Summary
형광 추적자를 사용하는 개방형 혈관 창 접근 방식은 달팽이관 혈류(CoBF) 측정에 충분한 분해능을 제공합니다. 이 방법은 정상 및 병리학 적 조건에서 마우스에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화에 대한 연구를 용이하게합니다.
Abstract
소리의 변환은 대사적으로 까다로우며, 측벽에 있는 미세혈관구조의 정상적인 기능은 내달팽이관 전위, 이온 수송 및 체액 균형을 유지하는 데 중요합니다. 다양한 형태의 청력 장애가 달팽이관의 비정상적인 미세 순환을 수반하는 것으로 보고됩니다. 달팽이관 혈류(CoBF) 병리가 청력 기능에 미치는 영향에 대한 조사는 실현 가능한 심문 방법이 부족하고 내이에 접근하기 어렵기 때문에 어렵습니다. 형광 생체 내 현미경과 결합 된 측면 달팽이관 벽의 열린 혈관 창은 생체 내에서 CoBF 변화를 연구하는 데 사용되었지만 대부분 기니피그에서, 최근에야 마우스에서 사용되었습니다. 이 논문과 관련 비디오는 마우스 달팽이관의 혈류를 시각화하기위한 열린 혈관 창 방법을 설명합니다. 상세는 1) 마우스로부터 형광 표지된 혈구 현탁액의 제조; 2) 마취된 마우스에서 생체내 현미경 검사를 위한 개방 혈관 창의 구성, 및 3) 영상의 오프라인 기록을 이용한 혈류 속도 및 부피의 측정. 이 방법은 정상 및 병리학적 조건에서 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 조사하기 위해 마우스에서 열린 창 접근 방식을 사용하는 방법을 보여주기 위해 비디오 형식으로 제공됩니다.
Introduction
외측 달팽이관 벽의 미세 순환의 정상적인 기능(나선형 인대 및 선조체 혈관에 있는 모세혈관의 대부분을 구성)은청력 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다1. 비정상적인 CoBF는 소음 유발성 난청, 귀 수종 및 노안 2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 많은 내이 장애의 병태생리학과 관련이 있습니다. 생체 내 CoBF의 시각화는 청력 기능과 달팽이관 혈관 병리 사이의 연관성을 더 잘 이해할 수 있게 해줍니다.
측두골 내 달팽이관의 복잡성과 위치로 인해 CoBF의 직접적인 시각화 및 측정이 불가능하지만 레이저 도플러 유량 측정(LDF)10,11,12, 자기 공명 영상(MRI)13, 형광 생체 내 현미경(FIVM)14, 형광 미세 내시경(FME)15, 내시경 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)16을 포함한 다양한 방법이 CoBF 평가를 위해 개발되었습니다. , 표지 된 마커 및 방사성 태그 된 마이크로 스피어를 혈류에 주입하는 접근법 (광학 미세 혈관 조영술, OMAG) 17,18,19,20. 그러나 이러한 방법 중 어느 것도 FIVM을 제외하고 생체 내 CoBF의 변화를 절대적으로 실시간으로 추적할 수 없었습니다. FIVM은 측면 달팽이관 벽의 혈관 창과 결합하여 다양한 실험실 14,21,22에 의해 다양한 실험 조건 하에서 기니피그에서 사용되고 검증 된 접근법입니다.
형광 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란을 조영제로 사용하고 형광 염료(DiO(3'-디옥타데실록사카르보시아닌 과염소산염, 녹색) 또는 딜(1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염, 빨간색)을 사용하여 마우스의 달팽이관 미세 순환의 구조적 및 기능적 변화를 연구하기 위한 FIVM 방법이 성공적으로 확립되었습니다. 본 연구에서이 방법의 프로토콜은 정상 및 병리학 적 상태 (예 : 소음 노출 후)에서 마우스의 CoBF 변화를 이미징하고 정량화하기 위해 설명되었습니다. 이 기술은 연구자에게 특히 쉽게 사용할 수있는 형질 전환 마우스 모델과 함께 적용 할 때 선조체 혈관의 청력 기능 장애 및 병리와 관련된 CoBF의 기본 메커니즘을 조사하는 데 필요한 도구를 제공합니다.
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Protocol
참고: 이것은 생존이 아닌 수술입니다. 동물 사용과 관련된 모든 절차는 Oregon Health & Science University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 승인 번호 : TR01_IP00000968)에서 검토하고 승인했습니다.
1. 형광표지된 혈액세포의 제조
- 케타민/자일라진 마취액(5mL/kg, 재료 표 참조)을 복강내(i.p.) 주사하여 기증자 마우스(수컷 C57BL/6J ~6주 된 수컷 C5BL/J 마우스)를 마취합니다.
알림: 이 마취 프로토콜은 매우 신뢰할 수 있으며 전신 혈압을 유지합니다. - 마우스를 등 뒤로 눕히고 피부를 열고 핀셋과 해부 가위를 사용하여 흉강을 노출시킵니다. 횡격막을 자르고 클램프 가위를 사용하여 흉골 기저부를 잡고 흉곽을 자르고 들어 올려 심장을 노출시킵니다. 심장 천자로 헤파린 (15IU / mL 혈액)에 1mL의 혈액을 수집하고 4 ° C에서 3 분 동안 3,000 ×g으로 원심 분리합니다. 채혈 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
- 혈장을 제거하고 혈구 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL로 세척하고 3000× g 에서 4°C에서 3분 동안 3x 원심분리합니다.
- 혈액 세포를 PBS 중 1mL의 20mM DiO 또는 Dil로 표지하고 실온23,24에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
- 표지된 혈액 세포를 PBS 1mL로 원심분리 및 세척하고, 4°C에서 3분 동안 3000× g 에서 3회 원심분리하고, 주사 전에 ~0.9mL의 PBS(최종 부피 ~1.3mL)로 30% 헤마토크릿에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
2. 열린 창을 만드는 수술 25
- 멸균 수술 기구와 이미징 플랫폼을 준비하고 드레이프 아래에 가열 패드를 놓습니다(그림 1A). 단계 1.1에 기재된 바와 같이 마우스(~6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스)를 마취하고, 발 반사 및 일반적인 근긴장도를 모니터링하여 마취의 깊이를 확인한다. 동물을 따뜻한 가열 패드에 놓고 직장 온도를 37 ° C로 유지하십시오.
- 혈압과 심장 박동을 모니터링하기 위해 CODATM 모니터 시스템에 동물 꼬리를 놓습니다 ( 재료 표 참조). 마취 상태에서 동물의 수축기 혈압, 이완기 혈압 및 평균 혈압 (MBP)을 기록합니다.
참고: 마취된 상태와 마취되지 않은 상태에서 동물 MBP에는 차이가 없습니다(107 ± 11 mmHg 대 97 ± 7 mmHg). 동물의 심박수는 마취되지 않은 상태(357 ± 12bmp 대 709 ± 3bmp)보다 낮지만(여전히 정상 범위 내에서) 마취 상태에서 안정적입니다. 구속26에 배치 된 동물에서 약간 증가 된 심장 박동이 예상됩니다. - 실체 현미경 ( 재료 표 참조)에서 측면 및 복부 접근을 통해 왼쪽 고막 수포를 열고 고막과 이소골을 그대로 둡니다21.
- 동물의 목 정중선을 따라 머리를 고정하고 움직임을 최소화하도록 배치하여 절개합니다(그림 1B). 이위 근육의 왼쪽 턱밑샘과 후배를 제거하고 소작하십시오.
참고: 수술 중 통증을 줄이기 위해 부프레노르핀을 0.05mg/kg으로 피하 주사합니다. - 흉쇄 유돌근과 수포를 향해 앞쪽으로 뻗어 있는 안면 신경을 식별하여 뼈 수포를 찾아 노출시킵니다.
- 30G 바늘로 뼈 수포를 열고 수술 용 핀셋으로 주변 뼈를 조심스럽게 제거하여 달팽이관과 등골 동맥을 명확하게 볼 수 있으며 내측 여백은 둥근 창 틈새의 가장자리에 놓여 있으며 타원형 창쪽으로 앞쪽으로 쏟아져 나옵니다 (그림 1C, D).
알림: 기관 절개술은기도가 막히지 않도록 수행되며 수술 중 호흡기 문제가있는 경우에만 수행해야합니다. 일반적으로 마취하에있는 대부분의 동물은 호흡이 부드럽습니다. 그러나 동물이 수술 중 기관 절개술을받은 경우 기록 된 혈류를 비교에 사용해서는 안됩니다.
- 동물의 목 정중선을 따라 머리를 고정하고 움직임을 최소화하도록 배치하여 절개합니다(그림 1B). 이위 근육의 왼쪽 턱밑샘과 후배를 제거하고 소작하십시오.
- 작은 칼날(맞춤 밀링된 #16 메스)을 사용하여 얇은 부분에 금이 갈 때까지 정점에서 약 1.25mm 떨어진 마우스 달팽이관의 정점-중간 회전에서 측벽 뼈를 긁습니다. 작은 와이어 후크로 뼈 조각을 제거합니다(그림 1E).
- 정상적인 생리적 조건을 유지하고 혈관 이미지 기록을 위한 광학 보기를 제공하기 위해 절단된 덮개 슬립으로 용기 창을 덮으십시오.
참고: 모든 절차는 주의해서 수행해야 합니다. 체온을 모니터링하는 것 외에도 혈압과 심장 박동을 포함한 동물의 활력 징후도 수술 내내 모니터링해야 합니다.
3. FIVM에 따른 CoBF의 이미징
- 오른쪽 복재 정맥을 따라 ~1cm 절개를 하여 혈관을 노출시킵니다(그림 1F).
- 100μL의 FITC-덱스트란 용액(2000kDa, PBS에서 40mg/mL)과 100μL의 혈액 세포 현탁액(30% 헤마토크릿)을 복재 정맥(그림 1G)을 통해 동물에 연속적으로 주입하여 혈관을 시각화하고 혈류 속도를 추적할 수 있습니다.
- 주사 후 5분 후에 비디오 모니터에서 직접 실시간으로 혈류를 관찰합니다. 긴 작동 거리(W.D.) 대물렌즈(W.D. 30.5mm, 10x, 0.26 개구수)가 장착된 형광 현미경과 다중 대역 여기 필터 및 호환 가능한 방출 필터(재료 표)가 포함된 램프 하우징을 사용하여 혈관을 이미지화합니다. 고해상도 디지털 흑백 전하 결합 장치 카메라(재료 표)를 사용하여 2프레임/초로 비디오를 녹화합니다. 비디오당 350개 이상의 이미지를 수집하여 유속을 성공적으로 분석할 수 있습니다.
알림: 나선형 인대와 선조 혈관의 혈관은 광학 초점을 조정하여 이미지화할 수 있습니다(보충 비디오 1).
4. 비디오 분석
- 적절한 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 용기 직경을 측정하고 획득한 이미지에서 용기를 가로지르는 두 고정 지점 사이의 거리를 결정합니다.
- 이미지 위치들(27) 사이의 공간적 거리 내에서 표지된 혈액 세포의 이동을 추적함으로써 캡처된 비디오 프레임들로부터 혈류 속도를 계산한다.
- 소프트웨어에서 혈류의 비디오를 열고 (피지 [ImageJ]가이 프로토콜에서 사용됨), 이미지의 크기를 설정하십시오.
- 추적 기능을 사용하여 선택한 DiO 염색 혈액 세포를 추적합니다. 유속의 자동 계산을 위해 비디오에서 셀이 이동한 거리와 이미지 프레임 사이의 시간 간격을 사용합니다.
- 다음 방정식에 따라 체적 유량(F)을 계산한다: F = V × A. (V: 속도; A: 선박의 단면적).
5. 소음 노출
- 동물을 철망 케이지에 넣습니다. 소음 노출 부스에서 120dB 음압 레벨의 광대역 소음에 3시간 동안 노출시키고 다음 날 추가로 3시간 동안 노출시킵니다.
참고: 이 실험실에서 일상적으로 사용되는 이 소음 노출 방식은 달팽이관 감도의 영구적인 손실을 초래합니다28.
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Representative Results
측벽에 있는 달팽이관 모세혈관의 외과적 노출 후(그림 1), 열린 혈관 창을 통해 FITC-덱스트란 표지된 혈관에서 딜 표지된 혈액 세포의 생체 내 고해상도 형광 현미경 관찰이 가능했습니다. 도 2A는 마우스 달팽이관 정점-중간 회전 측벽의 모세혈관을 보여주는 FIVM 하에서 촬영한 대표적인 이미지이다. 이 혈관의 루미나는 혈장과 혼합 된 FITC- 덱스 트란의 형광에 의해 가시화됩니다. 혈관 네트워크에 분포 된 개별적으로 표지 된 혈액 세포도이 이미지에서 명확하게 볼 수 있습니다. 두 개의 별개의 네트워크 - 나선형 인대의 모세 혈관 및 선조 혈관의 모세 혈관 -은 위치에 의해 구별된다 (직립 현미경 하에서, 선조 혈관은 나선형 인대 아래에서 광학적으로 실행되며, 더 많은 모세 혈관 루프와 더 작은 혈관(25)을 포함한다). 둘 다 광학 초점 조정으로 혈류를 평가할 수 있습니다. 도 2B, C에 도시된 바와 같이, 나선형 인대의 혈관 밀도는 선조체 혈관의 혈관밀도보다 희박하다.
소음에 노출된 마우스 모델의 혈관 기능은 대조군의 혈관 기능과 비교되었다. CoBF 측정은 소음 노출 2주 후에 수행되었습니다. 그림 3A, B는 대조군 및 소음 노출 그룹의 흐름 패턴을 보여주는 대표적인 이미지입니다. 소음에 노출 된 그룹에서 혈류의 방해 패턴이 나타났습니다 (그림 3B). 이상에는 용기 직경 감소(그림 3C)와 용기 직경의 변동 증가(그림 3D)가 포함되었습니다. 그림 4A, B에 표시된 바와 같이, 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 속도는 DiO 표지 된 혈액 세포의 경로를 추적하여 계산되었습니다 (보충 비디오 2). 결과는 소음 노출 그룹의 혈액 속도와 부피가 대조군보다 현저히 낮았 음을 보여줍니다 (그림 4C, D). 이 데이터는 큰 소리가 혈액 순환에 현저하게 영향을 미치고 혈류를 감소시키고 방해한다는 것을 나타냅니다.
그림 1: 마우스에서 IVM 이미징을 위한 열린 혈관 창 준비. (A) 수술을 위한 기구 및 도구의 준비. (B) 왼쪽 bulla는 측면 및 복부 접근을 통해 노출되었습니다. (C) 수포를 제거한 후 달팽이관을 노출시켰다. (D) (C)의 원에서 달팽이관의 확대 이미지. (E) 달팽이관 측벽 (상자)의 정점-중간 회전에 열린 용기 창이 생성되었습니다. (F 및 G) 복재 정맥을 통해 FITC- 덱스 트란과 표지 된 혈액 세포의 정맥 내 주입. 약어 : OW = 타원형 창; RW = 둥근 창; IVM = 생체 내 현미경; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 측벽에 있는 달팽이관 모세혈관의 대표 이미지. (A) FITC- 덱스 트란 (녹색)으로 표지 된 심상 혈관의 딜 표지 된 혈액 세포 (빨간색, 화살표). (B) FITC- 덱스 트란 (화살표, 녹색)으로 표지 된 나선형 인대 혈관의 DiO 표지 된 혈액 세포 (녹색). 혈관은 드문 드문합니다. (C) FITC- 덱스 트란 (녹색)으로 표지 된 혈관 내의 DiO 표지 된 혈액 세포 (녹색). 혈관이 더 조밀하다는 점에 유의하십시오. 스케일 바: 50 μm 및 100 μm. 약어: 딜 = 1,1-디옥타데실-3,3,3,3-테트라메틸인도카르보시아닌 과염소산염; DiO = 3, 3'- 디 옥타 데실 록사 카르보 시아닌 퍼 클로 레이트; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 소음 노출 2주 후 선조체의 혈관 직경 변화. (A 및 B) 혈관에 FITC-덱스트란(녹색)을 표지하고 대조군에서 DiO(녹색)가 있는 혈액 세포 및 고해상도 IVM으로 소음 노출(NE) 그룹을 표지한 후 혈액 순환의 대표 이미지. (C) 대조군 및 NE 그룹에 대해 계산된 평균 용기 직경. 대조군과 비교하여, 소음 노출군에서 용기 직경이 감소하였다. (n = 18, t (34) = 2.880, ** p = 0.007, 스튜던트 t- 검정, 평균 ± 표준 편차 [SD]). (D) 대조군과 NE 그룹의 용기 직경의 분산. 용기 직경은 대조군보다 NE 그룹에서 훨씬 더 다양했습니다. (n = 6, t (10) = 6.630, ****p < 0.0001, 스튜던트 t-검정, 평균 ± SD). 스케일 바: 100 μm. 약어 : DiO = 3, 3'- 디 옥타 데실 록사 카르보 시아닌 퍼 클로 레이트; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; IVM = 생체 내 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 소음 노출 2 주 후 선조체의 혈류 변화. (A 및 B) 대표 이미지는 대조군 및 소음 노출 그룹의 혈류 속도 측정을 위한 DiO 표지 혈액 세포(녹색)의 추적 경로(빨간색, 녹색 및 파란색 선)를 보여줍니다. (C 및 D) 혈류 속도 (μm / s) 및 체적 유량 (μm3 / s)은 대조군 및 소음 노출 그룹에 대해 각각 계산되었습니다. 소음 노출 그룹의 혈류 유량 및 체적 유량은 대조군보다 낮았습니다 (n = 54, t 속도 (106) = 19.705, **** p속도 < 0.0001; t 부피 (106) = 15.342, ****p부피 < 0.0001, 스튜던트 t-검정, 평균± 표준 편차). 스케일 바: 100 μm. 약어 : DiO = 3, 3'- 디 옥타 데실 록사 카르보 시아닌 과염소산 염1; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; NE 2W = 2주 소음 노출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1 : 나선형 인대와 선조 혈관의 혈관. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2: 대조군 동물의 혈류 속도 계산을 위한 DiO 표지 혈액 세포의 경로 추적. 약어 : DiO = 3, 3'- 디 옥타 데실 록사 카르보 시아닌 과염소산 염. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 마우스 모델의 달팽이관 측벽(및 선조체 혈관)에 있는 모세혈관이 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창 준비에서 형광단 라벨링으로 시각화될 수 있는 방법을 보여줍니다. 마우스 모델은 널리 사용되고 인간의 건강 및 질병을 조사하기 위한 포유동물 모델로서 선호된다. 여기에 설명된 프로토콜은 FIVM 시스템 하에서 열린 혈관 창을 사용하여 마우스 측벽(특히 선조체 혈관에서)에서 CoBF를 이미징하고 조사하기 위한 실현 가능한 접근 방식입니다. 이 방법은 형광 표지된 혈액 세포를 추적자로서 사용하여 혈류 속도 및 부피를 결정하기 위한 충분한 분해능을 제공합니다(그림 3 및 그림 4 ). 이러한 접근법은 혈관 투과성의 평가 및 주위세포 수축성의 검사, 및 순환 골수 세포 이동의 추적과 같은 여러 상이한 용도에 사용될 수 있다(25). 외상, 감염, 소음, 이물질, 이독성 약물 또는 측벽에 영향을 미치는 기타 인자에 대한 반응으로 CoBF의 급성 변화도 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다25,29.
지난 수십 년 동안 LDF, MRI, OMAG, 내시경 LSCI, 내시경 FME 및 혈장에 마이크로스피어 주입을 포함하여 달팽이관 뼈 벽을 제거하지 않고 CoBF를 평가하기 위해 몇 가지 비교적 비침습적인 방법이 확립되었습니다. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 개별 선박의 절대 유량을 평가하는 데 사용할 수 없습니다. 예를 들어, 비침습적 내시경 FME는 둥근 창 근처의 제한된 영역을 이미지화하는 데만 사용할 수 있지만 선조체 혈관의 혈류는 이미징하는 데 사용할 수 없습니다. 그러나 선조체 혈관의 혈액 순환은 청각 민감성에 필수적인 EP, 이온 수송 및 내림프액 균형을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다(Zhang et al., 2021). OMAG는 손상되지 않은 달팽이관의 혈류를 시각화하는 데에도 유용하지만, 마우스 모델19의 선조체 혈관에서 개별 모세혈관을 이미징하기에는 해상도가 너무 낮습니다.
FIVM과 함께 열린 혈관 창을 사용하면 달팽이관 측벽의 혈류를 실시간으로 시각화하고 기록된 영역의 혈관 직경 및 혈류 속도를 측정할 수 있습니다. IVM 시스템은 다른 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 동물은 필요에 따라 편리하게 배치되고 조작 될 수 있습니다. 형광 표지된 혈장과 혈액 세포의 대비를 조정하여 혈관 구조의 시각화를 최적화하고 관련 구조를 강조할 수 있는 유연성이 있습니다. FITC 접합 트레이서의 다양한 분자량을 선택하여 혈관 투과성 평가를 최적화할 수도 있습니다. e 혈장을 표지하는 데 사용되는 FITC-덱스트란과 달리 혈액 세포를 표지하기 위해 딜(lex = 550 nm; lem = 564 nm) 또는 Dio(lex = 484 nm; lem = 501 nm)를 사용할지 여부는 실험 목표에 따라 결정됩니다. 일반적으로 Dil은 혈관 내강과 개별 혈액 세포의 시각화에 더 나은 대비를 제공하는 반면, Dio는 동일한 획득 채널에서 혈액 세포와 내강의 시각화에 동시 이미징을 사용할 때 선호됩니다. 또한 추적은 혈관의 모든 혈액 세포가21로 표지된 경우 혈액 세포 형광이 혈관 내강 형광을 가리기 때문에 적은 수의 표지된 세포로 가장 잘 수행됩니다. 또한, 혈액에 투여되는 용액의 양을 제한하고, 달팽이관(30)의 희석 및 점도 관련 혈류 변화를 최소화하기 위해 주의를 기울여야 한다.
전반적으로 이 방법은 강력하며 염증, 소음 및 노화와 같은 정상 및 병리학적 조건에서 CoBF의 구조적 및 기능적 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 중요하게도, 수술 중에 일정하고 정상적인 EP가 유지될 수 있으며, 이는 충분히 주의 깊게 수행될 때 절차가 달팽이관 기능에 무해함을 나타냅니다(25). 그러나 열린 혈관 창을 성공적으로 설정하려면 높은 수준의 수술 기술이 필요합니다. 예를 들어, 달팽이관 측벽의 뼈를 제거하는 데 주의를 기울여 림프 주위액의 손실과 달팽이관 나선형 인대의 외층에 대한 미세 손상을 방지해야 합니다. 이는 인공와우 항상성에 부정적인 영향을 미치고 영상을 손상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) 및 Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi)의 Medical Research Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
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