Summary
卵巢癌干细胞 （OCSC） 负责癌症的发生、复发、治疗耐药性和转移。OCSC血管生态位被认为可促进OCSC的自我更新，导致化学耐药性。该协议为体外建立可重复的OCSC血管生态位模型提供了基础。
Abstract
癌症干细胞（CSC）位于支持性生态位中，构成由相邻基质细胞，血管和细胞外基质组成的微环境。CSC参与内皮发育的能力构成了一个重要特征，直接有助于对肿瘤发生和肿瘤转移机制的一般理解。这项工作的目的是建立一种可重复的方法，以研究卵巢癌干细胞（OCSC）的肿瘤起始能力。本文使用体外共培养模型NICO-1研究了内皮细胞和OCSC之间的新生血管形成机制以及内皮细胞的形态变化。该协议允许以时程方式可视化OCSC周围的新生血管形成步骤。该技术可以提供有关OCSC在肿瘤转移中的血管生成特性的见解。
Introduction
卵巢癌是全球女性第八大常见恶性肿瘤，每年约有 300，000 例新诊断，估计有 180，000 例死亡1。在初步诊断时，卵巢癌通常出现严重症状，约75%的患者已经处于III-IV期。因此，卵巢癌的5年生存率为<30%，死亡率在妇科癌症中最高2，卵巢癌的治疗效率高度依赖于减瘤手术的成功完成、化疗耐药和初始治疗后复发等临床因素。
卵巢癌组织是分层组织的，并非所有肿瘤成分都能够同样产生后代。唯一能够自我更新并产生异质性肿瘤细胞群的细胞被认为代表癌症干细胞（CSC）3。CSC自我更新和肿瘤起始伴随着促进血管生成以重塑其肿瘤微环境，以维持支持性生态位。然而，以前的模型不能用于体外分析，因为培养来自临床样品的CSC的可重复性有限，因为多次传代后球状体的破坏。最近，已经开发了从患者身上培养CSC的实验方法，用于多种应用4，5，6，7。特别是，通过利用CSCs在无血清培养基的超低附着板中形成球状体来生长的特性，诱导培养的CSC表达在具有多谱系分化潜力的正常肿瘤细胞中未表达的干细胞表面标志物8，9。
最近的数据表明，在腹膜上可视化为播散的休眠卵巢（O）CSC的持续存在与其作为复发性肿瘤的再生有关10。因此，了解OCSC的分子和生物学特征可以有效地靶向和根除这些细胞，从而产生潜在的肿瘤缓解。特别是，关于CSC在血管生成中的作用的细胞和分子机制特征知之甚少11。因此，在本协议中，我们在体外环境中使用患者来源的OCSCs，使用共培养模型研究内皮细胞的血管生成特性，该模型可能模拟CSC和内皮细胞的肿瘤微环境在临床环境中转移部位。最终，由于新生血管形成是支持肿瘤生长和转移所必需的关键过程，因此更好地了解其机制将允许在转移部位为OCSC开发一种新的靶向疗法。
在这里，我们提出了一个协议，以时间过程的方式可视化围绕CSC的新生血管形成步骤。该方案的优点包括允许使用3D共培养系统NICO-1进行完全可重复的研究，从而允许观察OCSC衍生的肿瘤起始能力在内皮细胞血管生成过程中对患者的影响。
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Protocol
所有程序均根据人类福利伦理委员会批准的协议执行。所有患者都为其样本的研究用途提供了书面知情同意书，本研究的组织收集和使用得到了帝京大学人类基因组基因分析研究伦理委员会的批准。
1. 在 2 级生物安全柜中分离和培养卵巢癌和腹水患者的卵巢癌干细胞 （OCSC）
- 从通过穿刺获得的人卵巢癌腹水中分离癌症干细胞。从患者身上收集至少 100-250 mL 的腹水，以摄取足够数量的癌症干细胞。此外，通过流式细胞术评估癌症干细胞标志物（即 EpCAM、钙视黄素、CD133、CD44、CD45、ALDH1 和 Oct4）和卵巢癌标志物（pAX-8、WT-1）的表达谱。
- 在腹水抽吸后24小时内在室温下以300× g 离心人卵巢癌腹水10分钟。
- 除去上清液，加入 2 mL OCSC 培养基和 8 mL 30% 组氨酸盐/磷酸盐缓冲盐水 （PBS，pH 7.4） 溶液。
- 制备 OCSC 培养基：StemPro hESC 补充剂、含有 L-谷氨酰胺的 DMEM/F-12（GlutaMAX 培养基）、25% BSA、100 μM 2-巯基乙醇、8 ng/mL FGF BASIC、10 μM 胰岛素和 20 μM Y-27632。
- 小心地将 2 mL OCSC 培养基覆盖到 15 mL 管中的步骤 1.1.2 中的细胞溶液中，并在室温下在水平吊篮转子中以 450 x g 离心 20 分钟，无需制动。
- 通过移液管小心地将OCSC层（在相间不受干扰）转移到新的15 mL管中。
- 用高达 15 mL 的 PBS 填充。在室温下以300× g 离心5分钟，除去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于OCSC培养基中，并接种在超低附着培养皿上;培养物应保持在37°C的5%CO2中。
- 每三天更换一次培养基。小心地将培养皿静置约1分钟，弃去部分上清液并加入新培养基。
- CSC的通过
- 将 OCSC 收集在 15 mL 管中，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
- 除去上清液，填充PBS，并在室温下以200× g 离心5分钟。
- 除去上清液，加入1mL由蛋白水解和胶原溶解酶（例如AccuMax）组成的细胞分离溶液，并在37°C下孵育10分钟。
- 通过移液充分混合并在37°C孵育5分钟。确保细胞处于单个悬浮液中。
- 通过移液充分混合，填充PBS，并在室温下以300 x g 离心5分钟。
- 除去上清液并将细胞沉淀重悬于OCSC培养基中，随后接种在超低附着培养皿上，并在37°C的5%CO2中维持。
2. HUEhT-1内皮细胞培养
- HUEhT-1细胞的传代
- 从HUEhT-1培养皿中取出培养基并用PBS洗涤细胞。
- 加入 1 mL 的 0.025% 胰蛋白酶，并在室温下孵育 3 分钟。
- 加入 5 mL 内皮细胞生长培养基 2，将细胞收集在 15 mL 管中，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
- 除去上清液，将细胞沉淀重悬于HUEhT-1培养基中，并将细胞接种在胶原蛋白包被的培养皿上，然后在37°C的5%CO2中维持。
- 每三天更换一次培养基。
3. 使用 HUEhT-1 细胞制备用于管形成测定的 NICO-1 共培养板
- 组装NICO-1并涂有基于细胞外基质的水凝胶（基质胶基质）。
- 按照制造商的说明组装 NICO-1 的一侧并保持在冰上。
- 用 300 μL 冷 PBS 覆盖 NICO-1 表面，然后取出缓冲液。
- 加入 300 μL 冷却的基于细胞外基质的水凝胶，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
- 为了平衡，用100%乙醇浸入过滤器，然后用PBS洗涤13mm ICCP过滤器（0.6μm）1分钟。
- 组装 NICO-1，包括主体部件 A（右腔）和 B（左腔）以及 O 形圈和平衡过滤器。
4. 将 HUEhT-1 细胞和 CSC 接种到 NICO-1 系统上
- 通过胰蛋白酶消化细胞单层并将细胞重悬于含有2%胎牛血清的内皮细胞生长培养基中来制备HUEhT-1细胞悬液。
- 向每个基于细胞外基质的水凝胶包被孔中加入 1.2 mL 细胞悬液（1.5 x 105 个 细胞）。
- 将 1.5 mL 培养五天的 OCSC 加入另一个孔中。
- 在37°C的5%CO2中孵育NICO-1;可以在显微镜下观察管的形成，并通过通过分支数测量基于细胞外基质的水凝胶上的网络形成。
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Representative Results
我们收集了晚期卵巢癌患者在手术或穿刺过程中获得的腹水，以便对球状体进行长期稳定的培养。在这里，我们介绍了卵巢CSC的长期球状体培养案例，称为CSC1和CSC2。两种细胞系具有相同的诊断和组织学特征。OCSC与内皮细胞相互作用的机制作用仍然是诱导OCSC周围内皮细胞新生血管所必需的。因此，我们旨在阐明转移部位CSC血管生态位发育的过程。我们使用体外共培养模型NICO-1检查了内皮细胞（HUEhT-1）和OCSC之间的相互作用。 图1 显示了CSC1和CSC2诱导的管形成活性的比较。随着时间的推移，在与CSC2共培养中形成的血管管的数量显着增加（图2A）。对于阳性对照，我们提出了 图2B ，它显示了在没有CSC2共培养的情况下处理VEGF（10ng / mL）后HuEhT-1的血管生成特性。我们现在正在澄清结果背后的详细机制。 图3 显示了使用 NICO-1 的 OCSC 与内皮细胞共培养模型的代表性图像。将HUEhT-1细胞与CSC2共培养20小时，并捕获延时视频图像。 图3A 显示了共培养20小时前后CSC2的表型。 图3B 显示了同时共培养的HUEhT-1细胞。值得注意的是，HUEhT-1细胞在与CSC2共培养过程中形成血管管 （图3C：视频剪辑）
图 1：OCSC 血管生态位模型。 OCSC诱导内皮细胞管形成（血管化）的机制作用仍然未知。我们使用体外共培养模式NICO-1检查了内皮细胞（HUEhT-1）和OCSCs之间的相互作用。该系统的右侧隔室由一个插入物组成，该插入物将OCSC与细胞培养基一起固定。左隔室由含有内皮细胞和HUVEC的孔组成，其培养基与右孔相同。
图2：OCSC诱导的新生血管活动比较。 随着时间的推移，与CSC2共培养时形成的血管管的数量显着增加。
图 3：使用 NICO-1 与 CSC2 共培养的 HUEhT-1 细胞的血管形成。 HUEhT-1细胞在与CSC2共培养过程中形成血管管。
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Discussion
所提出的协议描述了如何在体外环境中模拟OCSC的肿瘤微环境。该方法的主要组成部分构成了使用NICO-1系统（一种间接Transwell共培养系统）获得的高度可重复的共培养模型。许多目前可用的共培养模型检查了直接细胞-细胞接触对共培养细胞群的影响12，13，14，15，16，17，18。可用于检查共培养效果的最简单模型可以通过两种细胞类型的直接混合来繁殖，并且可以通过改变每种细胞类型的接种密度和亚群的相对接种比例来检查异型和同型相互作用的程度19。然而，由于每个细胞的精确隐形，很难通过显微镜独立地直接确定OCSC对共培养的任何观察到的效果的相对贡献;因此，这些研究通常伴随着条件培养基实验。例如，分离的共培养系统可用于研究旁分泌信号对肿瘤微环境的影响19。相比之下，在本文的方法中，我们描述了一种模型，该模型允许同时评估细胞 - 细胞接触和旁分泌信号传导的影响，其模拟天然肿瘤微环境的结构。
血管生成是卵巢癌的标志，并在其进展中起关键作用，其涉及癌细胞，内皮细胞和周围肿瘤微环境之间的相互作用20。贝伐珠单抗是一种关键的分子靶向药物，已被广泛接受用于晚期卵巢癌的联合化疗21。具体而言，贝伐珠单抗构成针对血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体。VEGF通过促进新生血管形成和增强血管通透性，有助于晚期卵巢癌或腹膜癌腹水的发展和恶性腹水的形成22。因此，VEGF抑制已被证明可以抑制腹水的产生和转移部位的大量肿瘤生长。因此，有必要在肿瘤微环境水平上有效靶向VEGF刺激的血管内皮细胞进行进一步研究。然而，可能难以有效地利用临床前模型，例如小鼠模型，进行这些研究。例如，据报道，贝伐珠单抗对人VEGF的亲和力很高，而小鼠蛋白的亲和力较低23。这限制了贝伐珠单抗在实验中的应用，这些实验旨在进一步研究其抗VEGF机制，如使用小鼠模型确定的那样，在肿瘤微环境中形成新生血管。因此，需要一个具有良好控制结构的适当模型来概括体内肿瘤微环境的组成部分。在这种情况下，我们注意到我们的体外共培养模型系统允许在患者来源的OCSC和内皮细胞的培养过程中实时跟踪细胞行为，并允许研究这些单个细胞亚群以响应共培养。
更好地了解OCSC的作用及其血管生态位可以为制定OCSC的治疗策略提供新的见解。如代表性实验所示，该模型的优势在于它提供了一个似乎与临床环境部分一致的研究平台，能够开发和测试更具针对性和更有效的新药。需要进一步的研究，直接临床复制我们的结果，涉及更多患者来源的OCSC。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本文部科学省的科学研究C补助金（K.N.拨款号19K09834）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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