng 1:1 (v/v) met cellulaire suspensie om een 200.000 cellen/mL-oplossing in 4% matrix te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereken de hoeveelheid medium die nodig is om matrix onnodig afval te voorkomen.
   8. Plaats 500 μL celsuspensie in matrixoplossing bovenop de reeds gestolde matrixlaag om een totale hoeveelheid van 100.000 cellen in medium met 4% keldermembraanmatrix te zaaien.
   9. Incubeercellen bij 37 °C gedurende een paar minuten en voeg vervolgens 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix. Incubeer de cellen bij 37 °C in een couveuse met 5% CO₂ gedurende 14 dagen. Gezaaide cellen zullen groeperen en zich vermenigvuldigen om de acini-achtigestructuren te ontstaan.
      OPMERKING: Celmotiliteit en aggregatie kunnen worden gecontroleerd door time-lapse tijdens het 3D-vormingsproces. Gebruik software voor beeldanalyse (bijvoorbeeld Fiji/ImageJ of Imaris) om deze gebeurtenissen te evalueren. Het aantal en de grootte van de acini zijn afhankelijk van het aggregatieproces en de proliferatiesnelheid en kunnen variëren tussen celtypen. Pas de keldermembraanmatrixconcentratie en gezaaide cellen aan om de gewenste 3D-structuren te verkrijgen.
   10. Voeg 500 μL van het medium toe met 4% keldermembraanmatrix 2-3 keer per week.
       OPMERKING: Voorkom verstoring van de lagen die de plaat voorzichtig dragen tijdens manipulatie.
   11. Indien gewenst kunnen het aantal en de grootte van acini worden gemeten tijdens de cultuurperiode. Om dit te doen, neem willekeurige foto's op verschillende tijdstippen na het zaaien met behulp van een fase contrast of DIC omgekeerde microscoop. Gebruik beeldanalysesoftware om de diameter van 100-200 3D-structuren te meten.
2. Immunostaining
   LET OP: Steriele omstandigheden zijn niet vereist tijdens dit deel van het protocol.
   1. Verwijder het cultuurmedium.
   2. Scheur de kelder membraan matrix met behulp van een p200 pipet tip met het einde afgesneden. Plaats ~50 μL uitgesplitste matrix bovenop een glazen schuif en smeer deze in een gebied van 1-2 cm².
   3. Laat het monster volledig drogen bij kamertemperatuur of gebruik een verwarmingsplaat bij 37 °C om het proces te versnellen. Fix monsters met methanol:aceton (1:1, v/v) op -20 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Fluorescerend signaal van eerdere markers, zoals die van fluorescerende eiwitten uitgedrukt door de cellen, zal worden gewist.
      LET OP: Methanol is ontvlambaar, giftig bij inademing, ingeslikt of in geval van contact met de huid. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rookkap.
   4. Gooi de fixatieoplossing weg en verwijder het eventuele overtollige risico door de schuif op filterpapier te plaatsen.
      LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Eenmaal droog kunnen dia's enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
   5. Blokkeer monsters epitopes met 5% normaal geitenserum en 0,1% triton-X-100 in 1x PBS (blokkeeroplossing) voor 2 uur bij kamertemperatuur.
   6. Bereid ondertussen antilichamen voor door primaire of secundaire antilichamen te verdunnen bij de gewenste concentratie in blokkeringsoplossing.
      OPMERKING: De concentratie van antilichamen moet nauwkeurig worden aangepast, afhankelijk van het celtype en de referentie van het antilichaam. Als leidraad kunnen primaire anti-Cytokeratine 14- en anti-Claudin-IV-antilichamen (zie Tabel van materialen)worden gebruikt om cellen van luminale en myopitheliale afstammingen in BPEC te identificeren. De aanbevolen concentratie van werkoplossing is 1:100 voor deze primaire antilichamen en 1:500 voor anti-muis- en anti-konijn secundaire antilichamen (zie tabel met materialen).
   7. Voeg 30 μL primaire antilichamen werkoplossing toe en bedek deze met een strook laboratoriumverpakkingsfolie om verdamping te voorkomen. Incubeer 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer.
   8. Was drie keer met 1x PBS voor 1 uur per stuk.
   9. Herhaal stap 2.2.7 voor secundaire antilichamen. Incubatie moet worden uitgevoerd in het donker.
   10. Was met 1x PBS voor 2 uur.
       OPMERKING: Pas de concentratie van antilichamen, incubatietijd en washardheid aan om de signaal-ruisverhouding voor specifieke monsters te verbeteren.
   11. Verwijder de resterende PBS en, eenmaal droog, counterstain met DAPI op 0,25 μg/mL verdund in antifade montagemedium. Bedek dia's met een coverslip door het te laten bezinken zonder druk uit te oefenen. Verzegel met nagellak.
       LET OP: Monsters kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard. Voor langdurige opslag, houd ze op -20 °C.
   12. Analyseer fluorescerende signaalverdeling voor elke acinus met behulp van een confocale microscoop.
       OPMERKING: De confocale microscoopconfiguratie moet nauwkeurig worden bepaald, afhankelijk van de gebruikte apparatuur en de antilichamen die op het monster worden aangebracht. Als een gids, met de apparatuur en reagentia beschreven in de tabel van materialen, gebruik maken van een 40x doelstelling en de volgende laser en detector instellingen: voor DAPI gebruik excitatie met een 405 laser (3%-5%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -9) en een spectrale band van 410 nm tot 500 nm; voor A488 (Claudin-IV) gebruik excitatie met een 488 laser (7%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -20) en een spectrale band van 490 nm tot 550 nm; en voor Cy3 (Cytokeratin 14) gebruik excitatie met een 555 laser (2%-10%), detectie met een PMT detector (800V, Offset: -35) en een spectrale band van 560 nm tot 600 nm.

3. Anchorage-onafhankelijke test, MTT-kleuring en automatische koloniekwantificering

1. Anchorage-onafhankelijke test: agar en cellulaire vering beplating
   OPMERKING: Protocol is aangepast van Borowicz et al., 2014¹¹ om experimenten in BPC's uit te voeren.
   1. Bereid een 1,2% agar-oplossing verdund in ultrazuiver water in een steriele fles. Autoclave de oplossing en onderhoud het op 42 °C tijdens het experiment. De agar-oplossing kan bij 4 °C worden opgeslagen; verwarm de agar-oplossing indien nodig totdat deze weer vloeibaar is.
      LET OP: Gebruik hittebestendige handschoenen om te voorkomen dat branden na autoclave.
      LET OP: Vanaf nu moeten steriele omstandigheden worden gehandhaafd.
   2. Bereid een 0,6% agar-oplossing door 1:1 (v/v) volledig voorverwarmd medium te mengen met 1,2% agar-oplossing. Handhaven op 42 °C om voortijdige verharding te voorkomen.
      LET OP: Medium kan eerder dubbel worden aangevuld om een volledig aangevulde 0,6% agar + medium oplossing te verkrijgen eenmaal gemengd.
   3. Bedek de onderkant van een 35 mm goed met 1,5 mL van 0,6% agar in medium oplossing en laat het stollen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de bodem van de plaat volledig is afgedekt vóór agar stolling, anders kunnen cellen zich aan de plaat hechten en in monolaag groeien.
      OPMERKING: Aanhangende en niet-aanhangende oppervlakteplaten kunnen worden gebruikt.
   4. Ondertussen proberen cellen te stoppen en, eenmaal centrifuged en opnieuw op te stellen in medium, bereiden een 50.000 cellen / ml oplossing en zachtjes desaggen een cel klomp door herhaaldelijk pipetteren.
   5. Bereid een 0,3% agar + celsuspensie in het medium voor bij een uiteindelijke concentratie van 25.000 cellen/mL.
      OPMERKING: Optimale celconcentratie kan verschillen tussen celtypen. Probeer verschillende concentraties totdat geïndividualiseerde kolonies worden gevormd.
      1. Plaats een 40 μm zeeffilter bovenop een steriele buis van 50 mL en filter de 50.000 cellen/mL-oplossing waardoor het in de bodem van de buis kan vallen.
      2. Haal het filter uit de steriele buis van 50 mL, kantel de celhoudende buis naar een hoek van 45° en laat hetzelfde volume van 0,6% agar + medium oplossing door de binnenwand van de buis gieten. Hierdoor kan de agar-oplossing net genoeg afkoelen om de cellen niet te beschadigen en de voortijdige verharding ervan te voorkomen.
   6. Homogenize het mengsel en deponeren 1 mL van 0,3% agar + cel suspensie in het medium (met 25.000 cellen) op de top van de eerder gestolde bodem agar laag.
   7. Visualiseer gezaaide cellen met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen worden geïndividualiseerd. Anders moet het experiment worden herhaald.
   8. Wacht tot de agarlaag volledig gestold is en voeg vervolgens voorzichtig 1 mL van het verse medium toe aan de bovenkant zonder de delicate agarlagen eronder te verstoren.
   9. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 3 weken in een couveuse.
      OPMERKING: De tijd die nodig is voor kolonievorming kan variëren tussen verschillende celtypen, maar meestal zijn 3 weken voldoende.
   10. Wissel twee keer per week van medium. Om dit te doen, voorzichtig kantelen van de plaat naar je toe, aanzuigen medium in de onderste hoek, en voeg 1 mL van vers medium.
       OPMERKING: Raak de agarlagen niet aan omdat ze gemakkelijk loskomen van de plaat.
2. MTT-kleuring
   1. Bereid de thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) voorraadoplossing op 6 mg/mL in ultrazuiver water in een steriele fles en filteroplossing met 0,2 μm filters. Deze MTT-oplossing kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
      LET OP: MTT kan irritatie veroorzaken en wordt verdacht van het veroorzaken van genetische afwijkingen. Gebruik een veiligheidsbril, handschoenen en een ademhalingsfilter.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde vriesdooicycli.
   2. Bereid een werkoplossing van MTT op 1 mg/mL door de voorraadoplossing te verdunnen met steriel ultrazuiver water.
   3. Zodra de kolonievormingsperiode is afgelopen, verwijder het medium van de plaat en voeg 1 mL van 1 mg/mL MTT toe aan elke put.
   4. Incubeer voor 24 uur in de couveuse. Verwijder de MTT-oplossing door deze voorzichtig te aspireren. Platen kunnen enkele weken bij 4 °C worden bewaard.
      OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht om niet-specifieke kristalvorming te voorkomen.
3. Koloniekwantificering
   1. Verkrijg beelden van elke plaat met behulp van een omgekeerde microscoop. Pas de vergroting aan om het maximale gezichtsveld te verkrijgen met minder afbeeldingen en nog steeds in staat om kleine kolonies te detecteren (meestal 4x of 10x doelstellingen).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat afbeeldingen een homogene achtergrond vertonen. Er is geen fasecontrast of differentieel interferentiecontrast vereist, omdat niet-gekleurde kolonies niet zullen worden gekwantificeerd.
   2. Upload afbeeldingen naar ImageJ/Fiji software¹² om het aantal kolonies en het gebied van elke MTT-positieve kolonie te tellen.
      OPMERKING: Een script voor automatische kwantificering wordt verstrekt als een aanvullend bestand. Als u de code wilt uitvoeren, plakt u deze op de macro-editor(Plugins | Nieuwe | Macro) en volg de instructies.
      1. Een binair masker verkrijgen door de oorspronkelijke afbeelding te thresholderen(afbeelding | | aanpassen drempel) om goed afgebakende kolonies te verkrijgen (figuur 1).
         OPMERKING: 8- of 16-bits afbeeldingen zijn meestal vereist om deze stap uit te voeren. De methode "Minimumdrempel" wordt aanbevolen.
      2. Voer de Extended Particle Analyzer uit Biovoxxel plugin¹³ (Plugins | BioVoxxel | Extended Particle Analyzer) om MTT positieve kolonies te identificeren(figuur 2). Eerste leidende voorwaarden: Grootte (μm²) = 250–Oneindigheid; Degelijkheid = 0,75–1,00.
   3. Schat de gemiddelde diameter (D) van elke waarde van het koloniegebied (A) volgens de formule:
      
   4. Filterresultaten door het uitsluiten van lage proliferative kolonies (bijvoorbeeld lage diameter).
      1. Kies een minimum aantal divisies per week(m)dat in aanmerking moet worden genomen (bijv. 1).
      2. Schat de straal van een kolonie(R) met n cellen volgens de volgende formule:
         
         Wanneer, r is de gemiddelde straal van individuele cellen in suspensie, n is het aantal cellen die een kolonie die leed m divisies elke week tijdens w weken in de cultuur. In exponentiële groei: n = 2^(m*w). ρ is de verpakkingsefficiëntie. Merk op dat, in willekeurige beweging, de verpakkingsefficiëntie ~0,64 is en de dichtst mogelijke verpakkingsfractie voor identieke bollen 0,74¹⁴is.
      3. Gooi alle kolonies die een diameter lager dan 2R als hun cellen hebben niet bereikt het minimum aantal divisies beschouwd in stap 3.3.4.1.

Representative Results

Er werd gekozen voor een experimenteel model van cellulaire transformatie met de introductie van drie genetische elementen in BPC's om representatieve resultaten van oncogene transformatie te genereren^6,7 (figuur 3). Niet-getransformeerde BPC's(N)werden afgeleid van ziektevrij borstweefsel zoals beschreven door Ince en collega's⁶ en gekweekt volgens het hier aangegeven protocol. Na het overwinnen van STASIS (stress of afwijkende signaal-geïnduceerde-senescentie, een fenomeen dat typisch wordt waargenomen bij borstepitheelcellen in vitro die ongeveer 4 weken na de celkweek-vestiging wordt overwonnen), werden cellen achtereenvolgens getransduceerd met de lentivirale deeltjes pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP en pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP om gedeeltelijk getransformeerde cellen te verkrijgen (dubbeltransduced; D). Expressie van de virale Ttag remt p53 en retinoblastoom functie, en buitenbaarmoederlijke expressie van het hTERT gen compenseert voor proliferatie-afhankelijke telomeer lengte uitputting. Na fluorescerende selectie door celsorling werden cellen omgezet met pLenti-CMV/TORasV12-Puro, die een aanhoudend mitogeen signaal verleent, en vervolgens groei in aanwezigheid van antibiotica om doorgenoemde cellen te selecteren (triple transduced; T), die volledig werden getransformeerd volgens Ince en collega's⁶.

Zoals blijkt uit figuur 4, wordt een stijging van de helling van de regressielijn (parameter b in de vergelijking 1.2.3) waargenomen met het toenemende aantal genetische modificaties dat in BPEC(N: 0,47, D: 0,93, T: 1.13) wordt geïntroduceerd. Voor een specifiek tijdsinterval bereikten gedeeltelijk (D)en volledig getransformeerde(T)cellen een hoger aantal populatieverdubbelingen in vergelijking met de niet-getransformeerde cellen(N),waardoor het celdelingspercentage werd verhoogd met het transformatieproces. Hetzelfde resultaat kan ook worden uitgedrukt als de tijd die nodig is om de populatie cellen (t_d),die kan worden verkregen na vervanging van y door 1 (PD) in de vergelijking y = bx, dus t_d = 1/b te dupliceren. In tegenstelling tot de helling, t_d vermindert met transformatie. Terwijl niet-getransformeerde cellen meer dan 2 dagen nodig hadden om hun populatie te dupliceren(N: t_d = 2,13 dagen), deden gedeeltelijk getransformeerde cellen het in de helft van de tijd (D: t_d = 1,08 dagen). De toevoeging van HRAS in het kader van de regulering van een constituerende promotor leidde tot een verhoogde proliferatieactiviteit en cellen die minder dan 1 dag nodig hadden om te dupliceren (T: t_d = 0,89 dagen) in overeenstemming met de mitogene activiteit van dit oncogeen.

Terwijl monolayer celcultuur een nuttig hulpmiddel is om in vitro celgedrag te bestuderen, is het een sterk beperkte benadering omdat het het grootste deel van de fysiologische voorwaarden niet kan reproduceren. In plaats daarvan, de drie-dimensionale cel cultuur techniek hier beschreven kan cellen uit verschillende afstammingen te verzamelen en vrij bewegen in een 3D-omgeving vormen acinar structuren dankzij de cel-cel en cel-matrix knooppunt creatie (Figuur 5A. Time-lapse). Gedurende de volgende 2 weken verdelen cellen zich volgens hun oorspronkelijke weefselfunctie en vermenigvuldigen ze het verhogen van de acini-grootte (figuur 5B). De juiste polarisatie van elke acinus kan nauwkeurig worden beoordeeld dankzij de combinatie van immunofluorescente detectie van luminale (Claudin-IV) en myoepithelial (Cytokeratin 14) lijnmarkeringen met driedimensionale signaallocatie door confocale microscopie(figuur 6A). Terwijl alle acini gevormd door niet-getransformeerde BPC's goed waren georganiseerd (Claudin-IV positieve cellen omringd door Cytokeratin 14 positieve cellen; Figuur 6Ai), verlies van polarisatie (figuur 6Aii) werd waargenomen in acini gevormd door gedeeltelijk en volledig getransformeerde BPECs (figuur 6B).

Een van de belangrijkste eigenschappen van een getransformeerde cel is het vermogen om te groeien met de onafhankelijkheid van contact met de basale lamina. Deze eigenschap werd geëvalueerd door de cellen te laten groeien die gedurende 3 weken op agar zijn ingebed, waardoor de verankering aan het plaatoppervlak wordt vermeden(figuur 7A). Gedurende de volgende 3 weken, die cellen met verankering-onafhankelijke groeicapaciteit gaf aanleiding tot kolonies samengesteld uit meerdere cellen. Zoals blijkt uit figuur 8, 2 dagen na te zijn gezaaid in agar, sommige cellen al leed 2-3 divisies. Na 1 week kunnen cellen met doodsachtige morfologie worden waargenomen die aangeeft dat de cellen die niet in staat zijn om te overleven onder deze omstandigheden uiteindelijk stierven, waarschijnlijk door anoikis. Niettemin, sommige cellen blijven delen en vormen kleine kolonies groeien gedurende de tweede en derde week van de cultuur.

Na het toevoegen van MTT aan de cultuur, alleen die cellen metabolisch actief, dat wil zeggen, levend, zijn in staat om de tetrazolium ring van de MTT wat resulteert in paarse MTT formazan kristallen 24 uur later (Figuur 7B). Deze kristallen worden echter niet alleen gevormd door kolonies met levende cellen, maar ook door enkele cellen die na 3 weken in agar nog in leven zijn (figuur 9). Aangezien het doel van deze techniek is om het vermogen van cellen te bepalen om zich te vermenigvuldigen op een substraat-onafhankelijke manier, moet de grootte van de MTT-positieve kolonies worden geëvalueerd. Meting van de koloniediameter kan worden beoordeeld aan de hand van automatische beeldanalyse(figuur 7C)zodat kleine kolonies of geïndividualiseerde cellen kunnen worden gefilterd. Zoals blijkt uit figuur 10komen grijze stippen overeen met kolonies die in drie weken minder dan drie divisies hebben geleden, waardoor de diameter minder dan 65 μm is gemeten. Deze gebeurtenissen zijn opgenomen in de gegevensvisualisatie, maar uitgesloten van de uiteindelijke kwantificering.

Over het geheel genomen geven deze resultaten aan dat de onafhankelijkheidstest van anchorage het mogelijk maakt onderscheid te maken tussen verschillende graden van transformatie(figuur 10). Het aantal kolonies gevormd door niet-getransformeerde BPC's was verwaarloosbaar in vergelijking met het aantal kolonies gevormd door gedeeltelijk en volledig getransformeerde BBC's (kolonienummer: N = 3; D = 278; T = 243). Ook, toen de grootte van de kolonie werd overwogen, werden de verschillen tussen gedeeltelijk en volledig getransformeerde staten duidelijk (koloniemediaangrootte: N = 70 μm; D = 83 μm; T = 114 μm). Rekening houdend met de grootte van de kolonie biedt nauwkeurigere informatie over het tumorigenic potentieel van bestudeerde cellijnen en daarom wordt het hoogst geadviseerd om het te overwegen.

Figuur 1: Screenshot is een voorbeeld van beelddrempeling na MTT-kleuring met Fiji-software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Screenshot van de Extended Particle Analyzer van Biovoxxel plugin voorwaarden en uitkomst in Fiji software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Schematische weergave van het experimentele model van cellulaire transformatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: Proliferatiepercentage in niet-getransformeerde, gedeeltelijk en volledig getransformeerde BPC's. Best-fit lijnen en 95% betrouwbaarheidsbanden (stippellijnen) van de lineaire regressie worden getoond. VOOR de vergelijking tussen de voorwaarden werd ANCOVA voor een lineair regressiemodel toegepast; * p-waarde < 0,0001. Dit cijfer is aangepast van Repullés et al. 2019⁷. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Acini-vorming en -groei na het zaaien van BPC's in keldermembraanmatrix. (A) Representatieve beelden van een time-lapse voor de initiële tijden (van 0 tot 7 uur) na het zaaien van BBC's in de keldermembraanmatrix. Schaalbalk = 100 μm. (B) Acini-grootte over de 14 dagen cultuur in keldermembraanmatrix voor de niet-getransformeerde, gedeeltelijk en volledig getransformeerde BPEC. Foutbalken geven SEM aan. Geen statistische verschillen tussen de omstandigheden op dag 14 (One-way ANOVA en Tukey correctie; p-waarde > 0,05). Dit cijfer is aangepast van Repullés et al. 2019⁷. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Acini polarisatie in niet-getransformeerde, gedeeltelijk (D), en volledig getransformeerd (T) BPC's na 3D-cultuur in kelder membraan matrix. (A) Representatieve beelden van een gepolariseerde en een niet-gepolariseerde acinus na Cytokeratin 14 (K14, red) en Claudin-IV (Cl-IV, groen) immunofluorescentie. Gepolariseerde acini (i) werden overwogen toen Cytokeratin 14-positieve cellen claudin-IV positieve cellen omringden; anders werden acini beschouwd als niet-gepolariseerd aangezien Cytokeratin 14 en Claudin-IV positieve cellen zich zowel in de middelste als perifere locaties bevonden (ii). Schaalbalk = 25 μm.(B)Percentage acini gepolariseerd. Voor elke aandoening werden minimaal 10 acini geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 7: Schematische weergave van de verschillende stappen die worden gebruikt voor de verankeringsonafhankelijke groeitest in BPC's. Cellen werden gekweekt voor 3 weken in zachte agar(A) en vervolgens MTT kleuring werd toegepast (B). Schaalbalk = 5 mm. (C) MTT positieve kolonies werden gekwantificeerd met behulp van Fiji-software. Verschillende stappen op het gebied van beeldverwerking worden gemarkeerd. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 8: Evolutie van de celgroei gedurende 3 weken na het zaaien van geïndividualiseerde cellen in 0,3% agar. Beelden worden verkregen uit een gedeeltelijk getransformeerde BPEC-cultuur. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 9: Representatieve afbeeldingen van de MTT-kleuring en kwantificering. Voorbeelden met een MTT-positieve kolonie (rij 1), twee MTT-negatieve kolonies (rij 2) en enkele cellen positief of negatief voor MTT-kleuring (rij 3) worden weergegeven. A geeft het gebied van de MTT positieve kolonie of cel aan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 10: Koloniekwantificering na verankeringsonafhankelijke test in niet-getransformeerde (N),gedeeltelijk (D),en volledig getransformeerd (T) BPC's. a) Aantal en diameter van de kolonies verkregen voor de verschillende omstandigheden. Elke stip komt overeen met één kolonie. Zachte grijze stippen vertegenwoordigen MTT positieve kolonies, die werden uitgesloten in de resultaten omdat hun diameter lager was dan 65 μm (minimale grootte beschouwd na de toepassing van de vergelijking nummer 4 en rekening houdend met ten minste een verdeling per week). De rode lijn geeft de gemiddelde koloniediameter voor elke groep aan. Voor elke voorwaarde werden twee onafhankelijke replica's uitgevoerd. Verschillende letters (a, b, c) geven statistisch significante verschillen aan voor het aantal kolonies (de exacte test van Fisher; p-waarde < 0,05) en voor hun mediane diameter (Kruskal-Wallis test met meerdere vergelijkingen correctie; p-waarde < 0,05). Deze grafiek is aangepast van Repullés et al. 2019⁷. (B) Representatieve beelden van hele putten na MTT-kleuring. Schaalbalk = 5 mm; Inzetschaalbalk = 2,5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden. 

Discussion

De experimentele protocollen beschreven in dit document bieden nuttige instrumenten om de oncogene transformatie van in vitro gekweekte cellen te beoordelen. Elke techniek evalueert specifieke aspecten van het transformatieproces, en daarom moet bijzondere aandacht worden besteed aan het trekken van conclusies uit een enkele analyse. Groeicurven opbouw is een aanpak die informatie die al beschikbaar is bij het kweken van cellen voor andere doeleinden vereist. Dat maakt deze techniek goedkoper en gemakkelijker toe te passen in vergelijking met andere celproliferatietesten. Echter, om geldige resultaten te verkrijgen, moet speciale aandacht worden besteed bij het tellen en zaaien van cellen elke keer dat ze worden subcultuur. Een verhoogd groeipercentage is indicatief voor cellulaire transformatie¹, maar mag niet alleen worden gebruikt omdat andere exogene factoren, zoals de toevoeging/verwijdering van antibiotica en schimmeldodende stoffen of de variatie in kweekomstandigheden (bijvoorbeeld temperatuur, CO₂₎ook de cellulaire verdeling kunnen beïnvloeden. Het is ook belangrijk om te overwegen dat transductie of de behandeling van cellen met geneesmiddelen hun groeipercentage in de komende dagen of weken kan beïnvloeden en dus een vertekend beeld kan geven van de proliferatiecapaciteit op lange termijn. In dit verband moeten passende controles worden uitgevoerd.

De 3D-cultuur in keldermembraanmatrix maakt de beoordeling van celdistributie binnen een hele functionele entiteit, de acinus. Een gewijzigde organisatie is indicatief voor een intercellulaire communicatiestoornis die kan leiden tot een functieverlies, een kenmerk van tumorweefsels. Het feit dat sommige acini aanwezig niet-gepolariseerde organisatie geeft aan dat sommige cellen het transformatieproces hebben geïnitieerd. Wat technische problemen betreft, is het belangrijk om de optimale concentratie van gezaaide cellen en de concentratie van de matrix nauwkeurig te bepalen. Deze twee parameters kunnen het aantal en de grootte van de resulterende acini beïnvloeden en dit kan hun organisatorische capaciteit verstoren. Ook manipulatie van kelder membraan matrix vereist een zekere mate van ervaring als het moet voorzichtig worden behandeld. Ondanks het feit dat een moeizame techniek, de groei van cellen in drie dimensies lijkt op de fysiologische context van deze cellen en maakt de evaluatie niet alleen van de verdeling van borstlijn markers⁷,^15, maar ook van andere structuren die informatie over tumorale kenmerken, zoals de verstoring van de kelder membraan¹⁶. 3D-celculturen vertegenwoordigen de toekomst in celcultuuronderzoek. In feite kunnen 3D-gezwellen aanleiding geven tot meer fysiologische en interessante bevindingen, waarbij rekening wordt gehouden met micro-milieu-elementen en ons veel verschillende studies en therapeutische doelen kunnen identificeren en evalueren, cel-tot celinteracties of stamcelonderzoeken.

Verankering-onafhankelijke groei van aanhangende cellen is een ondubbelzinnige behandeling van het transformatieproces. Terwijl sommige van de gedeeltelijk en volledig getransformeerde BPC's nog steeds in staat waren om aanleiding te geven tot een gestructureerde acinus,manifesteren ze hun vermogen om kolonies te vormen wanneer ze gedwongen werden individueel te groeien in suspensie. Op technisch niveau is de ankertest ook complex omdat kleine variaties tijdens agarmanipulatie (bijvoorbeeld hoge temperatuur) of tijdens de disaggregatie van cellen na trypsinisatie de vorming van celkolonie notoir kunnen beïnvloeden. Echter, het benodigde materiaal is goedkoper dan kelder membraan matrix gebruikt voor 3D-cel culturen waardoor de beoordeling van de verankering-onafhankelijke groei meer betaalbaar. Ook, voorafgaand aan MTT toevoeging, enkele kolonies kunnen worden geplukt en toegestaan om te groeien uit de agar in platen met een aanhangende oppervlak. Deze kolonies kunnen resulteren in klooncellijnen die kunnen blijven groeien in suspensie of weer hechten. DNA, RNA en/of eiwit kunnen uit deze celculturen worden gehaald voor verdere analyses.

Er is een algemene beperking met betrekking tot de methoden die hier worden beschreven: ze zijn zeer tijdrovend, en het duurt enkele weken om de resultaten te verkrijgen. Echter, aangezien elke test beoordeelt een specifieke tumor kenmerk, conclusies gemaakt gezien de hele set van de resultaten zijn zeer gezond. Daarom zijn alle drie de tests samen krachtige indicatoren van cellulaire transformatie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture