Summary
Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.
Abstract
O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.
Introduction
A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas1. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto reprodutivo; Figura 1A) e uma criação fácil. Nas últimas três décadas, seu uso foi expandido para investigar características ancestrais de vários traços, como plano corporal, diferenciação neural e ritmos circadianos2,3,4.
A aplicação de ferramentas genéticas avançadas em T. domestica poderia acelerar ainda mais tais contribuições em uma ampla área de pesquisa. A interferência de RNA bem sucedida (RNAi) mediada por danos genéticos em embriões, ninfas e adultos foi relatada em T. domestica4,5,6. A eficiência do RNAi sistêmico ainda é altamente dependente de espécies — por exemplo, é geralmente alta em coleoptera, enquanto é baixa na ordem lepidoptera7. A eficiência e duração do knockdown rnai em T. domestica ainda está para ser avaliada. Além da RNAi, já reportamos um nocaute genético bem sucedido no CRISPR/Cas9 mediado em T. domestica8. O sistema CRISPR/Cas tem sido amplamente aplicado para edição de genomas em insetos particularmente para nocaute genético direcionado. Seu uso poderia ser expandido para outras aplicações, como ensaio de repórteres genéticos, rastreamento de linhagem celular e manipulação da atividade transcricional, derrubando construções exógenas após o estabelecimento de um protocolo para a entrega de componentes do sistema CRISPR/Cas em núcleos9. Combinado com o conjunto de genomas publicado10,o amplo uso e o desenvolvimento da edição de genoma baseada em CRISPR/Cas em T. domestica facilitaria estudos com foco nos mecanismos evolutivos por trás do excelente sucesso adaptativo dos insetos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para microinjeção de embriões e para acasalamento adulto T. domestica para gerar uma cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Considerando este novo método, discutimos a importância de considerar a biologia única de espécies modelos não tradicionais para aplicações bem sucedidas dessas técnicas.
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Protocol
1. Manutenção de colônias de laboratório
- Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%.
NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera11,um fornecimento direto de água não é necessário. O RH apropriado é mantido devido à presença de vapor de água de copos plásticos contendo um orifício de ventilação na parte superior ou de copos sem tampa dentro de cada recipiente. Não há necessidade de umidificar dentro de uma incubadora inteira que contém culturas. A duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento sob a condição descrita neste protocolo é mostrada na Figura 1. A velocidade de desenvolvimento poderia ser ajustada alterando a temperatura e/ou RH12. - Adicione comida periodicamente. Adicione água antes que se doe.
- Transfira as populações para um novo recipiente limpo pelo menos a cada 3 meses, dado que os adultos param de colocar ovos em um ambiente sujo e/ou população densa (ver Discussão).
2. Coleta de ovos e microinjeção
- Projete um RNA guia (gRNA)
- Projete uma sequência de gRNA para cada alvo necessário e BLAST as sequências de gRNA contra o conjunto do genoma para verificar possíveis locais de reconhecimento fora do alvo.
- Sintetizar e purificar as gRNAs de acordo com as instruções do fabricante8.
NOTA: Como exemplo, no caso de direcionar o gene branco do transportador de de ligação ATP, foi projetada uma sequência de alvos de 20 bps e dois oligonucleotídeos de DNA sintetizados 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' e 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCACACACACACACTTA-3' foram ordenados. O modelo de DNA foi preparado por annealing esses dois oligonucleotídeos seguidos de amplificação PCR e o gRNA é então in vitro transcrito do modelo com uma polimerase T7 RNA.
- Prepare colônias de coleta de ovos
- Transfira cerca de 20 adultos do sexo masculino e 20 do sexo feminino para um recipiente de tamanho médio (200 mm x 150 mm x 90 mm) com alimentos, abastecimento de água, papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão em camadas para a colocação de ovos(Figura 2B).
- Configure várias colônias para obter um grande número de embriões encenados em um curto período de tempo para serem usados para a edição de genomas.
NOTA: Cerca de 20 a 40 ovos devem ser coletados de uma colônia após 8h a 37 °C. Geralmente leva alguns dias para os adultos transferidos começarem a colocar ovos, possivelmente devido à adaptação a um novo ambiente.
- No dia da injeção, substitua o algodão dentro dos recipientes por novos.
- Coloque uma fita de 76 mm x 5 mm de dupla face em uma lâmina de vidro normal de 76 mm x 26 mm.
- Oito horas depois, recolhe os ovos do algodão em camadas separando as camadas usando fórceps.
- Alinhe os ovos na fita de dois lados usando um pincel de tinta molhada e mantenha uma distância de 2 mm entre os ovos. Todos os ovos devem ser orientados para que o eixo longitudinal de um ovo enfrente o lado da injeção(Figura 3A). Pressione suavemente os ovos com uma escova de tinta para segurar firme durante a injeção.
NOTA: Neste protocolo, o fungo cresce rapidamente em ovos injetados danificados em condições molhadas e quentes. É importante manter a distância entre os ovos para evitar contaminação cruzada e expansão de fungos. - Misture a proteína gRNA e Cas9 a uma concentração final de 100 ng/μL e 500 ng/μL, respectivamente. Use água destilada para diluição. Incubar a mistura por 10 minutos à temperatura ambiente para promover a formação complexa da ribonucleoproteína e, em seguida, manter a mistura no gelo.
NOTA: O vermelho neutro a uma concentração final de 1% pode ser adicionado à solução de injeção para monitorar a quantidade injetada. - Carregue 2 μL da solução gRNA/Cas9 em um capilar de injeção de vidro com um microcarregador. Certifique-se de que não há bolhas de ar na solução antes da injeção. Se necessário, toque na agulha para remover as bolhas.
NOTA: Neste experimento, uma agulha pronta é usada para obter uma ponta fina de agulha(Figura 3B). Uma agulha caseira com uma forma semelhante poderia ser usada em vez disso. - Fixar o capilar de injeção de vidro, previamente carregado com a solução gRNA/Cas9, a um suporte equipado com um manipulador e conectar o suporte a um microinjetor eletrônico.
- Otimize a forma da ponta da agulha, quebrando-a ligeiramente com fórceps para evitar entupimento e melhor durabilidade ao longo de uma série de injeções (um exemplo de uma agulha apropriada é mostrado na Figura 3C).
NOTA: Recomenda-se trocar uma agulha quando estiver entupida. É possível continuar injetando com a mesma agulha se for quebrada novamente com fórceps, mas uma ponta mais larga leva a mais danos aos ovos e reduz sua taxa de sobrevivência. Como os ovos T. domestica são macios e frágeis, manter uma ponta fina de agulha é fundamental para ter uma alta taxa de sobrevivência após a injeção. - Insira a agulha no ponto médio do eixo longitudinal de um ovo e injete uma pequena quantidade da solução (ver Figura 3D-H para referência sobre a quantidade de injeção). Ajuste a configuração do microinjetor eletrônico durante a injeção, dependendo da forma da ponta da agulha.
NOTA: Recomenda-se aplicar uma pressão constante durante a injeção, caso contrário, o conteúdo de ovos pegajoso pode facilmente fluir para dentro da agulha de vidro e pode entupi-lo. A solução pode ser injetar com um pulso de pressão curta ou com uma pressão constante, dependendo da quantidade de líquido injetado. Tenha em mente que quando uma ponta de agulha tem uma abertura larga, muita solução é injetada em um ovo, o que causa letalidade(Figura 3F-H). Nesse caso, mantenha um fluxo líquido constante por pressão constante, em seguida, insira a agulha em um ovo e puxe-a imediatamente. Se causar muito transbordamento ou o ovo estourar, troque a agulha. - Mantenha os ovos injetados em um recipiente com o tamanho adequado para o número de ovos injetados (<20 ovos: prato pequeno; >20 ovos: recipiente de tamanho médio) com 60%-80% RH e 37 °C.
3. Acasalamento
- Verifique periodicamente os ovos injetados e descarte ovos danificados com fórceps para evitar o crescimento fúngico(Figura 3I,J). No caso de muito fungo está crescendo em um ovo, limpe a superfície do ovo com 70% de EtOH.
- Antes de eclodir (aproximadamente 10 dias a 37 °C após a colocação do ovo), mergulhe o deslizamento de vidro com os ovos injetados em pó de talco para revestir a superfície da fita de dois lados. Isso evitará o empilhamento de ninfas eclodidas. Transfira os slides de vidro revestidos em pó para um recipiente de tamanho médio com comida, água e um papel dobrado para esconder os insetos.
- Remova as lâminas de vidro depois que as ninfas chocarem. Forneça periodicamente alimentos até chegarem à idade adulta.
NOTA: Leva cerca de 2,0-2,5 meses para os indivíduos chegarem à idade adulta após a eclosão(Figura 1A). A fase adulta é julgada com base em um ovipositor bem desenvolvido em fêmeas(Figura 1B). - Para acasalar os indivíduos, transfira quantos adultos fêmeas precisam de uma colônia de laboratório para o recipiente de tamanho médio e incuba-os por pelo menos 14 dias a 37 °C para ter certeza de que são virgens.
NOTA: Não é necessário coletar fêmeas virgens de uma colônia de laboratório porque a T. domestica adulta tem um ciclo repetido de molting e acasalamento chamado "ciclo reprodutivo e de fusão", durante o qual as fêmeas jogam fora esperma com cada molt e mate novamente no próximo ciclo de fertilização13. - Transfira um macho ou uma fêmea G0 adulto que se desenvolveu de um ovo injetado e um adulto wildtype(s) para um pequeno prato plástico (Ø 100 mm x 40 mm) com alimentos, um papel dobrado e um pequeno pedaço de algodão para a colocação de ovos G1(Figura 2C'; prato de acasalamento). Mantenha os pratos de acasalamento em um recipiente maior com 60%-80% RH(Figura 2C).
NOTA: Vários adultos selvagens podem ser incluídos em um prato para aumentar a chance de acasalamento bem sucedido, embora altas taxas de sucesso tenham sido alcançadas com um par.
4. Genotipagem
- Design pcr primer pares para cada gRNA para amplificar um produto de 100-200 bp que inclui o site visado pelo gRNA. BLAST cada sequência de primer contra o conjunto do genoma para verificar sua especificidade (um exemplo é mostrado para o direcionamento do gene branco na Figura 4A).
- Verifique a transformação germinal dos adultos G0.
- Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos.
NOTA: Recomenda-se genótipo pelo menos 12 ninfas G1 de cada par de acasalamento para avaliar o sucesso da transmissão germinal (ver Resultados Representativos). - Adicione 15 μL de uma solução Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissolvida em tampão Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneize brevemente amostras com palitos de dente e incubar a 55 °C por 3 a 16 h.
- Inative o Proteinase K colocando as amostras a 95 °C por 10 minutos.
- Adicione 90 μL de água destilada em cada tubo e misture bem. Use 2 μL de supernasário em uma mistura de reação PCR de 10 μL contendo os primers projetados na etapa 4.1.
NOTA: Recomenda-se o uso de uma polimerase de DNA otimizada para modelos brutos para atingir amplificação pcr suficiente. - Para analisar os produtos PCR, realize um ensaio de mobilidade heteroduplex (HMA) com um sistema de eletroforese de microchip(Figura 3B; ver Ohde et al., 2018)8.
NOTA: As mutações podem ser avaliadas com dois métodos alternativos: (1) HMA com polímeros de gel padrão, como 8% poliacrilamida14; (2) digestão de produtos PCR com endonuclease T7 seguida de eletroforese de gel agarose15. - Mantenha apenas as ninfas G1 resultantes de adultos G0 que contêm mutações em sua germe e descarte as outras.
- Cinco dias após a colocação dos ovos, colete ovos G1 individuais de cada par adulto G0 em tubos de 0,2 mL (um ovo por tubo; armazene amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo). Separe as camadas de algodão para coletar os ovos.
- Genotipagem individual de ninfas/adultos do G1
- Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D)..
NOTA: Embora esta etapa possa ser realizada em qualquer ponto de estágios ninfais e adultos, recomenda-se realizá-la após atingir a idade adulta e pouco antes do emparelhamento (>2,5 meses após a injeção; Figura 1B) porque é mais fácil manter os focos de incêndio em um recipiente grande. A criação individual é necessária para rastrear o genótipo de cada ninfa G1 nas etapas a seguir. Ninfas G1 do mesmo G0 adulto podem ter mutações diferentes. - Aperte e puxe cerci e o filamento caudal de uma ninfa/adulto usando fórceps e colete-os em um tubo de 0,2 mL contendo 50 μL EtOH (armazene as amostras coletadas a -20 °C para um armazenamento a longo prazo).
NOTA: As amostras de tecido são coletadas em EtOH porque evita a perda dessas pequenas amostras devido à eletricidade estática. Se for preciso parar o movimento dos insetos, anestesia a ninfa/adulto no gelo ao colher amostras de tecido. Como T. domestica não pode sobreviver após o resfriamento a longo prazo no gelo, não anestesia-os por mais de um minuto e imediatamente movê-los de volta à temperatura ambiente. A ablação do cerci e do filamento caudal não causa aumento da mortalidade. - Coloque tubos de amostra com as tampas abertas em um bloco térmico por 15 minutos a 70 °C para evaporar o EtOH.
- Repetir passos 4.2.2-4.2.5 para genotipagem.
- Envie os produtos PCR nos quais um padrão de banda mutante é observado para um serviço padrão de sequenciamento Sanger.
- Mantenha as ninfas/adultos do G1 com as mutações desejadas e descarte as outras (ver Figura 4C para um resultado de sequenciamento representativo).
- Isole as ninfas G1 em placas de 24 poços com um aspirador ou um pincel de tinta. Coloque as placas de 24 poços em um recipiente maior (por exemplo, o recipiente de tamanho médio utilizado neste protocolo) com abastecimento de água conforme descrito acima para manter um RH de 60%-80%(Figura 1D). Manter o fornecimento de alimentos de peixe regulares artificiais(Figura 1D)..
- Cruze os adultos contendo as mutações desejadas em um prato de acasalamento e obtenha as próximas gerações para estabelecer uma cepa mutante homozigosa.
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Representative Results
Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA que é projetado para atingir o gene branco, 32,6% das ninfas G0 apresentam perda parcial de pigmentação em seus olhos compostos e regiões dorsais(Figura 5)8.
Usando o método de injeção seca atualmente descrito, quando 80-120 ovos são injetados a taxa de sobrevivência dos embriões injetados é de 40%-60%. Isso contrasta com o método anterior de injeção molhada, no qual os ovos são injetados e mantidos em uma placa de agarose, ocasionalmente resultando em uma taxa de sobrevivência inferior a 10%.
A avaliação da transformação germinal de adultos G0 e indivíduos mutantes do G1 foi feita por PCR genômico seguido pelo HMA. Em HMA, o tipo selvagem e os alelos mutantes se alegram em cada combinação possível, o que normalmente resulta em quatro bandas distintas em uma eletroforese de gel (dois homoduplexos e dois heteroduplexos)14. Nas amostras do G1, padrões diferenciais de banda entre tipo selvagem e amostras mutantes são claramente distinguíveis(Figura 4B). A transformação germinal foi encontrada em 39,1% dos adultos do G0 quando visamos o gene branco 8. Em nossa experiência, a porcentagem de indivíduos mutantes em ninfas G1 de um único par G0 varia de 25% a 100%.
Para avaliar o efeito do nosso ambiente de acasalamento no sucesso do acasalamento, cruzamos adultos selvagens em um prato de acasalamento e obtivemos uma taxa de sucesso de 95,8% (23/24 pares).
Figura 1: O ciclo de vida de T. domestica. (A) Duração aproximada de cada estágio de desenvolvimento em T. domestica. (B) Visão dorsal de uma fêmea adulta. A ponta de flecha indica um ovipositor bem desenvolvido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ambientes artificiais utilizados neste protocolo. (A) Um recipiente grande para colônia de laboratório, (B) um recipiente de tamanho médio para coleta de ovos, (C) pratos de acasalamento com suprimentos de água em um recipiente grande, (C') um prato de acasalamento, (D) uma placa de 24 poços com abastecimento de água no recipiente de médio porte. A região encaixotado é ampliada em(D)para mostrar um indivíduo T. domestica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Injeção seca de ovos T. domestica. (A) Ovos alinhados em uma lâmina de vidro. A seta preta indica o ponto onde uma agulha é inserida. (B) Forma de uma ponta de agulha de vidro usada para injeção. (C) A mesma agulha de vidro antes (superior) e depois (inferior) quebrando a ponta. As agulhas estavam cheias com 1% de vermelho neutro. A ponta da ponta da agulha indica a ponta da agulha. Barra de escala é de 1 mm.(D) Ovo não injetado. (E) Um bom exemplo de uma injeção. A seta indica o ponto de injeção. (F-H) A solução está transbordando do local injetado (F) ou do lado oposto(G)do ovo injetado; muito volume de injeção causou uma explosão(H). A ponta de flecha indica conteúdo de ovo transbordado. Normalmentedesenvolveu embrião tardio. A ponta de flecha indica o olho composto colorido. (J) Encolheu o ovo danificado 3 dias após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Genotipagem de indivíduos do G1. ( A )Osprimers pcr são projetados para amplificar uma região genômica de 120 bp que inclui o local de destino gRNA. (B) Várias bandas de DNAs homoduplex e heteroduplex são detectadas em amostras mutantes, enquanto bandas únicas aparecem em amostras nãomutadas. L: escada de DNA, U: amostras nãomutadas, M: amostras mutantes. (C) Resultado representativo do sequenciamento direto de produtos PCR de amostras mutantes selvagens e heterozigosas. Sequências de alelo selvagem e mutante 
são mostradas em cima. A cartilha dianteira mostrada em (A) foi usada como um primer de sequenciamento. A sequência de um mutante heterozigoso (fundo) é indicada por duas sequências sobrepostas do local de decote previsto (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Perda de mosaico de pigmentações em olhos compostos e na região dorsal após atingir o gene branco com injeção de proteína gRNA/Cas9. (A) Wildtype e (B) gRNA branca/cas9 injetadas primeiras ninfas instar. A perda parcial de pigmentações pretas e rosas nos olhos (ponta de flecha) e na região dorsal (seta) são indicadas. A barra de escala é de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada moltadulto 13. Um adulto T. domestica macho transfere seu esperma indiretamente para uma fêmea através de um espermatozoide. Sweetman (1938) relatou que leva adultos do sexo masculino de 20 a 35 minutos desde o início do comportamento de acasalamento até a colocação de um espermatozoide12. É provável que a perturbação da interação entre um par de acasalamento por outros indivíduos previne a fertilização bem sucedida, o que poderia acontecer com mais frequência em um ambiente denso.
Embora os ovos sejam coletados 8h depois de substituir o algodão dentro de um recipiente para coletar ovos suficientes em nosso protocolo, a maior eficiência da edição do genoma pode ser alcançada coletando ovos e injetando-os em um tempo menor (por exemplo, 4h após a colocação de ovos) quando os materiais injetados têm mais chance de serem entregues à grande proporção de núcleos. A injeção para um número suficiente de ovos dentro de um tempo menor poderia ser feita por (1) aumentar o número ou o tamanho dos recipientes se o espaço permitir, ou (2) repetir o mesmo procedimento para obter um número suficiente de ovos injetados.
O local da injeção é geralmente considerado importante para a transformação germinal bem sucedida em insetos. Os ovos T. domestica são geralmente elipsoidais em forma e contêm uma faixa de germes em um polo de seu eixo longitudinal. Recomenda-se injetar a mistura gRNA/Cas9 no ponto médio do eixo longitudinal do ovo, pois é difícil identificar o polo onde uma faixa de germes é formada em embriões precoces devido à forma variável do ovo T. domestica. Embora a solução gRNA/Cas9 não seja injetada diretamente no local da formação da banda de germes, conseguimos a transformação germinal em até 39,1% dos adultos G08.
Durante a microinjeção de ovos, é importante usar uma ponta fina de agulha para obter uma alta taxa de sobrevivência, como é o caso de outros modelos animais. Obtivemos uma taxa de sobrevivência maior após a injeção com agulhas prontas do que quando usamos agulhas de vidro caseiras em ovos T. domestica. No entanto, uma taxa de sobrevivência igualmente alta poderia ser alcançada replicando a forma fina da agulha com agulhas caseiras (como mostrado na Figura 3B,C). De acordo com nossa experiência, o método de injeção seca resulta em uma taxa de sobrevivência maior do que o método de injeção molhada relatado anteriormente8. Descobrimos que a incubação de ovos em um ambiente seco é fundamental para essa melhoria, aproveitando o fato de que os ovos T. domestica e as primeiras ninfas são resistentes à dessecação. Isso está de acordo com relatórios anteriores sugerindo que esta espécie prefere um ambiente seco, particularmente durante os estágios iniciais de desenvolvimento e que um ambiente úmido pode até ser prejudicial16. Em vez de uma placa de plástico, um gel de agarose pode ser usado para um rápido alinhamento dos ovos; no entanto, transferir os ovos injetados para uma superfície seca leva a uma maior taxa de sobrevivência.
Em conclusão, nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de T. domestica para uma edição bem sucedida do genoma: manter um ambiente esparsa para coletar um número suficiente de ovos e um ambiente seco para ter uma maior taxa de sobrevivência de embriões injetados. Os protocolos básicos de injeção, acasalamento e manutenção da cultura relatados aqui são usados não apenas para gerar cepas mutantes com edição de genomas, mas também para aplicações de outras ferramentas genéticas como RNAi e transgênese e ajudarão a entender os mecanismos subjacentes à evolução precoce dos insetos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
TO e TD foram apoiados pelos números de subvenção JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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