Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv cellefri metode for produksjon av proteoliposom av høy kvalitet ved dobbeltlagsdialysemetode ved bruk av hvetecellefritt system og liposomer. Denne metoden gir egnede midler for funksjonell analyse av membranproteiner, screening av legemiddelmål og antistoffutvikling.
Abstract
Membranproteiner spiller viktige roller i en rekke cellulære prosesser og utfører vitale funksjoner. Membranproteiner er medisinsk viktige i narkotikaforskning fordi de er mål for mer enn halvparten av alle legemidler. Et hinder for å gjennomføre biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier av membranproteiner samt antistoffutvikling har vært vanskeligheten med å produsere store mengder høykvalitets membranprotein med riktig konformasjon og aktivitet. Her beskriver vi en "dobbeltlagsdialysemetode" ved hjelp av et hvetekimcellefritt system, liposomer og dialysekopper for effektivt å syntetisere membranproteiner og tilberede rensede proteoliposomer på kort tid med høy suksessrate. Membranproteiner kan produseres så mye som i flere milligram, for eksempel GPCR, ionkanaler, transportører og tetraspaniner. Denne cellefrie metoden bidrar til å redusere tid, kostnader og krefter for å forberede proteoliposomer av høy kvalitet, og gir egnede midler for funksjonell analyse av membranproteiner, screening av legemiddelmål og antistoffutvikling.
Introduction
Membranproteiner er et av de viktigste stoffmålene i diagnose og terapi. Faktisk er halvparten av små sammensatte legemidler rettet mot membranproteiner, slik som G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) og ionkanaler1. Gjennom årene har forskere jobbet med biokjemiske, biofysiske og strukturelle studier av membranproteiner for å belyse deres struktur og funksjon 2,3. Utvikling av monoklonale antistoffer mot membranproteiner utføres også aktivt for å akselerere funksjonelle og strukturelle studier og for å utvikle terapeutiske og diagnostiske applikasjoner 4,5,6,7,8,9. Alle disse studiene krever en stor mengde membranproteiner av høy kvalitet10. For eksempel er det nødvendig med flere milligram rensede membranproteiner med naturlig konformasjon for antistoffutvikling. En mye større mengde høyt rensede membranproteiner er nødvendig for røntgenkrystallografi. Imidlertid er masseproduksjon av membranproteiner fortsatt en flaskehals i membranproteinforskning11. Membranproteiner har kompliserte strukturer med en eller flere transmembrane helices og spiller viktige roller i cellehomeostase. Heterolog overekspresjon av membranproteiner fører til flere hindringer som aggregering av membranproteiner som akkumuleres ved høye lokale konsentrasjoner eller forstyrrelse av cellulære signalveier. Selv om uttrykket er vellykket, står etterfølgende trinn for prøvepreparering også overfor vanskeligheter. For eksempel, forberedelse av proteoliposom, krever høyt nivå ferdigheter og yrkeserfaring i oppløseliggjøring, rensing og stabilisering av membranproteiner, og koster mye krefter og tid også12,13.
På den annen side har noen avanserte teknologier dukket opp de siste tiårene for å produsere proteiner uten bruk av levende celler 14,15,16,17,18. Cellefri proteinsynteseteknologi rekonstituerer translasjonsreaksjon i et reagensrør. Siden det ikke er noen begrensninger som det cellulære ekspresjonssystemet har, har cellefrie systemer potensial til å syntetisere en rekke proteiner som er vanskelige å uttrykke eller vise toksisitet i celler. Renset celleekstrakt eller rekonstituert translasjonsmaskineri blandes med mal-mRNA, aminosyrer og energikilder, og rekombinante proteiner syntetiseres på kort tid. Når det gjelder membranproteinsyntesen, tilsettes noen typer stillas sammensatt av lipider eller amfifiler, som liposomer, biceller, nanodiscs eller kopolymerer til den cellefrie reaksjonen 19,20,21,22,23,24. Syntetiserte membranproteiner interagerer med stillasene og kan stabiliseres i vann. Cellefrie syntetiserte membranproteiner brukes mye i funksjonelle studier og antistoffproduksjon 25,26,27,28,29,30,31.
I denne protokollen beskriver vi en effektiv cellefri metode for proteoliposomproduksjon ved bruk av hvetecellefritt system og liposomer. Hvetecellefritt proteinsyntesesystem er et kraftig in vitro-oversettelsessystem som bruker ekstrakt fra hvetekim 15,32,33. Hvetekim inneholder en stor mengde translasjonsmaskiner og få oversettelseshemmere. Translasjonsmaskineriet i hvete, et medlem av eukaryoter, er egnet for å oversette eukaryote proteiner, og oversettelseseffektiviteten påvirkes knapt av kodonbruk av malen mRNA. Ved hjelp av hvetecellefritt system har vi syntetisert en rekke proteiner, inkludert proteinkinaser 34,35, ubiquitin ligaser36, transkripsjonsfaktorer37 og membranproteiner med høye suksessrater. For membranproteinproduksjon tilsetter vi lipidvesikkelliposom i translasjonsblandingen som stillas19,38. Hydrofobe domener av membranprotein interagerer med lipid dobbeltlag og er spontant integrert med liposom. Tetthetsgradient sentrifugering brukes til å strengt skille proteoliposom fra endogene hveteproteiner, selv om en vanlig sentrifugering av translasjonsreaksjonsblandingen er tilstrekkelig for en enkel rensing av proteoliposom20. Mange typer integrerte membranproteiner har blitt syntetisert ved hjelp av hvetecellefritt system og anvendt for ulike undersøkelser og utviklinger 25,38,39,40,41,42,43,44. Videre utviklet vi "tolags-dialysemetoden" for storskala produksjon45,46. I denne metoden er kopp-type dialyseanordning nedsenket i substratfôringsbufferen, og to lag med translasjonsreaksjonsblanding og substratfôringsbuffer dannes i koppen som vist i figur 1. Kontinuerlig tilførsel av substrater og fjerning av biproduktet kan utføres effektivt både på toppen og bunnen av reaksjonsblandingen i lang tid, noe som fører til utmerket oversettelseseffektivitet (figur 2A og figur 2B)45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av pEU-ekspresjonsplasmid
MERK: pEU-ekspresjonsplasmid bør inkludere startkodon, åpen leseramme for målmembranprotein og stoppkodon i fragmentet (se figur 1). Legg til deteksjons-/rensingskodesekvens(er) i riktig posisjon når det er nødvendig. Enten restriksjonsenzymfordøyelse eller sømløs kloning gjelder for subkloning. Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av en sømløs kloningsmetode.
- Forbered sett inn DNA-fragment.
- Forsterk genet av interesse ved PCR ved hjelp av cDNA-malen, primer 1 og primer 2. Primer 1 og primer 2 inneholder henholdsvis 15 bp overlappinger for sømløs kloning (se materialtabellen).
MERK: Ikke inkluder sekvenser som skal behandles og fjernes fra modent protein i cellene (f.eks. signalsekvens). Behandling av syntetisert protein utføres ikke i hvetecellefritt system. Ikke legg til Kozak-sekvens. pEU-E01-MCS vektor har E01 oversettelse enhancer. - Legg til 1/25 volum DpnI restriksjonsenzym til PCR-produktet for å fjerne malplasmid-DNA. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Bruk et PCR-rensesett for å rense PCR-produktet og juster konsentrasjonen ved 20–50 ng / μL.
- Forsterk genet av interesse ved PCR ved hjelp av cDNA-malen, primer 1 og primer 2. Primer 1 og primer 2 inneholder henholdsvis 15 bp overlappinger for sømløs kloning (se materialtabellen).
- Linearisere pEU-E01-MCS vektor.
- Utfør invers PCR ved hjelp av pEU-E01-MCS, primer 3 og primer 4.
- Legg til 1/25 volum DpnI restriksjonsenzym til det inverse PCR-produktet. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
- Bruk et PCR-rensesett for å rense PCR-produktet i henhold til produsentens anbefaling. Juster konsentrasjonen ved 20–50 ng/μL.
- Bland 2 μL av innstikk DNA-fragment, 2 μL linearisert vektor og 4 μL av 2x sømløs kloning enzymblanding.
- Transformer Escherichia coli-stammen JM109 med det sømløse kloningsproduktet. Bruk en spreder til å spre bakteriesuspensjonen på en LB-ampicillin agarplate.
MERK: pEU-vektor har en ampicillinmotstandsmarkør. - Bekreft sekvensen av ekspresjonsplasmidet konstruert ved hjelp av primer 5 og primer 6 fra henholdsvis 5 'og 3' side av MCS i pEU-plasmid.
- Forsterk og rens uttrykket plasmider.
- Kultur den plasmidtransformerte E. coli-stammen JM109 i 150 ml LB-ampicillinmedium ved 37 ° C og 125 slag per minutt risting over natten.
- Trekk ut og rens plasmidene ved hjelp av kommersielt tilgjengelig plasmid prep midi kit. Oppløs plasmider i 500 μL TE-buffer.
FORSIKTIG: Ikke bruk et mini prep-sett for plasmidekstraksjon. Det gir ikke tilstrekkelig kvalitet og kvantitet av plasmid. - Tilsett 500 μL fenol / kloroform / isoamylalkohol (25:24:1). Bland kraftig i 5 minutter, og sentrifuge i 5 minutter ved 17 800 x g og romtemperatur. Overfør den øvre plasmidløsningen til et nytt rør.
FORSIKTIG: Bruk engangshansker for å beskytte huden mot fenol og kloroform.
MERK: For å fjerne forurensning av RNase fra plasmidekstraksjonssett, rens plasmidene ved hjelp av fenol-kloroformrensing. - Tilsett 500 μL kloroform for å fjerne fenol helt. Bland kraftig i 5 minutter, og sentrifuge i 5 minutter ved 17 800 x g og romtemperatur. Overfør den øvre plasmidløsningen til et nytt rør.
- Tilsett 2,5 volum etanol og 1/8 volum av 7,5 M ammoniumacetat, og oppbevares ved -30 °C i 1 time.
- Sentrifuge ved 17 800 x g ved 4 °C i 10 minutter. Vask pelleten med 500 μL 70% etanol. Fjern supernatanten forsiktig og la pelleten stå i 5 minutter for å tørke opp.
- Oppløs ekspresjonsplasmidene i 100 μL ultrarent vann helt. Mål konsentrasjonen av plasmider med absorbans ved 260 nm. Juster konsentrasjonen til 1 mg/ml.
2. Transkripsjon in vitro
FORSIKTIG: Bruk DNase og nukleasefrie plastrør og tips i trinn for transkripsjon og oversettelse. Unngå autoklavering av plastvarer for å forhindre forurensning.
- Høst ultrarent vann i et nytt plastrør.
FORSIKTIG: Ikke bruk DEPC-behandlet vann fordi gjenværende DEPC sterkt hemmer reaksjonen. Bruk nyrenset ultrarent vann for transkripsjon og oversettelse. - Forbered transkripsjonsreaksjonsblanding ved å blande 115,2 μL ultrarent vann, 40 μL transkripsjonsbuffer LM, 20 μL NTP-blanding, 2,4 μL av 80 U / μL RNasehemmer, 2,4 μL av 80 U / μL SP6 polymerase og 20 μL av 1 mg / ml pEU-ekspresjonsplasmider. Bland reagensene forsiktig ved å invertere. Utfør et raskt spinn.
- Inkuber transkripsjonsreaksjonen ved 37 °C i 6 timer.
- Bland reaksjonen forsiktig ved å snu og spinn raskt ned. Bruk den umiddelbart til oversettelse, ellers frys og oppbevar ved -80 °C.
- Bekreft transkripsjonsproduktet ved elektroforese.
- Bland 100 ml 1x TAE buffer og 1 g agarose. Varm suspensjonen i en mikrobølgeovn for å tilberede 1% agarose TAE gel.
- Ta 1 μL transkripsjonsreaksjon og bland med 3 μL vann og 4 μL 2x lastfargestoff.
MERK: Denaturering av RNA er ikke nødvendig. - Last inn 4 μL av blandingen og 2 μL DNA-stigemarkør til agarose TAE-gelen.
- Elektroforese ved 100 V i 20 min.
- Stain gelen i ethidiumbromid i 30 minutter. Kontroller stigebåndmønsteret til mRNA ved hjelp av UV-transilluminator og gelbilder.
MERK: Når et smurt bånd på mindre enn 500 bp observeres, mistenkes mRNA-nedbrytning.
3. Utarbeidelse av materialer for oversettelse
- Klargjør oversettelsesbufferen.
- Bland 27 ml nylaget ultrarent vann og 0,75 ml av hver 40x stamløsning for henholdsvis S1, S2, S3 og S4 i et 50 ml rør.
MERK: Moduler materialmengdene i henhold til den endelige nødvendige mengden 1x oversettelsesbuffer.
FORSIKTIG: Ikke oppbevar eller frys den overskytende 1x-oversettelsesbufferen etter bruk.
- Bland 27 ml nylaget ultrarent vann og 0,75 ml av hver 40x stamløsning for henholdsvis S1, S2, S3 og S4 i et 50 ml rør.
- Forbered kreatinkinase stamløsning. Løs opp lyofilisert kreatinkinase i ultrarent vann til en endelig konsentrasjon på 20 mg/ml. Dispenser løsningen i små mengder (10 til 50 μL hver) i 0,2 ml 8-stripe PCR-rør. Frys slangene i flytende nitrogen, og oppbevar ved -80 °C.
FORSIKTIG: Kreatinkinaseoppløsningen skal ikke fryses på nytt etter tining. - Vask dialysekopper (0,1 ml størrelse) for å fjerne glyserol fra dialysemembranen.
MERK: Det finnes flere dialysekopper i forskjellige størrelser. Små kopper (0,1 ml) brukes til småskala test (pkt. 5.4) og store kopper (2 ml) for storskala produksjon (pkt. 5.5). Vasketrinnet for dialysemembran av store kopper kan unngås.- Sett 1 ml ultrarent vann i et nytt 1,5 ml rør. Sett inn en liten dialysekopp (0,1 ml) i røret. Tilsett 0,5 ml ultrarent vann i koppen.
- Inkuber i mer enn 30 minutter ved romtemperatur.
4. Tilberedning av liposomer
MERK: Her beskriver vi to protokoller for fremstilling av liposomer. Den ene bruker bruksklare lyofiliserte liposomer (pkt. 4.1), mens den andre produserer liposomer ved å hydrere en tynn lipidfilm (pkt. 4.2).
- Forbered liposomer ved hjelp av lyofiliserte liposomer.
MERK: En enklere måte å produsere proteoliposom på er å bruke kommersielt tilgjengelig Asolectin liposom. Asolectin er en slags naturlig lipid ekstrahert fra soyabønner.- Åpne hetteglasset med 10 mg lyofilisert Asolectin liposomer (se materialtabellen) og tilsett 200 μL oversettelsesbuffer (pkt. 3.1) til bunnen av hetteglasset. Forsegl hetteglasset og inkuber i 10 minutter.
- Bland kraftig ved å sette hetteglasset på virvelblanderen i 1 min.
- Sett hetteglasset inn i et 50 ml rør. Spinn ned røret ved sentrifugering ved 500 x g i 1 min.
- Ved hjelp av en pipette overfører du Asolectin liposomsuspensjon (50 mg lipid/ml) til et nytt 1,5 ml rør. Bruk liposomet umiddelbart til oversettelse, ellers frys i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.
- Forbered liposomer ved å hydrere en tynn lipidfilm.
- Hvis et lipid selges i pulverform, oppløses i kloroform eller passende organisk løsningsmiddel til 10-100 mg / ml konsentrasjon.
MERK: En tynn lipidfilm kan fremstilles ved hjelp av rensede og / eller syntetiserte amfifile lipider. Rensemetoden for asolectin er tidligere beskrevet38. Funksjonelt modifiserte lipider, som biotinylerte lipider, fluorescerende lipider og adjuvante lipider, kan legges til basallipidene for å produsere funksjonelle liposomer. - Overfør lipidoppløsningen inneholdende 50 mg lipid (er) til en fordampningskolbe.
- Ved hjelp av en roterende fordamper, fordamp løsningsmiddel og fordel lipidet jevnt på veggen av kolbebunnen for å danne en tynn film av lipid.
- Sett kolben i en vakuumtørkende og la den stå under undertrykk over natten for å fjerne løsningsmidlet helt.
- Tilsett 1 ml oversettelsesbuffer til fordampningskolben. Roter kolben for å spre bufferen over den tynne lipidfilmen. Inkuber i 5 minutter for å hydrere filmen.
- Sonikere kolben med en ultralyd homogenisator eller ultralyd renere. Endre kolbens vinkel av og til for å la løsningen berøre filmen grundig. Sørg for at den tynne lipidfilmen skrelles fra bunnen og emulgeres helt og homogent.
MERK: Elektronmikrografi av biotinylerte lipider som inneholder liposomer er vist i figur 1. - Overfør liposomsuspensjonen (50 mg lipider/ml) til et nytt 1,5 ml rør. Hvis det ikke skal brukes umiddelbart, frys liposomene i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.
- Hvis et lipid selges i pulverform, oppløses i kloroform eller passende organisk løsningsmiddel til 10-100 mg / ml konsentrasjon.
5. In vitro-oversettelse
- Tine hvetekimekstraktet raskt ved å flyte rørene på vann ved romtemperatur i noen minutter. Etter tining, bland straks forsiktig ved å invertere rørene, spinn ned og avkjøl på is til bruk.
MERK: Frys hvetekimekstrakt i flytende nitrogen etter bruk, og oppbevar ved -80 °C. Den tåler flere fryse/tine sykluser. - Tine 20 mg/ml kreatinkinase stamløsning. Bland 5 μL stamløsning og 45 μL oversettelsesbuffer for å fremstille 2 mg/ml kreatinkinasearbeidsløsning.
FORSIKTIG: Refreezing kreatinkinase anbefales ikke. - Tine liposomer eller mRNA når det er nødvendig.
- Gjennomfør en småskala proteinoversettelse.
- Fjern vann fra både slangen og dialysekoppen (0,1 ml), som tilberedt i trinn 3.3.2.
- Injiser 1 ml og 300 μL oversettelsesbuffer i henholdsvis røret og dialysekoppen.
FORSIKTIG: Hvis bunnen av dialysekoppen ikke når overflaten av oversettelsesbufferen i 1,5 ml røret, injiser ytterligere 50-100 μL buffer til røret. - Forbered translasjonsreaksjonsblanding ved å blande 15,6 μL oversettelsesbuffer, 2,4 μL 2 mg / ml kreatinkinase, 12 μL 50 mg / ml liposomer, 15 μL hvetekimekstrakt og 15 μL mRNA. Bland forsiktig ved å snu rørene, og spinn ned.
- Aspirer 60 μL av oversettelsesreaksjonsblandingen ved hjelp av en 200 μL pipette.
- Sett pipettespissen inn i undergrunnen av oversettelsesbufferen i dialysekoppen. Pipetter ut reaksjonsblandingen sakte og forsiktig. Dekk dialysekoppen med et lokk for å forhindre fordampning.
NOTAT: Reaksjonsblandingen synker naturlig til bunnen av koppen og danner et dobbeltlag. Ikke forstyrr dobbeltlaget ved å blande eller riste koppen.
- Gjennomfør en omfattende oversettelse (figur 1).
- Hell 22 ml oversettelsesbuffer i et 25 ml rør. Sett inn en stor dialysekopp (2 ml) i røret og tilsett 2 ml oversettelsesbuffer i koppen.
- Forbered en translasjonsreaksjonsblanding ved å blande 130 μL oversettelsesbuffer, 20 μL 2 mg / ml kreatinkinase, 100 μL 50 mg / ml liposom, 125 μL hvetekimekstrakt og 125 μL mRNA. Bland forsiktig ved pipettering.
- Aspirer all translasjonsreaksjonsblandingen (500 μL) ved hjelp av en 1000 μL pipette. Injiser translasjonsreaksjonsblandingen i dialysekoppen på samme måte som beskrevet i trinn 5.4.5. Dekk dialysekoppen med lokket for å forhindre fordampning.
- Inkuber reaksjonene ved 15 °C i 24 timer.
- Bland reaksjonen godt i dialysekoppen ved pipettering. Overfør den rå proteoliposomsuspensjonen til et nytt rør.
MERK: Et flatbunnet 1,5 ml rør anbefales for å samle proteoliposomet fra småskalaoversettelsen. Etter sentrifugering danner liposomer kompakt og lett synlig pellet på undersiden av røret.
6. Rensing av proteoliposomer
- Sentrifuger slangen som inneholder rå proteoliposomsuspensjon ved 17 800 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Fjern supernatanten. Suspender proteoliposompelleten i PBS (liten skala: 1 ml, stor skala: 10 ml) ved pipettering.
- Gjenta sentrifugering og vasking av proteoliposomer for ytterligere to sirkler.
- Etter vask, tilsett en liten mengde PBS og suspendere proteoliposompelletsbrønnen ved pipettering. Mål volumet av suspensjonen ved hjelp av en mikropipette. Legg til PBS for å justere volumet til 60 μL (liten skala) eller 500 μL (stor skala). Overfør suspensjonen til et nytt 1,5 ml rør.
- Overfør 10 μL proteoliposomsuspensjon til et nytt PCR-rør for SDS-PAGE. Del resten av prøvene i mindre porsjoner for bruk når det er nødvendig. Frys ned i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C.
7. SDS-PAGE og CBB farging
- Tilsett 70 μL vann og 40 μL 3x SDS-PAGE prøvebuffer til 10 μL proteoliposomsuspensjon.
FORSIKTIG: Ikke kok SDS-PAGE-prøven, da membranproteiner aggregerer, og knapt trenger inn i akrylamidgel i elektroforese. Tilsett også nok reduksjonsmiddel til SDS-PAGE-prøvebufferen (f.eks. 2-merkaptoetanol ved 3% endelig konsentrasjon) for å forhindre oksidasjon. - Sett en 5% -20% gradient SDS-PAGE gel i et elektroforesekammer. Last inn 3 μL, 6 μL, 12 μL proteoliposomprøver, 2 μL proteinstørrelsesmarkør og BSA-standardserie også.
- Elektroforese ved 52 mA, 400 V i 30 min.
- Flekk gelen med CBB-fargestoff i 1 time. Avfarging i varmt vann og skann gelbildet.
- Ved hjelp av NIH Image J-programvare (https://imagej.nih.gov/ij/), kvantifisere båndintensiteten til membranprotein i hver bane. Beregn mengden syntetiserte membranproteiner med BSA-standardserier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen kan delvis rensede proteoliposomer oppnås på kort tid. Representative resultater er vist i figur 2A. Tjuefem GPCR-er i klasse A, B og C ble vellykket syntetisert ved hjelp av tolagsdialysemetoden (liten skala) og delvis renset ved sentrifugering og buffervask. Selv om mengden syntetiserte proteiner varierer i henhold til typen protein, kan 50 til 400 μg membranproteiner vanligvis syntetiseres per reaksjon når store dialysekopper brukes. Flere milligram membranproteiner kan enkelt produseres ved å øke antall reaksjoner, på grunn av den høye skalerbarheten til hvetecellefritt system. En pre-test ved hjelp av en liten dialyse kopp er tilstrekkelig til å bestemme produksjonseffekten av målproteinet i tolagsdialysemetode. I henhold til den oppnådde produktiviteten kan mengden av målproteinet som skal produseres ved hjelp av store dialysekopper estimeres.
Denne protokollen er egnet for ekspresjon av membranproteiner, spesielt for de med flere transmembrane helices. I de fleste tilfeller blir membranproteiner med tre eller flere transmembrane helices lett inkorporert i proteoliposomer etter syntese (figur 2B), noe som gir en god produktivitet av proteoliposomer. Single-transmembrane-helix proteiner syntetiseres vanligvis jevnt; Imidlertid integreres de knapt i liposomer på grunn av den lille hydrofobe regionen. Når det gjelder proteiner med to transmembrane helices, er hvorvidt de er forankret til liposomer avhengig av hvordan deres transmembrane helices blir utsatt.
Syntetiserte proteoliposomer oppsamles ved enkel sentrifugering og delvis renses med en vaskebuffer, noe som i stor grad forkorter renseprosessen av membranproteiner. Selv om både biologiske membraner og membranproteiner er fjernet fra hvetekimekstrakter på forhånd, blir små mengder hveteproteiner noen ganger utfelt ved binding til liposomer eller membranproteiner syntetisert (figur 2A). Slike proteinforurensninger er vanskelige å fjerne ved enkel sentrifugering og buffervask. Når et høyt renset membranprotein er nødvendig, er det nødvendig å oppløse de delvis rensede proteoliposomene med et overflateaktivt middel og rense dem ved kolonnekromatografi.
Figur 1: Skjema for cellefri proteoliposomproduksjon. SP6, SP6 promotor sekvens; E01, E01 oversettelse enhancer sekvens; Ampr, ampicillinresistensgen; DTT, dithiothreitol. Elektronmikrografi viser immunogold-merking av biotinylert lipid som inneholder liposom. Bar, 0,2 μm. Dette elektronmikrografbildet var fra figur 1D i Takeda et al., 201545. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av proteoliposomproduksjon ved dobbeltlagsdialysemetode. (A) SDS-PAGE-bilde av cellefrie syntetiserte GPCR-er. Tjuefem utvalgte GPCR-er ble syntetisert ved bilagsdialysemetoden. Proteoliposomer ble delvis renset og påført SDS-PAGE og CBB-farging. Pilspisser indikerer mål-GPCRs. (B) Sammenligning av membranproteinproduksjoner mellom forskjellige oversettelsesmetoder. Dopaminreseptor D1 (DRD1) protein ble syntetisert ved hver metode i samme forhold mellom hvetekimekstrakt, liposomer og mRNA, henholdsvis. DRD1 proteoliposom ble delvis renset ved sentrifugering, og utsatt for SDS-PAGE og CBB farging. (C) Immunogold merking av DRD1-biotin / liposomkompleks. DRD1 ble enzymatisk biotinylert av BirA biotin ligase. Bar, 0,2 μm. Blanke pilspisser indikerer DRD1-biotin på liposomer. Dette tallet ble endret fra figur 1 i Takeda et al., 201545. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Anvendelse av funksjonelle proteoliposomer. (A) Immunisering av adjuvant lipidholdig proteoliposom. (B) Biotinylert liposombasert interaksjonsanalyse (BiLIA). Interaksjon mellom membranprotein og antimembranproteinantistoff ble påvist av AlphaScreen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen gir en metode for å produsere membranproteiner med høy suksessrate. Denne protokollen er enkel, svært reproduserbar og lett å skalere opp. Det har også potensial til å redusere tid og kostnader for eksperimenter som bruker en stor mengde membranproteiner. Tolagsdialysemetoden forbedrer produktiviteten med 4–10 ganger sammenlignet med dobbeltlagsmetode eller dialysemetode (figur 2B)45. I ekstreme tilfeller økte utbyttet av en ionkanal og en transportør henholdsvis 30 og 20 ganger med dobbeltlagsdialysemetode enn med dobbeltlagsmetode (data ikke vist). Høy produktivitet av denne protokollen er en fordel i antigenproduksjon for immunisering. Proteoliposomer brukes ofte som immuniserende antigener for utvikling av antimembranproteinantistoffer. Høykonsentrerte og rensede membranproteiner innebygd i proteoliposom stimulerer effektivt immunresponsen og induserer antistoffer41,47. Ved hjelp av denne tolagsdialysemetoden kan proteoliposomer som bærer flere milligram membranproteiner for immuniseringsformål, lett fremstilles om noen dager. Faktisk har vår gruppe syntetisert GPCRs, ionkanaler og claudins ved hjelp av denne protokollen og immunisert mus med produktene for å oppnå monoklonale antistoffer mot dem31,41,45. Noen av de monoklonale antistoffene som ble oppnådd ble verifisert som funksjonelle antistoffer, slik som antistoffer med høy affinitet, konformasjonsfølsomme antistoffer, flowcytometri anvendelige antistoffer og hemmende antistoffer, noe som indikerer at denne protokollen er i stand til å produsere membranproteiner med funksjonelt korrekte konformasjoner.
En annen attraktiv fordel med denne protokollen er å tillate produksjon av proteoliposomer som er tildelt spesifikke funksjoner ved bruk av modifiserte lipider, for eksempel biotinylerte lipider, fluorescerende lipider eller adjuvante lipider. Forberedte proteoliposomer med spesifikke funksjoner er nyttige og anvendelige for et bredt spekter av eksperimenter. For eksempel gjør adjuvante lipidholdige proteoliposomer, som lipid A48 eller monofosforyllipid A (MPLA) 49, praktiske immuniserende antigener, fordi de kan administreres direkte for å immunisere mus uten emulsjon. Adjuvante lipider stimulerer effektivt immunresponsen hos vertsdyr, og induserer antistoffer mot målmembranproteiner (figur 3A). Faktisk har vi vellykket indusert flowcytometri anvendelige antistoffer ved å immunisere mus med MPLA-holdige proteoliposom31. Også proteoliposomer fremstilt fra biotinylerte lipider er ideelle prober for screeningsanalyser. Vi utviklet en screeningmetode med høy gjennomstrømning for å velge antimembranproteinantistoffer ved bruk av biotinylerte proteoliposomer og AlphaScreen (BiLIA-metoden) (figur 3B)45. Sandwich ELISA kan også enkelt konstrueres ved hjelp av biotinylerte proteoliposomer og streptavidinbelagte plater.
Til slutt er det to viktige forbehold som bør tas opp når du bruker denne metoden. For det første kan dannelsen av disulfidbindinger være utilstrekkelig på grunn av de høye konsentrasjonene av DTT i translasjonsbufferen, noe som muligens påvirker strukturen til noen typer membranproteiner15. Selv om disulfidbindinger er i stand til å danne seg etter at reduksjonsmidlet er fjernet under renseprosessen, dannes de muligens til en annen type i stedet for de naturlige. Den andre er at membranproteiner ikke glykosyleres. Enzymene som kreves for glykosylering er teoretisk fraværende i det cellefrie systemet fordi under prosessen når hvetekimekstrakt produseres, er biomembraner, inkludert Golgi og ER, fjernet. Siden mangel på disulfidbindinger og glykosylering kan forårsake forskjellige konformasjoner, bør det vurderes nøye og evalueres det eksperimentelle designet, spesielt når posttranslasjonelle modifikasjoner er kritiske for funksjonell ekspresjon av proteiner i henhold til eksperimentelle formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) fra AMED under Grant Number JP20am0101077. Dette arbeidet ble også delvis støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
- Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
- Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
- Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
- Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
- Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
- Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
- Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
- Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
- Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
- Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
- Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
- Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
- Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
- Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
- Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
- Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
- Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
- Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
- Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
- Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
- Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
- Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
- Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
- Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
- Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
- Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
- Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
- Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
- Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
- David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
- Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
- Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
- Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, Clifton, N.J. 49-67 (2018).
- Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
- Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
- Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).
