Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61830
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Department of Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Abstract

Büyüme faktörü β (TGF-β) dönüştürmek, hücreler arası iletişimde kilit rol oynayan gizli çok işlevli bir faktördür. TGF-β sinyallerinin pertürbasyonları meme kanserine yol açabilir. TGF-β, spesifik hücre yüzeyi TGF-β tip I ve tip II reseptörleri (tβRI ve TβRII) ile içsel serine/threonine kinaz etki alanı içeren çoğalma ve farklılaşma üzerindeki etkilerini ortaya çıkarır. TGF-β kaynaklı heteromerik kompleks oluşumu üzerine, aktif TβRI fosforilasyon SMAD2 ve SMAD3 ile hücre içi sinyal ortaya çıkarır. Bu aktif SMAD'ler, plazminojen aktivasyon inhibitörü 1 (SERPINE1 geni tarafından kodlanan PAI-1) dahil olmak üzere belirli hedef genleri düzenlemek için SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturur. Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) indüksiyon, epitel kanseri hücrelerinin birincil bölgede veya uzak bölgelerde kolonizasyon sırasında invaziv bir fenotip kazanmasını ve tümörün ilerlemesini sağlamasını sağlar. TGF-β EMT kullanarak meme kanseri invazyonunun güçlü bir indükleyicisi olarak hareket eder. Burada, TGF-β sinyallerini ve EMT yanıtlarını premalign insan MCF10A-RAS (M2) hücrelerini ve fare NMuMG epitel hücrelerini kullanarak araştırmak için sistematik yöntemleri örnek olarak açıklıyoruz. Batı şişkinliği ile TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunu, luciferaz muhabir aktivitesini kullanarak SMAD3/SMAD4 bağımlı transkripsiyon aktivitesini ve serpine1 hedef gen ekspresyonunu nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile belirleme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca morfoloji, epitel ve mezenkimal belirteç ekspresyişi, filamentli aksin lekelenmesi ve E-cadherin immünoresans lekelenmesindeki değişiklikler ölçülerek TGF-β kaynaklı EMT'nin incelenmesi için yöntemler açıklanmaktadır. TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyon, hedef genler ve EMT belirteç ifadesindeki değişiklikleri engellemek için GW788388 ve SB431542 olmak üzere iki seçici küçük molekül TGF-β reseptör kinaz inhibitörü kullanıldı. Ayrıca mezenkimal meme Py2T murine epitel tümör hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu tarif ediyoruz. Meme kanserinde TGF-β kaynaklı sinyalizasyon ve EMT'yi inceleme yöntemleri meme kanseri için yeni terapötik yaklaşımlara katkıda bulunabilir.

Introduction

Sitokin dönüşüm büyüme faktörü-β (TGF-β), TGF-βs (örneğin, TGF-β1, -β2 ve -β3), kemik morfojenik proteinler (BMP'ler) ve aktivinler1,2dahil olmak üzere yapısal ve işlevsel olarak ilgili düzenleyici polipeptidlerden oluşan geniş bir grubun prototipidir. Bu sitokinlerin hepsi embriyonik gelişimde ve doku ve organ homeostazlarının korunmasında önemli roller oynar3. TGF-β yanlış yönlendirilebilirliği, kanser4,5dahil olmak üzere çok çeşitlihastalıklarayol açabilir. TGF-β kanserin ilerlemesinde karmaşık, ikili bir rol oynar: normal ve premalign epitel hücrelerinde, TGF-β çoğalma inhibe ederek ve apoptoz6,7'yiindükleerek tümör baskılayıcı olarak davranır; bununla birlikte, tümör ilerlemesinin geç evresinde, onkogenlerin aktivasyonu veya tümör baskılayıcı genlerin kaybı ile sitostatik yanıtlar engellendiğinde, TGF-β kanser hücrelerinde epitelden mezenkimal geçişi (EMT) teşvik ederek tümör arttırıcı görevi görür, böylece kanser hücre invazyonunu ve metastazını mümkün kılar, tümör mikroçevreslerindeki hücrelere etki eder ve anjiogenez ve immün kaçamak8,9,10'uuyarır.

TGF-β olgun karboksi terminal TGF-β ve gecikme ile ilişkili peptit (LAP)11içeren inaktif bir öncü molekül olarak salgılanır. Bu küçük kompleks, gizli TGF-β bağlayıcı protein (LTBP)12ile birlikte bağlanabilir. Olgun TGF-β salınımı, LAP'yi ikiye ayıran spesifik proteazların etkisi veya LAP'nin integrin bağımlı bir işlemde mekanik olarak çekilmesi ile aracılık edilebilir13,14. LTBP'ye ek olarak, Glikoprotein A tekrarları baskın (GARP), düzenleyici T hücrelerinin (Tregs) yüzeyinde yüksek oranda ifade edilir ve TGF-β15,16aktivasyonunun düzenlenmesinde LTBP ile benzer bir rol oynar. GARP, disülfid bağlantı ve uyumsuz ilişki yoluyla doğrudan gizli TGF-β bağlanır. GARP/TGF-β kompleksinden TGF-β aktivasyonu17entegre gerektirir. Olgun TGF-β, sinyalizasyon başlatmak için TGF-β serine/threonine kinaz reseptörlerine, yani TGF-β tip I (TβRI) ve TGF-β tip II (TβRII) reseptörlerinebağlanır. TGF-β TβRII'ye bağlanması, TβRI'nin işe alınmasını ve heteromerik bir kompleksin oluşumunu teşvik eder. Daha sonra, TβRI kısa bir glisine ve serine bakımından zengin (GS) motifinde serine ve threonine kalıntıları üzerinde TβRII kinaz tarafından fosforillenir ve aktivasyonu19,20. Aktivasyondan sonra, aktif TβRI alt tabakalarını işe toplar ve fosforilasyonlar: SMAD2 ve SMAD3(Şekil 1)içeren iki reseptöre özgü SMAD (R-SMAD). R-SMAD'ler, proline bakımından zengin bir bağlayıcı bölgeyle ayrılan mad homology etki alanları MH1 ve MH2 ile benzer bir genel yapıyı paylaşırlar (Şekil 2). SMAD3'ün MH1 etki alanındaki DNA bağlama motifi SMAD2 ve SMAD3 arasında korunmuyor ve SMAD2, MH1 etki alanındaki iki ekleme nedeniyle (ekson 3 ve L1) DNA'yı doğrudan bağlayamıyor. SMAD2 ve SMAD3, C-terminilerinde SSXS motifinin fosforilasyonu ile aktive edilebilir (Şekil 2). Fosforilasyonlu SMAD2/3, hedef genlerin transkripsiyonunu modüle etmek için çekirdeğe geçen ortak bir SMAD aracı olan SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturur (Şekil 1)7,21. Bu kurallı SMAD sinyal yolu hassas bir şekilde düzenlenir ve hücre kaderinin düzenlenmesi ve tümör hücre metastazı ve istilası22gibi spesifik hücresel ve doku yanıtları üretir. TGF-β-SMAD sinyaline ek olarak, SMAD olmayan sinyal yolları da aşağı akış hücresel yanıtlarını düzenlemek için reseptörler tarafından doğrudan etkinleştirilebilir23.

Tümör ilerlemesi sırasında EMT'nin indüksiyonu için TGF-β kaynaklı SMAD'ye bağımlı ve SMAD'den bağımsız yolların aktivasyonuna ihtiyaç vardır. EMT, tümör hücrelerinin hücre-hücre kontaktlarının kaybı ve apik-bazal polaritenin azalmasıyla ilişkili bir epitel fenotipten, gelişmiş hareketlilik ve istila yeteneğine sahip mezenkimal fenotipe adanmış geri dönüşümlü bir süreçtir24. EMT, N-cadherin, vimentin, Zeb2 ve Salyangoz1/2 dahil olmak üzere mezenkimal belirteç proteinlerinin artan ekspresyasyonu ve E-cadherin ve β-catenin (Şekil 3)25gibi epitel belirteçlerinin eşlik eden downregülasyonu ile karakterizedir. Bununla birlikte, bir epitelden mezenkimal duruma geçiş genellikle eksiktir ve hücreler karışık epitel ve mezenkimal (E/M) özellikler kazanır. Uluslararası EMT derneğinin yakın tarihli bir makalesi, ara E/M fenotipik durumlara maruz kalan hücrelerin sürecini epitel-mezenkimal plastisite (EMP)26olarak tanımlamayı önermektedir. Bu plastisite kısmi EMT, hibrit E/ M durumu, metastable EMT durumu, EMT sürekliliği ve EMT spektrumu26anlamına gelir. EMT sırasında tümör hücreleri kanser kök hücre (CSC) özellikleri kazanır ve dekupsiyon kaynaklı apoptoz27'yekarşı daha dirençli hale gelir. EMT primer tümör hücrelerinde invaziv bir fenotipin kazanılmasından sorumlu olmakla birlikte ve kanserin ilerlemesini sağlarken, buna karşılık mezenkimal-epitel geçişinin (MET) uzak metastatik bölgelerde yayılan tümör hücrelerinin büyümesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir28,29. Yeni bir çalışma, EMT türevi meme kanseri hücrelerinin adipozitlere dönüştürülebileceğini göstermiştir, bu da metastazı inhibe etme ve tümör hücrelerinde tedavi direncinin üstesinden gelme fırsatı sunabilir ve kanserin nüksetme30. Meme karsinogenezinde EMT'nin aktivasyonunda TGF-β sinyalinin önemli rolü nedeniyle, Batı şişkinliği için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, luciferaz transkripsiyonel muhabir tahlili, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ve TGF-β sinyalizasyonunun araştırılması için immünofluoresans, TGF-β kaynaklı EMT ve EMT türevi murin meme epitel tümör hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonu. Bu teknikler hücre biyolojisi alanında en sık kullanılan analitik araçlardır. qRT-PCR, mRNA ifade düzeylerini nicel bir şekilde tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılır. Alternatif bir teknik olan nicel PCR (qPCR) ile karşılaştırıldığında, mRNA ekspresyonunu yarı nicel bir şekilde belirlemek için ters transkripsiyon (RT)-PCR kullanılabilir31,32. Batı şişkinliği, belirli bir hücre lisat örneğindeki belirli protein seviyelerini duyarlılık ve özgüllük avantajlarıyla yarı nicel bir şekilde incelemek için kullanılır. Bu nedenle, diğer sinyal yollarına da uygulanabilecek TGF-β sinyallerini araştırmaya yardımcı olmak için gen ekspresyonundan protein ekspresyona kadar değişiklikleri analiz etmek için sistematik bir iş akışı sunuyoruz.

Protocol

1. Batı şişkinliği kullanılarak TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunun analizi

NOT: Premalign insan göğsü MCF10A-Ras hücreleri, TGF-β sinyal yanıtlarını araştırmak için örnek olarak kullanılmıştır33. Prensip olarak, aşağıda açıklanan yöntemler diğer TGF-β duyarlı hücre hatları için de geçerlidir.

  1. Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM)/F12'sinde %5 at serumu ile L-glutamin içeren 37 °C'de meme epitel hücre hattı MCF10A-Ras'ı kültüre edin, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 mg/mL insülin, 100 ng/mL kolera enterotoksin, 0.5 mg/mL hidrokortizon ve 1:100 penisilin-streptomisin (Pen-Strep).
  2. Trypsinize MCF10A-Ras hücreleri 1 dakika boyunca % 0.25 trypsin-EDTA'nın 1 mL'si ile ve bir hücre sayacı kullanarak uygulanabilir hücreleri sayar.
  3. Tohum hücreleri 5×10 5 hücre / kuyu yoğunluğunda 6 kuyulu plakalarhalinde.
  4. Gece büyümeden sonra, hücreleri 1 saat boyunca TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 yağ asidi içermeyen sığır serum albümini (BSA)) ile tedavi edin ve ardından kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez hafifçe yıkayın.
  5. Buz üzerinde 6 kuyulu plakalarda serin hücreler ve 150 μL önceden soğutulmuş radyo immün çökeltme testi (RIPA) liziz tamponu (150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 0.5% sodyum deoksikolat, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ve taze eklenen mini proteaz inhibitörü kokteyli). Lizinin 10 dakika boyunca buz üzerinde ilerlemesine izin verin.
  6. Yapışan hücreleri plastik bir hücre kazıyıcı kullanarak tabaktan kazıyın, ardından hücre süspansiyonunu önceden soğmuş bir mikrosantrifüj tüpüne hafifçe aktarın.
  7. Hücreyi 4 °C'de 150 santrifüj kuvvetinde(x g)10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  8. Deterjan uyumlu (DC) protein test kiti kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.
  9. Her numuneden %10 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) jeline 30 μg protein yükleyin ve jeli 1,5-2 saat boyunca 100 V voltajda çalıştırın.
  10. Proteinleri jelden 1-1,5 saat boyunca 110 V voltajda 45-μm polivinylidene difluorid (PVDF) membranına aktarın.
  11. PVDF membranını protein tarafı (jelle bakan taraf) yukarı bakacak şekilde uygun bir kaba aktarın ve zarı damıtılmış suda kısa bir süre durulayın.
  12. Suyu atın, Ponceau S çözeltisi ekleyin ve zarı 1-2 dakika sallanan bir platforma koyun.
  13. Zarı hızlı bir şekilde durulayıp 1 dakika yıkayarak damıtılmış suyla lekeden arındırın.
  14. Ardından, PVDF zarını bir ışık kutusuna koyun ve eşit toplam protein yüklemelerini kontrol etmek için bir resim çekin.
  15. Membranı Tris tamponlu salin ile Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl ve % 0.1 Tween 20) ile görünür bir leke görene kadar yıkayın.
  16. Membranı bloke tamponuna koyun (TBST çözeltisinde% 5 yağsız süt) ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  17. Membranı TBST ile iki kez yıkayın.
  18. Membranı fosfot-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, ev yapımı 34),toplam SMAD2/3 1:1000 ve gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH; 1:1000) karşı primer antikorlarla kuluçkaya bırakın, gece 4 °C'de.
  19. Membranı TBST ile iki kez yıkayın ve membranı tavşan veya fareye karşı ikincil bir antikorla (1:5000) 2 saat kuluçkaya bırakın.
  20. PVDF membranını Batı ECL substratı ile 30 saniye kuluçkaya yatırın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılayın.
  21. Biyolojik triplikat elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.

2. TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtların analizi

  1. SMAD3/SMAD4 bağımlı CAGA12-luciferaz transkripsiyon muhabir tahlilini gerçekleştirin.
    1. Adım 1'de açıklandığı gibi kültür ve trypsinize MCF10A-Ras hücreleri. Tohum hücreleri 5×10 4 hücre / kuyuda24 kuyu plakalarına koyun ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.
    2. Tohumlamadan sonraki gün, her kuyudaki hücreleri TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferaz transkripsiyonal muhabirin polietilenini (PEI) kullanarak β-galaktosidaz ekspresyon yapının35 ve 80 ng'lik yapısı ile birlikte tercüme edin. β-galaktosidaz transfeksiyon, farklı kuyular arasındaki transfeksiyon verimliliğindeki farklılıkları normalleştirmek için kullanılır. Her deney grubunu üç taraflı olarak kurun.
    3. 24 saatlik inkübasyondan sonra, serumsuz DMEM-yüksek glikozlu hücreleri aç bırakın ve 6 saat sonra, hücrelere araç kontrolü olarak TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, % 0.1 BSA) ekleyin.
    4. 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, hücreleri önceden ısıtılan PBS ile iki kez yıkayın.
    5. 120 μL/kuyu 1× lizis tamponu ekleyin ve plakayı 4 °C'de 20 dakika hafifçe sallayın.
    6. Bir luminometre kullanarak luciferaz aktivitesini ölçmek için 96 kuyulu beyaz test mikro plakasının her kuyusuna 30 μL lysate aktarın.
    7. β-galaktosidaz aktivitesini ölçmek için 96 kuyulu şeffaf bir plakanın her kuyusuna 50 μL lysate aktarın.
    8. Luciferaz aktivitesini β-galaktosidaz aktivitesine normalleştirin ve biyolojik triplikatlar elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.
  2. TGF-β hedef genlerinin ekspresyonunun nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanılarak analiz edilmektedir.
    1. Adım 1'de açıklandığı gibi kültür ve trypsinize MCF10A-Ras hücreleri. Tohum hücreleri 5×10 5 hücre / kuyuda6 kuyu plakalarına koyun ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.
    2. Hücreleri TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 BSA) ile 6 saat boyunca tedavi edin ve ardından hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
    3. Bir RNA yalıtım kiti kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
    4. Bir NanoDrop ile RNA konsantrasyonu belirleyin ve ilk iplikçik cDNA sentez Kiti kullanarak 1 μg RNA ile cDNA sentezi gerçekleştirin.
    5. GAPDH (normalleştirme için), SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlamak için) için belirli insan ileri ve ters astarları içeren 10 μL reaksiyon karışımında on kat seyreltilmiş cDNA ile nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirmek için gerçek zamanlı bir PCR algılama sistemi kullanın, TGF-β/SMAD hedef geni), SMAD7 (TGF-β/SMAD hedef geni) ve qPCR Master Mix. Her deney grubunu üç taraflı olarak kurun.
      NOT: qRT-PCR'de hedef insan genlerini tespit etmek için kullanılan astar dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.
    6. Aşağıdaki qPCR reaksiyon koşullarını kullanın: başlatma, 3 dakika boyunca 95 °C; denatürasyon, 10 saniye için 95 °C; tavlama, 30 saniye için 60 °C; ve uzatma, 10 saniye boyunca 80 °C; denatürasyon, tavlama ve uzatma 40 kez tekrarlanır.
    7. Biyolojik triplikat elde etmek için deneyleri en az üç kez tekrarlayın.

3. TGF-β kaynaklı EMT analizi

  1. Batı şişkinliğini kullanarak protein seviyesinde EMT belirteçlerinin ekspresyonunu analiz edin.
    NOT: TGF-β kaynaklı EMT analizi, örnek olarak fare NMuMG epitel hücreleri kullanılarak gösterilmiştir36,37.
    1. Kültür NMuMG hücreleri 37 °C DMEM-yüksek glikoz ortamında% 10 fetal sığır serumu ve 1:100 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Protein izolasyonu ve tespiti için Adım 1'de açıklanan yöntemleri kullanın.
      NOT: Bu deneyde aşağıdaki antikorlar kullanılmaktadır: E-cadherin, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Salyangoz, 1:1000; Sümüklüböcek, 1:1000; Tübulin, 1:1000 (Şekil 3).
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi nicel gerçek zamanlı-PCR kullanarak mRNA düzeyinde EMT işaretleyicilerinin ifadesini analiz edin.
    NOT: CDH1 (E-cadherin proteinini kodlama), SALYANGOZve ZEB2 (Şekil 3) dahil olmak üzere qRT-PCR için kullanılan tüm fare astarları Tablo 1'delistelenmiştir.
  3. Dolaylı immünofluoresans ve doğrudan floresan boyama kullanarak EMT sürecini analiz edin.
    1. E-cadherin dolaylı immünofluoresans boyama
      1. Steril 18 mm'lik kare cam kapakları 6 kuyulu plakalara yerleştirin (kuyu başına bir kapak kılıfı).
      2. Tohum 1×105 NMuMG hücreleri, 6 kuyu plakası başına 2 mL tam DMEM ile ve hücrelerin bir gecede yapışmasını sağlar.
      3. Yapışan hücrelere sahip kapakları hafifçe yeni bir 6 kuyu plakasına hareket ettirin ve kuyulara 2 mL kültür ortamı ekleyin.
      4. Hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (5 ng/mL) veya ligand tampon (4 mM HCl, %0,1 BSA) ile tedavi edin.
      5. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1 mL önceden uyarılmış PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.
      6. %4 paraformaldehitin 1 mL'sini ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırarak hücreleri sabitleyin. Ardından, hücreleri 1 mL PBS ile iki kez hafifçe yıkayın.
      7. Sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca % 0,1 Triton X-100 ile permeabilize edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
      8. PBS'de %5 BSA olan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca tıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
      9. E-cadherin'e karşı birincil antikoru (PBS'de 1:1000 seyreltilmiş) her kapak kapağının üstüne ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
      10. Birincil antikoru çıkarın ve kapak kapağını PBS ile üç kez yıkayın.
      11. Alexa Fluor 555 ikincil antikorun (PBS'de 1:500 seyreltilmiş) her kapak kapağının üstüne ekleyin ve ışıktan korunmak için alüminyum folyo ile kaplarken oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatın.
      12. İkincil antikorun çıkarılması ve kapak kapağının PBS ile üç kez yıkanması.
      13. Kapak sapını (aşağı bakan hücreler) 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile montaj ortamını kullanarak cam slaytlara monte edin ve monte edilen slaytları ışıktan korunan 4 °C'de bir kutuda saklayın.
      14. SP8 konfokal mikroskopi ile boyamayı gözlemleyin.
    2. Filamentli (F)-aktinin doğrudan floresan boyanma.
      1. 3.3.1.1 adımlarını izleyerek örnekleri hazırlayın. 3.3.1.9'a kadar.
      2. Filamentli aksini (F-actin) görselleştirmek için karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) ekleyerek hücreleri lekelayın.
      3. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
      4. DAPI ile montaj ortamını kullanarak kapak sapını cam slaytlara monte edin ve SP8 konfokal mikroskopi ile görüntü alın.

Representative Results

TGF-β sinyalinin analizi
TGF-β sinyalizasyonunun en önemli adımı, SSXS motifinde (Şekil 2) en karboksi terminal serin kalıntılarının fosforilasyonudur TβRI kinaz38,39. TGF-β sinyal yanıtlarını araştırmak için, Fosforilasyonlu SMAD2'nin Batı şişkinliğini gerçekleştirdik. Premalign insan meme MCF10A-Ras hücrelerinde, SMAD2 fosforilasyonu 1 saat boyunca TGF-β stimülasyonuna yanıt olarak önemli ölçüde artarken, total SMAD2/3 ifadesi TGF-β tedavisinden etkilenmemiştir (Şekil 4A). TGF-β kaynaklı SMAD3/4 odaklı CAGA-luc transkripsiyonal muhabir testini kullanarak, TGF-β MCF10A-Ras hücreleri hattındaki luciferaz muhabirini tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla belirgin bir şekilde indüklediğini tespit ettik (Şekil 4B). Ayrıca, SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayan) dahil olmak üzere TGF-β iyi karakterize doğrudan transkripsiyonal gen hedeflerinin TGF-β tedavi edilen MCF10A-Ras hücrelerinde yüksek oranda ifade edildiğini gözlemledik (Şekil 4C).

TGF-β kaynaklı EMT analizi
TGF-β kaynaklı EMT'yi morfolojik değişiklikler, mRNA ve protein seviyelerinde EMT belirteçlerinin ekspresyolü ve EMT belirteçlerinin immünofluoresans boyanma36gibi çeşitli yöntemlerle değerlendirdik. 1 ve 2 gün boyunca TGF-β ile tedavi edilen NMuMG epitel hücreleri, faz kontrastı mikroskopisinde gösterildiği gibi klasik bir epitel morfolojisinden iğ şeklindeki mezenkimal benzeri morfolojiye dönüşmüştir (Şekil 5A). Morfolojik değişikliklerle uyumlu olarak, TGF-β tedavisinin N-cadherin, Salyangoz ve Sümüklüböcek37 (Şekil 5B)dahil olmak üzere mezenkimal belirteçlerin protein ekspresyonunda artışa yol açtığını gözlemledik. Buna karşılık, bir epitel belirteci olan E-cadherin, 2 günlük TGF-β tedavisinden sonra NMuMG hücrelerinde küçültüldü(Şekil 5B). Ek olarak, EMT belirteçlerinin gen ekspresyonını araştırmak için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gerçekleştirdik. CDH1 (E-cadherin proteinini kodlama) önemli ölçüde azalırken, SALYANGOZ ve Çinko parmak E-kutu bağlayıcı homeobox 2 (ZEB2) gibi mezenkimal belirteçler, NMuMG hücrelerinde TGF-β stimülasyonundan sonra tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla belirgin bir şekilde artmıştır (Şekil 5C). NMuMG hücrelerinde TGF-β kaynaklı EMT, E-cadherin immünoresans lekesi ile daha da doğrulandı. 2 gün boyunca TGF-β stimülasyonu üzerine, NMuMG hücreleri konfokal mikroskopi ile analiz edildiği gibi, yerleşik olmayan kontrol grubundaki hücrelere göre daha az E-cadherin ifade etti (Şekil 5D). Ayrıca, TGF-β varlığındaki NMuMG hücreleri, konfokal mikroskopide gösterildiği gibi daha fazla aktivin stres lifi oluşturmuştur (Şekil 5E).

SB431542 ve GW788388, TGF-β sinyalini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi inhibe eder
SB431542, TβRI'nin kinaz alanının ATP rekabetçi inhibitörüdür, aynı zamanda akivin reseptör benzeri kinaz 5 (ALK5) olarak da ad altındadır, GW788388 ise TβRI ve TβRII kinaz aktivitesini inhibe eder. Her iki inhibitör de TGF-β reseptör sinyaliniengelleyebilir 40. Böylece farklı konsantrasyonlarda GW788388 olan NMuMG hücrelerini 1 saat boyunca TGF-β varlığında tedavi ettik. Beklendiği gibi GW788388, TGF-β kaynaklı SMAD2 fosforilasyonunu doza bağlı bir şekilde inhibe etti (Şekil 6A). Ek olarak, SMAD2'nin TGF-β aracılı fosforilasyonu SB431542 tedavisi ile engellendi (Şekil 6A). Fosforillenmiş SMAD2/3, SMAD4 ile heteromerik bir kompleks oluşturur ve hedef genlerin transkripsiyonunu modüle etmek için çekirdeğe yer değiştirir. Bu nedenle NMuMG hücrelerinde SMAD2/3'ün SMAD2/3'ün immünofluoresans lekesi ile translokasyonunun araştırılmasını yaptık. Veriler, hem SB431542 hem de GW788388'in TGF-β kaynaklı nükleer translokasyonu ve NMuMG hücrelerinde SMAD2/3 birikimini önemli ölçüde engellediğini göstermiştir (Şekil 6B). Ayrıca, SB431542 ve GW788388'in inhibitör etkileri, PAI-1, SALYANGOZ, E-cadherin ve Fibronektin dahil olmak üzere EMT'de yer alan önemli TGF-β hedef genlerinin mRNA ekspresyon düzeylerinde de gözlenmiştir (Şekil 6C). Bu veriler, SB431542 ve GW788388'in TGF-β sinyalini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi engellediğini öne sürdü.

Mezenkimal meme kanseri hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunun analizi
EMT, kanserlerde hücresel plastisitenin arttırıcılığında hayati bir rol oynar ve tedavi direncinin gelişmesine neden olur. Kanser hücresi plastisitesi, zorla adipogenez30gibi bir trans-farklılaşma yaklaşımı ile doğrudan hedeflenebilir ve inhibe edilebilir. Emt kaynaklı kanser hücresi plastisitesinin hücresel modeli olarak fare meme tümörü virüs-polioma orta tümör-antijen (MMTV-PyMT) transgenik farenin meme bezinden elde edilen Py2T murine meme kanseri hücrelerini kullandık. Yerleşik bir protokole dayanarak41,emt türevi Py2T murine meme kanseri hücrelerini anti-diyabetik ilaç rosiglitazone ile 10 gün boyunca adipogenez indükledik. Adipogenez, yağ kırmızısı O lekeleme kullanılarak lipit damlacıkları görselleştirilerek değerlendirildi. Rosiglitazone ile tedavi edilen Py2T murine meme kanseri hücrelerinde yağ hücreleri kolayca tespit edildi (Şekil 7), rosiglitazone ile tedavinin tek başına EMT türevi meme kanseri hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir.

Figure 1
Şekil 1: TGF-β/SMAD sinyali. TGF-β sinyalizasyon, TGF-β TGF-β tip I reseptörü (TβRI) fosforilasyon gösteren, kesin olarak aktif bir kinaz olan TGF-β tip II reseptörüne (TβRII) bağlanmasıyla başlatılır. Daha sonra, aktif TβRI kinaz fosforilitleri SMAD2/3. Fosfor-SMAD2 'yi (p-SMAD2) tanıyan poliklonal antisera elde etmek için iki karboksi terminal fosforilasyonlu serin kalıntısı ile SMAD2'nin SSXS motifini içeren bir peptit kullanıldı. Bu nedenle, p-SMAD2 ekspresyonunun Batı blottingi ile analizi, TGF-β sinyal yolunun aktivasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Fosforillenmiş SMAD2/3, SMAD4 ile heteromerik kompleksler oluşturabilir ve daha sonra transkripsiyonal yanıtları modüle etmek için çekirdeğe yer değiştirebilir. SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayan) gibi TGF-β hedef genlerinin mRNA ekspresyonu için CAGA12-luciferase muhabir tahlili ve nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR), TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtları analiz etmek için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: R-SMAD'lerin şematik yapısı (SMAD2 ve SMAD3). MH1 (mavi) ve MH2 (sarı) etki alanları R-SMAD'ler arasında korunur, ancak bağlayıcı bölge (gri) korunmuyor. SMAD3'ün MH1 etki alanı DNA bağlayıcı bir motif barındırırken, SMAD2, MH1 etki alanına bir ekleme (exon 3) nedeniyle DNA'yı doğrudan bağlayamaz. MH2 alan adı SMAD oligomerizasyonuna, TGF-β reseptörleriyle etkileşime ve protein bağlanmasına aracılık eder ve transkripsiyonal düzenlemede yer almaktadır. SMAD2 ve SMAD3, C terminilerinde SSXS motifinin (kırmızı) fosforilasyonu ile aktive edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: TGF-β kaynaklı EMT. TGF-β kaynaklı epitel-mezenkimal geçiş (EMT) sırasında hücreler epitel kaybına uğrar ve gelişmiş hücre hareketliliği ve invazyon yeteneği ile mezenkimal özelliklerin kazanılmasına maruz kaldı. EMT indüksiyonu, N-cadherin, Zeb2 ve Salyangoz1/2 gibi mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunun yanı sıra E-cadherin, β-catenin ve claudin-1 gibi epitel belirteçlerinin küçültülmesine yol açar. Epitel/mezenkimal (E/M) özelliklerinin birikmiş kaybı veya kazancı, bir hücrenin geri dönüşümlü olarak ara durumlara girmesine neden olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: MCF10A-Ras hücrelerinde TGF-β sinyal yanıtları. (A) MCF10A-Ras hücreleri 1 saat boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) ile veya olmadan tedavi edildi ve fosforillenmiş SMAD2 (p-SMAD2), total SMAD2/3 ve GAPDH (yükleme kontrolü olarak) için hücre lysatları immünblott edildi. Boyut işaretçisi sağda gösterilir. Con: TGF-β tedavisi olmayan kontrol grubu. (B) MCF10A-Ras hücrelerinde SMAD3-SMAD4 bağımlı CAGA 12 -luciferaz (LUC) transkripsiyonal muhabiri kullanılarak TGF-β(5ng/mL) aktivitesinin analizi. Değerler β-galaktosidaz (βGal) aktivitesine normalleştirilir. Veriler ortalama ± s.d, n = 3 olarak ifade edilir. Öğrencinin t testi, ***P ≤ 0.001 (C) QRT-PCR analizi TGF-β hedef genleri SMAD7 ve SERPINE1 (PAI-1 proteinini kodlayarak) MCF10A-Ras hücrelerinde TGF-β (2.5 ng/mL) ile 6 saat boyunca tedavi edilir. GAPDH bir iç kontrol olarak kullanıldı. Veriler ortalama ± s.d, n = 3 olarak ifade edilir. Öğrenci sınavı, ***P ≤ 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: NMuMG hücrelerinde TGF-β kaynaklı EMT. (A) 1 veya 2 gün boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) ile tedavi edilen NMuMG hücrelerinin morfolojisi. TGF-β varlığında, NMuMG hücreleri mezenkimal fenotipe dönüştü. Ölçek çubuğu = 150 μm (B) NMuMG hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (5 ng/mL) ile veya olmadan tedavi edildi ve EMT belirteçleri Batı şişkinliği ile analiz edildi. Boyut işaretçisi sağda belirtildiği gibidir. Con: TGF-β tedavisi olmayan kontrol grubu. (C) TGF-β (5 ng/mL) ile 2 gün boyunca tedavi edilen NMuMG hücrelerinde EMT belirteçlerinin(CDH1 (E-cadherin proteinini kodlayan), SALYANGOZ ve ZEB2) gen ekspresyon analizi. GAPDH bir iç kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar ortalama ± s.d., n = 3 olarak ifade edilir. Öğrenci t-testi, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. (D) NMuMG hücreleri 2 gün boyunca TGF-β (2.5 ng/mL) tedavisinden sonra epitel belirteci E-cadherin (kırmızı) ekspresyonunun saptanmasını sağlamak için immünoresans ile lekelendi. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı konuldu. Görüntüler konfokal mikroskopi ile çekildi. Ölçek çubuğu = 50 μm (E) NMuMG hücreleri F-aksini görselleştirmek için floresan-phalloidin (yeşil) ile boyandı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile karşı konuldu. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: TGF-βsignaling ve TGF-β kaynaklı EMT, SB431542 ve GW788388 tarafından inhibe edildi. (A) NMuMG hücreleri, 1 saat boyunca TGF-β (5 ng/mL) varlığında veya yokluğunda 10 μM SB431542 (SB) veya belirtilen GW788388 (GW) konsantrasyonları ile tedavi edildi. Hücre lysatları p-SMAD2, SMAD2/3 ve GAPDH için immünblott edildi. (B) NMuMG hücreleri, 1 saat boyunca 5 ng/mL TGF-β varlığında veya yokluğunda 5 μM SB431542 (SB) veya 10 μM GW788388 (GW) ile tedavi edildi ve SMAD2/3'ün (yeşil) nükleer translokasyonunun tespiti için immünoresans ile lekelendi. Görüntüler konfokal mikroskopi ile çekildi. (C) PAI-1 ve SALYANGOZ, E-Cadherin ve Fibronektin dahil olmak üzere EMT belirteçlerini kodlayan genler de dahil olmak üzere TGF-β hedef genlerinin ekspresyasyonu, SB veya GW tedavisinden sonra NMuMG hücrelerinde ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve TGF-β stimülasyonu ile 48 saat boyunca analiz edildi. GAPDH bir yükleme kontrolü olarak hizmet etti. Denetim, tedavi edilmeyen hücreleri gösterir. Bu rakam Petersen M. ve ark. Yayıncıdan izin aylak 34. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: EMT türevi Py2T murine meme kanseri hücreleri adipositlere farklılaşmak için indüklenebilir. Py2T murine meme kanseri hücreleri 2 ng/mL TGF-β ile 20 gün boyunca komple EMT'ye indüklendi. Daha sonra, hücreler mezenkimal kanser hücrelerinin farklılaşmasına izin vermek ve adipogenez indük etmek için 10 gün boyunca bir araç kontrolü veya rosiglitazone (2 μM) olarak DMSO ile tedavi edildi. Ortam her 2 günde bir değiştirildi. 10 günlük tedaviden sonra, hücreler yağ kırmızısı O ile boyandı.

Tür Gen adı İleri (5' ila 3') Ters Çevir (5' ila 3')
Insan GAPDH TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG
SMAD7 TCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG
SERPINE1 CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC
Fare GAPDH TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG
CDH1 ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG
Salyangoz CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT GCGAGGGCCTCCGGAGCA
ZEB2 TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCATCATCAT

Tablo 1: qRT-PCR için kullanılan astarlar.

Discussion

TGF-β/SMAD sinyalizasyonu meme kanserinin ilerlemesinde önemli bir rol oynar, çünkü EMT7'yiindükleerek meme kanseri hücre invazivliğini ve metastazını teşvik edebilir. Burada, reseptör kaynaklı SMAD aktivasyonundan SMAD aracılı transkripsiyonal ve biyolojik yanıtlara kadar TGF-β başlatılan sinyali araştırmak için mantıklı bir iş akışı tanımladık. SMAD2 fosforilasyon analizini tanımlayarak başladık, TGF-β/SMAD sinyal yanıtını analiz etmek için hem gen hem de protein seviyelerinde TGF-β kaynaklı SMAD3 bağımlı transkripsiyonal yanıtlar ve EMT işaretleyici ekspresyonu ile devam ettik ve son olarak TGF-β kaynaklı EMT'yi inceledik. TGF-β/SMAD sinyal yolu35'inaktivitesini izlemek için PAI-1 promotöründen türetilen CAGA kutularını içeren CAGA 12 -luciferase transkripsiyon muhabirini kullandık. Bu muhabir yapısı etkinleştirme için SMAD3 ve SMAD4 gerektirir. Önceki çalışmalar, SMAD4'ün devrilmesinin TGF-β kaynaklı CAGA12-luciferaz aktivitesini zayıfladığını göstermiştir37. Muhabir testine ek olarak, SMAD2 ve SMAD3 de dahil olmak üzere endojen SMAD'lerin fosforilasyon durumunu belirlemek, TGF-β sinyal yanıtını araştırmanın bir başka yoludur. Gerçekten de, büyüme ve farklılaşma faktörü (GDF)-8/myostatin ve GDF-9 gibi TGF-β ailesinin diğer üyeleri de TβRI 42,43,44'ü devreye alarak SMAD2/3 proteinleri aracılığıyla sinyalleriaktarır. CAGA12-luciferase muhabirine ek olarak, TGF-β sinyalinin aktivasyonunu tespit etmek için benzer birkaç muhabir kullanılmıştır. Örneğin, JunB promotöründen türetilen yanıt öğelerine sahip transkripsiyonal (SBE)4-Lux muhabiri, TGF-β, aktivatörler ve BMP'ler45tarafından verimli bir şekilde indüklenebilir.

Epitel belirteçlerinin (yani E-cadherin) ve mezenkimal belirteçlerin (örneğin, N-cadherin, Salyangoz, Sümüklüböcek ve Zeb2) ekspresyonunu araştırmak için klasik yöntemler olan TGF-β kaynaklı EMT'yi analiz etmek için Batı şişkinliği ve qPCR kullanılmıştır. Ayrıca E-cadherin dolaylı immünofluoresans boyama ve F-actin doğrudan floresan boyama gerçekleştirdik. Bu tahliller TGF-β tedavisinden sonra hücrelerin mezenkimal fenotipini daha da doğrulamıştır. İmmünofluoresans lekelemenin sınırlaması, hücrelerin antikorlar ve görüntüleme ile inkübasyondan önce düzeltilmesi gerektiğidir ve canlı hücrelerde EMT belirteç ifadesindeki değişiklikleri araştırmak zordur. Son zamanlarda, A549 akciğer adenokarsinom-vimentin-RFP gibi EMT muhabir hücre hatlarının tasarımı, kırmızı floresan protein (RFP) etiketli vimentin ifadesiyle epitel hücrelerinin mezenkimal hücrelere dönüşümünü gerçek zamanlı olarak izlemeyi mümkün klas hale getirmiştir. Bu platform ilaç taraması ve yeni ilaç geliştirme için kullanılabilir46. Canlı hücrelerde F-actin yapılarını lekeleyebilen 17 amino asitli bir peptit olan LifeAct boyası, hücresel işlemlere müdahale etmeden aktin sitoskeleton'u gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için değerli bir araç haline geliyor47. Bu çalışmada, TGF-β sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı EMT üzerindeki inhibitör etkilerini doğrulamak için SB431542 ve GW788388 olmak üzere iki küçük molekül inhibitörü kullandık. Özellikle GW788388, TβRI ve TβRII aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe ederken, SB431542 sadece TβRI (ve ALK4 ve ALK7) üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir. Önceki çalışmalar GW788388'in SB43154240'tandaha güçlü olduğunu ortaya koydu. EMT inhibisyona ek olarak, GW788388 böbrekte fibrozis belirteçlerinin ekspresyonunu azalttı ve diyabetik farelerde GW788388'in oral olarak verilmesi glomerülopatiyi belirgin şekilde azalttı25,48.

EMT, kanser hücre plastisitesini teşvik etmede önemli bir rol oynar ve ilaç direnci ve metastaz ile sonuçlanır 49. Bu nedenle, EMT türevi hücrelerin spesifik sitotoksik ilaçlar50 ile hedeflenmesi veya mezenkimal-epitel geçişi (MET)51 yoluyla redifferentiation indüklenmesi kanser hücre metastazı ve tedavi direncinin üstesinden gelmek için bir yaklaşım olarak önerilmiştir. Bununla birlikte, MET uzak organlarda yayılan kanser hücrelerinin çoğalmasına katkıda bulunur52EMT'nin terapötik geri dönüşümlerini kullanırken ters tepebilir. Son zamanlarda, yeni bir çalışma emt türevli meme kanseri hücrelerini doğrudan adipositlere farklılaşmak için hedef alarak terapötik bir transdifferentiation yaklaşımı bildirdi30. Ishay-Ronen et tarafından yapılan çalışma. al.30, TGF-β ile uzun süreli tedaviye yanıt olarak mezenkimal hücrelere geçiş geçiren Py2T murine epitel kanser hücrelerini kullandı. Rosiglitazone'un MEK inhibitörleri ile birlikte epitel farklılaşması ve adipogenezini geliştirdiğini gösterdiler. Bununla birlikte, rosiglitazone'un tek başına mezenkimal Py2T murine hücrelerinin adipositlere transdifferentiasyonunu teşvik etmek için yeterli olduğunu bulduk.

Özetle, bu çalışmada kullanılan yöntemler TGF-β sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için mantıklı bir iş akışı sağlamıştır. İki inhibitör, SB431542 ve GW788388, TGF-β kaynaklı yanıtları ve EMT'yi engelleyebilir. Ek olarak, rosiglitazone'un tek başına bazı TGF-β kaynaklı mezenkimal meme kanseri hücrelerinde adipogenez indüklese neden olduğunu da gösterdik. TGF-β yanıtlarını araştırmak için sadece birkaç meme kanseri hücre hattı kullanmamıza rağmen, burada açıklanan yöntemler diğer (kanser) hücrelere tahmin edilebilir. Burada, hücresel yanıtları teşvik etmek için çeşitli TGF-β konsantrasyonları kullandık. Çoğu hücre tipinde, TGF-β biyolojik aktivitesini 0.01-10 ng/mL53 konsantrasyon aralığında uygular ve bir doz-yanıt deseninde sinyalizasyona neden olur. Sığır aort endotel hücreleri de dahil olmak üzere birincil endotel hücrelerinde, TGF-β fosforillenmiş SMAD2'nin önemli ekspresyonunun 0.025 ng/mL'de indüklendiğini, maksimum 0.25 ng/mL'ye ulaştığını ve daha yüksek konsantrasyonlara yanıt olarak bu seviyede kaldığını53. Çalışmamızda, güçlü yanıtlar elde etmek için transkripsiyonal muhabir tahlili için MCF10A-Ras hücrelerinde yüksek konsantrasyonda TGF-β (5 ng/mL) kullandık. SMAD2 fosforilasyon ve hedef gen ekspresyasyonu TGF-β tarafından düşük dozda indüklenebilir; böylece hücreleri tedavi etmek için 2,5 ng/mL TGF-β kullandık. Bununla birlikte, en uygun çalışma konsantrasyonu hücre tipine ve tahmini etkilere bağlıdır. TGF-β en iyi konsantrasyonunu belirlemek için, hücrelerin farklı dozlarda (düşükten yükseğe) tedavi etmesi önerilir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Çin Burs Konseyi'nin (CSC) J.Z. ve Kanser Genomik Merkezi Hollanda'ya (CGC) desteğini kabul ediyoruz. NL) P.t.D.'ye.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
18 mm-side square glass coverslips Menzel Gläser 631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21422
Anti-E-cadherin antibody BD Biosciences 610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody Merck Millipore MAB374
Anti-N-cadherin antibody BD Biosciences 610920
Anti-Slug antibody Cell Signaling Technology 9585
anti-SMAD2/3 antibody Becton Dickinson 610842
Anti-Snail antibody Cell Signaling Technology 3879
Anti-Tubulin antibody Cell Signaling Technology 2148
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
Cholera enterotoxin Sigma-Aldrich C8052
Clarity Western ECL Substrate Bio-Rad 1705060
DC protein assay kit Bio-Rad 5000111
DMEM-high glucose Thermo Fisher Scientific 11965092
DMEM-high glucose medium Thermo Fisher Scientific 11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 Thermo Fisher Scientific 11039047
epidermal growth factor (EGF) Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum (FBS) BioWest S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix PROMEGA A600X
Horse serum Thermo Fisher Scientific 26050088
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
NucleoSpin RNA II kit BIOKE´ 740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) Thermo Fisher Scientific 15140148
Polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane Merck Millipore IPVH00010
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific K1621
Rosiglitazone Sigma-Aldrich 557366-M
Skimmed milk Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001402
CFX Connect Detection System Bio-Rad 1855201
Luminometer Perkin Elmer 2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β Signaling. Biomolecules. 10 (3), (2020).
  2. Hao, Y., Baker, D., Ten Dijke, P. TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Cancer Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), (2019).
  3. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono, K. TGF-β and the TGF-β Family: Context-Dependent Roles in Cell and Tissue Physiology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (5), (2016).
  4. Derynck, R., Akhurst, R. J. Differentiation plasticity regulated by TGF-β family proteins in development and disease. Nature Cell Biology. 9 (9), 1000-1004 (2007).
  5. Massague, J. How cells read TGF-β signals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (3), 169-178 (2000).
  6. Seoane, J., Gomis, R. R. TGF-β Family Signaling in Tumor Suppression and Cancer Progression. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (12), (2017).
  7. Colak, S., Ten Dijke, P. Targeting TGF-β Signaling in Cancer. Trends in Cancer. 3 (1), 56-71 (2017).
  8. Suriyamurthy, S., Baker, D., ten Dijke, P., Iyengar, P. V. Epigenetic Reprogramming of TGF-β Signaling in Breast Cancer. Cancers (Basel). 11 (5), (2019).
  9. Drabsch, Y., Ten Dijke, P. TGF-β signalling and its role in cancer progression and metastasis). Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3-4), 553-568 (2012).
  10. Goumans, M. J., Ten Dijke, P. TGF-β Signaling in Control of Cardiovascular Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), (2018).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-β and TGF-β-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), (2016).
  12. Robertson, I. B., et al. Latent TGF-β-binding proteins. Matrix Biology. 47, 44-53 (2015).
  13. Khan, Z., Marshall, J. F. The role of integrins in TGF-β activation in the tumour stroma. Cell and Tissue Research. 365 (3), 657-673 (2016).
  14. Jenkins, G. The role of proteases in transforming growth factor-β activation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1068-1078 (2008).
  15. Tran, D. Q., et al. GARP (LRRC32) is essential for the surface expression of latent TGF-β on platelets and activated FOXP3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13445-13450 (2009).
  16. Stockis, J., Colau, D., Coulie, P. G., Lucas, S. Membrane protein GARP is a receptor for latent TGF-β on the surface of activated human Treg. European Journal of Immunology. 39 (12), 3315-3322 (2009).
  17. Wang, R., et al. GARP regulates the bioavailability and activation of TGF-β. Molecular Biology of the Cell. 23 (6), 1129-1139 (2012).
  18. Vander Ark, A., Cao, J., Li, X. TGF-β receptors: In and beyond TGF-β signaling. Cellular Signalling. 52, 112-120 (2018).
  19. Heldin, C. H., Miyazono, K., ten Dijke, P. TGF-β signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 390 (6659), 465-471 (1997).
  20. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signalling. Trends in Biochemical Sciences. 29 (5), 265-273 (2004).
  21. Miyazono, K. TGF-β signaling by Smad proteins. Cytokine & Growth Factor Reviews. 11 (1-2), 15-22 (2000).
  22. Yu, Y., Feng, X. H. TGF-β signaling in cell fate control and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 61, 56-63 (2019).
  23. Zhang, Y. E. Non-Smad pathways in TGF-β signaling. Cell Research. 19 (1), 128-139 (2009).
  24. Katsuno, Y., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression. Current Opinion in Oncology. 25 (1), 76-84 (2013).
  25. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (3), 178-196 (2014).
  26. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 341-352 (2020).
  27. Zhang, Y., Weinberg, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer: complexity and opportunities. Frontiers in Medicine. 12 (4), 361-373 (2018).
  28. Brabletz, T., Kalluri, R., Nieto, M. A., Weinberg, R. A. EMT in cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (2), 128-134 (2018).
  29. Ocana, O. H., et al. Metastatic colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 22 (6), 709-724 (2012).
  30. Ishay-Ronen, D., et al. Gain Fat-Lose Metastasis: Converting Invasive Breast Cancer Cells into Adipocytes Inhibits Cancer Metastasis. Cancer Cell. 35 (1), 17-32 (2019).
  31. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology. 67 (1), 6-20 (2009).
  32. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  33. Sundqvist, A., et al. JUNB governs a feed-forward network of TGF-β signaling that aggravates breast cancer invasion. Nucleic Acids Research. 46 (3), 1180-1195 (2018).
  34. Persson, U., et al. The L45 loop in type I receptors for TGF-β family members is a critical determinant in specifying Smad isoform activation. FEBS Letters. 434 (1-2), 83-87 (1998).
  35. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF-β-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. The EMBO Journal. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  36. Piek, E., Moustakas, A., Kurisaki, A., Heldin, C. H., ten Dijke, P. TGF-β type I receptor/ALK-5 and Smad proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells. Journal of Cell Science. 112, Pt 24 4557-4568 (1999).
  37. Deckers, M., et al. The tumor suppressor Smad4 is required for transforming growth factor-β-induced epithelial to mesenchymal transition and bone metastasis of breast cancer cells. Cancer Research. 66 (4), 2202-2209 (2006).
  38. Souchelnytskyi, S., et al. Phosphorylation of Ser465 and Ser467 in the C terminus of Smad2 mediates interaction with Smad4 and is required for transforming growth factor-β signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 28107-28115 (1997).
  39. Abdollah, S., et al. TβRI phosphorylation of Smad2 on Ser465 and Ser467 is required for Smad2-Smad4 complex formation and signaling. Journal of Biological Chemistry. 272 (44), 27678-27685 (1997).
  40. Petersen, M., et al. Oral administration of GW788388, an inhibitor of TGF-β type I and II receptor kinases, decreases renal fibrosis. Kidney International. 73 (6), 705-715 (2008).
  41. Gubelmann, C., et al. Identification of the transcription factor ZEB1 as a central component of the adipogenic gene regulatory network. Elife. 3, 03346 (2014).
  42. Nickel, J., Ten Dijke, P., Mueller, T. D. TGF-β family co-receptor function and signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 50 (1), 12-36 (2018).
  43. Mazerbourg, S., et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. Molecular Endocrinology. 18 (3), 653-665 (2004).
  44. Rebbapragada, A., Benchabane, H., Wrana, J. L., Celeste, A. J., Attisano, L. Myostatin signals through a transforming growth factor-β-like signaling pathway to block adipogenesis. Molecular and Cellular Biology. 23 (20), 7230-7242 (2003).
  45. Jonk, L. J., Itoh, S., Heldin, C. H., ten Dijke, P., Kruijer, W. Identification and functional characterization of a Smad binding element (SBE) in the JunB promoter that acts as a transforming growth factor-β, activin, and bone morphogenetic protein-inducible enhancer. Journal of Biological Chemistry. 273 (33), 21145-21152 (1998).
  46. Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
  47. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  48. Gellibert, F., et al. Discovery of 4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H- pyran-4-yl)benzamide (GW788388): a potent, selective, and orally active transforming growth factor-β type I receptor inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (7), 2210-2221 (2006).
  49. Ishay-Ronen, D., Christofori, G. Targeting Cancer Cell Metastasis by Converting Cancer Cells into Fat. Cancer Research. 79 (21), 5471-5475 (2019).
  50. Gupta, P. B., et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138 (4), 645-659 (2009).
  51. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), (2016).
  52. Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Research. 72 (6), 1384-1394 (2012).
  53. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-β type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).

Tags

Kanser Araştırması Sayı 164 büyüme faktörü-β dönüştürme epitelden mezenkimal geçiş meme kanseri Batı şişkinliği transkripsiyonel muhabir immünofluoresans inhibitörler adipogenez

Erratum

Formal Correction: Erratum: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells
Posted by JoVE Editors on 12/15/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. NMuMG was mislabeled as cancer cells.

NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-β in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Thorikay, M., van der… More

Zhang, J., Thorikay, M., van der Zon, G., van Dinther, M., ten Dijke, P. Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. J. Vis. Exp. (164), e61830, doi:10.3791/61830 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter