Summary
En este estudio, presentamos un método de la proyección de imagen en tiempo real usando microscopia confocal para observar las células que se mueven hacia el tejido dañado por la incubación ex vivo con el epitelio coclear que contiene el órgano de Corti.
Abstract
Para estudiar los efectos de las células madre mesenquimales (MSC) en la regeneración celular y el tratamiento, este método rastrea la migración msc y los cambios morfológicos después de co-cultivo con epitelio coclear. El órgano de Corti fue inmovilizado en una cubierta plástica presionando una porción de la membrana del Reissner generada durante la disección. MsCs confinado por un cilindro de cristal migró hacia el epitelio coclear cuando el cilindro fue quitado. Su localización predominante se observó en el modiolus del órgano de Corti, alineado en una dirección similar a la de las fibras nerviosas. Sin embargo, algunos MSCs fueron localizados en el área del limbus y demostraron una forma horizontalmente alargada. Además, la migración en el área de la célula de pelo fue aumentada, y la morfología del MSCs cambió a las varias formas después del tratamiento del kanamycin. En conclusión, los resultados de este estudio indican que el cocultivo de MSCs con epitelio coclear será útil para el desarrollo de la terapéutica vía el trasplante de la célula y para los estudios de la regeneración de la célula que pueden examinar las varias condiciones y factores.
Introduction
La pérdida de audición puede ocurrir congénitamente o puede ser causada progresivamente por varios factores, incluyendo el envejecimiento, las drogas y el ruido. La pérdida de audición es a menudo difícil de tratar porque es muy difícil restaurar la función deteriorada una vez que las células ciliadas responsables de la audición están dañadas1. Según la Organización Mundial de la Salud, se estima que 461 millones de personas en todo el mundo tienen pérdida auditiva, lo que representa el 6,1% de la población mundial. De las personas con pérdida auditiva, el 93% son adultos y el 7% son niños.
Se han intentado varios enfoques para tratar la pérdida de audición; notablemente, un acercamiento de la regeneración usando MSCs ha emergido como tratamiento prometedor. Cuando el tejido está dañado, los MSCs se liberan naturalmente en el sistema circulatorio y migran al sitio de la lesión donde secretan varias moléculas para formar un microambiente que promueve la regeneración2. Por lo tanto, es importante desarrollar un método para tratar los tejidos dañados a través de la migración de mscs implantados externamente a los órganos diana y su posterior secreción de moléculas que causan una potente regulación inmune, angiogénesis y anti-apoptosis para mejorar la restauración de la función celular dañada3,4,5.
El proceso de búsqueda en el que los MSCs migran a los tejidos dañados puede ser el obstáculo más importante a superar. Las MSCs tienen un mecanismo de localización sistémico con pasos secuenciales de atado/balanceo, activación, detención, transmigración/diapedesis y migración6,7,8. Actualmente, se están realizando esfuerzos para identificar formas de mejorar estas medidas. Se han ensayado diversas estrategias, entre ellas la modificación genética, la ingeniería de la superficie celular, el cebado in vitro y la orientación magnética6,7. Además, varias tentativas se han hecho de promover la protección y la regeneración de células de pelo auditivas homing MSCs al sitio de la cóclea dañada. Sin embargo, el seguimiento de las CSS in vivo requiere mucho tiempo y mano de obra y requiere habilidades altamente especializadas9.
Para resolver este problema, se desarrolló un método para observar el homing de MSCs en la cóclea a través de microscopía confocal time-lapse que fotografía la migración de las células durante varias horas (Figura 1). Fue desarrollado a principios delsiglo 20 y recientemente se ha convertido en una poderosa herramienta para estudiar la migración de células específicas.
Figura 1:Resumen gráfico. (A) Después de que el órgano diseccionado de Corti se adhiere en una cubierta de plástico usando fórceps, la tapa se coloca en un plato microscópico confocal con fondo de vidrio de 35 mm, y(B) se coloca el cilindro de vidrio. (C) Después de llenar el interior del cilindro de vidrio con medio, (D) los MSC etiquetados con GFP con medio se agregan cuidadosamente fuera del cilindro. (E) Después de la incubación durante la noche, (F) se retira el cilindro de vidrio, y las imágenes se toman con un microscopio confocal. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs = células madre mesenquimales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Protocol
Todos los protocolos de investigación que involucran ratones ICR fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Yonsei en wonju Facultad de Medicina. Los experimentos se realizaron de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial. En este protocolo, los ratones embarazadas de ICR fueron mantenidos en un ciclo claro/oscuro de 12/12 h con el acceso libre al alimento y al agua.
1. Disección de cocleas
- Esterilice la campana de cultivo de tejido de flujo laminar encendiendo la luz ultravioleta durante ~ 30 minutos, y rocíe todas las superficies con etanol al 70% antes de su uso. Deje que las superficies se sequen.
- Coloque los instrumentos de disección en etanol al 70% durante 10 min, y seque antes de usarlo.
- Utilice una cuchilla de operación para decapitar ratones postnatales de 3-4 días de edad (Figura 2A).
- Coloque el cráneo debajo de un estereomicroscopio en la campana de flujo laminar y remoje el tejido en etanol al 70%.
- Remoje rápidamente el tejido en la solución de disección de tejido (1x solución de sal balanceada de Hank, 1 mM HEPES) para eliminar el etanol.
- Cortar la línea central del cráneo con una cuchilla quirúrgica(Figura 2B,C).
- Exponer el cráneo tirando hacia abajo de la piel anterior y cortar el canal auditivo externo de la oreja (Figura 2D).
- Corte de la parte anterior a la posterior del cráneo a través de la línea ocular (Figura 2E).
- Abra el cráneo y retire el cerebro anterior, el cerebelo y el tronco encefálico con fórceps contundentes(Figura 2F,G).
- Usando micro fórceps, separe la cóclea del hueso temporal (Figura 2H).
- Transfiera las cocleas a una placa de Petri que contenga una solución de disección de tejidos.
- Diseccione cuidadosamente toda la cápsula ótica coclear, dejando sólo el tejido blando coclear interno(Figura 2I,J).
- Sostenga el modiolo de las cocleas con fórceps y el conducto coclear con otro par de fórceps, y separe lentamente los dos tejidos (Figura 2K).
- Retire las estrías vasculares y la membrana tectorial desprendiéndose suavemente de ellas(Figura 2L,M).
- Coloque una cubierta de plástico esterilizada en una nueva solución de disección de tejido, y luego coloque el órgano de Corti en una cubierta de 9 mm de diámetro, asegurándose de que la membrana basilar mira hacia abajo (Figura 2N-P).
- Inmovilizar el tejido presionando la membrana de Reissner y el tejido modiolus restante sobre la cubierta con fórceps (Figura 2N-P).
- Transfiera el cubrebocas con el tejido incrustado al centro de un plato confocal de 35 mm de diámetro.
- Colocar el cilindro de clonación de vidrio en el plato, con el explant coclear colocado en el centro del plato, y añadir 100 μL de medio de cultivo explant (DMEM/F12, 10% suero fetal bovino (FBS), 1% suplemento de N2, ampicilina (10 μg/mL))10 dentro del cilindro (Figura 2Q).
- Placa 5 × 103 células de proteína fluorescente verde derivada de la médula ósea de ratón (GFP)-etiquetado MSCs en 2 mL de medio de cultivo (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% suplemento de N2, 10 μg/mL de ampicilina) fuera del cilindro de vidrio (Figura 2R).
- Cuando los MSCs son 80-90% confluentes, pasarlos por separarlos con el ácido tetraacético tripsina-etilendiamina.
- Transfiera cuidadosamente el plato confocal a una incubadora humidificada e incube durante la noche a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.
- Aspirar todo el medio dentro y fuera del cilindro, y luego retire el cilindro de vidrio del plato confocal.
- Añadir 2 mL de medio de cultivo fresco al plato confocal, e incubar el plato de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada hasta que esté listo para el análisis.
Figura 2. Disección de una cóclea de ratón y cocultivo del órgano de Corti y MSCs. (A) Decapitación de ratón, (B) y (C) disección sagital de la línea media de la cabeza, (D) y (E) disección coronal del cerebro, (F) y (G) eliminación del cerebro y el hueso temporal, (H) la cóclea, (I) eliminación de la pared coclear ósea, (J) aislamiento de la cóclea, (K) separación del conducto coclear del modiolus, (L) separación de la estría vascular (SV) y ligamento espiral (SL) del órgano de Corti, (M) eliminación de la membrana tectorial, (N-P) fijación de la cóclea en un resbalón de cubierta de plástico, (Q) ubicación de la cubierta y el cilindro de vidrio en el plato confocal, (R) inoculación de MSCs. Barra de escala blanca (A-E) = 1 cm; naranja (F, G, P) y barra de escala amarilla (H,I) = 1 mm; barra de escala verde (J-O) = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Imágenes de lapso de tiempo
- Para los experimentos presentados aquí, utilice un sistema de microscopía confocal con un sistema de incubadora de etapa superior.
- Encienda el microscopio confocal, la luz fluorescente y la computadora.
- Establezca las condiciones de la incubadora de etapa superior colocada en la etapa del microscopio confocal a 37 °C y 5% de CO2 atmósfera.
- Coloque el plato de muestra en el recipiente de fijación del plato, cubra con la tapa de fijación del plato y cierre la cámara con la tapa del calentador superior.
- Ajuste el zoom y el enfoque para localizar el órgano de Corti y MSCs en el campo de visión.
- Abra el software de procesamiento de imágenes. En la opción de localización, seleccione un objetivo Plan-Apochromat de 20x (apertura numérica 0,8) y un área de recorte de 0,5x.
- En Adquisición, haga clic en configuración inteligente y seleccione EGFP.
- Abra la pestaña del canal en Adquisicióny ajuste la potencia del láser a 0,2%, el agujero de alfiler a 44 μm,la ganancia maestra a 750 Vy la ganancia digital a 1,0.
- Haga clic en ESID en configuración de imágenesy establezca la ganancia de ESID en 4 y la ganancia digital en 7.5.
- Haga clic en azulejos y estaca para producir 210 azulejos.
- Abra la estrategia de enfoque y seleccione el modo de enfoque.
- En Serie temporal,establezca la duración en 24 h y el intervalo en 10 min.
- En Adquisición, establezca el tamaño del fotograma en 512 x 512 píxeles, la velocidad de escaneo en 8, la dirección a bidireccional, el promedio a 4xy los bits por píxel a 16.
- Haga clic en iniciar experimento para comenzar el experimento.
3. Modificación del archivo de imagen
- En el procesamiento,haga clic en costurasy establezca la superposición mínima en 5% y el cambio máximo en 10%.
- Haga clic en exportación de película, establecer sin comprimiry establezca la velocidad en 7,5.
4. Inmunosutención
- Aspirar el medio con cuidado y lavar la muestra dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min.
- Fijar la muestra con formol al 4% en PBS durante 15 min, y lavar la muestra 3 veces con PBS durante 5 min.
- Permeabilizar la muestra en Tritón X-100 al 0,1% en PBS durante 10 min, y lavar 3 veces con PBS durante 5 min.
- Añadir 250 μL de reactivo faloidina-iFluor 647 (dilución 1:1000 en PBS), e incubar la muestra durante 1 h a temperatura ambiente en la coctelera.
- Lavar la muestra 3 veces con PBS durante 5 min.
- Transfiera el cubrebocas a la corredera de vidrio y agregue 2 gotas de solución de montaje.
- Coloque suavemente un cubrebocas en la corredera.
- Selle el cubrebocas con esmalte de uñas transparente y guárdelo a 4 °C en la oscuridad hasta que se observen las células.
- Imagen de la diapositiva usando un microscopio confocal con un filtro apropiado en la excitación/emisión (Ex/Em)=650/665 nm para la faloidina y en Ex/Em=488/507 nm para EGFP.
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Representative Results
La migración in vitro de mscs en modo tridimensional ha sido evaluada por un sistema Transwell o por el método tradicional de cicatrización de heridas para observar la migración en modo bidimensional (2D)11. El órgano de Corti es una estructura compleja compuesta por varias células como las células de Boettcher, las células de Claudio, las células de Deiters, las células del pilar, las células de Hensen, las células ciliadas externas, las células ciliadas internas, las fibras nerviosas, la membrana basilar y la lámina reticular12. Cuando los MSCs se trasplantan en el tejido compuesto por tales células complejas, el uso de la tecnología de determinar donde las células se reclutan y se estabilizan es fundamental para entender el mecanismo de la terapia celular y la regeneración usando MSCs. Además, para determinar cómo se localizan los MSCs en presencia o ausencia de daño, un método 2D como un método de cicatrización de heridas es más adecuado que un sistema Transwell en el que las células se mueven aleatoriamente hacia abajo en una dirección.
En este estudio, la trayectoria de dos dimensiones de MSCs fue seguida en un método curativo de la herida simplemente usando un cilindro de cristal como barrera entre el MSCs y el órgano de Corti y quitando el cilindro después de que se unen los MSCs. Cuando se cultivó el órgano de Corti, los fibroblastos crecieron muy rápidamente hacia afuera de las células ciliadas externas presentes en la capa más externa(Figura 3, Video 1). Por lo tanto, la mayoría de los MSC etiquetados con GFP parecían ser expulsados por fibroblastos de rápido crecimiento (Video 1). No obstante, algunos MSCs marcados con GFP penetraron en la capa de fibroblastos y migraron con éxito al órgano de Corti(Figura 3, Video 1).
Figura 3. Imagen confocal del órgano de Corti y mscs GFP-etiquetados. Después del retiro del cilindro de cristal y de 4 h adicionales de la incubación, la fijación y la coloración fueron realizadas. Barra de escala =100 μm. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs: células madre mesenquimales. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Vídeo 1: Microscopía confocal time-lapse del órgano de Corti y mscs GFP-etiquetados. Después del retiro del cilindro de cristal y de 4 h adicionales de la incubación, la fijación y la coloración fueron realizadas. Barra de escala =100 μm. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; MSCs: células madre mesenquimales. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Los resultados a partir de 72 h de incubación mostraron que MSCs migró al órgano de Corti y fueron localizados principalmente en el modiolus y el área donde las fibras de nervio cocleares separadas del modiolus fueron recogidas; la morfología de los MSCs fue alterada a una forma radial similar a la de las fibras nerviosas (Figura 4B). Curiosamente, las células se transformaron en una forma lineal a lo largo de la línea del limbo en lugar del área de las células ciliadas(Figura 4E,ver flecha). Aunque los extremos apical y basal del órgano de Corti se combinaron para evitar que los MSCs se movieran hacia el lado medial de la membrana basilar, los MSCs pudieron migrar y crecer en el área de recolección de fibras nerviosas penetrando en las diversas capas celulares y barreras físicas(Figura 4E). Cuando el daño a las células ciliadas fue inducido por el tratamiento con 1 mM de kanamicina durante 16 h, y las células se cultivaron durante otras 72 h después de la eliminación de la kanamicina, las MSCs se localizaron no solo en el modiolus, sino también en las células ciliadas externas(Figura 4C,D).
Figura 4. Imágenes confocales del órgano de Corti y mscs GFP-etiquetados. (A) Después de la extracción del cilindro de vidrio y 16 h adicionales de incubación, se tomó una imagen después de la fijación y la tinción. Barra de escala = 200 μm. (B) MsCs se distribuyeron predominantemente en el área modiolus, barra de escala = 20 μm. Después del retiro del cilindro de cristal del plato, las células fueron incubadas más a fondo con el kanamycin de 1,0 milímetros para 16 h, cultivadas con el medio kanamycin-libre para 72 h, y después fijadas y manchadas. Imágenes de la(C)región externa de la célula ciliada, barra de escala = 20 μm; (D) región modiolus, barra de escala = 50 μm; y(E) cóclea entera, barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Estos resultados indican que el sistema experimental demostrado en este estudio sería una herramienta de prueba útil para desarrollar estrategias terapéuticas celulares usando MSCs y se puede aplicar específicamente para estudiar la pérdida de oído causada por diversos factores.
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Discussion
El trasplante de MSCs en sitios dañados para promover la regeneración de células dañadas se ha estudiado extensivamente, y el efecto terapéutico es evidente. El trasplante y la diferenciación subsecuente de MSCs se han divulgado para restaurar la audiencia en ratas con la pérdida de oído inducida por el ácido 3-nitropropionic13. Aunque Lee et al. aplicaron mscs a seres humanos transvenosamente, no lograron ninguna mejora significativa en la audición14. Hasta hace poco, se realizaban casi 12 experimentos para restaurar la audición en el modelo de roedores mediante el trasplante msc. Aunque el resultado es algo confuso debido a heterogeneidad, hay una cierta indicación que MSCs puede promover la audiencia.
Diversos factores de crecimiento y quimiocinas relacionadas con la quimioatracción están involucrados en la migración de células madre trasplantadas a áreas dañadas, independientemente de la heterogeneidad u homogeneidad15. Las quimiocinas son reguladores clave de la migración celular para la homeostasis tisular, las respuestas inmunitarias y la cicatrización de heridas. La quimioatracción inducida por quimioquinas in vivo podría no funcionar de la misma manera que lo hace in vitro debido a las diferencias entre las condiciones experimentales in vivo e in vitro. Aunque las condiciones experimentales in vitro tienen sus propias limitaciones, es muy difícil realizar estudios in vivo para promover la migración eficiente, el reclutamiento y la regeneración de las células16.
Aunque el seguimiento de las MSCs trasplantadas para la restauración de la audición es importante en la investigación de la medicina regenerativa, los experimentos in vivo, especialmente los que involucran la audición, son intensivos en mano de obra en la mayoría de los casos y, por lo tanto, son extremadamente difíciles de realizar con grandes tamaños de muestra. Por lo tanto, la homogeneidad de los resultados es baja, y el sesgo es severo. Por lo tanto, sería eficiente estudiar primero tales eventos basados en la migración en condiciones in vitro. La mayoría de los estudios ines vitro sobre la migración celular se han realizado mediante el uso de Transwell o métodos de cicatrización de heridas.
Se estableció un método de coincubación de explantación de cocleas con MSCs para rastrear las células madre migratorias, que reconocen los sitios de lesión y se mueven hacia ellos. La mayoría de los estudios han utilizado un método de fijación de un órgano de Corti en cubiertas de vidrio recubiertas con β-mercaptoetanol después de la explantación. Aunque el mismo método fue utilizado aquí, era difícil examinar los tejidos porque se separaron o enrollaron a menudo para arriba del cubrebocas. Por lo tanto, se realizó un nuevo ensayo para facilitar el monitoreo del tejido. Primero, un órgano de Corti fue colocado en un cubrebocas de plástico, y entonces el tejido fue inmovilizado en el coverslip presionando la porción restante de la membrana del Reissner generada durante la disección usando el fórceps.
Esto permitió la unión estable del órgano de Corti a la cubierta para que una imagen pudiera ser adquirida con éxito por microscopía confocal. Aunque el método de cultivo de tejidos presentado aquí es un ahorro de tiempo y de bajo costo, el desarrollo de la competencia en la disección toma algún tiempo. Los métodos conocidos de cultivo de tejidos incluyen la unión del tejido mediante el recubrimiento de la cubierta con poli-L-ornitina y laminina16; la aplicación de inserciones organotípicas de cultivos celulares que no requieran adhesivos o materiales de recubrimiento17, eliminando así la necesidad de sustancias adhesivas, lo que reduce el daño a los explantes; y utilizando un adhesivo tisular compuesto por proteínas extraídas de mejillones marinos10. Este protocolo no requiere ni materiales de recubrimiento ni membranas organotípicas ni adhesivos tisulares; un cubrebocas de plástico barato es suficiente. Se pueden adquirir mejores imágenes si se considera un área de 8 mm x 8 mm junto con una pila Z del espesor del tejido del órgano de Corti. Teniendo en cuenta la gran cantidad de datos a almacenar y el tiempo adecuado para el lapso de tiempo, se adquirieron imágenes del movimiento de toda la célula, centrándose en los MSCs en lugar del órgano de Corti.
Los resultados mostrados en la Figura 4 parecen sugerir que tanto el órgano de Corti como los MSCs se pueden visualizar como imágenes de vídeo claras cuando las imágenes tomadas tienen 2 mm de largo, y la pila Z se combina con un lapso de tiempo. Aquí, aunque un experimento de la co-cultura fue realizado con MSCs y un explant, este ajuste se podría aplicar a diversos tipos o condiciones de la célula para los estudios futuros. Por ejemplo, ayudará a aplicar este protocolo para examinar los efectos de fármacos o exosomas que protegen el daño de la cóclea. Las células madre embrionarias (CES) o las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden regenerarse funcional y morfológicamente en células similares a células ciliadas mechanosensibles18. Por lo tanto, este protocolo se puede aplicar para estudiar la diferenciación de iPSCs o ESCs en células ciliadas auditivas o células de apoyo. Este método ex vivo puede ayudar en la medicina regenerativa para restaurar la audición.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Corea y el Fondo de Investigación de la Universidad Hallym.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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