Summary
Denne protokollen skisserer metoder bak Ramsay-analysen, ion-selektive mikroelektroder, skanning av ion-selektiv elektrodeteknikk (SIET) og in vitro-sammentrekningsanalyser, anvendt for å studere det voksne myggutskillelsessystemet, som består av malpighiske tubuli og bakgut, for kollektivt å måle ion- og væskesekresjonshastigheter, kontraktil aktivitet og transepithelial iontransport.
Abstract
Studier av insektfysiologi, spesielt i de artene som er vektorer av patogener som forårsaker sykdom hos mennesker og andre vertebrater, gir grunnlaget for å utvikle nye strategier for skadedyrsbekjempelse. Her beskrives en rekke metoder som rutinemessig brukes til å bestemme de funksjonelle rollene til nevropeptider og andre nevronfaktorer (dvs. biogene aminer) på myggens ekskresjonssystem, Aedes aegypti. De malpighiske tubuliene (MTs), som er ansvarlige for primær urindannelse, kan fortsette å fungere i flere timer når de fjernes fra mygga, noe som gir mulighet for væskesekresjonsmålinger etter hormonbehandlinger. Som sådan er Ramsay-analysen en nyttig teknikk for å måle sekresjonshastigheter fra isolerte MTs. Ion-selektive mikroelektroder (ISME) kan sekvensielt brukes til å måle ionkonsentrasjoner (dvs. Na + og K +) i utskilt væske. Denne analysen gjør det mulig å måle flere MT-er på et gitt tidspunkt, og bestemme effekten av ulike hormoner og stoffer. Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk bruker ISME til å måle spenningsrepresentant for ionisk aktivitet i det uprøvde laget ved siden av overflaten av iontransporterende organer for å bestemme transepithelial transport av ioner i nær sanntid. Denne metoden kan brukes til å forstå rollen som hormoner og andre regulatorer på ionabsorpsjon eller sekresjon på tvers av epithelia. Hindgut-sammentrekningsanalyser er også et nyttig verktøy for å karakterisere myoaktive nevropeptider, som kan forbedre eller redusere dette organets evne til å fjerne overflødig væske og avfall. Samlet gir disse metodene innsikt i hvordan ekskresjonssystemet reguleres i voksne mygg. Dette er viktig fordi funksjonell koordinering av ekskresjonsorganene er avgjørende for å overvinne utfordringer som uttørkingsstress etter eklosjon og før du finner en passende vertebratvert for å få et blodmel.
Introduction
Vedlikehold av salt- og vannnivåer i insekter gjør at de kan lykkes i mange økologiske og miljømessige nisjer, ved hjelp av en rekke fôringsstrategier1. De fleste insekter har utviklet mekanismer for å regulere sammensetningen av hemolymfen innenfor smale grenser for å motstå de forskjellige utfordringene knyttet til deres spesielle miljø2. Terrestriske insekter står ofte overfor utfordringen med å bevare vann, og ekskresjonssystemet gjennomgår anti-diurese for å forhindre tap av vann og noen essensielle salter, og unngår derfor uttørking. I motsetning oppstår diurese når insektet strømmer og utfordres med overflødig vann og potensielt salter3,4. Gjennom sitt spesialiserte og svært aktive ekskresjonssystem har insekter utviklet regulatoriske mekanismer som virker for å motvirke deres osmoregulatoriske utfordringer. Hos voksne Aedes aegypti mygg består ekskresjonssystemet av malpighiske tubuli (MTs) og bakgut, hvorav sistnevnte består av det fremre ileum og bakre endetarm5. MTs er ansvarlige for å generere primær urin, vanligvis rik på NaCl og / eller KCl. Den primære urinen endres deretter gjennom sekretoriske og reabsorptive prosesser når den beveger seg nedstrøms tubule og går inn i hindgut5. Den endelige ekskretaen kan være hyper- eller hypoosmotisk til hemolymfen, avhengig av fôrings-/miljøforhold, og er beriket i giftig og nitrogenholdig avfall2.
MT-er er ideelle for å studere mange egenskaper ved epitelvæske og løsemiddeltransport da de utfører et stort utvalg av transport- og ekskresjonsfunksjoner2,6. Gjennom hormonell regulering2 fungerer MTs ved å utskille ioner og andre solutes fra blodet inn i tubule lumen7, noe som gir en osmotisk gradient som gjør at vann kan transporteres av aquaporins8,9, som samlet skaper primær urin, før du reiser mot reabsorptive hindgut2. Dermed, ved å samle utskilt væske fra isolerte MTs, kan man kontinuerlig overvåke transepithelial transport av væske og ioner. Måling av sekresjonshastighet og urinsammensetning gir innsikt i mekanismer som er ansvarlige for transepithelial ion og væsketransport. En populær metode for å studere væskesekresjonsrater er Ramsay-analysen, som først ble introdusert av Ramsay i 195310. I denne metoden behandles den distale (lukkede) enden av tubule med et hormon (eller annen testforbindelse / stoff), mens den proksimale (åpne) enden er pakket rundt en pinne i vannmettet parafinolje, som skiller ut den primære urinen, akkumuleres som en dråpe på spissen av pinnen. Isolerte MT-er er i stand til å overleve og fungere i lange perioder (opptil 24 timer) under optimaliserte in vitro-forhold, noe som gjør dem egnet og effektive modeller for væskesekresjonsmåling. Insekter har åpne sirkulasjonssystemer, slik at MT-ene lett dissekeres og fjernes, da de vanligvis flyter fritt i hemolymfen6. I tillegg, med unntak av bladlus - som mangler MTs11 - kan antall MT-er i en gitt insektart variere betydelig fra fire til hundrevis (fem i Aedes mygg) som tillater flere målinger fra ett insekt.
MTs i Aedes mygg, til felles med andre endopterygote insekter, består av to celletyper som danner et enkelt epitel2,12; store hovedceller, som letter aktiv transport av kasjoner (dvs. Na + og K +) inn i lumen, og tynne stellate celler, som hjelper i transepithelial Cl- sekresjon13. MT-ene er ikke innervated2, og er i stedet regulert av flere hormoner, inkludert både vanndrivende og anti-vanndrivende faktorer, noe som muliggjør kontroll av iontransport (hovedsakelig Na +, K + og Cl-) og osmotisk forpliktet vann2. Tallrike studier har undersøkt hormonell regulering av Aedes MTs for å forstå rollen som endokrine faktorer på transepithelial transport14,15,16,17,18. Som vist i de representative resultatene, viser protokollene heri effekten av forskjellige hormonelle faktorer på isolerte MTs fra voksne kvinnelige A. aegypti mygg, inkludert både vanndrivende og anti-vanndrivende kontroll (figur 1). Ramsay-analysen brukes til å demonstrere hvordan et anti-vanndrivende hormon, AedaeCAPA-1, hemmer væskesekresjon av MTs stimulert av vanndrivende hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre størrelsen på insekter har krevd utvikling av mikrometoder for måling av ionisk aktivitet og konsentrasjoner i væskeprøver, eller nær overflaten av isolerte vev som MTs og tarm. Ulike metoder er implementert, inkludert bruk av radioisotoper av ioner19, som krever innsamling av utskilte væskedråper for måling av ionkonsentrasjoner20. Stimulerte Aedes tubules in vitro skiller vanligvis ut ~ 0,5 nL / min21, og dermed kan håndtering av slike små volumer utgjøre en utfordring og potensielt introdusere feil ved overføring. Som et resultat har ion-selektive mikroelektroder (ISMEs) blitt mye brukt til å måle ionkonsentrasjoner i utskilte dråper MTs in vitro. I denne metoden er en referanseelektrode og ISME, fylt med riktig etterfyllingsløsning og ionofor, plassert i den utskilte urindråpen for å bestemme ionkonsentrasjoner22. Tilpasset fra Donini og kolleger23, bruker denne nåværende protokollen en Na + selektiv ionofor for å måle ionaktivitet i utskilte dråper fra stimulerte MT-er i voksne Aedes mygg. Siden ion-selektive mikroelektroder måler ionaktivitet, kan disse dataene uttrykkes som ionkonsentrasjoner etter antagelsen om at kalibreringsløsningene og eksperimentelle prøver deler samme ionaktivitetskoeffisient21 (figur 1B, C).
Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk (SIET) bruker også ISME-er til å måle ionkonsentrasjonsgradienter i det uprøvde laget ved siden av organer, vev eller celler som transporterer ioner. ISME-ene måler spenningsgradienter som deretter kan brukes til å beregne ionkonsentrasjonsgradientene og retningen og størrelsen på ionfluksen over orgelet, vevet eller celle20. I denne teknikken er ISME montert på en tre akser manipulator styrt av datastyrte mikro-stepper motorer slik at 3D-posisjonen styres til mikrometernivået20. Spenninger måles på to punkter i det ustigede laget ved hjelp av en prøvetakingsprotokoll programmert inn i og kontrollert av dataprogramvare. De to punktene er vanligvis adskilt med en avstand på 20-100 μm med ett punkt innenfor 5-10 μm av overflaten av organet, vevet eller cellen og det andre punktet ytterligere 20-100 μm unna. Forskjellen i spenningsstørrelse mellom de to punktene beregnes for å oppnå en spenningsgradient24,25,26, som deretter brukes til å beregne konsentrasjonsgradienten og deretter nettostrømmen ved hjelp av Ficks Law24,27. Denne metoden er nyttig for å vurdere transport av spesifikke ioner på tvers av forskjellige regioner i insekts tarmen og MTs, eller på bestemte tidspunkter etter en blodmel eller behandlingseksponering. For eksempel kan SIET brukes til å forstå hvordan absorptive og sekretoriske prosesser i myggutskillelsessystemet reguleres av hormoner28 samt forskjellige fôringsatferd og oppdrettsforhold25. Tidligere arbeid ved hjelp av SIET avslørte steder som er involvert i iontransport langs anal papill og endetarm av larval og voksne mygg24,28. Den nåværende protokollen, beskrevet tidligere av Paluzzi og kolleger26, måler Na + flux over rektal pad epithelia av den voksne kvinnelige endetarmen (figur 2).
Det siste segmentet av myggekskresjonssystemet krever koordinert muskelbevegelse for å blande mat og skille ut avfall26. Ikke-absorberbare produkter av fordøyelsen fra midgut, sammen med primær urin utskilt av MTs, passeres gjennom pyloric ventilen og leveres til hindgut2. Spontane hindgutsammentrekninger begynner ved pylorisk ventil og forekommer i peristaltiske bølger, som videresendes over ileum gjennom koordinert sammentrekning av sirkulære og langsgående muskler rundt den basale overflaten av epitelceller26. Til slutt bidrar musklene i endetarmen til å drive og eliminere avfall gjennom analkanalen. Selv om insekt hindgutmotilitet er myogen, som krever ekstracellulær Ca2 + for å produsere spontane sammentrekninger, kan disse prosessene også reguleres nevronally26,29,30. Denne eksogene reguleringen av nervesystemet er viktig etter fôring, da dyret må utvise avfall fra tarmen og gjenopprette hemolymf balanse31. Som et resultat er det nyttig å utføre in vitro bioassays for å identifisere myostimulatorium eller myoinhibitory neuropeptider for å vurdere hvordan nevrokjemikalier påvirker hindgutmotilitet. Den nåværende protokollen, utført av Lajevardi og Paluzzi28, bruker videoopptak for å undersøke ileal motilitet som svar på nevropeptider (figur 3). På samme måte kan en krafttransduser eller impedanskonverterer også brukes til å observere spor av sammentrekninger gjennom en datainnsamlingsprogramvare32,33. Ved hjelp av videoteknologi kan vi imidlertid visuelt vurdere orgelet og analysere videre ved hjelp av en undergruppe av parametere for å identifisere hormonenes rolle på bakgutmotilitet.
Ved hjelp av disse teknikkene kan du bidra til å karakterisere faktorer som regulerer og koordinerer væske- og iontransport langs ekskresjonssystemet sammen med bakre bevegelighet. Viktigst, en funksjonell kobling mellom vanndrivende respons av MTs og hindgut motility støttes, som vanndrivende hormoner, som DH31 og 5HT, preget av deres evne til å stimulere væskesekresjon av MTs, har også blitt funnet å vise myotrope handlinger langs mygg hindgut21,34,35 . Disse funnene fremhever viktigheten av streng koordinering mellom MT-ene og bakenden under hendelser som post-prandial diurese i insekter som krever rask avfalls eliminering.
Heri beskrives den detaljerte tilnærmingen bak Ramsay-analyseteknikken for å måle væskesekresjonshastigheten i mygga, A. aegypti, og bruken av ion-selektive mikroelektroder for å bestemme Na + konsentrasjoner i den utskilte væsken til MT-ene, som når de kombineres, gjør det mulig å bestemme transepitheliale iontransportrater. I tillegg er Scanning Ion-selektiv elektrodeteknikk og hindgut-sammentrekningsanalyser beskrevet for å måle henholdsvis ionfluks og bevegelighet, noe som bidrar til å belyse hormonell regulering av bakguten (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lage silikonforede retter
MERK: Dette trinnet bør gjøres før forsøkene. Disse rettene vil bli laget for å forberede analyseretten for disseksjoner, og for sammentrekningsanalyseeksperimenter.
- Forbered silikonet ved hjelp av et silikonelastomersett etter produsentens anbefalinger. Bland de todelte væskekomponentene i forholdet 10 til 1. Bland forsiktig og grundig ved å snu, men sørg for å minimere bobledannelse.
- Hell silikonelastomeren i standard 60 mm engangs polystyrenkulturretter til en dybde på normalt mellom 7-9 mm. Forbered så mange retter som nødvendig. Fjern eventuelle luftbobler ved hjelp av en fin pinne under et mikroskop kort tid etter å ha hellet silikon i retter. Plasser rettene i et støvfritt kammer eller skap ved romtemperatur (RT) i minst 48 timer eller i ovnen ved 50 °C i ca. 4 timer for å kurere (herdes) (figur 5A).
2. Lage Ramsay analyse parabolen
MERK: Retten kan brukes på nytt fra eksperiment til eksperiment, og gjenta dermed dette trinnet bare hvis parabolen er skadet eller går i stykker. En separat tallerken brukes til disseksjoner.
- Bruk en skalpell (med standard skarpe forholdsregler), lag brønner i en av de silikonbelagte Petri-rettene for å forberede analysefatet, ved å fjerne nok av silikonet, ca ~ 5 mm, fra toppen av parabolen (dette skal passe ~ 20 μL badedråpe). Før dette, bruk en permanent markør for å markere posisjonene under parabolen for å notere hvor du skal lage brønnene. Brønnene skal være ~ 1 cm fra hverandre, med en diameter på ca ~ 4 mm for å tillate den distale enden av tubule å passe. Hver brønn vil inneholde en væskeutskillende tubule, og dermed vil en tallerken som inneholder 20 brønner tillate at opptil 20 MTs analyseres per eksperiment.
- For å forberede Minutien-pinnene, plasser de 0,1 mm rustfrie stålpinnene på rad på et stykke merkingstape, vinkelrett på båndets akse. Bruk saks, kutt langs lengden på båndet, og skape like halvdeler av pinnene. Bruk en halv pinne for hver brønn.
- Bruk et sløvt par tang, sett hver halvstift inn i silikonbelagt analysefat, ved siden av hver brønn. Avhengig av lengden på insekts tubule, sett inn halvpinnen på en avstand som gjør at den distale enden av tubule å fordype seg i badesalt og proksimal ende for å vikle rundt pinnen. Dette trinnet kan gjøres under et mikroskop for å visualisere brønner enkelt. Pinnene kan brukes på nytt, men bytt ut halvpinnen hvis den er skadet eller mistet. (Figur 5B)
3. Lage den poly-L-lysinbelagte SIET-parabolen
MERK: Dette trinnet er viktig for orgelet å holde seg til bunnen av parabolen under SIET-målinger, slik at målestedet forblir det samme for hver prøve. Forberedelse av disse rettene bør gjøres minst 2 dager før forsøkene. Hver tallerken skal kun brukes én gang ved påføring av en bestemt behandling. Kast etter hver prøve, eller hvis poly-L-lysinjakken er riper av eller skadet.
- For hver prøve, legg en 35 mm Petri-tallerken på en jevn overflate. Fjern dekslene og pipetten 70 μL poly-L-lysin (0,1 mg/ml) i midten av hver tallerken. Sett på lokkene igjen og la poly-L-lysinen tørke (~48 h) uforstyrret.
- Når den er tørr, merk parabolbunnen med en sirkel som skisserer den tørkede poly-L-lysinjakken for bedre å visualisere hvor det utskilte organet skal plasseres etter disseksjoner. Hvis det er nødvendig for å minimere mengder saltvann og behandlingsløsninger i eksperimenter, bruk en varm limpistol for å omkranse poly-L-lysinbelegget, slik at det er nok plass til at elektroden kan bevege seg og ta bakgrunnsmålinger (~ 20-25 mm diameter av den limte sirkelen er nok). Disse belagte rettene kan lagres på ubestemt tid på RT (figur 5C).
4. Forbereder Ramsay og sammentrekningsanalyseretter for eksperimenter
MERK: Retten kan brukes på nytt (forutsatt passende vask for å fjerne tidligere brukt saltvann/behandlinger), og gjenta derfor bare dette trinnet hvis platen er skadet eller går i stykker. En separat tallerken brukes til disseksjoner. Dette trinnet utføres på eksperimentets dag.
- For sammentrekningsanalyseretten, bruk en skalpell (med standard skarpe forholdsregler), lag brønner i en av de silikonbelagte Petri-rettene for å forberede analysefatet. Vinkle skalpellen på en måte som brønnene blir trekantformede for å lette festingen av det dissekerte vevet på kantene. Brønnene skal være store nok til å holde opptil 250 μL og passe til hele fordøyelseskanalen (i stedet for å grave for dypt, gjør brønnen bredere til ca. 0,5-1 cm) (figur 5D).
- For Ramsay plate, bruk en pipette og fyll opp brønner opp til 20 μL oppløsning (18 μL 1X Aedes saltvann:Schneiders medium tilberedt i trinn 5.2, og 2 μL hormon / stoff). For ustimulerte kontroller, fyll opp brønner med 20 μL 1X Aedes saltvann: Schneiders medium. Når alle brønnene er fylt opp, hell hydrert mineralolje i analysefatet til brønnene og Minutien-pinnene er nedsenket. Bruk en pipettespiss på 20 μL til å poppe eller fjerne luftbobler som kan forstyrre de utskilte dråpene.
5. Utarbeide løsninger
- Forbered 2X Aedes aegypti saltvann og 10x glukose, som beskrevet i tabell 1, tilpasset fra Petzel og kolleger36. Lagerløsninger skal oppbevares ved 4 °C. Lag arbeidslagr på 1X Aedes aegypti saltvann (tabell 1), og oppbevar ved 4 °C. På eksperimentdagen, la arbeidsaksjene komme til RT før bruk. Forbered deg frisk hvis det er tegn på sopp eller bakterievekst.
- For å forberede badedråpen, bland Aedes saltvann (fra trinn 5.1) med Schneiders medium, med et 1:1-forhold. Forbered deg i små aliquots, avhengig av hvor mye som trengs. Hold Schneiders medium i kjøleskapet, kast hvis det er tegn på sopp eller bakterievekst. (Dette trinnet bør gjøres på eksperimentets dag).
- For Na+ fluxmålinger ved hjelp av SIET, klargjør du en modifisert Ca2+-fri Aedes-saltvann (tabell 2), som tidligere beskrevet26.
6. Mygg MTs og hindgut disseksjoner
- For voksne mygg disseksjoner, samle pupa i et lite beger og legg i en krukke som inneholder en sukroseløsning for fôring. For å bestemme myggens alder, isoler klekkede mygg og legg i en annen krukke som noterer myggens alder og kjønn for fremtidige disseksjoner.
- Legg kort mygg som skal dissekeres på en CO2-pute og vent til de ikke svarer. Bruk fine tang, plukk opp mygga fra beinet eller vingen og legg på en silikon elastomerbelagt dissekeringsfat tilberedt i trinn 1. Plasser mygga på den ene siden (sidesiden opp), og med en Minutien-pinne, impale inn i thoraxen for å sikre mygga på plass. Fjern eventuelt vinger og ben av mygg for enklere disseksjon.
- Bruk en Pasteur pipette, legg til en dråpe RT Aedes saltvann for å fordype mygga helt i saltvann. Pass på at disseksjonen er under saltvann (se tabell 1 for å lage Aedes saltvann).
- Legg dissekeringsfatet under et stereoskopisk mikroskop. Klem det siste buksegmentet med fine tang og trekk sakte bort fra mygga. Dette trinnet forenkles ved samtidig å se under mikroskopet. Midguten, festet med MT-er og bakgut, bør eksponeres (figur 6).
- For Ramsay-analysen, fjern forsiktig hver tubule fra midgut-hindgut-krysset, og sørg for å ikke skade organene. Bruk skarpe fine tang for å fjerne tubuliene individuelt – ikke bruk skadede tubuli til analysen. (Se trinn 7 for oppsett.)
- For SIET dissekerer du bakguten i Ca2+-fri Aedes-saltvann (trinn 5.3). Sørg for at poly-L-lysinfatet også har et fast volum ca2 +-fri Aedes saltvann. Fjern forsiktig kutikylen fra endetarmen og legg bakguten (kan fjerne andre vedlagte organer, avhengig av hva som måles) i poly-L-lysinfatet. Hvis du måler iontransport langs rektalputepe-epitheliaen, plasserer du den hemolymfevendte siden av minst én rektalpute for å være tilgjengelig for mikroelektroden (figur 7).
- Bruk tang for å ta tak i den mest bakre enden, ta bakenden ned til bunnen av parabolen (uten å skade noen strukturer som vil bli målt). Så snart orgelet berører poly-L-lysinjakken, vil den feste seg. Denne dissekerte prøven er klar for målinger. (Se trinn 14–16 for SIET-oppsett og -målinger.)
- For ileum-sammentrekningsanalysen må du påse at bakenden forblir festet til midguten under disseksjonen (figur 4D). Fjern MT-ene forsiktig for å ha en uhindret utsikt over baken. Dette organet vil bli overført til en ny tallerken tilberedt som beskrevet i trinn 4.1. (Se trinn 17 for å få analysevideoer.)
7. Sette opp Ramsay-analysen
- Bruk spissen av tangene, løft forsiktig den proksimale (åpne) enden av tubule ved å drapere den over tangene (ikke klem tubule), og overfør til en brønn av analysefatet. Dette trinnet kan også gjøres ved hjelp av fine glassprober.
- Når tubule er nedsenket i brønnen, plukk opp den proksimale enden av tubule med tang, fjern den fra badedråpen, og pakk enden rundt pinnen. Vikle tubule rundt pinnen to ganger – og hold lengden på tubule igjen i badedråpen i samsvar med de andre tubuliene. På dette tidspunktet bør den distale enden av tubule være i badedråpen, mens den proksimale enden viklet rundt pinnen bort fra badedråpen slik at den utskilte væsken kan samle seg på spissen av pinnen fra den åpne proksimale enden.
- Umiddelbart etter at tubule er viklet rundt pinnen, noter brønnene (f.eks. A, B, C), tiden (som vil være starttidspunktet for når væsken begynner å bli utskilt fra tubule), og annen identifiserende informasjon (f.eks. hormon, genotype, etc.).
- Hver mygg har fem tubules, og gjentar dermed trinn 7.1-7.3 med resten av tubuliene. For kontroll og eksperimentelle behandlinger, del de fem tubuliene innenfor de forskjellige behandlingene. Fortsett med neste disseksjon, til hele analyseretten er fylt. Med øvelse bør denne teknikken ta vanligvis 2-3 min å dissekere tubuliene, overføre dem til badesallinen og vikle seg rundt pinnen, og dermed skape en 2-3 min forskjell i starttiden mellom hver tubule.
MERK: Før du starter eksperimentet, kalibrerer du mikroskopets okulære mikrometer med et trinnmikrometer under det valgte målet. Utskilte dråper måles rutinemessig under en 40x-50x total forstørrelse. - Etter den tildelte inkubasjonstiden kan den utskilte dråpen måles. Ved hjelp av mikroskopets okulære mikrometer måler og registrerer du diameteren på den utskilte dråpen. Beregn diameteren (d) på den utskilte dråpen ved å multiplisere okulær enhetsdiameter målt ved kalibreringskonverteringen (tabell 3). Beregn volumet av det utskilte dråpet ved hjelp av ligningen, V = πd3/6.
- For å beregne sekresjonshastigheten (nL min-1), bruk ligningen, væskesekresjonshastighet = V / sekresjonstid, hvor V er volumet av den utskilte dråpen beregnet i trinn 7.5, og sekresjonstiden refererer til inkubasjonsperioden til tubule.
8. ISME-oppsett
- Plasser mikromanipulatorer på hver side av stereomikroskopet for å sette opp ISME-stasjonen. Kloridering av sølvtrådene kan oppnås ved å nedsenke i en løsning av jernklorid og tre hver sølvtråd inn i hver av mikroelektrodeholderne (eller lodde ledningene på koaksialkablene om nødvendig). Gjenta dette trinnet når sølvtrådene løsner.
- Koble sølvtrådene til en forsterker, som leses til et datainnsamlingssystem. Sett opp og kalibrer systemet i henhold til produsentens instruksjoner. Ved økt elektrisk interferens, bruk et riktig jordet Faraday-bur.
9. Klargjøring av mikroelektrodene for ISME og SIET
- Bruk en P-97 Flaming Brown pipettetrekker, trekk ~ 5-6 ufilamenterte borosilikatglasskapillærer (ytre diameter 1,5 mm, indre diameter 1,12 mm, lengde 100 mm) med en spiss på 1-5 μm. Disse vil bli brukt som ion-selektive mikroelektroder. For SIET mikroelektroder skal den resulterende elektroden ha en spissåpning på ~ 5 μm, preget av en kort skaft.
- I en hette plasserer du mikroelektrodene på en kokeplate (stilles forsiktig ned for ikke å bryte elektrodenes spisser). Tilsett diklorodimetylsilane i en 15 cm glass Petri-tallerken og snu over elektrodene på kokeplaten. Bruk diklorodimetylsilane til å simulere de ion-selektive elektrodene ved å legge til et hydrofobt strøk på alle overflatene av elektroden, slik at den kan beholde den hydrofobe ionofor37. Ubrukte silaniserte elektroder kan stå i noen uker; Derfor utføres dette trinnet med noen få ukers mellomrom, eller for nylig trukket elektroder.
MERK: Vær forsiktig når du håndterer diklorodimetylsilane – brannfarlig, etsende og giftig, se MSDS for sikker håndtering.- Vri kokeplaten til 350 °C og la den stå på plass i 75 minutter. Bruk et 1:2-forhold mellom antall mikroelektroder og volum (μL) dichlorodimethylsilane for å legge til på glass petriskålen. Således, for 10 mikroelektroder, tilsett 20 μL dichlorodimethylsilane.
- Etter 75 min, slå av varmeplaten. Etter at elektrodene og varmeplaten er avkjølt, fjern glass petriskålen og overfør elektrodene (med tang) til en oppbevaringsboks med støpeleire. Sørg for at elektroden peker oppover for å unngå skade.
- For å lage referanseelektroder for ISME, trekk ~ 4-5 filamenterte borosilikatglass kapillærrør (ytre diameter 1 mm, indre diameter 0,58 mm, lengde 100 mm). Disse elektrodene trenger ikke å bli silanisert. Merk og oppbevar i en lignende boks, og unngå skade på spissen.
- SIET-referanseelektroder er laget av standard glasskapillærer (ytre diameter 2 mm, indre diameter 1,12 mm, lengde 102 mm). Kapillærene er fylt med smeltet 1 M KCl + 3% agar og skal lagres i et 50 ml sentrifugerør som inneholder 1 M KCl (helt nedsenket) til bruk. De kan brukes gjentatte ganger til bobler begynner å danne seg eller hvis agaren bryter. Hvis det er luftrom, kast glasset og bruk et nytt for å sikre at kretsen er fullført.
10. Klargjøring av etterfyllingssprøytene
MERK: Dette trinnet er gjort for å lage fine sprøyter for å fylle elektroder for ISME.
- Bruk en 1 ml slip-tip sprøyte med en engangsnål. Kast kanylen og trekk sprøyten tilbake til 1 ml-merket. Under avtrekket slår du på Bunsen-brenneren og varmer opp plastspissen på sprøyten til den begynner å smelte. Bruk et gammelt par tang, klyp forsiktig den smeltede sprøytespissen og trekk ned for å strekke spissen.
- Bruk saks til å kutte den smeltede spissen til ønsket lengde, slik at diameteren er liten nok til å passe inn i elektrodene (se figur). Etter at sprøyten er avkjølt, test sprøytens trykk med vann for å sikre at det ikke er blokkering. Opprett en for hver etterfyllingsløsning som kreves, og merk deretter (figur 8).
11. Fylling av ion-selektiv og referansemikroelektrod for ISME og SIET
MERK: Mikroelektroden kan brukes på nytt så lenge den fortsatt fungerer (kalibrere før hvert eksperiment). For ISME kan dette trinnet gjøres mens MT-ene inkuberes i Ramsay-analysen.
- For å lage en Na +-selektiv mikroelektrod, bruk 1 ml sprøyte opprettet i trinn 10 for å fylle elektroden med 100 mM NaCl. Påse at bakfyllingsløsningen fylles til elektrodens spiss. Hvis det oppstår luftbobler, sveiper du forsiktig mikroelekroden eller fjerner oppløsningen og fyller den på nytt. Dette bør gjøres under et stereoskopisk mikroskop for å visualisere bedre.
- Under et stereoskopisk mikroskop dypper du en 10 μL pipettespiss i Na+-selektiv ionoforløsning. Stille opp elektroden vinkelrett på pipetten, plasser en hansket finger over bunnen av spissen for å skape trykk og utvise en liten dråpe ionofor. Visning under høyt mål av et mikroskop, berør forsiktig dråpen av ionofor til mikroelektrodespissen, og unngå å bryte spissen. Normalt er mikroelektroder fremover fylt med en ionofor cocktail kolonne lengde på mellom 150-300 μm, til ionofor / bakfylling løsning grensen er flat.
FORSIKTIG: Denne ionoforen er giftig, se MSDS for sikker håndtering. - I et lite beger, fyll opp halvveis med 100 mM NaCl, og legg litt modelleringsleire på innsiden på toppen av begeret. Etter at Na+ ionoforen er tatt opp, plasser elektroden tipp ned på veggen på begeret, la spissen sitte innenfor 100 mM NaCl, og hold ISME i begeret til den er klar til bruk.
- For å gjøre ISME-referanseelektroden, fyll en elektrode med 500 mM KCl for å sikre at løsningen er fylt til spissen (følg samme protokoll som ovenfor). Oppbevar KCl på et beger.
12. Kalibrere elektroder for ISME
MERK: Dette trinnet utføres rett før du tar målinger av den utskilte væsken (~10–15 min før). Kalibreringer bør gjøres hver ~ 5-6 målinger for å sikre at skråningen er konsistent.
- Belegge elektrodespissene ved hjelp av en løsning på ~ 3,5% (w / v) polyvinylklorid oppløst i tetrahydrofuran, for å unngå forskyvning av ionofor når den er nedsenket i parafinolje.
FORSIKTIG: Dette er brannfarlig, se MSDS for sikker håndtering. - For å kalibrere Na+ elektroden, plasser 10 μL dråper av følgende NaCl standardkonsentrasjoner på kanten av Ramsay-parabolen med inkuberte MTs: 200 mM NaCl og 20 mM + 180 mM LiCl. Plasser standarddråpene ~ 2 cm fra hverandre, med høyere konsentrasjon på toppen.
- Sett inn både referanseelektroden og den ion-selektive elektroden over de klorerte sølvtrådene og fest dem sikkert ved hjelp av elektrodeholdere som er festet til mikromanipulatorer. Naviger begge elektrodene mot 200 mM NaCl-dråpen ved hjelp av mikromanipulatorene, og sørg for at elektrodespissene ikke berører bunnen av parabolen. Slå på elektrometeret for å starte opptaket og la avlesningen stabilisere seg.
- Ta opp avlesningen og fortsett til neste standard (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Beregn skråningen, og hvis elektrodeavlesningen er stabil og hellingen er innenfor rekkevidde, fortsett å bruke elektroden til de utskilte dråpemålingene. Hvis avlesningen er ustabil, ikke gir riktig opptak eller helling, eller tar en stund å likevekte, forberede enten en ny ion-selektiv elektrode eller bryte selve spissen av referanseelektroden ved å kjøre et vev over spissen. Skråningen for Na+ skal være ~ 58-60 mV38, selv om et akseptabelt område er 50-60 mV.
13. ISME-opptak og beregninger
- Etter målinger av væskesekresjonshastigheten (se trinn 7.7), flytt forsiktig både referanse- og ion-selektiv elektroden inn i det utskilte dråpet ved hjelp av mikromanipulatorene. Slå på innspillingen og la avlesningen stabilisere seg og registrere verdi. Gjenta dette trinnet for de andre dråpene (gjenta kalibreringsmålinger hver ~5–6 målinger).
- Kationkonsentrasjoner beregnes ved hjelp av ligningen beskrevet tidligere22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, hvor [C] er konsentrasjonen i mmol L-1 av kalibreringsløsningen som brukes til å kalibrere ISME, ΔV er spenningsendringen mellom spenningen som registreres fra det utskilte væskedråpen og spenningen i samme kalibreringsløsning, og m er spenningsforskjellen mellom de to standardkalibreringene, som også er skråningen.
14. SIET-oppsett
MERK: SIET-systemet er beskrevet tidligere27,39. For å redusere bakgrunnsstøy er det installert et Faraday-bur rundt lysmikroskopet og hodelykten. Eksperimenter som presenteres i dette dokumentet, bruker følgende innstillinger på ASET-programvaren (Automated Scanning Electrode Technique) 2.0: en 4 sekunders ventetid for å tillate iongradienter å gjenopprette følgende mikroelektrodebevegelser, med spenning registrert i 0,5 sekunder etter ventetiden, en ekskursjonsavstand på 100 μm og tre repetisjoner for hvert opptak. Visse innstillinger kan endres av brukeren i ASET etter behov.
- Slå på IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, lysmikroskopet (med et tilkoblet videokamera) og datamaskinen(e) som er koblet til hver av disse som kjører ASET og cellSens.
- Klargjør mikroelektroder og referanseelektroder som er beskrevet i trinn 9.1–9.3, 9.5, 10 og 11.1–11.3. Den ion-selektive mikroelektroden vil inneholde Na + ionofor med 100 mM NaCl-fylling og referanseelektroden (med agarbroene) vil alltid bli fylt med 3 M KCl.
- Plasser Na+-selektiv mikroelektrorode på holderen som består av en sølvkloridtråd (AgCl) og fest den i den kvinnelige kontaktkontakten. Bruk en sprøyte til å fylle referanseelektrodeholderen med frisk 3 M KCl (kan gjøres før eksperimentdagen og lagres hos RT).
MERK: Etter eksperimenter, vask ut referanseelektrodeholderen med ddH2O. - Fjern en referanseelektrode fra begeret som inneholder alle referanseelektroder nedsenket i 3 M KCl, plasser en finger i den ene enden og vipp glasskapillæren mot denne fingeren for å forhindre at agaren faller ut. Plasser forsiktig den ene enden i holderen, og sørg for at det ikke dannes bobler. Hvis det er en boble, fjern referanseelektroden, fyll holderen på nytt med mer 3 M KCl og gjenta. Plasser elektrodeholderen i den kvinnelige kontaktkontakten.
15. Kalibrere elektroder for SIET
- For Na+ målinger, bruk en 150 mM NaCl og 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-løsninger24. Det bør være en 10 ganger forskjell i Na + konsentrasjoner mellom de to løsningene, som omfatter rekkevidden av Na + (20 mM) nivåer i saltvann (tabell 2).
- Oppbevar kalibreringsløsninger på RT i et 50 ml sentrifugerør og aliquot i en Petri-tallerken når du utfører eksperimentet. Denne aliquoten avhendes på slutten av dagen. Hvis det er tegn på forurensning i lagerløsningene, kast og lag nye løsninger.
- For å kalibrere, aliquot de to kalibreringsløsningene (trinn 15.1) i individuelle 35 mm Petri-retter, og legg disse på mikroskopstadiet. Bruk de manuelle justeringsknappene som styrer steppermotorene med "deaktiver" valgt på datamaskinens bevegelseskontrollenhet, og sørg for at mikroelektrodspissen er plassert inne i kalibreringsløsningen. Ikke senk spissen for langt ned, da den kan gå i stykker. Hvis spissen går i stykker, klargjør du en ny ion-selektiv mikroelektrod og kalibrerer på nytt.
- Åpne ASET-programvaren på datamaskinen som er koblet til forsterkeren. Åpne Kalibreringsinnstillinger. Velg Nernst Slope for kalibreringstypen, still inn prøven i 3 sekunder, og angi konsentrasjonene til kalibreringsløsningene. For Na+ -målinger angir du for eksempel 150 mM i løsning 1, plasser Na+-selektiv mikroelektrorodspiss og referanseelektrode inne i denne kalibreringsløsningen. Spenningsavlesningen på forsterkeren skal være stabil. Klikk på Løsning 1, vent til spenningen (i mV) skal registreres. Plasser deretter mikroelektroden og referanseelektroden inne i 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-løsningen, skriv inn 15 mM i løsning 2 og klikk på Løsning 2 for å få spenningsavlesningen. Hellingen vil være forskjellen mellom disse to spenningene, beregnet i disse innstillingene. Etter kalibrering klikker du på OK.
- Bakker for Na+-selektive mikroelektroder for en ti ganger endring i ionkonsentrasjon bør være rundt 59,0 ± 1,624. Hvis Nernst-skråningen avviker sterkt fra dette området, lag en ny mikroelektrode, eller aliquot nye standarder (da de kan være forurenset). Kalibrering er nødvendig før hver 2-3 prøve, avhengig av spenningsstabilitet. Hvis spenningen blir ustabil og begynner å svinge, lag en ny ion-selektiv mikroelektrode.
16. SIET-målinger
MERK: Motorbryteren på datamaskinens bevegelseskontrollenhet må alltid byttes til Deaktiver unntatt når du manipulerer elektroden ved hjelp av datataster gjennom ASET, eller under måleopptak (da skal nøkkelen byttes til Aktiver).
- Etter kalibrering dissekerer du orgelet (se trinn 6.6). Plasser poly-L-lysinfatet med den dissekerte prøven på mikroskopstadiet og sett spissen av referanseelektroden inn i saltvannen. Senk spissen av ionen selektiv mikroelektrode i saltvannsvann og pass på at du ikke bryter spissen.
- Bruk de manuelle justeringsknappene til å justere mikroelektrodposisjonen mens du ser under lysmikroskopet. Juster mikroelektrodens vertikale posisjon slik at spissen er på samme plan som organet eller vevet. Når du er i ønsket posisjon, dreier du motorbryteren til Aktiver. På dette tidspunktet kan steppermotorene bare betjenes ved hjelp av dataprogramvaren.
- Bruk datamaskinpiltastene til å flytte mikroelektroden horisontalt til en posisjon 3 mm fra vevet for å måle bakgrunnsopptak. Sett inn notater ved å trykke F2. Når du er klar, begynner du å spille inn (ved å trykke F5). Oppnå fem målinger av bakgrunnsaktivitet. Den gjennomsnittlige bakgrunnsspenningsaktiviteten for hver prøve vil bli trukket fra spenningsgradientene målt langs vevet for samme prøve.
- Flytt mikroelektrodespissen tilbake nær vevet, vær forsiktig så du ikke pierce orgelet. Reduser nøkkelhitfølsomheten for å plassere mikroelektrodespissen 2 μm direkte til høyre, vinkelrett på vevet. Få tre opptak på hvert sted langs rektal pad for å identifisere stedet for størst ion aktivitet. Få grunnleggende saltvannsmålinger på stedet som viser størst aktivitet (hotspot-området).
- Bytt motoren til Deaktiver og legg til riktig behandling i parabolen for å oppnå den endelige ønskede dosen. Etter påføring, opprett en ny merknad (dvs. behandlingsnavn og dose), bytt motor tilbake til Aktiver og ta spenningsopptak ved hjelp av F5. Hvis målet er å observere endringer over tid, fortsetter du å ta målinger ved bestemte tidsintervaller. Flere protokoller kan opprettes for spesifikke applikasjoner ved hjelp av SIET, avhengig av forskerens mål.
- Se ASET-programvaren registrere spenningen på stedet langs vevet og trekk denne fra spenningen ved en ekskursjonsavstand (figur 7) på 100 μm unna vevet. Siden det første opptaket er tatt i vevet, indikerer en positiv spenningsforskjell at spenningen er høyere ved epitelet (vev) (figur 7A) enn bort fra epitelet (figur 7B), og dermed absorberes kationen. En negativ spenningsgradient indikerer kationsekresjon.
- Få bakgrunnsopptak igjen etter behandlingen (3 mm unna) og bruk disse ved beregning av ionfluks etter behandlingen. Lag ett sett med bakgrunnsopptak i "baseline" og ett sett etter behandlingen. Bytt motoren til Deaktiver når mikroelektroden ikke justeres med datamaskinnøklene eller når spenningen ikke registreres. Eksporter dataene til en tekstfil, og åpne ved hjelp av Excel for å utføre alle beregningene.
- Beregn ionfluks ved hjelp av ligninger beskrevet tidligere24,26. Netto ionfluks for hver behandling kan uttrykkes som en absolutt endring fra baseline ion flux målinger. For å verifisere betydningen av resultatene, kan en kjøretøykontroll (dvs. å legge saltvann alene inn i parabolen i stedet for en behandling) brukes. Endringer i iontransport etter hormonell behandling bør vurderes i forhold til eventuelle endringer som svar på denne kontrollen.
17. Hindgut sammentrekning analyser
- Fyll en av brønnene i retten beskrevet i trinn 4.1 med et kjent volum Aedes saltvann (trinn 5.1). Etter disseksjon (trinn 6.7), overfør forsiktig den dissekerte bakguten festet til midgut til brønnen i den andre parabolen, sørg for ikke å klemme orgelet som undersøkes (ileum). Senk tarmen ned i saltvannet inne i brønnen, og plasser Minutien-pinnene i midgut og endetarm. Ved å gjøre det, bør ileum ikke være under spenning, og spontane sammentrekninger, som stammer fra pylorisk ventil på det fremre ileum, bør observeres.
- Koble et videokamera til et stereoskopisk mikroskop, og ta opp videoer ved hjelp av en videoopptaksprogramvare (f.eks. Lumineras INFINITY CAPTURE). Plasser retten som inneholder det dissekerte organet under mikroskopet og registrer i 2 min. Dette vil være betingelsen "Opprinnelig plan".
- Legg til et kjent volum på 1X Aedes saltvann (trinn 5.1) i brønnen for å ta høyde for eventuelle endringer i ileal motilitet ved å øke volumet i brønnen. Vent i 1 min etter påfølgende søknad, og ta deretter opp igjen i 2 min. Dette er "saltvannstilstanden".
- Tilsett et kjent behandlingsvolum (fra en 10x lagerkonsentrasjon for å oppnå ønsket dose i brønnen). Vent i 1 min etter påfølgende søknad, og ta deretter opp igjen i 2 min. Dette vil være "behandling" -tilstanden.
- Lagre alle videoene og konverter dem til MP4. For å analysere, telle antall sammentrekninger i 2 min intervaller (definert som en peristaltisk bølge initiere ved pyloric ventilen og utvide gjennom ileum). Del dette tallet med 2 min for å oppnå sammentrekningsraten. Andre parametere kan også vurderes, for eksempel sammentrekning eller avslapningsvarighet. Etter innsamling av rådata uttrykker du hver parameter i forhold til dataene for "baseline"-betingelser for hvert utvalg. Plott foldeendringen for "saltvann" og "behandling" i forhold til "baseline".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse av DH31 mot ustimulerte MTs resulterer i en betydelig økning i væskesekresjonshastigheten, og bekrefter sin rolle som et vanndrivende hormon i Aedes mygg (figur 1A). Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduksjon i sekresjonshastigheten i DH31-stimulerte MT-er. Figur 1B viser bruk av ion-selektive elektroder for å måle Na + konsentrasjoner i de utskilte dråpene. Behandling av DH31 på MT-ene hadde ingen effekt på Na + konsentrasjonen i det utskilte dråpet; Men med anvendelsen av AedaeCAPA-1 ble Na + -konsentrasjonen i den utskilte væsken betydelig økt. I tillegg, sammenlignet med ustimulerte kontroller, førte DH31 til en betydelig større Na + transportrate, mens AedaeCAPA-1 avskaffet denne økningen i DH31-stimulerte tubuli (figur 1C). Sammen viser disse prøveresultatene hvordan væskesekresjonsrater etter påføring av vanndrivende og anti-vanndrivende hormoner kan måles, samt ionkonsentrasjonen i de utskilte dråpene. Tre til seks dager gamle kvinner ble dissekert og mellom 23-35 MT ble analysert for eksperimentet. Forskjeller ble betegnet som statistisk signifikante hvis p < 0,05 ved hjelp av en enveis ANOVA og ubetalte t-tester.
SIET ble brukt til å vurdere endringer i Na + transport langs rektal pad epithelia av voksne kvinnelige mygg. De fleste ustimulerte recta undersøkt utvist hemolymfe-rettet Na + transport (absorpsjon), og så bare disse preparatene ble undersøkt. På grunn av variasjon i baseline aktivitet ble forskjellen i ionfluks, etter enten saltvanns- eller peptidapplikasjon, i forhold til innledende transportaktivitet i saltvann beregnet. Disse verdiene gir en negativ endring i ionfluks (ionfluks etter behandling – ionfluks under baseline forhold), selv om alle organer forble absorptive etter behandlinger. En leucokinin analog (Drosokinin) ble brukt til å undersøke endringer i Na + absorpsjon, noe som resulterte i en fire ganger reduksjon i Na + absorpsjon sammenlignet med saltvannskontroll (figur 2).
For å vurdere rollen som et nevropeptid, pyrokinin-2 (PK2), på ileal motilitet, ble en Rhodnius prolixus-analog brukt, som tidligere ble vist å aktivere A. aegypti PK2-reseptoren, beriket i mygg ileum28. I forhold til baseline nivåer hemmer PK2 signifikant ileal sammentrekninger (figur 3).
Figur 1: Effekt av vanndrivende og anti-vanndrivende nevropeptider på in vitro væskesekresjonshastighet, Na + konsentrasjon og transporthastighet av voksne kvinnelige A. aegypti MTs. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) ble påført MT-er stimulert med DromeDH31 (25 nM). (A) MT ble inkubert i 60 min med nevropeptider og 120 min for ustimulerte kontroller. (B) Na+ konsentrasjoner i det utskilte dråpet ble målt ved hjelp av ISME og verdier ble brukt til å beregne transporthastighet (C). Kolonner som er vesentlig forskjellige fra kontroller, er merket med samme bokstav, som bestemt av en enveis ANOVA og Bonferroni etter testen (n = 23–35). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Endringer i Na+ transport over kvinnelig rektal pad epithelia målt ved hjelp av SIET. Na + absorpsjon ble registrert i ustimulerte baseline saltvannsforhold, etterfulgt av behandling med enten ekstra saltvann (kjøretøykontroll) eller 1 μM Drosokinin (n = 10-12). Endringer i hemolymf-rettet Na + flux ble målt for hver behandling. Det var en fire ganger reduksjon i Na + absorpsjon som svar på Drosokinin, som bestemt av en uparret to-tailed t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Endring i ileal motilitet av kvinnelige mygg etter saltvann (kjøretøykontroll) og RhoprPK2-applikasjon. Endringen i sammentrekningsfrekvens etter begge behandlingene ble registrert for hver prøve i forhold til baseline forhold (n = 32). Rhopr PK2 reduserte ileal motilitet, som bestemt av en parret to-tailed t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk for Ramsay-analysen, bruk av ion-selektive mikroelektroder (ISME), skanningsion-selektiv elektrodeteknikk (SIET) og hindgut-sammentrekningsanalyser. Illustrasjoner av de fire metodene som brukes til å bestemme de funksjonelle rollene til endokrine faktorer på myggens ekskresjonssystem, Aedes aegypti. (A) Ramsay-analysen brukes til å måle væskesekresjonsrater i isolerte malpighiske tubuli. Den proksimale (åpne) enden av tubule er viklet rundt en pinne, omgitt av mineralolje, mens den distale (lukkede) enden er badet i behandlingssaltet. Etter en angitt tidsperiode vil den proksimale enden skille ut primær urinen, akkumuleres som dråper på pinnen. (B) En referanseelektrode og ISME plasseres i det utskilte dråpen, koblet til et datainnsamlingssystem, for å måle ionkonsentrasjon. (C) SIET måler iontransport ved hjelp av en ion-selektiv mikroelektrod vinkelrett plassert ~ 2 μm unna orgelet festet til bunnen av en poly-L-lysinfat. Retningen på de røde pilene i dette skjemaet indikerer at Na + blir absorbert i saltvannet, indikert av et større spenningsopptak langs epitelet i forhold til regionen vekk fra organoverflaten. (D) Hindgut-sammentrekningsanalyser utføres ved hjelp av videoopptak for å vurdere endringer i sammentrekningsfrekvens, lengde og avslapningsvarighet. I dette skjemaet er organene plassert inne i en brønn, og en metallpinne settes direkte inn i midgut og endetarm slik at ileum fritt kan flyte og trekke seg sammen. Behandlinger legges til brønnen for å vurdere endringer i bevegelighet både kvalitativt og kvantitativt. Opprettet ved hjelp av BioRender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Retter som brukes til (A) dissekering av mygg, (B) Ramsay-analyse, (C) SIET- og (D) sammentrekningsanalysemålinger. A, B og D er helt belagt med silikon, mens C er belagt med poly-L-lysin i midten. For å tilberede retten som brukes til Ramsay-analysen (B), benyttes en liten silikonbelagt Petri-tallerken, og små ~ 4-5 mm brønner er skåret 1 cm fra hverandre (rundt ~ 20 brønner kan skjæres ut / tallerken). Minutien metallpinner plasseres ved siden av hver brønn for å holde fast på den isolerte tubule for å måle væskesekresjonshastigheten. Poly-L-lysinretten (C) gjør at orgelet kan holde seg til bunnen under SIET-målinger. Brønnene i sammentrekningsanalysefatet (D) er fylt med saltvann og eventuelle følgende behandlinger. Kontraherende organ plassert inne i brønnen observeres ved hjelp av et videokamera. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Utskillelsessystemet av mygg, Aedes aegypti. Etter en blodmel overføres solutes, vann og næringsstoffer langs fordøyelseskanalen, som inkluderer (men er ikke begrenset til) midgut, pylorisk ventil, MTs og bakgut. Midgut er hovedstedet for mat fordøyelse og næringsabsorpsjon. De fem MT-ene transporterer vann, løsemidler og avfall fra den omkringliggende hemolymfen og skiller ut denne primære urinen i bakenden, som består av et fremre ileum og bakre endetarm, hvorav sistnevnte inkluderer fire (mannlige) eller seks (kvinnelige) rektal pads. Baken fungerer som det endelige reabsorpsjonsstedet før avfall skilles ut. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Stillbilder av en dissekert mygg-bakgut under SIET-målinger. For å måle ionaktivitet langs epitheliaen til en av de seks rektal padsene, plasseres Na +-selektiv mikroelektrode 2 μm vekk fra vevet (A). Spenningen registreres på dette stedet før mikroelektrodspissen flyttes i en ekskursjonsavstand (Δx) på 100 μm fra dette punktet (B). Spenningsgradienten mellom disse to punktene brukes til å beregne konsentrasjonsgradienten og ionstrømmen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Etterfyllingssprøytene til ISME og SIET. Et bilde av sprøytene som brukes til å fylle opp NaCl- og KCl-oppløsninger i mikroelektrodene. Dette viser fire 1 ml slip-tip sprøyter med engangs nåler, med en modifisert strukket spiss for å tillate innsetting i en elektrode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 2X Aedes aegypti saltvann | ||
| For 500 ml: | ||
| I et beger legger du til 400 ml ddH2O, og tilsett deretter følgende løsningsmidler: | ||
| Komponent | Vekt (g) | Endelig konsentrasjon (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaOH | 0.3 | 7.5 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| Rør og juster pH til 7,1 | ||
| Legg ddH2O til det endelige volumet på 500 ml for å lage 2x Aedes saltvann | ||
| 10X glukose | ||
| For 500 ml: | ||
| Legg til 450 ml ddH2O på et beger, og legg deretter til: | ||
| Komponent | Vekt (g) | Endelig konsentrasjon (mM) |
| Glukose | 4.5 | 5 |
| Rør og tilsett ddH2O til sluttvolum på 500 ml | ||
| Slik lager du 1X Aedes aegypti saltvann: | ||
| For 100 ml: | ||
| Legg til 40 ml ddH2O på et beger, og legg deretter til: | ||
| Komponent | Volum (ml) | |
| 2x Aedes saltvann | 10 | |
| Rør, juster pH til 7,1 | ||
| Steriliser filter | ||
Tabell 1: Lage Aedes aegypti saltvann. For å lage Aedes saltvann, lag separat 2X Aedes saltvann og 10x glukose, oppbevares i 4 °C kjøleskap. Bruk disse to løsningene til å forberede arbeidsbestander (1x Aedes saltvann), som brukes til dissekering av vev, Ramsay-analyser og sammentrekningsanalyser.
| Kalsiumfrie Aedes aegypti Saline + NMDG | ||
| For 500 ml: | ||
| I et beger legger du til 400 ml ddH2O, og tilsett deretter følgende løsningsmidler: | ||
| Komponent | Vekt (g) | Endelig konsentrasjon (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| Glukose | 0.9 | 5 |
| Rør og juster pH til 7,1 | ||
| Legg ddH2O til sluttvolum på 500 ml | ||
Tabell 2: Modifisert aedes aegypti saltvann som brukes til SIET-målinger. Denne Ca2+-frie saltvannslinjen brukes til å forhindre spontane bakveissammentrekninger under SIET-målinger. Denne saltvannslinjen er spesifikk for måling av Na+ transport, da den består av redusert Na + (20 mM) som består av equimolar substitusjon med N-metyl-D-glucamin (NMDG) for å redusere bakgrunnsstøy.
| DH31-stimulerte MT-er | Dråpediameter (enheter) | Dråpediameter (um) | Slippvolum (um3) | Sekresjonsrate (nl/min) |
| n | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) | Behandling #1 (60 min) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| Bety | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD ERR | 0.06 |
Tabell 3: Eksempel på Ramsay-analysedata. Tabell som viser eksempeldata samlet inn fra DH31-stimulerte MT-er fra voksne kvinnelige mygg. Når du måler diameteren på den utskilte dråpen, må du først måle med stereomikroskopet okulært mikrometer og notere ned verdien. Deretter multipliserer du okulær enhetsdiameteren med kalibreringskonverteringen som ble utført før eksperimentet for å få diameteren på dråpen i μm. Beregn volumet av ligningen neste, ved hjelp av ligningen som er notert i trinn 7.7, etterfulgt av sekresjonshastigheten, ved hjelp av ligningen som er notert i trinn 7.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du inntar et blodmåltid, står hematofagus insekter overfor utfordringen med overflødige solutes og vann i hemolymfen2. For å takle dette har de et spesialisert ekskresjonssystem, som er tett kontrollert av hormonelle faktorer, slik at insekter raskt kan initiere post-prandial diurese. Ramsay-analysen og bruk av ion-selektive mikroelektroder gjør det mulig å måle væskesekresjonshastigheter sammen med ionkonsentrasjoner og transportrater i isolerte insekt-MTs. Kritiske skritt innenfor disse tilnærmingene inkluderer å sikre riktig disseksjon av insektet MTs. Individuelt fjerne hver tubule fra insektet må gjøres nøye, da eventuelle skader på tubule vil føre til at væsken blir utskilt fra tåren eller fører til en ikke-funksjonell forberedelse. Aedes MTs utskiller seg ikke lett i ustimulerte kontroller, og dermed kan hormoner og stoffer brukes til å stimulere sekresjon. Men selv med vanndrivende anvendelse eller forsiktige disseksjoner, kan noen MTs unnlate å skille ut hvis de er skadet (selv om det ikke i det hele tatt er åpenbart med visuell inspeksjon), og dermed kan flere runder av analysen måtte utføres. For riktig bruk av ion-selektive elektroder under både ISME- og SIET-målinger, må du sørge for at skråningen av standardene er innenfor det normale området som rapporteres for ionoforen, noe som vil gi de mest nøyaktige avlesningene. Men hvis målingene er ustabile, undersøk elektroden under mikroskopet for å bekrefte at ionoforen er tatt opp og ikke lekker. En ny elektrode bør fremstilles hvis det er luftbobler til stede, spissen er ødelagt, eller ionoforen ikke er tatt opp riktig. Hvis ionofor/bakfyllingskant er konveks, er elektrodene underslaniserte og mer diklorodimetylsilane skal brukes. Hvis grensen er konkav, er elektrodene over-silanisert, og mindre dichlorodimetylsilane bør brukes. I tillegg kan noen elektroder være mindre stabile enn andre, for eksempel Na +-selektiv elektroden, der skråningen forverres raskere sammenlignet med K + eller H +.
Disse tilnærmingene gir ubegrensede muligheter til å studere mekanismene bak væskesekresjon av MTs. På grunn av nylige fremskritt innen genomisk redigering, kan omvendte genetiske strategier som CRISPR-Cas9 genredigering og RNA-interferens brukes til å undersøke regulerings- og / eller funksjonell rolle for spesifikke gener uttrykt i ekskresjonsorganer. Studier har brukt slike verktøy for å forstå hormonell regulering i Aedes40 og Drosophila41 MTs. I tillegg kan badedråpen endres for å se på de spesifikke rollene til hormoner14,15,18,21,42, andre-messenger systemer, og narkotika på sekresjonsrate og ionkonsentrasjoner. Disse metodene er brukt i forskjellige andre insekter som Rhodnius prolixus38, larval og voksne myggarter, Drosophila41, og mayfly arter (Hexagenia rigida)43. På samme måte kan ulike ioner undersøkes, for eksempel Cl-, K+, H+ og NH4+.
Under SIET-målinger kan det være variasjon mellom hver prøve under baseline-forhold. Forskjeller kan fortsatt oppstå når du kontrollerer myggens alder, kjønn og fôringstilstand, spesielt når du undersøker forskjellige tarmregioner (dvs. visse avstander fremre eller bakre fra ileum-endetarmskrysset). Disse forskjellene kan redegjøres for ved å uttrykke ionfluks etter behandling som en endring i forhold til baseline forhold. Over tid kan også ionaktiviteten svinge, og derfor er det viktig å vurdere endringer i forhold til en kjøretøykontroll (saltvann), som vist i resultatene som presenteres her. Hvis spenningsavlesningene begynner å svinge drastisk, klargjør du en ny ion-selektiv mikroelektrod og kalibrerer på nytt. Bruk av en tredje kalibreringsløsning (fortynnet 10 ganger fra den laveste kalibreringsløsningskonsentrasjonen) kan ytterligere bidra til å etablere en mer nøyaktig Nernst-skråning. Siden Na+- aktiviteten vanligvis er svært utsatt for bakgrunnsstøy, brukes en modifisert Aedes-saltvann som består av mindre Na+ (tabell 2). Det er også viktig å holde avstand til Faraday-buret under målinger for å unngå forstyrrelser og redusere enhver bakgrunn. I tillegg, hvis orgelet fortsatt produserer spontane sammentrekninger når det følges poly-L-lysin på bunnen av parabolen, vil det å legge til en kalsiumchelator til saltvann ytterligere bidra til å forhindre dette. Hvis du undersøker iontransport langs rektal pad-epitheliaen, som vist i resultatene som presenteres her, er det viktig å identifisere "hotspot" -stedet som viser størst ionaktivitet ved å flytte mikroelektrodespissen i små trinn langs den hemolymfevendte siden av rektalputen. Hvis det ikke er mulig å oppdage store endringer i ionaktivitet, kan orgelet ha blitt skadet eller mikroelektrodespissen er ikke i samme tredimensjonale plan som rektalputeåpningen, og dermed bør en annen mygg dissekeres.
SIET kan brukes til ulike eksperimenter, for eksempel å undersøke ionaktivitet i mygg oppdrettet under forskjellige forhold25 eller matet forskjellige dietter (dvs. sukrosematet vs. blodmatet vs. unfed), noe som kan være nyttig for å identifisere iontransportmekanismer som er kritiske etter en blodmel. Det er derfor viktig å sikre at målinger hentes fra samme sted mellom prøver. For eksempel kan målinger tas fra ileum-endetarmskrysset eller på bestemte avstander som ligger fremre fra dette stedet (langs ileum) eller bakre (langs rektal epitel). Disse målingene kan også oppnås langs rektal pad epitelet som krever forskjellig plassering av orgelet i parabolen. I tillegg er det viktig å merke seg at SIET ikke er begrenset til å måle ionaktivitet utelukkende langs baken; andre organer, inkludert midgut og MTs kan også undersøkes. På samme måte kan K+, H+, NH4+ og Cl-flux måles ved hjelp av SIET25,44,45 og målinger kan tas ved angitte tidsintervaller etter en behandling44. Denne teknikken har blitt brukt på både larve og voksne mygg26,44, samt ulike andre insekter, inkludert Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 og Hexagenia rigida43. Disse eksperimentene kan brukes sammen med Ramsay-analysen og ISME for å få en bedre forståelse av rollen til ulike behandlinger og miljøfaktorer på væskesekresjon, ionkonsentrasjon og iontransport.
Til slutt er sammentrekningsanalyser nyttige for å identifisere nevroendokrine faktorer som påvirker tarmmotiliteten. Det er avgjørende at orgelet som studeres ikke er skadet siden denne analysen er avhengig av bevegelser generert av muskulatur. Derfor bør tang bare brukes til å gripe omkringliggende strukturer når du overfører organene til analysefatet. Å gripe disse tilstøtende organene med en pinne inne i brønnen forhindrer også at de beveger seg og påvirker bevegelsen av det isolerte organet som undersøkes. Hvis det ikke observeres spontane sammentrekninger, kan vevet ha blitt skadet, og en ny disseksjon er nødvendig. Andre metoder som vanligvis brukes til å undersøke insekt gut kontraktil aktivitet inkluderer bruk av en kraft transducer32 eller impedans monitor33. Disse metodene kan også brukes til å måle sammentrekningshastighet i mygg hindgut; Men hvis målet er å visuelt undersøke disse endringene gjennom videoopptak, vil metodene beskrevet i denne protokollen være gunstige og kan brukes til videre analyse48.
De fire teknikkene som er skissert i denne protokollen har bidratt til å utlede rollen som en rekke nevropeptider i ekskresjonssystemet til ulike insekter. Bruk av disse metodene i forbindelse med ytterligere teknikker som brukes av insektfysiologer, som kvantitativ PCR og immunhiistokjemi, kan gi en mer omfattende forståelse av underliggende veier og signalsystemer, som kan tjene som nye potensielle mål for vektorstyring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants til AD og J-PP. AL og FS mottok NSERC CGS-M-priser til støtte for sin avgangsforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
References
- Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
- Bradley, T. J.
- Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
- Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
- Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
- Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
- Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
- Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
- Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
- Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
- Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
- Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
- Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
- Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
- Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
- Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
- O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
- Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
- Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
- Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
- Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
- Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
- Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
- Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
- Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
- Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
- Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
- Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
- Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
- Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
- Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
- Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
- Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
- Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
- Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
- D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
- Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
- Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
- O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
- Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).
