Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Nøytronkrystallografi Datainnsamling og prosessering for modellering av hydrogenatomer i proteinstrukturer

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61903
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, 2Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Nøytronproteinkrystallografi er en strukturell teknikk som tillater lokalisering av hydrogenatomer, og dermed gir viktige mekanistiske detaljer om proteinfunksjon. Vi presenterer her arbeidsflyten for montering av en proteinkrystall, nøytrondiffraksjonsdatainnsamling, strukturraffinering og analyse av nøytronspredningslengdetetthetskartene.

Abstract

Nøytronkrystallografi er en strukturell teknikk som gjør det mulig å bestemme hydrogenatomposisjoner innen biologiske makromolekyler, noe som gir mekanistisk viktig informasjon om protonasjons- og hydreringstilstander mens de ikke induserer strålingsskader. Røntgendiffraksjon gir derimot bare begrenset informasjon om posisjonen til lysatomer, og røntgenstrålen induserer raskt strålingsskader på lysfølsomme kofaktorer og metallsentre. Presentert her er arbeidsflyten ansatt for IMAGINE og MaNDi bjelker på Oak Ridge National Laboratory (ORNL) for å få en nøytron diffraksjon struktur når en protein krystall av passende størrelse (> 0,1 mm3) har blitt dyrket. Vi demonstrerer montering av hydrogenerte proteinkrystaller i kvarts kapillærer for nøytrondiffraksjonsdatainnsamling. Også presentert er damputvekslingsprosessen til de monterte krystallene med D2O-inneholdende buffer for å sikre utskifting av hydrogenatomer på utskiftbare steder med deuterium. Inkorporering av deuterium reduserer bakgrunnen som oppstår fra usammenhengende spredning av hydrogenatomer og forhindrer tetthetsreduksjon forårsaket av deres negative sammenhengende spredningslengde. Innsamlingsstrategier for prøvejustering og romtemperaturdata illustreres ved hjelp av kvasi-Laue-datainnsamling ved IMAGINE ved High Flux Isotope Reactor (HFIR). Videre demonstreres krystallmontering og rask frysing i flytende nitrogen for kryo-datainnsamling for å fange labile reaksjons-mellomprodukter på MaNDi-flytidsinstrumentet ved Spallation Neutron Source (SNS). Utarbeidelse av modellkoordinat- og diffraksjonsdatafiler og visualisering av nøytronspredningslengdetetthetskart (SLD) vil også bli adressert. Strukturforbedring mot kun nøytrondata eller mot felles røntgen-/nøytrondata for å oppnå en atomstruktur av proteinet av interesse vil endelig bli diskutert. Prosessen med å bestemme en nøytronstruktur vil bli demonstrert ved hjelp av krystaller av det lytiske polysakkaridmonoksygenase Neurospora crassa LPMO9D, et kobberholdig metalloprotein involvert i nedbrytning av rekalsykliske polysakkarider via oksidativ spalting av glykosidbindingen.

Introduction

Nøytron makromolekylær krystallografi er en teknikk som gir et unikt vindu inn i strukturen og underliggende kjemi av proteiner. Konseptuelt lik røntgendiffraksjon, gir nøytrondiffraksjon atomistiske detaljer om makromolekylær struktur, men samspillet mellom nøytroner med kjerner muliggjør lokalisering av lysatomer, ofte vanskelig å oppdage med røntgendiffraksjon1. Under røntgendiffraksjon sprer røntgenstråler seg fra elektronskyen, noe som gjør lysatomer som hydrogen (H) dårlig synlige i elektrontetthetskart som ikke har nær sub-Ångström oppløsning2. I motsetning er spredningsintensiteten til nøytroner avhengig av komplekse interaksjoner med kjernen, med isotoper av samme element som viser forskjellige spredningslengder. Derfor har lysatomer og deres isotoper, som hydrogen (1H) og deuterium (2H eller D), sammenlignbar synlighet med ryggradskarbon-, nitrogen- og oksygenatomer i nøytronspredningslengdetetthetskart (SLD). Videre, siden størrelsen på nøytronspredning er uavhengig av antall elektroner, er spredning fra lyselementer ikke skjult av tunge elementer når de er i nærheten av hverandre, som det observeres i røntgenspredning. Den forbedrede synligheten av H og dens isotop D ved bruk av nøytrondiffraksjon gir verdifull informasjon om protonasjonstilstanden til katalytisk viktige rester, kofaktorer og ligander og hjelper orienteringen av vannmolekyler, og avslører viktig informasjon om katalytiske mekanismer og proteinkjemi3. Nøytrondiffraksjon gir også fordelen av å være en ikke-destruktiv teknikk, spesielt egnet til biologiske prøver som er følsomme for ionisering som proteiner med metallsentre eller lysfølsomme redoks kofaktorer2. Hovedfokuset i denne artikkelen er å gi en oversikt over arbeidsflyten for å oppnå en høykvalitets nøytronproteinkrystallstruktur. Vi henviser den interesserte leseren til Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 og O'Dell et al.3 for en utmerket oversikt over nøytronproteindiffraksjon og Ashkar et al.7 for videre anvendelser av nøytronspredning.

Nøytroner genereres hovedsakelig under kjernefysiske reaksjoner som bruker en av to prosesser: kjernefysisk fisjon ved reaktorkilder eller spallasjon ved akseleratorbaserte kilder8. Reaktorkilder gir en kontinuerlig nøytronstråle ved å bruke kjernefysisk fisjon av 235U-isotopen, mens spallasjons nøytronkilder produserer en pulserende nøytronstråle ved å bombardere et mål, for eksempel et flytende metall som kvikksølv, med protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, er vert for både en steady-state nøytronkilde ved High Flux Isotope Reactor (HFIR) og en 60 Hz pulsert kilde ved Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE-strålelinjen, som ligger ved HFIR, er et nøytrondiffraktomometer optimalisert for biologiske makromolekyler (tilleggs figur 1)10. IMAGINE bruker en nøytronbildeplatedetektor til å måle kvasi-Laue-data ved hjelp av en smal båndovergang i området 2,8 – 4,5 Å fra enkeltkrystaller med enhetscellekanter <150 Å. Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), som ligger ved SNS, er et tidsforløp (TOF) Laue nøytrondiffraktomometer utstyrt med en sfærisk detektormatriseramme (DAF) (supplerende figur 2)11. MaNDi måler data fra enkeltkrystaller med enhetscellekanter i området 10 – 300 Å ved å bruke en justerbar 2 Å-bølgelengdebåndbredde mellom 2,0 – 6,0 Å12.

Prosessen med å generere nøytroner er svært energiintensiv, noe som resulterer i relativt svake nøytronstråleflukser når de kontrasteres til røntgenstråleflukser ved synkrotronkilder13. For å sikre tilstrekkelige signal-til-støy-forhold under datainnsamling, er det nødvendig å dyrke krystaller av passende størrelse og kvalitet14. Vanligvis er det nødvendig med krystaller med volumer > 0,1 mm3 for å samle inn data med tilstrekkelig statistikk15. I tillegg til lavere fluxer må iboende egenskaper ved samspillet mellom nøytroner og prøvekjerner tas i betraktning16. Spredningslengden på nøytroner er forskjellig for isotoper av samme element, en egenskap som med fordel kan utnyttes i små vinkel nøytronspredning (SANS) for å maskere eller markere regioner i en prøve - en prosess kjent som kontrastmatching17. I diffraksjonseksperimenter kan den negative sammenhengende nøytronspredningslengden på H (-3,741 fm for 1H) føre til kansellering av nøytronspredningstetthetskartfunksjoner siden den sammenhengende nøytronspredningslengden til andre biologisk relevante atomer, inkludert karbon (6.6511 fm for 12C), nitrogen (9.37 fm for 14N), oksygen (5.803 fm for 16O), fosfor (5,13 fm for 31P) og svovel (2,804 fm for 32S), er positive (tabell 1)12,14. Videre øker den store usammenhengende spredningslengden på H (25.274 fm), bakgrunnen under datainnsamlingen, hemmer kvaliteten på datasettet og kompromitterer dataoppløsningen7. For å omgå disse begrensningene introdusert av H er det nødvendig, for nøytrondiffraksjon, å bytte H for isotopdeuterium, 2H (D), som har en positiv sammenhengende nøytronspredningslengde (6.671 fm) og betydelig lavere usammenhengende spredningslengde (4.04 fm)19. Dette kan oppnås ved perdeuterasjon, en prosess der proteinet uttrykkes av organismer dyrket i fullt deuterte medier som sikrer fullstendig innlemmelse av D på H-steder20. Det er også mulig å delvis deuterate protein ved å erstatte H med D utelukkende på utskiftbare steder (titratable grupper) mens de ikke-utskiftbare karbonbundne stedene forblir hydrogenert21. Dette kan oppnås ved vekst av hydrogenerte proteinkrystaller i deuterated moderluten22. Vanligvis utføres imidlertid H/D-utveksling av hydrogenerte proteiner ved damputveksling etter vekst av passende store krystaller i H2O-basert buffer23. I slike tilfeller er krystaller montert i en kvarts kapillær og damp-likevektet med en D20-basert moderluten.

De begrensede nøytronfluksene ved nøytronkilder resulterer i lengre datainnsamlingstider, alt fra dager til flere uker24. På ORNL bruker både IMAGINE og MaNDi et smalt bølgelengdebåndpass i 2–6 Å-serien for å optimalisere datainnsamlingen25. Data kan samles inn ved romtemperatur eller ved kryotemperatur. Kryodatainnsamling kan potensielt forbedre datakvaliteten og åpner muligheten for å fryse fange katalytiske mellomprodukter. Etter nøytrondiffraksjonsdata samles vanligvis et røntgendatasett på samme krystall ved samme temperatur eller på en krystall som vokser under identiske forhold26. Datainnsamling ved samme temperatur gjør det mulig å utføre strukturforbedring mot både røntgen- og nøytrondata, noe som forhindrer potensielle temperaturinduserte gjenstander som endringer i synligheten og posisjonen til farvann eller belegg av rester med alternative konformasjoner27. Ledd røntgen nøytron data raffinement øker data-til-parameter forholdet og gir fordelen av å tillate protein ryggraden koordinater å bli raffinert mot røntgendata, mens nøytron diffraksjon data brukes til å avgrense posisjonen til H / D atomer28. Dette er spesielt nyttig ved bruk av delvis deuterte prøver, hvor tetthetsreduksjon på grunn av H-atomer på ikke-utskiftbare steder på proteinet er til stede. Selv om antallet røntgenstrukturer langt overstiger antall nøytronstrukturer deponert i Protein Data Bank (PDB), har programvarepakker som opprinnelig ble designet for raffinering av røntgendata blitt utvidet til å omfatte nøytrondata også3,29,30. Etter datainnsamlingen kan modeller raffineres ved hjelp av raffineringspakker som phenix.refine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under raffineringsprosessen kan nøytronspredningstetthetskart visualiseres for manuell montering ved hjelp av COOT34. Etter strukturløsning kan koordinatene og nøytron- og/eller røntgendiffraksjonsdatafilene sendes til PDB, som vil validere og deponere modellen, noe som gjør den tilgjengelig for offentlig tilgang18,29,30.

Strukturell analyse av proteiner er en mangesidig tilnærming der mange teknikker brukes til å sondere deres funksjon og mekanisme35. Nøytronproteinkrystallografi gir verdifull kjemisk innsikt for å utvide og utfylle funn fra tilleggsstudier som røntgendiffraksjon, spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) eller mikrokrystallelektrondiffraksjon (microED)36. Nøytronproteindiffraksjon er unikt posisjonert for å gi innsikt i enzymatiske mekanismer, siden H-atomer er sentrale i kjemien. Fraværet av strålingsskader forårsaket av nøytroner gjør dem til en sonde som er usedvanlig egnet til studiet av metalloproteiner37. Vi presenterer her et representativt eksempel på prosessen med nøytronproteindiffraksjon fra prøvepreparering til datainnsamling, raffinement og analyse (figur 1). Krystaller av tilstrekkelig størrelse for nøytrondiffraksjonsforsøk har blitt dyrket av metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D er et kobberholdig metalloprotein involvert i nedbrytning av rekalsitrantcellulose ved oksygenatominnsetting ved glykosidbindingen38,39. Det aktive nclpmo9d-anlegget inneholder et mononukleært kobbersenter innenfor en karakteristisk "histidin-støtte" sammensatt av N-terminal histidin og en annen bevart histidin (tilleggsfigur 3)40. N-terminalen for sopp-LPMOer er metylert, men den post-overgangsmodifiseringen oppstår ikke under rekombinant uttrykk i gjær. I hviletilstanden ncLPMO9D er kobbersenteret til stede i en Cu2+ oksidasjonstilstand og aktiveres ved enkelt elektronreduksjon til Cu1+, slik at molekylært oksygen kan bindes og aktiveres ved raskt å bli redusert til en superoksidart41,42. Den generelle NcLPMO9D-reaksjonen krever ytterligere tilsetning av ett elektron og to protoner for å danne det hydroksylerte polysakkaridproduktet43. Identiteten til de aktiverte oksygenartene som er ansvarlige for hydrogenatomabstraksjon (HAA) fra polysakkaridsubstratet er ikke identifisert, og intensive strukturelle og beregningsstudier pågår for tiden44,45. Gitt redokskjemien på det aktive nettstedet NcLPMO9D, er reduksjon av strålingsskader spesielt relevant. Vi illustrerer her romtemperatur og innsamling av kryotemperaturdata på NcLPMO9D-krystaller for å bestemme NcLPMO9D-strukturen i hviletilstanden og i den aktiverte reduserte formen, henholdsvis46. Det vil bli lagt vekt på proteinkrystallmontering, stråleinstrumentoppsett for datainnsamling, utarbeidelse av data- og koordinatfiler og raffineringstrinnene som er nødvendige for å modellere en atom nøytronstruktur.

Protocol

1. Evaluering av krystallstørrelse

  1. Mål størrelsen på krystallene ved hjelp av et mikroskop utstyrt med normalt og polarisert lys. Velg krystaller med et minimumsvolum på ~0,1 mm3 (tilleggsfigur 4).
  2. Merk brønner med tilstrekkelig store krystaller og legg merke til krystalliseringsforholdene som brukes til å generere disse krystallene.

2. Forberedelse av deutert krystalliseringsbuffer

  1. Løs opp krystalliseringsbufferkomponenter i D2O for å generere deutert krystalliseringsbuffer.
  2. Juster pH for bufferen ved å beregne pD for løsningen ved hjelp av følgende ligning:
    Equation 1 (1)
    hvor pHmeas er pH målt med en standard glasselektrode. Den opprinnelige pH i NcLPMO9D-krystalliseringsbufferen var 6,0, derfor vil vi bruke en pHmeas på 5,6 for den deutererte krystalliseringsbufferen ved pD 6.0.
  3. Senk pH-målerelektroden ned i D2O i ti minutter før bruk (tilleggsfigur 5).
  4. Juster pHmeas til 5,6 ved bruk av basen NaOD eller syre-DCl.

3. Krystall høsting

  1. Plasser silikoniserte 22 mm runde glasssklier ved siden av krystalliseringsbrettet som krystaller skal høstes fra. Bruk en ren glasssklie per krystall (figur 2A).
  2. Åpne den forseglede sandwichboksen som inneholder proteinkrystallene i den 9-brønns store volum silikoniserte glassplaten.
  3. Fjern 10-20 μL fra krystalliseringsreservoarløsningen med en mikropipette og plasser løsningen på glasssklie (figur 2B).
  4. Høst krystallen ved hjelp av en mikroloop av passende størrelse og legg krystallen i reservoarløsningsfallet på glasssklie for å fjerne rusk som ofte høstes sammen med krystallen (figur 2C og figur 2D).
    MERK: Det vil være nødvendig å arbeide raskt siden små volumdråpene kan fordampe. Høstede krystaller er også i fare for å tørke ut når de blir utsatt for atmosfæren. Det kan være nødvendig å legge til noe reservoarløsning til proteindråpen for å forhindre at krystaller tørker ut i små krystalliseringsfallvolumer.

4. Krystall montering

MERK: Kapillærmonteringsprotokoller varierer med eksperimentelle preferanser. For å forhindre skade på krystaller, bør kapillærer som må forkortes, skåres med en skjærestein eller sandpapir for å sikre en jevn pause.

  1. Fyll den ene enden av en kvartskapillær med diameter på 2 mm med reservoarbuffer ved kapillærvirkning eller ved direkte pipettering ~10 μL reservoarbuffer i kapillæren (figur 3A).
    MERK: Brukere oppfordres til å bruke kvarts kapillærrør fordi det i tillegg til sin mekaniske styrke er viktig å begrense nøytronstråleabsorpsjon og lavere bakgrunnsbidrag fra kapillæren. Glass kapillærer introduserer høy bakgrunn og absorberer nøytroner, og kompromitterer datakvaliteten.
  2. Plasser krystallen forsiktig i reservoarbufferen i kvartskapillæren ved hjelp av monteringssløyfen (figur 3B og figur 3C).
  3. Trykk forsiktig på røret for å flytte reservoarbufferen og den nedsenkede krystallen nedover kapillæren (figur 3D).
  4. Plasser krystallen ikke nærmere enn 13,5 mm og ikke lenger 27,5 mm fra den ene enden av kapillæren; Dette vil være monteringsenden (tilleggsfigur 6).
  5. Aspirer bufferløsningen rundt krystallen ved hjelp av en lang tynn pipettespiss, slik at krystallen blir litt våt. Ikke berør krystallen (tilleggsfigur 7A).
  6. Tørk kapillærveggene med en tynn papirtransport (tilleggsfigur 7B).
  7. Pipette 20-50 μL av deutert bufferløsning inn i enden av kapillæren på motsatt side av monteringsenden (figur 4A).
  8. Smelt bivoks med en varme "tryllestav" og sett forsiktig kapillæren i denne smeltede bivoksen. Gjenta til en lufttett tetning dannes (figur 4B og figur 4C).
  9. Pipette en svært liten mengde deutert buffer, ca. 5 μL i monteringsenden av kapillæren for å fungere som en "kjøleribbe" for den varme bivoksen. Dypp denne enden i smeltet bivoks for å generere en lufttett forsegling som beskrevet tidligere for å danne en kapillær forseglet i begge ender (figur 4D).
  10. Inspiser den monterte krystallen ved hjelp av et mikroskop etter montering for å sikre lufttetthet (figur 4E).
  11. Fest forsiktig de monterte krystallene med Kim-våtservietter i en beholder, for eksempel et 15 ml Falcon-rør eller Petri Dish, og oppbevar dem horisontalt ved temperaturen der krystallene ble dyrket (figur 4F).

5. Damp utveksling

  1. Bytt ut den deutererte bufferen med ny buffer to dager etter krystallmontering.
  2. Smelt vokstetningen lengst fra krystallen med en varmesløyfe, og bruk en pipette og papirkurver for å fjerne bufferen.
  3. Fyll kapillæren med 20-50 μL deutert bufferløsning og tetning med voks.
  4. Gjenta deutert bufferutskifting to ganger til med fire dagers intervaller for å sikre at deutert bufferdamputveksling er fullført og la damputveksling i minst to uker.

6. Nøytronprotein diffraksjon

MERK: Lesere som er interessert i IMAGINE-strålelinjespesifikasjonene oppfordres til å konsultere Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

  1. Innsamling av romtemperaturdata ved IMAGINE-strålelinjen ved HFIR
    1. Prøvemontering
      1. Fest den kapillærmonterte krystallen på goniometeret med kitt.
      2. Monter goniometeret på prøvepinnen og sentrer krystallen i strålen ved hjelp av off-line justeringsstasjon.
      3. Fest prøvepinnen på instrumentets prøvetrinn (tilleggsfigur 1B).
      4. Sørg for at den eksperimentelle hutch er fraflyttet og åpne beamline lukkeren for nøytron datainnsamling.
    2. Datainnsamling
      1. Åpne datainnsamlingsprogrammet på beamline-kontrolldatamaskinen, og klikk på oppsettfanen for å sette opp datainnsamlingsstrategien. Skriv inn eksempelnavnet ved siden av Eksempelnavn under Eksperimentparametere, og skriv inn forslagsnummeret ved siden av Forslag. Velg Mappemal under Bildenavn, og angi målet for de innhentede dataene som skal lagres, og velg Bildeprefiks og skriv inn relevant rammenavn (Tilleggsfigur 8).
      2. Åpne Optikk GUI og klikk på 2.78 for λmin og 4.78 for λmax å sette kvasi-Laue-området for datainnsamling (Supplerende figur 9).
      3. Bytt til Samle inn-fanen , og under Parametere for neste skanning setter du inn eksponeringstiden i sekunder under Eksponering, antall bilder under N-rammer og vinklene for datainnsamling under Δ φ/Frame. Gi rammen navnet som skal samles inn under Bildeprefiks, og start datainnsamlingen ved å klikke start skanning-knappen (tilleggsfigur 10).
      4. De diffracted nøytronene vil bli oppdaget av bildeplatedetektoren. På slutten av hver eksponering vil bildeplaten bli lest og mønsteret som vises på datainnsamlings-GUI (tilleggsfigur 11).
      5. Rammer indekseres, integreres, bølgelengde normaliseres og skaleres ved hjelp av Lauegen, Lscale50 og Scala av den ansvarlige strålelinjeforskeren, som vil gi brukeren den sammenslåtte refleksjonsfilen etter datainnsamling (Tilleggsfigur 12).
        MERK: Datainnsamling på både IMAGINE og MaNDi vil bli utført i kvasi-Laue-modus, ved hjelp av metodikk og programvare utviklet for Laue diffraksjonsdatainnsamling som utviklet av Helliwell et al.48 og Nieh et al.49.
      6. Samle inn et tilsvarende røntgendatasett på samme krystall ved samme temperatur etter nøytrondiffraksjonsdatainnsamling (tilleggs figur 13).
        MERK: En krystall dyrket fra samme dråpe eller under de samme krystalliseringsforholdene kan også brukes til å samle røntgendiffraksjonsdata for ledd nøytron/ røntgen raffinement.
  2. Cryo-datainnsamling ved MaNDi-strålelinjen ved SNS
    MERK: Lesere som er interessert i bjelkelinjespesifikasjonene oppfordres til å konsultere Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
    1. Prøvemontering
      1. Forbered den deuterte ascorbate soaking-løsningen for reduksjon av krystallene og det deutererte kryopregetektanten. Legg 20 μL dråper av hver av disse løsningene i sittende fallbrønner i en krystalliseringsplate.
        MERK: Den kryotopektive løsningen er vanligvis kryotopektanten som har vist seg effektiv for kryotemperatur røntgendiffraksjonsdatasamling utarbeidet i D2O. Dette kryopreotektantet kan optimaliseres ytterligere (f.eks. konsentrasjon) for nøytrondatainnsamling om nødvendig.
      2. Velg løkker for prøvemontering og fest dem til en magnetisk kryobase etter MaNDi-retningslinjene (tilleggs figur 14).
      3. Fyll et skum cryo-Dewar med flytende nitrogen. Plasser en kryobeskyttelseshylse av metall i det flytende nitrogenet for å avkjøles (tilleggsfigur 15A).
      4. Fjern vokspluggene fra begge ender av kapillæren og trykk på kapillæren for å flytte bufferpluggen slik at den monterte krystallen er nedsenket i bufferen. Vask krystallen ut i 20 μL reservoaroppløsningsfallet i sittedråpebrønnen (supplerende figur 15B og supplerende figur 15C).
        MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig hvis H/D-utveksling ble utført ved likevekt av krystalliseringsfallene mot deutert buffer eller ved direkte bløtlegging av krystallen i deuterert buffer.
      5. Senk krystallen ned i ascorbate soaking-løsningen i to timer. Monter krystallen i en mikroloop festet til en magnetisk kryobase. Senk den monterte krystallen ned i kryoprektanten i 10 sekunder og dypp krystall- og kryobraketten i det flytende nitrogenet for å fryse (tilleggsfigur 15D).
      6. Når krystallen er frosset, bruk ferdigkjølt kryostifttangen og monter krystallen på MaNDi-prøvetrinnet utstyrt med en kryostrøm. Åpne forsiktig kryostifttangen og sørg for at krystallen forblir i kryostrømmen (tilleggsfigur 2C).
    2. Datainnsamling
      1. Åpne datainnsamlingsprogramvaren der eksperimentinformasjonen skal fylles ut automatisk.
      2. Klikk på midten av krystallen for å midtstille den med det datastyrte goniometeret (tilleggsfigur 16).
      3. Under Tabell setter du opp datainnsamlingsstrategien ved å legge inn vinklene for datainnsamling under "phi" samt den totale nøytronstråleeksponeringen per ramme under Verdi (tilleggs figur 17).
      4. Klikk Send for å starte datainnsamlingen.
      5. Etter hvert som data samles inn, vil diffracted nøytron være synlig (supplerende figur 17). Diffraksjonsflekker blir tydeligere etter hvert som eksponeringstiden øker, noe som forbedrer signal-til-støy-forholdet (figur 5).
      6. Rammer vil bli indeksert, integrert, bølgelengde normalisert og skalert ved hjelp av Mantid og Lauenorm av den ansvarlige strålelinjeforskeren, som vil gi brukeren den sammenslåtte intensitetsfilen etter datainnsamling51.

7. Struktur raffinement

  1. Felles røntgen- og nøytrondataforbedring
    1. Forberedelse av struktur
      1. Finpuss røntgendataene for å få en proteinstruktur ved hjelp av programvarepakken phenix.refine og Coot for manuell bygging for å oppnå en fullført struktur.
      2. Åpne CCP4 og velg Konverter til / endre / utvid MTZ-programmet for å matche R-frie dataflaggene til nøytrondataene med røntgendataene. Velg for å importere gjenspeilingsfilen i MTZ-format . Under Last opp den oppnådde nøytron MTZ-filen og last opp røntgen mtz-filen under Import FreeR MTZ (Tilleggsfigur 18). Gi et navn på den nye MTZ-filen under Ut , og klikk Kjør.
      3. Åpne Phenix-programvarepakken og klikk på ReadySet under Raffinementsverktøy. Ved siden av PDB-filen laster du opp PDB-koordinatfilen raffinert mot røntgendataene. Velg å legge til hydrogener i modellen hvis de ikke finnes , og velg H/D på utskiftbare steder, H et annet sted fra rullegardinmenyen. Velg Legg til deuteriumer til løsningsmiddelmolekyler og la de resterende alternativene stå på standardverdiene (Tilleggs figur 19A).
        MERK: Hvis et perdeutert protein brukes, velger du alternativet Legg hydrogener til modell hvis det ikke er fraværende og velg H / D på utskiftbare steder, D andre steder.
    2. Presisering av struktur
      1. Åpne phenix.refine-programmet under Fanen Presisering for å sette opp raffinementet ved hjelp av både røntgen- og nøytrondata. I kategorien Konfigurer i Inndatafiler legger du inn PDB-filen fra røntgenstrukturen som er behandlet med ReadySet og den nødvendige CIF-restrains-filen for alle relevante ligander. Last opp MTZ-filen fra nøytrondataene med Rfree-flaggene tilordnet ved hjelp av CCP4, og tilordne dette som "Neutron data" og "Neutron R-free" under Datatype-overskriften. Last opp MTZ-filen fra røntgendataene og tilordne dette som "røntgendata" og "X-ray R-free" under Datatype-overskriften. Områdegruppen og dataetikettene fylles ut automatisk når dataene er lastet opp (tilleggsfigur 19B).
        MERK: Når du utfører forbedringen og legger inn krystallinformasjonen, bruker du enhetscellen som bestemmes av røntgendataene.
      2. Under konfigureringsfanen i presiseringsinnstillingene beholder du standard presiseringsstrategi. Øke antall sykluser til fem (supplerende figur 20)
      3. Velg Alle parametere, klikk på Avansert og velg Hydrogens .... Endre hydrogenforbedringsmodellen til individuell og slå av Force riding adp (Tilleggsfigur 20).
      4. Velg Alle parametere , og åpne alternativet Søkeparametere . Søk etter ordet kjernefysisk , og velg å bruke atomavstandene for X-H/D (tilleggsfigur 20).
      5. Velg Kjør for å starte presiseringen.
    3. Modellbygging
      1. Etter raffinementet i Phenix, klikk på Åpne i Coot i Resultater-fanen for å visualisere røntgenelektrontettheten og nøytron SLD-kartene. Klikk på Display Manager-fanen og under Kart klikker du på Slett kart ved siden av _neutron kart for å fjerne nøytronkartene (tilleggsfigur 21). Klikk på Fil > Åpne MTZ, mmCIF fcf eller phs .... Velg gjeldende presiseringsfiler, og åpne MTZ-filen. For både Amplitudes og Phases velger du 2FOFC WT_no_fill_neutron data fra rullegardinmenyen. Gjenta dette og åpne FOFC WT_neutron data. Åpne Display Manager og bytt til Scroll for både nøytron- og røntgenkartene 2FOFCWT, og rull deretter for å redusere rmsd for 2FOFCWT-kartene til 1,00 (tilleggs figur 21). Bytt til Scroll for både nøytron- og røntgen-FOFCWT-kartene, og bla for å redusere rmsd for FOFCWT-kartene til 3,00.
      2. Utfør visuell inspeksjon av rester for å avgjøre om modellen passer til dataene. Bestem riktig retning og H/D-belegg for alle utskiftbare områder ved å analysere karttoppene for forskjellstetthet. Dette inkluderer hydroksylgruppene av seriner, treoniner og tyrosiner; nitrogenet av histidin, glutamin, aspargin og lysin; sulhydryl av cystein; karboksylgruppene av aspartat og glutamat; ryggrad blant grupper; ligander; kofaktorer og eventuelle funksjonaliserte rester (figur 6).
      3. Reorienteringsvannmolekyler i henhold til nøytrontetthet og hydrogenbindingsinteraksjoner ved å rotere dem ved hjelp av funksjonen Roter oversettingssone/kjede/molekyl (tilleggsfigur 22A og tilleggsfigur 22B). Juster posisjonene til proteinrester H/D utskiftbare steder ved hjelp av Verktøyet Rediger chi-vinkler og funksjonen Roter oversettingssone/kjede/molekyl (tilleggsfigur 22C og tilleggsfigur 22D).
  2. Strukturforbedring – nøytrondataforbedring
    1. Forberedelse av struktur
      1. Åpne Phenix og velg "Molecular Replacement" og velg "Phaser-MR (full featured)" for å utlede fasen av de skalerte intensitetene levert av instrumentforskeren ved molekylær erstatning for å generere en startkoordinatfil i PDB-format. Skriv inn start-PDB-strukturen i kategorien "Input and general options og fullfør alternativene Ensembler, ASU-innhold og Søkeprosedyre .
      2. Åpne Modellverktøy , og velg PDB-verktøy. Sett inn PDB-filen som inndatafil. Naviger til Alternativer-fanen , og under Fjern atomvalg velger du navnene på løsningsmidlet, ligandene, kofaktorene og metallene. Dette fjerner alle vannmolekyler, kofaktorer, ligander og metallioner for å generere en minimal modell. I tillegg velger du for å fjerne alternative konforme elementer fra modellen (tilleggsfigur 23).
      3. Velg Raffinement i Phenix og åpne ReadySet. Skriv inn den redigerte PDB-koordinatfilen ved siden av PDB-filen. Velg å legge til hydrogener i modellen hvis de ikke finnes , og velg H/D på utskiftbare steder, H et annet sted fra rullegardinmenyen i Nøytronforbedringsalternativer (Tilleggs figur 23).
    2. Presisering av struktur
      1. Åpne phenix.refine-programmet under Raffinement-fanen i Phenix. I kategorien Konfigurer skriver du inn PDB-filen som er behandlet med ReadySet under boksen Inndatafiler . I Boksen Inndatafiler laster du opp MTZ-filen fra nøytrondataene og tilordner denne som røntgendata og røntgen R-fri under Datatype-kolonnen selv om det er nøytrondata. Raffineringskonfigurasjonen som er satt opp i neste trinn, vil bli brukt til å behandle refleksjonsfilen som nøytrondata. Områdegruppen og dataetikettene fylles ut automatisk når dataene er lastet opp (tilleggsfigur 24A).
      2. Under konfigureringsfanen i presiseringsinnstillingene beholder du standard presiseringsstrategi. Øk antall sykluser til fem. Velg nøytron på rullegardinmenyen Spredningstabell under Andre alternativer. Fjern merket for alternativet Oppdater farvann (tilleggsfigur 24B).
      3. Velg Alle parametere>Advanced>Hydrogener. I det nye vinduet velger du Individuell fra rullegardinmenyen Hydrogen refinement model og slår av rullegardinmenyen Force riding adp (Tilleggs figur 20).
      4. Velg Alle parametere > søkeparametere... opsjon. Søk etter ordet kjernefysisk , og velg å bruke atomavstandene for X-H/D (tilleggsfigur 20).
      5. Velg Kjør for å starte presiseringen.
        MERK: Etter den første raffinementet vil det være nødvendig å visuelt inspisere nøytron SLD-kartene og utføre manuell modellbygging i Coot. Det kan være nødvendig å sette inn ligander/kofaktorer som finnes i modellen. Etterfølgende forbedringer vil kreve den nødvendige CIF-begrensningsfilen for alle relevante ligander, og disse skal lastes opp i Konfigurer-fanen til phenix.refine.
    3. Modellbygging
      1. Etter raffinementet i Phenix, klikk på Åpne i Coot i Resultater-fanen for å visualisere nøytron SLD-kartene og strukturen. Klikk på Display Manager-fanen og under Kart klikker du på Slett kart for å slette både 2FOFCWT- og FOFCWT-kartene (Tilleggs figur 25). Klikk på Fil > Åpne MTZ, mmCIF fcf eller phs .... Velg gjeldende presiseringsmappe, og velg MTZ-filen. For både Amplitudes og Phases velger du 2FOFC WT_no_fill data fra rullegardinmenyen. Gjenta ved å klikke på Fil > Åpne MTZ, mmCIF fcf eller phs... og velg FOFCWT-dataene fra rullegardinmenyen for både Amplitudes og Phases-alternativet. Åpne Skjermbehandling og bytt til Rull for 2FOFC WT_no_fill kartet, og rull deretter for å redusere rmsd for 2FOFC WT_no_fill data til 1,00 (tilleggs figur 25). Veksle for å rulle for FOFCWT-kartet og rulle for å redusere rmsd for FOFCWT-dataene til 3,00.
      2. Utfør visuell inspeksjon av proteinstrukturen for å avgjøre om modellen passer til nøytron SLD-kartet.
      3. Som beskrevet i 7.1.3.2, bestem riktig orientering og H /D belegg av rester og grupper med H / D utskiftbare steder. Juster restposisjoner ved hjelp av Roter oversetting-verktøyet og Rediger chi-vinkler (figur 6). Om nødvendig kan Real Space Refine Zone brukes. Fiks D-atomer som eksploderer fra restene manuelt ved hjelp av tekstredigeringsprogrammet for å sette inn de riktige atomkoordinatene
        MERK: Real Space Refine Zone er ikke optimalisert for nøytron SLD-kart i Coot og kan resultere i uregelmessige bindingslengder for atomer bundet til D, kalt eksploderende rester (tilleggs figur 26). Det er å foretrekke å redigere de nødvendige atomkoordinatene manuelt og unngå bruk av Real Space Refine Zone.
      4. Sett inn og reorientere vannmolekyler i henhold til nøytrontetthet. Hvis du vil legge til vann i Coot, velger du ikonet Plasser atom ved peker og velger å sette inn et vannmolekyl (tilleggsfigur 27A). Coot vil sette inn et O-atom i denne posisjonen som standard.
      5. For å legge D atomer til O atomer av farvann satt inn i Coot bruk Phenix. Åpne Presiseringsmenyen og klikk på ReadySet. Ved siden av Neutron Refinement Options velger du bare alternativet for å legge til deuterier til løsningsmiddelmolekyler. Fjern merket for Legg hydrogener til modell hvis de ikke er fraværende (Tilleggs figur 27B og Tilleggs figur 27C).
        MERK: Modellbygging ved hjelp av nøytrondata skiller seg fra modellbygging av en felles røntgen-/nøytronstruktur fordi det ikke finnes røntgendata som bidrar til å raffinere koordinatene til ryggraden og tyngre atomer. I en felles raffinement brukes elektrontetthetskartet i utgangspunktet til å bestemme proteinrygden og sidechainkoordinatene. Denne modellen brukes deretter i en felles røntgen/nøytrondataforbedring der orientering og belegg av H/D-atomer er avledet fra nøytron SLD-kartet. I en nøytronforedling er hele strukturen avledet fra analyse av nøytron SLD-kartene, som krever bygging av vannmolekyler, ryggrad, sidekjeder og ligander i tillegg til H/D-atomene (figur 6). Data-til-parameter-forholdet er lavt i forbedringer mot nøytrondata alene, og det bør tas forsiktighet for ikke å overmontere dataene.

Representative Results

Nøytrondiffraksjonsdata om krystaller av en lytisk polysakkaridmonoksygenase fra Neurospora crassa (NcLPMO9D) ble samlet inn på IMAGINE ved HFIR ved romtemperatur og på MaNDi ved SNS under kryoforhold etter protokollen beskrevet ovenfor. Krystaller av hydrogenert protein dyrket i H2O-basert buffer med volum større enn 0,1 mm3 ble brukt (illustrerende eksempel på store krystaller er vist i Supplerende figur 4 og tall deretter). Krystaller ble montert i kvarts kapillærer og damputveksling med D2O-basert buffer ble utført i tre uker før datainnsamling (figur 4).

Innsamling av romtemperaturdata ble utført på IMAGINE-strålelinjen (figur 1). En fire timers hvitstråletest førte til høyoppløselig diffraksjon som antyder at krystallen var av passende størrelse og kvalitet for et fullstendig datasett som skulle samles inn. I tillegg til å gi foreløpig informasjon om diffraksjonskvaliteten til krystallen, kan den første brede bandpasseksponeringen brukes til å indeksere diffraksjonsmønsteret og bestemme krystallorienteringsmatrisen. Gitt P21-romgruppen til krystallen, ble en datainnsamlingsstrategi på 18 rammer med en innsamlingstid på 20 timer per ramme implementert. Som med innsamling av røntgendiffraksjonsdata krever høyere symmetriromgrupper færre rammer (dvs. mindre vinkeldekning) for å samle inn et komplett datasett. Dataene ble samlet inn i kvasi-Laue-modus ved hjelp av et bølgelengdeområde på 2,8 – 4,0 Å. Etter datainnsamlingen ble dataene indeksert, integrert skalert og slått sammen for å gi en nøytron SLD-fil i MTZ-format med en oppløsning på 2,14 Å. Data ble evaluert til å være av tilstrekkelig kvalitet etter lignende retningslinjer for røntgendataanalyse, selv om en fullstendighet på 80 % og en CC1/2 på minst 0,3 ble ansett som akseptabel siden nøytronproteindiffraksjon er en fluksbegrenset teknikk.

Etter innsamling av romtemperatur nøytrondiffraksjonsdata ble den samme krystallen brukt til å samle inn røntgendiffraksjonsdatasett for romtemperatur ved 1,90 Å-oppløsning (tilleggs figur 13). Røntgendataene ble brukt til å bestemme posisjonene til de "tyngre" atomene, inkludert C, N, O og S. Strukturen raffinert mot røntgendataene alene ble deretter brukt som startmodell for å utføre en felles raffinement mot røntgen- og nøytrondata. Phenix ReadySet ble brukt til å tilsette H-atomer på ikke-utskiftbare steder, H- og D-atomer på utskiftbare steder og D-atomer til vannmolekyler av start-røntgenmodellen. Etter denne modellforberedelsen ble det utført iterative forbedringer mot begge datasettene (Tilleggs figur 19 og Supplerende figur 20). Interaktiv modellbygging ble utført i Coot ved å visuelt inspisere tetthetskartene for å orientere sidekjeder og vannmolekyler deretter (Supplerende figur 22). Nøytrondataene ble først og fremst brukt til å bestemme protonasjonstilstander og vannmolekylorienteringer. Sammenligning av elektrontetthetskartet over rester som serin og tryptofan og det tilsvarende nøytron SLD-kartet illustrerer informasjonen som kan oppnås på protonasjonstilstander på H/D-utskiftbare steder fra nøytronproteindiffraksjon (figur 7). Et kartoverlegg av elektron- og nøytron SLD-kart for vannmolekyler indikerer også at mens hydrogenbindingsinteraksjoner kan utledes fra røntgendata, gir nøytroner klar informasjon om orienteringen av disse hydrogenbindingene (figur 8). Nøytron SLD FO-FC utelate kart ble generert for å bestemme protonasjonstilstander og H / D orientering av sidekjeder. Illustrert er nøytron SLD-kartene som er oppnådd for tyrosin- og treoninrester, der nøytron Fo-FC-kartene tydelig indikerer positive topper som indikerer tilstedeværelsen av H / D (figur 9). De innsamlede nøytrondiffraksjonsdataene ga også verdifull informasjon om flere protonasjonstilstander, for eksempel -ND3+-gruppen av Lys (figur 10). Raffineringsstatistikk (Rwork og Rfree) ble nøye overvåket under modelloptimalisering for å forhindre overmontering. Endelig statistikk ga en røntgen Rwork på 12,77 % og en Rfree på 18,21 %, og et nøytron-arbeid på 14,48 % og en Rfree på 21,41 % med 389 vannmolekyler til stede (tilleggs figur 28).

Kryotemperaturdata ble samlet inn på NcLPMO9D etter en ascorbate-suge for å redusere kobberaktivt sted fra CuII til CuI på MaNDi-strålelinjen (tilleggs figur 2 og tilleggsfigur 15)45. Data ble samlet inn ved hjelp av TOF Laue-modus etter en nøytrondiffraksjonstest ved hjelp av en 4 timers eksponering for å verifisere kvaliteten på diffraksjon. Gitt romgruppen av krystallen, ble det utarbeidet en datainnsamlingsstrategi på 18 rammer med en innsamlingsdose på 80 Coulombs per ramme. Dataene ble samlet inn i TOF-Laue-modus i et bølgelengdeområde på 2,0 – 4,0 Å. Etter datainnsamlingen ble dataene indeksert, integrert, skalert og slått sammen for å gi en refleksjonsfil i MTZ-format med en oppløsning på 2,40 Å51,52.

Etter datainnsamling ble 2.40 Å cryo-temperatur NcLPMO9D nøytrondiffraksjonsdatasett brukt til nøytron-bare dataraffinering. Nøytrondataene ble faset av molekylær erstatning ved hjelp av PDB 5TKH som startmodell. Phenix ReadySet ble brukt til å tilsette H-atomer på ikke-utskiftbare steder og H/D-atomer med delvis belegg på utskiftbare steder. Vannmolekyler ble fjernet fra startmodellen med PDB Tools (Supplementary Figure 23). Modellpreparatet ble etterfulgt av raffinement med fenix.refine ved hjelp av nøytronspredningstabellen (supplerende figur 24). Interaktiv modellbygging ble utført i Coot, med vannmolekyler som ble tilsatt ved hjelp av de positive toppene på FO-Fc-kartet og plassert i henhold til potensielle hydrogenbindingsinteraksjoner (figur 11A og figur 11B). Ved analyse av nøytron SLD-kart er vannmolekyler tydelig synlige hvis de er høyt bestilt, men tettheten kan være sfærisk eller ellipsoidal hvis de ikke er godt bestilt (figur 11C-E). Nøytron SLD-kart ble brukt til å gi verdifull informasjon om orientering av rester som aspargin, der det kan være utfordrende å skille mellom karbonyl- og aminogruppene ved bruk av røntgendiffraksjonsdata alene (figur 12A og figur 12B). Topper i FO-FC nøytron SLD utelate kart var også svært informative for å bestemme protonasjonstilstander av histidinrester ved N δ- eller N ε-posisjon (figur 12C og figur 12D). Protonasjonstilstanden til rester med flere H / D utskiftbare steder kan også bestemmes ved hjelp av nøytron SLD-kart. Dette ble tydelig illustrert med et FO-FC nøytron SLD utelater kart over arginin, som er kjent for å ha en positiv ladning (figur 12E og figur 12F). Som tidligere ble overmontering forhindret ved å overvåke Rwork og Rfree. Endelig statistikk ga en Rwork på 22,58% og en Rfree på 30,84% (Tilleggs figur 29). Gitt at nøytronproteindiffraksjon er en fluksbegrenset teknikk der den negative spredningslengden og den store usammenhengende spredningsfaktoren til H må tas i betraktning, kan det forventes at en nøytrondata-bare raffinement ville ha dårligere statistikk enn en felles røntgen / nøytron-data raffinement med færre synlige vannmolekyler (Supplerende figur 28 og supplerende figur 29).

Når du analyserer nøytron SLD-kart, vil det bli tydelig at tetthetsreduksjon på grunn av den negative nøytronspredningslengden på H vil oppstå for hydrogenerte proteiner som ble utsatt for damputveksling med D2O-inneholdende krystalliseringsbuffer. Av denne grunn vises nøytron SLD-kart der ikke-utskiftbare H-atomer er festet til karbon, ufullstendige sammenlignet med deres elektrontetthetskart motstykke (figur 13A). Effekten av kansellering er ofte tydeligere ved dårligere oppløsninger, noe som gjør det viktig å oppnå proteinkrystaller av høy kvalitet. Det er derfor å foretrekke å utføre en felles raffinement av en prøve med både røntgen- og nøytrondata der røntgendataene kan brukes til å bestemme posisjonen til proteinryggbenet (figur 13B). Videre kan svovelatomer i cystein og metionin være dårlig synlige, noe som krever røntgendata for nøyaktig atomplassering (figur 13C og figur 13D). Metaller med svake nøytronspredningslengder kan også være utfordrende å modellere i nøytron SLD-kart, som det fremgår av våre LPMO9D-kart. Innsamling av en lav dose (uten strålingsskade) Røntgendatasett på samme krystall er derfor nyttig, siden det tillater metallatomposisjonering ved hjelp av elektrontetthetskart (figur 13E og figur 13F).

Figure 1
Figur 1: Flytskjema over arbeidsflyt for nøytronproteinkrystallografi. Protein produksjon. For å oppnå en nøytronstruktur uttrykkes protein først. Bakteriell uttrykk i H2O- eller D2O-baserte medier brukes vanligvis til å produsere et høyt utbytte av henholdsvis hydrogenert eller perdeutert rekombinant protein. Proteinet renses i H2O-basert buffer og krystalliseres deretter i enten H2O- eller D2O-basert krystalliseringsbuffer for å vokse krystaller til en minimumsstørrelse på 0, 1 mm3. Prøveforberedelse: Før nøytrondiffraksjonsdatasamlingen gjennomgår H2O-dyrkede krystaller H/D-utveksling for å utveksle proteinet titratable H-atomer med D. H/D-utveksling kan gjøres ved direkte bløtlegging av krystallene i deutert krystalliseringsbuffer, likevekt av krystalliseringsfallet med et D2O-basert reservoar, eller ved å montere krystallene i kvarts kapillærer for damputveksling med deuterert krystalliseringsbuffer. Innsamling av nøytrondata: Etter H/D-utveksling screenes potensielle krystaller for å bestemme diffraksjonskvaliteten. Krystaller med en minimumsoppløsning på 2,5 Å anses egnet for et fullstendig datasett som skal samles inn. Krystaller er montert i kvarts kapillærer for datainnsamling ved romtemperatur eller blits frosset i en kryo-sløyfe for datainnsamling ved kryogen temperatur. Et røntgendatasett samles inn på samme (eller en identisk) krystall ved samme temperatur. Modell bygning: Raffinement utføres ved hjelp av fenix.refine mot både nøytron- og røntgendata eller kun mot nøytrondataene. Manuell modellbygging av proteinstrukturen utføres i Coot ved hjelp av nøytron SLD-kartene. Fullstendig struktur: Etter ferdigstillelse av proteinstrukturen valideres koordinatmodellen og deponeres i Protein Data Bank. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Høsting av proteinkrystaller. (A) Krystaller håndteres under et mikroskop. (B) Den forseglede sandwichboksen som inneholder den silikoniserte glassplaten åpnes. Reservoarbufferen pipettes på silikoniserte glasssklier. (C) En krystall høstes med en mikroloop. (D) Krystallen plasseres i en dråpe moderluten for å vaske av rusk som ofte høstes sammen med krystallen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Overføring av krystall til kvarts kapillær. (A) Enden av en kvarts kapillær er fylt med reservoarbuffer. (B) Krystallen overføres til kvartskapillæren og (C) nedsenket i reservoarbufferen. (D) Krystallen føres ned kapillær ved hjelp av reservoarbuffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Tetting av kvartskapillæren. (A) Deuterated buffer legges til på slutten av kapillæren for å danne en "plugg". (B) Voks smeltes med en "tryllestav". (C) Kapillæren plasseres i smeltet voks for å forsegle. (D) Voksplugger dannes i begge ender for å forsegle kapillæren. (E) Krystallen etter montering. (F) Den forseglede kapillæren plasseres i en Petri-tallerken og holdes på plass med kitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Økt signal-til-støy av nøytrondiffraksjonsmønsteret. Etter hvert som datainnsamlingen fortsetter, blir diffracted flekker mer intense. (MERK: live diffraksjonsbildene som presenteres her, er for illustrasjon og ble tatt fra forskjellige krystaller.) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Interaktiv modellbygging ved hjelp av nøytrondata i Coot. (A) En positiv FO-FC nøytron SLD tetthetstopp (grønn) som indikerer at serin må reorienteres ved å redigere chi-vinkler. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (B) Riktig plassert serin. (C) Positive og negative FO-FC nøytron SLD tetthetstopper (henholdsvis grønn og rød) som indikerer at tryptofan må roteres / oversettes for å matche forskjellen tetthet topp. (D) Riktig orientert tryptofan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Tilleggsinformasjon fra nøytron SLD-kart. (A) 2FO-FC elektrontetthetskart (blå) viser posisjonene til de "tyngre" atomene i serin. (B) 2FO-FC nøytron SLD-kart (lilla) viser tydelig posisjonen til det "lettere" D-atomet i serin. (C) 2FO-FC elektrontetthetskart (blå) viser posisjonene til de "tyngre" atomene i tryptofan. (D) 2FO-FC nøytron SLD kart (lilla) viser tydelig posisjonen til det "lettere" D-atomet i tryptofan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Plassering av vannmolekyl. (A) Den sfæriske formen på en 2FO-FC elektrontetthetskart (blå) funksjon for vann. (B) 2FO-FC nøytron SLD-kartet (lilla) gir informasjon om vannorientering og hydrogenbindingsinteraksjon. (C) Kartlegg overlegg av elektron- og nøytron SLD-kart over vann. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Nøytron SLD FO-FComit kart. (A) FO-FC nøytron SLD kart (grønn) gir klar informasjon om H / D orientering av tyrosinrester. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (B) Tyrosinrester med riktig H/D-retning. (C) FO-FC nøytron SLD kart (grønn) gir klar informasjon om H / D orientering av treoninrester. (D) Threonine rester med riktig H / D orientering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Flere protonasjonstilstander som vises med nøytron SLD-kart. (A) 2FO-FC elektrontetthetskart (blå) gir bare posisjonen til N-atomet til lysin ε-ammoniumgruppen. (B-E) FO-FC nøytron SLD utelater kartet (grønt) viser tydelig den positivt ladede -NH3-gruppen. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (F) Overlegg av elektrontetthet og nøytron SLD-kart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Utseende av vannmolekyler i nøytron SLD-kart. (A) Vannmolekyler er plassert i henhold til FO-FC nøytron SLD kart (grønn) og potensielle hydrogenbindinger. 2FO-FC nøytron SLD kartet vises i lilla. (B) Riktig plassert vannmolekyl. (C-E) De ulike formene til nøytron SLD-kart for vannmolekyler avhengig av B-faktorer og hydrogenbindingsinteraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: Informasjon om aminosyreorientering og protonasjon levert av nøytron SLD-kart. (A) Nøytron SLD FO-FC karttoppene (grønn) indikerer feil orientering av en asparaginrester. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (B) 2FO-FC nøytron SLD kart (lilla) av riktig asparagin orientering. (C) Nøytron SLD FO-FC karttoppen (grønn) indikerer enkel protonering av histidinet ved N ε. (D) 2FO-FC nøytron SLD kart (lilla) av histidin N ε -protonasjon. (E) Neutron SLD FO-FC utelater karttopper (grønn) bekrefter den positive ladningen av arginin. (F) 2FO-FC nøytron SLD kart (lilla) av positivt ladet arginin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Diskontinuerlige Nøytron SLD-kart. (A) 2FO-FC nøytron SLD kart (lilla) av en hydrogenert, damp H / D utvekslet protein. Glutaminsyre viser nøytron SLD kart kansellering på grunn av den negative spredningslengden på ikke-utskiftbare H-atomer. (B) Et overlagt 2FO-FC elektrontetthetskart (blå) viser tydelig tettheten til glutaminsyren. (C) Svovelatomet i metionin er dårlig synlig i 2FO-FC nøytron SLD-kart (lilla). (D) Et overlagt elektrontetthetskart viser tydelig tettheten til metionin. (E) Metallatomer, her kobber, er dårlig synlige i nøytron 2FO-FC SLD kart (lilla). (F) Et overlagt 2FO-FC elektrontetthetskart (blått) viser tydelig tettheten til det koordinerte kobberatomet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Isotop Sammenhengende spredningslengde (fm) Usammenhengende spredningslengde (fm)
1T -3.741 25.274
2H 6.671 4.04
12C 6.6511 0
14N 9.37 2
16O 5.803 0
23Na 3.63 3.59
24Mg 5.66 0
31P 5.13 0.2
32S 2.804 0
35Cl 11.65 6.1
39K 3.74 1.4
40Ca 4.8 0
55Mn -3.73 1.79
56Fe 9.94 0
63Cu 6.43 0.22
64Zn 5.22 0

Tabell 1: Nøytronspredningslengder og usammenhengende spredningsverdier. Tilpasset fra Sears, 199216.

Supplerende figur 1: IMAGINE-instrumentet ved isotopreaktoren med høy fluks. (A) IMAGINE-instrumentet i den kalde nøytronføringshallen. (B) Prøve i montert i kvarts kapillær festet med kitt til goniometeret. Prøve- og detektorbordet lukkes for å plassere krystallen og den sylindriske bildeplaten i nøytronstrålen. Modifisert med tillatelse fra International Union of Crystallography53. Bilder levert med tillatelse fra Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 2: MaNDi-instrumentet ved spallasjonsnøytronkilden. (A) MaNDi Anger kameradetektor array. Gjengitt med tillatelse fra International Union of Crystallography11. (B) MaNDi flyttbar prøvetrinn. (C) Prøve montert i kvarts kapillær montert på goniometeret på MaNDi for innsamling av romtemperaturdata. Bilder levert med tillatelse fra Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 3: Strukturen av den lytiske polysakkaridmonoksygenase NcLPMO9D. Det kobberaktive ncLPMO9D-anlegget ligger på en flat polysakkaridbindingsoverflate. Kobberet koordineres av to histidinrester i en klassisk "histidinstøtte" samt en aksial tyrosinrester. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 4: Krystall med tilstrekkelig volum i sittedråpekrystalliseringsbrett. (A) Store krystaller dyrkes i sittende dråper satt opp i 9-brønns silikoniserte glassplater. (B og C) Krystaller måles for å identifisere de med volum > 0,1 mm3. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Tilleggs figur 5: pH-måler satt opp for deutererte bufferavlesninger. pH-elektroden er gjennomvåt i D2O før bruk. NaOD og DCl brukes til å justere pH for deutererte buffere. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 6: Retningslinjer for mandi-prøvemontering. Maksimale dimensjoner på kvarts kapillær og prøveposisjon for innsamling av romtemperaturdata.
Gjengitt fra: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 7: Fjerning av overflødig buffer. (A) Overflødig buffer aspireres fra kvarts kapillæren med mikrokapillære spisser. (B) Den gjenværende bufferen fjernes med en tynn papir veke for å tørke kapillæren helt. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 8: Datainnhentings-GUI. Inngangsvindu for "Experiment Parameters" for datainnsamling. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 9: Optikk-GUI. Valg av kvasi-Laue-serien for datainnsamling og overvåking av nøytrontellingsraten. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 10: Datainnsamling i brukergrensesnittet for datainnsamling. Eksponeringstiden, antall rammer og vinkler for datainnsamling er angitt i kategorien "Samle inn". Datainnsamlingen startes deretter ved hjelp av Start skanning. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 11: Diffracted nøytroner oppdaget og vist. På slutten av eksponeringstiden leses den nøytronfølsomme bildeplatedetektoren ut og diffraksjonsmønsteret vises i datainnhentings-GUI. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 12: Databehandling etter nøytrondiffraksjon. Rammer indekseres, integreres, bølgelengde normaliseres og skaleres ved hjelp av Lauegen, Lscale og Scala for å generere en sammenslått refleksjonsfil etter datainnsamling. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 13: Innsamling av røntgendata. Hjemmekilde røntgengenerator satt opp med kvarts kapillærmontert krystall for innsamling av romtemperaturdata. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 14: Retningslinjer for montering av MaNDi cryo-data. Dimensjoner på CrystalCaps og pin høyde for kryo-datainnsamling på MaNDi.
Gjengitt fra: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 15: Blitsfrysing for innsamling av kryo nøytrondiffraksjonsdata. (A) Oppsett for krystall soaking, høsting med en mikroloop og frysing i flytende nitrogen ved hjelp av en kryo kompatibel beholder som en skum Dewar. Den monterte krystallen overføres direkte til beamline cryo goniometer ved hjelp av forhåndskjølte kryopinnetangen. (B) Vokstetningen smeltes for krystallfjerning. (C) Krystallen skylles til enden av kvartskapillæren for høsting. (D) Krystallen er sekvensielt gjennomvåt i ascorbate sugebuffer og deretter kryopreotektant etterfulgt av blitsfrysing i flytende nitrogen. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 16: Grensesnitt for prøvejustering. Krystalljustering i nøytronstrålen, representert av det blå korset, gjøres ved punkt og klikker på sentrering. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 17: CSS GUI for datainnsamling. Datainnsamlingsstrategien, inkludert eksponeringsdoser og vinkler, lastes opp i CSS GUI. Etter hvert som datainnsamlingen fortsetter, vises de diffracted nøytronene som oppdages på sanntidsdetektoren i det øvre panelet. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 18: Samsvarende R-frie flagg i CCP4. De R-frie flaggene til nøytrondataene samsvarer med de R-frie flaggene til røntgendata samlet inn på samme eller en identisk krystall for felles raffinement. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 19: Strukturforberedelse og raffinement. (A) Phenix ReadySet-verktøyet brukes til å legge til dobbelt H/D-belegg på utskiftbare steder. (B) Både nøytrondataene og røntgendataene brukes til en felles raffinement, mens den første inngangsmodellen ble raffinert mot røntgendatasettet samlet inn på samme krystall eller en identisk krystall. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 20: Konfigurasjon av presiseringsinnstillinger. Raffineringsmodellen samt kjernefysiske avstander er konfigurert for felles røntgen-/nøytrondataforbedring. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 21: Datavalg for Coot modellbygg. Fenix MTZ-filutgangen som inneholder røntgen- og ufylte nøytrondata åpnes i Coot for å generere elektron- og nøytron SLD-kart for interaktiv modellbygging. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 22: Interaktiv modellbygging i Coot under en felles raffinement. (A) En positiv og negativ FO-FC nøytron SLD tetthetstopp (henholdsvis grønn og rød) som indikerer at vannet må reorienteres ved rotasjon/oversettelse. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (B) Riktig plassert vann. (C) En positiv FO-FC nøytron SLD kart topp (grønn) indikerer at threonine må roteres for å matche forskjellen tetthet topp ved å redigere chi vinkler. (D) Korrekt orientert treonin. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 23: Strukturforberedelse for dataraffinering kun for nøytron. Startkoordinatfilen er klargjort for raffinering ved fjerning av vannatomer i PDBTools og ved tilsetning av dobbelt H /D-belegg på utskiftbare steder. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 24: Nøytrondataforbedring. (A) Nøytrondata lastes opp samt den forberedte startmodellen. (B) Innstillingene for nøytrondataforbedring bruker nøytronspredningstabellen.

Supplerende figur 25: Datavalg for Coot modellbygg. De ufylte nøytrondataene åpnes i Coot for interaktiv modellbygging. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 26: Reell romforbedring i Coot for deutererte rester. (A) Positive og negative FO-FC nøytron SLD tetthetstopper (henholdsvis grønn og rød) som indikerer at en argininrester må flyttes for å passe til FO-FC tetthetstoppen. 2FO-FC nøytron SLD-kartet vises i lilla og 2FO-FC elektrontetthetskart vises i blått. (B) Bruk av Real Space Refine resulterer i "eksploderende" D-atomer på grunn av manglende Coot-geometribeherskelsesbiblioteker. (C) D-atomene beveger seg ikke med resten av rester av atomer. (D) D-atomposisjonene kan festes manuelt ved hjelp av en tekstredigerer. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 27: Tilsetning av vannmolekyler. (A) Vannmolekyler kan legges manuelt til de positive FO-FC nøytron SLD-karttetthetstoppene (grønne). De innsatte vannmolekylene vil i utgangspunktet bli representert av et O-atom i Coot. (B) Phenix ReadySet brukes til å tilsette D-atomer til O-atomene for vannmolekyler. (C) Det deutererte vannmolekylet er vellykket tilsatt. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 28: Raffineringsstatistikk. Endelig dataforbedringsstatistikk etter felles røntgen-/nøytronraffinering. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 29: Raffinementstatistikk. Endelig dataforbedringsstatistikk etter nøytrondataforbedring. Klikk her for å laste ned denne figuren.

Discussion

Nøytronproteinkrystallografi er en svært følsom teknikk for å sondere protonasjonstilstander og vannmolekylorientering i proteiner. Denne informasjonen kaster lys over proteinkatalytiske mekanismer siden endringer i protonering og hydrogenbindingsinteraksjoner ofte er sentrale for enzymkjemi10. Nøytronproteinkrystallografi, om enn en informativ teknikk, har en rekke faktorer som bør tas i betraktning før du planlegger å gjennomføre et nøytrondiffraksjonseksperiment, nemlig:

  1. Kravet til store proteinkrystaller for datainnsamling.
  2. Spredningsegenskapene til hydrogen og andre elementer, for eksempel metallioner.
  3. Begrensninger i strukturforbedrings- og modellbyggingsprogramvaren når du arbeider med deutererte prøver.

Nøytronproteinkrystallografi er en fluksbegrenset teknikk. I motsetning til røntgendiffraksjonsdatasett forventes høyere R-faktorer og lavere fullstendighet, redundans- og signal-til-støy-forhold for nøytrondatasett på grunn av teknikkens iboende begrensninger (flux begrenset, kvasi-Laue, lengre bølgelengder). Datainnsamling av en enkelt ramme er vanligvis 12 - 18 timer. Suksessen til et eksperiment er svært avhengig av prøvestørrelse og kvalitet med krystaller på 0,1 mm3 som ofte er minimumskravet3. Nøytrondiffraksjon krever produksjon av store mengder protein for å sette opp krystalliseringsdråper fra 10 til 800 μL. Minimumsvolumet for dyrking av tilstrekkelig store krystaller kan estimeres ved hjelp av en volumkalkulator gitt krystall- og prøveparametrene (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Vekst av store krystaller har mest utbredt blitt oppnådd ved dampdiffusjon3. Hengende dråpekrystallisering tillater vekst av krystaller i store dråper fra 10-25 μL, mens større dråper som spenner opp til ~ 50 μL kan settes opp ved hjelp av kommersielt tilgjengelig sittedråpeutstyr14,54. Silikoniserte nibrønns glassplater kan brukes til å sette opp svært store dråper, med volumer opp til 800 μL. Disse glassplatene er plassert i "sandwichbokser" kommersielt tilgjengelig fra Hampton Research. Ytterligere krystalliseringsteknikker inkluderer batchkrystallisering, der grensen for dråpestørrelsen dikterer av fartøyet. Batch krystallisering eksperiment satt opp kan variere fra mikroliter til milliliter55. Krystallisering kan også utføres ved hjelp av dialyseteknikken der proteinet likevektes med utfellingsmiddelet via en dialysemembran eller ved motspredning langs en utfellende konsentrasjonsgradient eller gjennom en porøs plugg som agarose56,57. Såing tilbyr et annet alternativ for å oppnå krystaller av ønsket volum. Mikro- og makroseeding har blitt brukt for stor krystallvekst, inkludert stor krystall av NcLPMO9D45. Noe kunnskap om proteinfasediagrammet, inkludert påvirkning av temperatur på løselighet, bidrar til stor krystallvekst.

Når du planlegger et nøytrondiffraksjonseksperiment, er optimalisering av proteinpreparatet for å maksimere signal-til-støy-forholdet under diffraksjonsdatainnsamling viktig7. For å omgå tetthetsreduksjon og høy usammenhengende spredning forårsaket av H-atomer, kan nøytron SLD-kart forbedres ved å bytte H-atomer for isotop D, som har en positiv sammenhengende spredningslengde og lav usammenhengende spredningslengde. For å oppnå dette utføres damputveksling av hydrogenert proteinkrystall mot deutert krystalliseringsbuffer. Dette sikrer H/D utveksling av løsningsmiddelmolekyler og det labile, titratable proteinet H atomer23. Damputveksling utføres ved å montere den hydrogenerte krystallen i en kvarts kapillær med D2O-basert, deuterert krystalliseringsbuffer "plugger", og den representerer en effektiv, skånsom teknikk som oftest brukes14,23,35. Utvekslingen kan ta flere uker, og krever helst at den deutererte bufferen endres ofte for å sikre maksimal H/D-utveksling. H/D-utveksling kan også utføres ved å suge krystallen direkte i deutert buffer. For å unngå å plassere krystallen under stress på grunn av D2O-eksponering, bør bløtleggingsprosessen utføres gradvis ved å øke D2O: H2O-forholdet gradvis58. I tillegg til dette kan krystallisering av hydrogenert protein også utføres i deutert buffer for H / D-utveksling på labile H-steder22,59. Det skal imidlertid bemerkes at D2O-basert buffer har en effekt på proteinløselighet som krever ytterligere justering av de kjente H2O-baserte forholdene3,59. D2O-baserte buffere er også observert for å føre til mindre krystaller i noen tilfeller59. Full utveksling av titratable og karbonbundne H-atomer til D kan oppnås ved å uttrykke proteiner i deutererte medier for å generere en perdeutert prøve20. De resulterende nøytron SLD-kartene til den perdeutererte prøven vil bli betydelig forbedret, og viser ikke lenger tetthetsreduksjonen til den hydrogenerte prøvemotparten. Dette er gunstig når du karakteriserer H / D bundet på ikke-utskiftbare steder i et protein eller kofaktor. Uttrykk for perdeutert protein er imidlertid både høyt i pris og lavt utbytte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) tilbyr et deuteringsanlegg for brukere som ønsker å generere en perdeutert prøve (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeutert uttrykk utføres vanligvis i en bioreaktor på 1 L-skalaen som gir ~ 50 mg renset protein61.

Etter innsamling av nøytrondiffraksjonsdata utføres raffinement og interaktiv modellbygging. Raffinement kan kjøres ved hjelp av flere programvarepakker, inkludert phenix.refine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Phenix-pakken er den mest brukte programvaren for raffinering av nøytrondiffraksjonsdata i forbindelse med Coot som brukes til å bygge modellen manuelt fra nøytron SLD-kartene34. Selv om både Phenix og Coot tillater behandling av nøytrondiffraksjonsdata, kan de mangle visse funksjoner som er nødvendige for å behandle idiosynkrasi forbundet med nøytrondata og deuterte prøver. Coot inneholder for eksempel ikke geometrioptimalisering for deutererte rester, noe som kan føre til komplikasjoner under modellbygging siden funksjonen "Real Space Refine" resulterer i "eksploderende" rester (tilleggs figur 26)62. Dette kan løses ved å generere selvbeherskelsesfiler for alle de deutererte rester. Dette er imidlertid en intensiv prosess, og slike biblioteker er for tiden ikke offentlig tilgjengelige. Ved forbedringer i Phenix vil utskiftbare H/D-lokaliteter i utgangspunktet bli satt til 0,50 belegg for H og D. Etter hvert som forbedringer utføres, vil belegget til H og D bli raffinert i henhold til nøytron SLD-kartene. Under interaktiv modellbygging er forskjellstetthet Fo-Fc-kart svært informative når det gjelder å vurdere H / D-belegg. Kart kan brukes til å bestemme hvilke steder som har høyt D-belegg, noe som er spesielt informativt på det aktive stedet der protonasjonstilstander er katalytisk relevante63. Tvetydige situasjoner oppstår imidlertid når H:D belegget er nær 0.70:0.30, noe som resulterer i fullstendig signalavbestilling i nøytron SLD-kart64. Det bør også tas i betraktning at kvasi-Laue nøytrondatasett ofte har fullstendighet rundt 80%, noe som er lavere enn de rutinemessig observerte ≥ 98% for røntgendiffraksjonsdata. Ved raffinering av nøytrondiffraksjonsdata i Phenix beregnes derfor de manglende observerte amplitudene (Fo) fra modellen for å fullføre refleksjonslisten, og introduserer dermed modellbias. For å ta høyde for denne potensielle skjevheten bør "no_fill" kart undersøkes under interaktiv modellbygging i motsetning til "fylte" kart.

Brukere kan velge å utføre en felles røntgen/nøytrondataforedling av strukturen, eller en nøytrondata bare raffinement. Visualisering av nøytron SLD-kart, spesielt ved lavere oppløsning, kan i utgangspunktet være urovekkende, spesielt for et hydrogenert protein der H fortsatt er til stede på ikke-utskiftbare steder til tross for H / D damputveksling. Dette resulterer i kastrontetthet kart kanselleringer, noe som gir inntrykk av diskontinuerlige kart65,66. Innsamling av et tilsvarende røntgendatasett kompletterer med fordel disse kanselleringene i en felles raffinement (figur 13A og figur 13B). En leddraffineringsstrategi innebærer vanligvis å raffinere protein-ryggraden koordinater mot røntgendataene, mens nøytrondiffraksjonsdataene brukes til å avgrense posisjonen og belegget til H / D-atomene på utskiftbare steder28. Siden innføring av felles H/D-belegg på utskiftbare steder øker antall parametere som raffineres, øker en felles forbedring med røntgendata også data-til-parameter-forholdet. En felles raffinement krever at et tilsvarende røntgendatasett samles inn ved samme temperatur på samme krystall eller en krystall som vokser under samme forhold. For nøytrondiffraksjonsdata som samles inn ved romtemperatur (300 K), bør det tilsvarende røntgendatasettet samles inn ved romtemperatur ved hjelp av en datainnsamlingsstrategi med lav dose for å begrense strålingsskade. Perdeutererte prøver gir derimot forbedrede og kontinuerlige nøytron SLD-kart siden de ikke har samme størrelsesorden for H / D-signalreduksjon. Nøytronspredningslengden på visse elementer, inkludert metaller og svovel, gjør dem imidlertid dårlig synlige i nøytron SLD-kart, selv om proteinet har blitt perdeutert (figur 13C-F)18. Hvis et metall må karakteriseres, er det best å bruke røntgendiffraksjon i en felles raffinement eller bruke spektroskopiske teknikker for å utfylle diffraksjonseksperimenter. Nøytronbaserte dataforbedringer utføres ofte når nøytrondatasettet har høy oppløsning eller hvis et perdeutert protein ble brukt. I tillegg er nøytron-bare dataraffinering spesielt nyttig hvis et protein som er svært følsomt for strålingsskader studeres, siden en røntgen avledet struktur kan ha strålingsinduserte gjenstander. Hvis en nøytron-data-bare raffinement skal utføres, må det fastslås om det tilsvarende nøytrondatasettet har tilstrekkelig fullstendighet og oppløsning.

ORNL tilbyr to fasiliteter for innsamling av nøytrondiffraksjonsdata: IMAGINE-strålelinjen ved HFIR samt MaNDi-strålelinjen på SNS36,67. Mens begge instrumentene gir effektive midler for å samle inn et nøytrondiffraksjonsdatasett som bruker lignende prinsipper, har hvert instrument unike spesifikasjoner som bør tas i betraktning når du søker om stråletid. IMAGINE samler inn kvasi-Laue-data og er optimalisert for datainnsamling av romtemperatur på krystaller med enhetsceller opp til ~100 Å. MaNDi kan brukes til innsamling av romtemperatur og kryotemperaturdata ved bruk av TOF-Laue-innsamling på krystaller med enhetsceller opp til ~ 300 Å. Før du samler et komplett datasett, utføres en test på krystallen for å evaluere kvaliteten på det oppnådde diffraksjonsmønsteret der krystallen blir utsatt for nøytronstrålen for en enkelt ramme. Hvis krystallen er av tilstrekkelig kvalitet, vil et fullstendig nøytrondiffraksjonsdatasett bli samlet inn, indeksert, integrert, skalert og fusjonert i en prosess som er analog med røntgendatabehandling. IMAGINE benytter seg av Lauegen og Lscale og MaNDi benytter Mantid-pakken og benytter tredimensjonal profiltilpasning48,50,51,68,69,70. Forskere som blir brukere ved et av disse anleggene vil få et datasett i MTZ- eller HKL-format for videre analyse.

Nøytrondiffraksjon er en ikke-destruktiv, svært følsom teknikk for å undersøke protonasjonstilstanden og hydrogenbindingsinteraksjoner av biologiske makromolekyler. Det er spesielt nyttig for fotofølsomme proteiner og metalloproteiner. Flere hensyn til teknikken samt behandlingen av dataene må tas i betraktning før du utfører et eksperiment, men utfallet gir resultater som kan gi verdifull innsikt i den katalytiske mekanismen til proteinet av interesse. Nøytronproteinkrystallografi utfyller beregningsstudier, strukturelle, biokjemiske og spektroskopiske studier, noe som gjør det til et verdifullt verktøy i biologens verktøykasse av teknikker som brukes til å karakterisere biologiske makromolekyler.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Proteinuttrykk, rensing og krystalliseringseksperimenter ble utført ved Center for Structural Molecular Biology (CSMB), et amerikansk institutt for energibiologisk og miljømessig forskningsbrukeranlegg ved Oak Ridge National Laboratory. Nøytrondiffraksjonsdata ble samlet inn ved BL-11B MaNDi ved Spallation Neutron Source (SNS) ved ORNL som er sponset av Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Forfatterne takker Brendan Sullivan for hjelp med datareduksjon. Røntgendiffraksjonsdata ble samlet inn ved METRIC-anleggene (Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center) ved North Carolina State University, som støttes av delstaten North Carolina. GCS anerkjenner delvis støtte fra National Research Foundation (NRF), Sør-Afrika og Graduate Opportunities (GO!)-programmet ved ORNL. FM erkjenner støtte fra USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length DiaDent/DiaVet 218-292
Capillary wax Hampton HR4-328
CCP4 Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) Corning CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL) Corning CLS430828
Coot Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS Hampton HR4-779
Curved-Tip Forceps Mitegen TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich 543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D Sigma-Aldrich 151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm Mitegen M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit Mettler Toledo 30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml Spearlab M-FD-800
Four Color Mounting Clay Hampton HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), Sigma-Aldrich 54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris XtaLAB Synergy-R Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight Mitegen M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) Eppendorf 930001007
Microtubes volume 1.5 mL Eppendorf Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter Fischerbrand FB0875713
Phenix Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm Mitegen M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL Eppendorf Research Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL Eppendorf Research Z683825
Pipette Volume 10-100 μL Eppendorf Research Z683809
Pipette Volume 20-200 μL Eppendorf Research Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder Sigma-Aldrich P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length Hampton HR6-146 Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System Olympus SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases Mitegen GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length VitroCom CV1012 Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover Hampton HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate Hampton HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) Mitegen XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D Sigma-Aldrich 176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) Hampton HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL VWR 76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL VWR 76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL VWR 76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL VWR 76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL VWR 76322-134
Wax pen Hampton HR4-342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
  2. Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
  3. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  4. Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
  5. Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
  6. Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
  7. Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
  8. Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
  9. Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
  10. Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
  11. Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
  12. Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
  13. Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
  14. Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  15. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  16. Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
  17. Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
  18. Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  19. Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
  20. Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
  21. Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
  22. Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
  23. Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
  24. Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  25. Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802 (2018).
  26. Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
  27. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  28. Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
  29. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
  30. Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
  31. Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
  32. Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
  33. Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  35. Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
  36. Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
  37. Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
  38. Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
  39. Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
  40. Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
  41. Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
  42. Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
  43. Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
  44. Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
  45. O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
  46. O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
  47. Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
  48. Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
  49. Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
  50. Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
  51. Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
  52. Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
  53. Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
  54. Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
  55. Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
  56. Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
  57. Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
  58. Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
  59. Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  60. Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
  61. Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
  62. Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  63. Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
  64. Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
  65. Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
  66. Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
  67. Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  68. Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
  69. Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
  70. Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Tags

Kjemi Utgave 166 Nøytronproteinkrystallografi nøytroner proteiner hydrogenatomer protonering enzymer metalloproteiner strukturbiologi polysakkaridmonoksygenaser reaksjonsmekanisme røntgenkrystallografi
Nøytronkrystallografi Datainnsamling og prosessering for modellering av hydrogenatomer i proteinstrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröder, G. C., Meilleur, F.… More

Schröder, G. C., Meilleur, F. Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures. J. Vis. Exp. (166), e61903, doi:10.3791/61903 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter