Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Published: September 22, 2020 doi: 10.3791/61871
Automatic Translation
1, 2
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

Summary

Este protocolo describe un método eficiente libre de células para la producción de proteoliposoma de alta calidad por el método de diálisis bicapa utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. Este método proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Abstract

Las proteínas de membrana desempeñan funciones esenciales en una variedad de procesos celulares y realizan funciones vitales. Las proteínas de membrana son médicamente importantes en el descubrimiento de fármacos porque son los objetivos de más de la mitad de todos los fármacos. Un obstáculo para la realización de estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de las proteínas de membrana, así como el desarrollo de anticuerpos, ha sido la dificultad para producir grandes cantidades de proteína de membrana de alta calidad con conformación y actividad correctas. Aquí describimos un "método de diálisis bicapa" utilizando un sistema libre de células germinales de trigo, liposomas y copas de diálisis para sintetizar eficientemente proteínas de membrana y preparar proteoliposomas purificados en poco tiempo con una alta tasa de éxito. Las proteínas de membrana se pueden producir tanto como en varios miligramos, como GPCR, canales iónicos, transportadores y tetraspaninas. Este método libre de células contribuye a reducir el tiempo, el costo y el esfuerzo para preparar proteoliposas de alta calidad, y proporciona medios adecuados para el análisis funcional de proteínas de membrana, detección de objetivos farmacológicos y desarrollo de anticuerpos.

Introduction

Las proteínas de membrana son uno de los objetivos farmacológicos más importantes en el diagnóstico y la terapéutica. De hecho, la mitad de los pequeños fármacos compuestos diana son proteínas de membrana, como los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) y los canales iónicos1. A lo largo de los años, los investigadores han estado trabajando en estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales de proteínas de membrana para dilucidar su estructura y función 2,3. El desarrollo de anticuerpos monoclonales contra proteínas de membrana también se realiza activamente con el fin de acelerar los estudios funcionales y estructurales y desarrollar aplicaciones terapéuticas y diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos estos estudios requieren una gran cantidad de proteínas de membrana de alta calidad10. Por ejemplo, se necesitan varios miligramos de proteínas de membrana purificadas con conformación natural para el desarrollo de anticuerpos. Se requiere una cantidad mucho mayor de proteínas de membrana altamente purificadas para la cristalografía de rayos X. Sin embargo, la producción masiva de proteínas de membrana sigue siendo un cuello de botella en la investigación de proteínas de membrana11. Las proteínas de membrana tienen estructuras complicadas con una o más hélices transmembrana y juegan un papel importante en la homeostasis celular. La sobreexpresión heteróloga de proteínas de membrana conduce a múltiples obstáculos, como la agregación de proteínas de membrana que se acumulan a altas concentraciones locales o la alteración de las vías de señal celular. Incluso si la expresión es exitosa, los pasos posteriores de preparación de la muestra también enfrentan dificultades. Por ejemplo, la preparación del proteoliposoma requiere habilidades de alto nivel y experiencia profesional en solubilización, purificación y estabilización de proteínas de membrana, y también cuesta mucho esfuerzo y tiempo12,13.

Por otro lado, algunas tecnologías avanzadas han surgido en las últimas décadas para producir proteínas sin el uso de células vivas 14,15,16,17,18. La tecnología de síntesis de proteínas libres de células reconstituye la reacción de traducción en un tubo de ensayo. Dado que no hay limitaciones que tiene el sistema de expresión celular, los sistemas libres de células tienen potencial para sintetizar una variedad de proteínas que son difíciles de expresar o muestran toxicidad en las células. El extracto celular purificado o la maquinaria traslacional reconstituida se mezcla con ARNm plantilla, aminoácidos y fuentes de energía, y las proteínas recombinantes se sintetizan en poco tiempo. En cuanto a la síntesis de proteínas de membrana, a la reacción libre de células se añaden algunos tipos de andamios compuestos de lípidos o anfifilios, como liposomas, biceles, nanodiscos o copolímeros 19,20,21,22,23,24. Las proteínas de membrana sintetizadas interactúan con los andamios y pueden estabilizarse en agua. Las proteínas de membrana sintetizadas libres de células se utilizan ampliamente en estudios funcionales y producción de anticuerpos 25,26,27,28,29,30,31.

En este protocolo, describimos un método eficiente libre de células de producción de proteoliposomas utilizando un sistema libre de células de trigo y liposomas. El sistema de síntesis de proteínas libres de células de trigo es un potente sistema de traducción in vitro que utiliza extracto de germen de trigo 15,32,33. El germen de trigo contiene una gran cantidad de maquinaria de traducción y pocos inhibidores de traducción. La maquinaria de traslación en el trigo, un miembro de los eucariotas, es adecuada para traducir proteínas eucariotas, y su eficiencia de traducción apenas se ve afectada por el uso del codón del ARNm plantilla. Utilizando el sistema libre de células de trigo, hemos sintetizado una variedad de proteínas que incluyen proteínas quinasas 34,35, ligasas de ubiquitina36, factores de transcripción37 y proteínas de membrana con altas tasas de éxito. Para la producción de proteínas de membrana, agregamos liposoma de vesícula lipídica a la mezcla de traducción como andamio19,38. Los dominios hidrofóbicos de la proteína de membrana interactúan con la bicapa lipídica y se integran espontáneamente con el liposoma. La centrifugación por gradiente de densidad se utiliza para separar estrictamente el proteoliposoma de las proteínas endógenas del trigo, aunque una centrifugación común de la mezcla de reacción de traslación es suficiente para una purificación simple del proteoliposoma20. Muchos tipos de proteínas integrales de membrana han sido sintetizadas utilizando el sistema libre de células de trigo y aplicadas para diversas investigaciones y desarrollos 25,38,39,40,41,42,43,44. Además, desarrollamos el "método de diálisis bicapa" para la producción a gran escala45,46. En este método, el dispositivo de diálisis tipo copa se sumerge en el tampón de alimentación del sustrato, y se forman dos capas de mezcla de reacción de traducción y tampón de alimentación de sustrato en la copa, como se muestra en la Figura 1. El suministro continuo de sustratos y la eliminación del subproducto pueden llevarse a cabo de manera eficiente tanto en la parte superior como en la inferior de la mezcla de reacción durante mucho tiempo, lo que conduce a una excelente eficacia de traducción (Figura 2A y Figura 2B)45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación del plásmido de expresión de pEU

NOTA: El plásmido de expresión de pEU debe incluir el codón de inicio, el marco de lectura abierto de la proteína de la membrana diana y el codón de parada en el fragmento (ver Figura 1). Agregue secuencias de etiquetas de detección/purificación en la posición adecuada cuando sea necesario. La digestión enzimática de restricción o la clonación sin fisuras son aplicables para la subclonación. Aquí describimos un protocolo utilizando un método de clonación sin fisuras.

  1. Preparar insertar fragmento de ADN.
    1. Amplificar el gen de interés mediante PCR utilizando la plantilla de ADNc, cebador 1 y cebador 2. El cebador 1 y el cebador 2 contienen superposiciones de 15 pb para una clonación perfecta, respectivamente (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: No incluya secuencias para ser procesadas y eliminadas de la proteína madura en las células (por ejemplo, secuencia de señal). El procesamiento de la proteína sintetizada no se realiza en el sistema libre de células de trigo. No agregue la secuencia de Kozak. El vector pEU-E01-MCS tiene potenciador de traslación E01.
    2. Agregue 1/25 de volumen de enzima de restricción DpnI al producto de PCR para eliminar el ADN plásmido plantilla. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Utilice un kit de purificación por PCR para purificar el producto de PCR y ajustar la concentración a 20-50 ng/μL.
  2. Linealizar el vector pEU-E01-MCS.
    1. Realizar PCR inversa utilizando pEU-E01-MCS, cebador 3 y cebador 4.
    2. Agregue 1/25 volumen de enzima de restricción DpnI al producto de PCR inversa. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Utilice un kit de purificación de PCR para purificar el producto de PCR según la recomendación del fabricante. Ajustar la concentración a 20-50 ng/μL.
  3. Mezcle 2 μL de fragmento de ADN de inserto, 2 μL de vector linealizado y 4 μL de 2x mezcla de enzimas de clonación sin costuras.
  4. Transforme la cepa JM109 de Escherichia coli con el producto de clonación sin costuras. Usando un esparcidor, extienda la suspensión bacteriana en una placa de agar LB-ampicilina.
    NOTA: El vector pEU tiene un marcador de resistencia a la ampicilina.
  5. Confirmar la secuencia del plásmido de expresión construido utilizando el cebador 5 y el cebador 6 del lado 5' y 3' de la SQM en plásmido pEU, respectivamente.
  6. Amplificar y purificar los plásmidos de expresión.
    1. Cultivar la cepa JM109 de E. coli transformada por plásmido en 150 ml de medio LB-ampicilina a 37 °C y 125 golpes por minuto agitando durante la noche.
    2. Extraiga y purifique los plásmidos utilizando el kit midi de preparación de plásmidos disponible comercialmente. Disolver plásmidos en 500 μL de tampón TE.
      PRECAUCIÓN: No utilice un mini kit de preparación para la extracción de plásmidos. No proporciona suficiente calidad y cantidad de plásmido.
    3. Añadir 500 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Mezclar vigorosamente durante 5 min, y centrifugar durante 5 min a 17.800 x g y temperatura ambiente. Transfiera la solución plásmida superior a un nuevo tubo.
      PRECAUCIÓN: Use guantes desechables para proteger la piel del fenol y el cloroformo.
      NOTA: Para eliminar la contaminación de la RNasa del kit de extracción de plásmidos, purifique los plásmidos utilizando la purificación de fenol-cloroformo.
    4. Agregue 500 μL de cloroformo para eliminar el fenol por completo. Mezclar vigorosamente durante 5 min, y centrifugar durante 5 min a 17.800 x g y temperatura ambiente. Transfiera la solución plásmida superior a un nuevo tubo.
    5. Añadir 2,5 volúmenes de etanol y 1/8 de volumen de acetato de amonio 7,5 M, y conservar a -30 °C durante 1 h.
    6. Centrifugadora a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min. Lave el pellet con 500 μL de etanol al 70%. Retire el sobrenadante con cuidado y deje que el pellet se seque durante 5 minutos.
    7. Disolver completamente los plásmidos de expresión en 100 μL de agua ultrapura. Medir la concentración de plásmidos con absorbancia a 260 nm. Ajuste la concentración a 1 mg/ml.

2. Transcripción in vitro

PRECAUCIÓN: Use tubos y puntas de plástico sin DNasa y sin nucleasa en los pasos de transcripción y traducción. Evite esterilizar en autoclave los productos de plástico para evitar la contaminación.

  1. Cosecha agua ultrapura en un nuevo tubo de plástico.
    PRECAUCIÓN: No utilice agua tratada con DEPC porque el DEPC residual inhibe fuertemente la reacción. Use agua ultrapura recién purificada para la transcripción y traducción.
  2. Preparar la mezcla de reacción de transcripción mezclando 115,2 μL de agua ultrapura, 40 μL de tampón de transcripción LM, 20 μL de mezcla NTP, 2,4 μL de 80 U/μL de inhibidor de la RNasa, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polimerasa y 20 μL de plásmidos de expresión de pEU de 1 mg/ml. Mezclar los reactivos suavemente invirtiendo. Realiza un giro rápido.
  3. Incubar la reacción de transcripción a 37 °C durante 6 h.
  4. Mezclar la reacción suavemente invirtiendo y girar rápidamente hacia abajo. Úselo inmediatamente para la traducción, de lo contrario congele y guárdelo a -80 ° C.
  5. Confirmar el producto de transcripción mediante electroforesis.
    1. Mezclar 100 mL de 1x tampón TAE y 1 g de agarosa. Calentar la suspensión en un horno de microondas para preparar gel TAE de agarosa al 1%.
    2. Tomar 1 μL de reacción de transcripción y mezclar con 3 μL de agua y 4 μL de 2x colorante de carga.
      NOTA: No se requiere la desnaturalización del ARN.
    3. Cargue 4 μL de la mezcla y 2 μL de marcador de escalera de ADN al gel TAE de agarosa.
    4. Electroforeso a 100 V durante 20 min.
    5. Manchar el gel en bromuro de etidio durante 30 min. Verifique el patrón de banda de escalera del ARNm usando un transiluminador UV y un generador de imágenes de gel.
      NOTA: Cuando se observa una banda manchada de menos de 500 pb, se sospecha degradación del ARNm.

3. Preparación de materiales para traducción

  1. Prepare el búfer de traducción.
    1. Mezcle 27 ml de agua ultrapura recién preparada y 0,75 ml de cada solución madre 40x para S1, S2, S3 y S4, respectivamente, en un tubo de 50 ml.
      NOTA: Module las cantidades de materiales de acuerdo con la cantidad final requerida de 1x búfer de traducción.
      PRECAUCIÓN: No almacene ni vuelva a congelar el exceso de búfer de traducción 1x después de su uso.
  2. Prepare una solución madre de creatina quinasa. Disuelva la creatina quinasa liofilizada en agua ultrapura hasta una concentración final de 20 mg / ml. Dispensar la solución en pequeñas cantidades (10 a 50 μL cada una) en tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml. Congelar los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
    PRECAUCIÓN: No vuelva a congelar la solución de creatina quinasa después de la descongelación.
  3. Lave las tazas de diálisis (tamaño 0.1 ml) para eliminar el glicerol de la membrana de diálisis.
    NOTA: Hay varias tazas de diálisis de diferentes tamaños. Las tazas pequeñas (0,1 ml) se utilizan para la prueba a pequeña escala (sección 5.4) y las tazas grandes (2 ml) para la producción a gran escala (sección 5.5), respectivamente. El paso de lavado de la membrana de diálisis de tazas de gran tamaño es evitable.
    1. Ponga 1 ml de agua ultrapura en un nuevo tubo de 1,5 ml. Inserte una taza de diálisis de tamaño pequeño (0.1 ml) en el tubo. Agregue 0.5 ml de agua ultrapura en la taza.
    2. Incubar durante más de 30 min a temperatura ambiente.

4. Preparación de liposomas

NOTA: Aquí describimos dos protocolos para la preparación de liposomas. Uno utiliza liposomas liofilizados listos para usar (sección 4.1), mientras que el otro produce liposomas hidratando una película lipídica delgada (sección 4.2).

  1. Preparar liposomas usando liposomas liofilizados.
    NOTA: Una forma más fácil de producir proteoliposoma es usar liposoma de asolectina disponible comercialmente. La asolectina es un tipo de lípido natural extraído de la soja.
    1. Abra el vial que contiene 10 mg de liposomas de asolectina liofilizados (ver la tabla de materiales) y añada 200 μL de tampón de traducción (sección 3.1) al fondo del vial. Sellar el vial e incubar durante 10 min.
    2. Mezclar vigorosamente poniendo el vial en el mezclador de vórtices durante 1 min.
    3. Inserte el vial en un tubo de 50 ml. Girar el tubo centrifugando a 500 x g durante 1 min.
    4. Con una pipeta, transfiera la suspensión liposomal de asolectina (50 mg de lípidos/ml) a un nuevo tubo de 1,5 ml. Use el liposoma inmediatamente para la traducción, de lo contrario congele en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 ° C.
  2. Preparar los liposomas hidratando una película lipídica delgada.
    1. Si un lípido se vende en forma de polvo, disolver en cloroformo o disolvente orgánico apropiado a una concentración de 10-100 mg/ml.
      NOTA: Se puede preparar una película lipídica delgada utilizando lípidos anfifílicos purificados y/o sintetizados. El método de purificación de la asolectina se describe anteriormente38. Los lípidos modificados funcionalmente, como los lípidos biotinilados, los lípidos fluorescentes y los lípidos adyuvantes, se pueden agregar a los lípidos basales para producir liposomas funcionales.
    2. Transfiera la solución lipídica que contiene 50 mg de lípidos a un matraz de evaporación.
    3. Usando un evaporador rotativo, evapore el disolvente y extienda uniformemente el lípido en la pared del fondo del matraz para formar una película delgada de lípidos.
    4. Poner el matraz en un desecador al vacío y dejar bajo presión negativa durante la noche para eliminar el disolvente por completo.
    5. Añadir 1 ml de tampón de traslación al matraz de evaporación. Gire el matraz para extender el tampón sobre la película lipídica delgada. Incubar durante 5 min para hidratar la película.
    6. Sonicar el matraz con un homogeneizador ultrasónico o limpiador ultrasónico. Cambie el ángulo del matraz de vez en cuando para permitir que la solución toque bien la película. Asegúrese de que la película lipídica delgada se pela de la parte inferior y se emulsiona completa y homogéneamente.
      NOTA: La micrografía electrónica de lípidos biotinilados que contienen liposomas se muestra en la Figura 1.
    7. Transfiera la suspensión del liposoma (50 mg de lípidos/ml) a un nuevo tubo de 1,5 ml. Si no se va a utilizar inmediatamente, congelar los liposomas en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.

5. Traducción in vitro

  1. Descongele el extracto de germen de trigo rápidamente flotando los tubos en agua a temperatura ambiente durante unos minutos. Después de descongelar, mezcle inmediatamente suavemente invirtiendo los tubos, gire hacia abajo y enfríe en hielo hasta que lo use.
    NOTA: Congelar el extracto de germen de trigo en nitrógeno líquido después de su uso y almacenar a -80 °C. Soporta varios ciclos de congelación/descongelación.
  2. Descongele 20 mg/ml de solución madre de creatina quinasa. Mezclar 5 μL de solución madre y 45 μL de tampón de traducción para preparar 2 mg/ml de solución de trabajo de creatina quinasa.
    PRECAUCIÓN: No se recomienda volver a congelar la creatina quinasa.
  3. Descongele los liposomas o ARNm cuando sea necesario.
  4. Realizar una traducción de proteínas a pequeña escala.
    1. Retire el agua tanto de la sonda como de la taza de diálisis (0,1 ml), tal como se preparó en el paso 3.3.2.
    2. Inyecte 1 ml y 300 μL de tampón de traducción en el tubo y la copa de diálisis, respectivamente.
      PRECAUCIÓN: En caso de que la parte inferior de la copa de diálisis no alcance la superficie del tampón de traducción en el tubo de 1,5 ml, inyecte 50-100 μL adicionales de tampón en el tubo.
    3. Preparar la mezcla de reacción de traducción mezclando 15,6 μL de tampón de traducción, 2,4 μL de 2 mg/ml de creatina quinasa, 12 μL de liposomas de 50 mg/ml, 15 μL de extracto de germen de trigo y 15 μL de ARNm. Mezclar suavemente invirtiendo los tubos, y girar hacia abajo.
    4. Aspirar 60 μL de la mezcla de reacción de traslación utilizando una pipeta de 200 μL.
    5. Inserte la punta de la pipeta en la superficie inferior del tampón de traducción en la copa de diálisis. Pipetea la mezcla de reacción lenta y suavemente. Cubra la taza de diálisis con una tapa para evitar la evaporación.
      NOTA: La mezcla de reacción se hunde naturalmente hasta el fondo de la taza y forma una bicapa. No perturbe la bicapa mezclando o agitando la taza.
  5. Realizar una traducción a gran escala (Figura 1).
    1. Vierta 22 ml de tampón de traducción en un tubo de 25 ml. Inserte una taza de diálisis de tamaño grande (2 ml) en el tubo y agregue 2 ml de tampón de traducción en el vaso.
    2. Preparar una mezcla de reacción de traducción mezclando 130 μL de tampón de traducción, 20 μL de 2 mg/ml de creatina quinasa, 100 μL de 50 mg/ml de liposoma, 125 μL de extracto de germen de trigo y 125 μL de ARNm. Mezclar suavemente por pipeteo.
    3. Aspirar toda la mezcla de reacción de traslación (500 μL) utilizando una pipeta de 1.000 μL. Inyecte la mezcla de reacción de traducción en la copa de diálisis de la misma manera que se describe en el paso 5.4.5. Cubra la taza de diálisis con una tapa para evitar la evaporación.
  6. Incubar las reacciones a 15 °C durante 24 h.
  7. Mezclar bien la reacción en la taza de diálisis por pipeteo. Transfiera la suspensión de proteoliposoma crudo a un tubo nuevo.
    NOTA: Se recomienda un tubo de fondo plano de 1,5 ml para recoger el proteoliposoma de la traducción a pequeña escala. Después de la centrifugación, los liposomas forman gránulos compactos y fácilmente visibles en la esquina inferior del tubo.

6. Purificación de proteoliposomas

  1. Centrifugar el tubo que contiene la suspensión de proteoliposoma crudo a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min.
  2. Retire el sobrenadante. Suspender el pellet de proteoliposoma en PBS (pequeña escala: 1 mL, gran escala: 10 mL) por pipeteo.
  3. Repita la centrifugación y el lavado de los proteoliposomas para otros dos círculos.
  4. Después del lavado, agregue una pequeña cantidad de PBS y vuelva a suspender bien el pellet de proteoliposoma mediante pipeteo. Mida el volumen de la suspensión con una micropipeta. Agregue PBS para ajustar el volumen a 60 μL (escala pequeña) o 500 μL (escala grande). Transfiera la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  5. Transfiera 10 μL de suspensión proteoliposoma a un nuevo tubo de PCR para SDS-PAGE. Divida el resto de las muestras en porciones más pequeñas para usarlas cuando sea necesario. Congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.

7. Tinción SDS-PAGE y CBB

  1. Añadir 70 μL de agua y 40 μL de tampón de muestra 3x SDS-PAGE a 10 μL de suspensión proteoliposómica.
    PRECAUCIÓN: No hierva la muestra SDS-PAGE, ya que las proteínas de membrana se agregan, y apenas penetran en el gel de acrilamida en la electroforesis. Además, agregue suficiente agente reductor al tampón de muestra SDS-PAGE (por ejemplo, 2-mercaptoetanol al 3% de concentración final) para evitar la oxidación.
  2. Coloque un gel SDS-PAGE de gradiente del 5% al 20% en una cámara de electroforesis. Carga 3 μL, 6 μL, 12 μL de muestras de proteoliposomas, 2 μL de marcador de tamaño de proteína y series estándar BSA también.
  3. Electroforeso a 52 mA, 400 V durante 30 min.
  4. Mancha el gel con tinte CBB durante 1 h. Decolorar en agua caliente y escanear la imagen de gel.
  5. Usando el software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), cuantifique la intensidad de la banda de la proteína de membrana en cada carril. Estimar la cantidad de proteínas de membrana sintetizadas con series estándar BSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando este protocolo, se pueden obtener proteoliposomas parcialmente purificados en poco tiempo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Veinticinco GPCR de Clase A, B y C se sintetizaron con éxito utilizando el método de diálisis bicapa (pequeña escala) y se purificaron parcialmente por centrifugación y lavado tampón. Aunque la cantidad de proteínas sintetizadas varía según el tipo de proteína, generalmente se pueden sintetizar de 50 a 400 μg de proteínas de membrana por reacción cuando se usan tazas de diálisis grandes. Se pueden producir fácilmente varios miligramos de proteínas de membrana aumentando el número de reacciones, debido a la alta escalabilidad del sistema libre de células de trigo. Una prueba previa con una pequeña taza de diálisis es suficiente para determinar la eficacia de producción de la proteína diana en el método de diálisis bicapa. De acuerdo con la productividad obtenida, se puede estimar la cantidad de proteína diana que se producirá utilizando grandes tazas de diálisis.

Este protocolo es adecuado para la expresión de proteínas de membrana, particularmente para aquellos con múltiples hélices transmembrana. En la mayoría de los casos, las proteínas de membrana con tres o más hélices transmembrana se incorporan fácilmente a los proteoliposomas después de la síntesis (Figura 2B), lo que hace una buena productividad de los proteoliposomas. Las proteínas de hélice transmembrana simple generalmente se sintetizan sin problemas; Sin embargo, apenas se integran en liposomas debido a la pequeña región hidrofóbica. En cuanto a las proteínas con dos hélices transmembrana, si están o no ancladas a liposomas depende de la forma en que están expuestas sus hélices transmembrana.

Los proteoliposomas sintetizados se recolectan por centrifugación simple y se purifican parcialmente con un tampón de lavado, lo que acorta en gran medida el proceso de purificación de las proteínas de membrana. Aunque tanto las membranas biológicas como las proteínas de membrana se han eliminado de los extractos de germen de trigo de antemano, pequeñas cantidades de proteínas de trigo a veces se coprecipitan al unirse a liposomas o proteínas de membrana sintetizadas (Figura 2A). Tales contaminantes proteicos son difíciles de eliminar mediante una simple centrifugación y lavado amortiguador. Cuando se requiere una proteína de membrana altamente purificada, es necesario solubilizar los proteoliposomas parcialmente purificados con un surfactante y purificarlos por cromatografía en columna.

Figure 1
Figura 1: Esquema de producción de proteoliposomas libres de células. SP6, secuencia promotora SP6; E01, E01 secuencia potenciadora de la traducción; Ampr: gen de resistencia a la ampicilina; DTT, ditiothreitol. La micrografía electrónica muestra el marcado de inmunooro de liposomas que contienen lípidos biotinilados. Bar, 0,2 μm. Esta imagen de micrografía electrónica fue de la Figura 1D en Takeda et al., 201545. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de la producción de proteoliposomas por el método de diálisis bicapa. (A) Imagen SDS-PAGE de GPCR sintetizados libres de células. Veinticinco GPCR seleccionados se sintetizaron por el método de diálisis bicapa. Los proteoliposomas se purificaron parcialmente y se aplicaron a la tinción SDS-PAGE y CBB. Las puntas de flecha indican los GPCR objetivo. (B) Comparación de las producciones de proteínas de membrana entre diferentes métodos de traducción. La proteína del receptor de dopamina D1 (DRD1) fue sintetizada por cada método en la misma proporción de extracto de germen de trigo, liposomas y ARNm, respectivamente. El proteoliposoma DRD1 se purificó parcialmente por centrifugación y se sometió a tinción SDS-PAGE y CBB. (C) Etiquetado inmunooro del complejo DRD1-biotina/liposoma. DRD1 fue biotinilada enzimáticamente por BirA biotina ligasa. Bar, 0,2 μm. Las puntas de flecha en blanco indican DRD1-biotina en liposomas. Esta figura se modificó de la Figura 1 en Takeda et al., 201545. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aplicación de proteoliposomas funcionales. (A) Inmunización del proteoliposoma adyuvante que contiene lípidos. (B) Ensayo de interacción basado en liposomas biotinilados (BiLIA). La interacción entre la proteína de membrana y el anticuerpo de proteína antimembrana fue detectada por AlphaScreen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El protocolo presentado proporciona un método para producir proteínas de membrana con una alta tasa de éxito. Este protocolo es simple, altamente reproducible y fácil de escalar. También tiene el potencial de reducir el tiempo y el costo de los experimentos que consumen una gran cantidad de proteínas de membrana. El método de diálisis bicapa mejora la productividad de 4 a 10 veces en comparación con el método bicapa o el método de diálisis (Figura 2B)45. En un caso extremo, el rendimiento de un canal iónico y un transportador aumentó 30 y 20 veces, respectivamente, con el método de diálisis bicapa que con el método bicapa (datos no mostrados). La alta productividad de este protocolo es una ventaja en la producción de antígenos para la inmunización. Los proteoliposomas se utilizan a menudo como antígenos inmunizantes para el desarrollo de anticuerpos anti-proteína de membrana. Las proteínas de membrana altamente concentradas y purificadas incrustadas en el proteoliposoma estimulan eficazmente la respuesta inmune e inducen anticuerpos41,47. Usando este método de diálisis bicapa, los proteoliposomas que transportan varios miligramos de proteínas de membrana para fines de inmunización se pueden preparar fácilmente en unos pocos días. De hecho, nuestro grupo ha sintetizado GPCRs, canales iónicos y claudinas utilizando este protocolo e inmunizado ratones con los productos para obtener anticuerpos monoclonales contra ellos31,41,45. Algunos de los anticuerpos monoclonales obtenidos fueron verificados como anticuerpos funcionales, como anticuerpos de alta afinidad, anticuerpos sensibles a la conformación, anticuerpos aplicables a la citometría de flujo y anticuerpos inhibitorios, lo que indica que este protocolo es capaz de producir proteínas de membrana con conformaciones funcionalmente correctas.

Otro beneficio atractivo de este protocolo es permitir la producción de proteoliposomas a los que se les asignan funciones específicas utilizando lípidos modificados, como lípidos biotinilados, lípidos fluorescentes o lípidos adyuvantes. Los proteoliposoma preparados con funciones específicas son útiles y aplicables a una amplia gama de experimentos. Por ejemplo, los proteoliposomas adyuvantes que contienen lípidos, como el lípido A48 o el lípido monofosforilo A (MPLA)49, son antígenos inmunizantes convenientes, ya que pueden administrarse directamente para inmunizar ratones sin emulsión. Los lípidos adyuvantes estimulan eficazmente la respuesta inmune en animales huéspedes, induciendo anticuerpos contra proteínas de membrana diana (Figura 3A). De hecho, hemos inducido con éxito anticuerpos aplicables a la citometría de flujo mediante la inmunización de ratones con proteoliposoma31 que contiene MPLA. Además, los proteoliposomas preparados a partir de lípidos biotinilados son sondas ideales para los ensayos de detección. Desarrollamos un método de cribado de alto rendimiento para seleccionar anticuerpos antimembrana utilizando proteoliposomas biotinilados y AlphaScreen (método BiLIA) (Figura 3B)45. Sandwich ELISA también se puede construir fácilmente utilizando proteoliposas biotinilados y placas recubiertas de estreptavidina.

Finalmente, hay dos advertencias importantes que deben abordarse al usar este método. En primer lugar, la formación de enlaces disulfuro puede ser insuficiente debido a las altas concentraciones de TDT en el tampón de traducción, que posiblemente afectan la estructura de algunos tipos de proteínas de membrana15. Aunque los enlaces disulfuro pueden formarse después de que el reductor se elimina durante el proceso de purificación, posiblemente se formen en un tipo diferente en lugar de los naturales. La otra es que las proteínas de membrana no están glicosiladas. Las enzimas requeridas para la glicosilación están teóricamente ausentes en el sistema libre de células porque durante el proceso cuando se produce el extracto de germen de trigo, se han eliminado las biomembranas, incluidas Golgi y ER. Dado que la falta de enlaces disulfuro y glicosilación puede causar diferentes conformaciones, se debe considerar y evaluar cuidadosamente el diseño experimental, particularmente cuando las modificaciones postraduccionales son críticas para la expresión funcional de las proteínas de acuerdo con los propósitos experimentales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de AMED bajo el número de subvención JP20am0101077. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI Número de subvención 20K05709.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Tags

Bioquímica Número 163 proteína de membrana proteoliposoma síntesis de proteínas libres de células extracto de germen de trigo desarrollo de anticuerpos GPCR canal iónico transportador
Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free… More

Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter