Summary
En præcis og reproducerbar metode til in vivo nukleotider/nukleotider kvantificering i planter er beskrevet her. Denne metode anvender en HPLC-MS/MS.
Abstract
Nukleotider/nukleotider er byggesten af nukleinsyrer, dele af cosubstrater og coenzymer, cellesignaleringsmolekyler og energibærere, som er involveret i mange celleaktiviteter. Her beskriver vi en hurtig og pålidelig metode til absolut kvalificering af nukleoside/nukleotidindhold i planter. Kort sagt blev 100 mg homogeniseret plantemateriale udvundet med 1 ml ekstraktionsbuffer (methanol, acetonionstrid og vand i et forhold på 2:2:1). Senere blev prøven koncentreret fem gange i en frysetørrer og derefter injiceret i en HPLC-MS/MS. Nukleotider blev adskilt på en porøs grafitisk kulstof (PGC) kolonne og nukleotider blev adskilt på en C18 kolonne. Masseovergangene for hver nukleoside og nukleotid blev overvåget af massespektrometri. Indholdet af nukleotider og nukleotider blev kvantificeret i forhold til deres eksterne standarder (ESTD'er). Ved hjælp af denne metode kan forskere derfor nemt kvantificere nukleotider / nukleotider i forskellige planter.
Introduction
Nukleotider/nukleotider er centrale metaboliske komponenter i alle levende organismer, som er forløbere for nukleinsyrer og mange coenzymer, såsom nicotinamid-adenin dinukleotid (NAD), og vigtige i syntesen af makromolekyler såsom fosfolipider, glykolipider og polysaccharider. Strukturelt indeholder nukleoside en nukleobase, som kan være en adenin, guanine, uracil, cytosin eller thymine og en sukkergeiety, som kan være en ribose eller en deoxyribose1,2. Nukleotider har op til tre fosfatgrupper, der binder sig til 5-carbon-positionen af nukleososidernes sukkermoiety3. Metabolismen af nukleotider i planter er afgørende for frøspiring og bladvækst4,5,6. For bedre at forstå deres fysiologiske roller i planteudviklingen bør metoderne til absolut kvantificering af forskellige nukleotider/nukleotider in vivo fastlægges.
En af de mest anvendte metoder til måling af nukleotider/nukleotider anvender en højtydende væskekromatografi (HPLC) kombineret med en ultraviolet-synlig (UV-VIS) detektor4,7,8,9,10,11. I 2013 kvantificerede ved hjælp af HPLC, Dahncke og Witte flere typer af nukleosiderne i Arabidopsis thaliana7. De identificerede et forbedret guanosinindhold i en T-DNA-indsættelsesmutant, der var målretning i guanosindeaminasegenet sammenlignet med den vilde type plante. En anden pyrimidinkerne, cytidin, blev også kvantitativt påvist i planter, der anvender denne metode, hvilket resulterede i identifikation af et bona fide cytidin deaminase gen4. Baseret på UV-detektoren kan denne metode imidlertid ikke let skelne mellem de nukleotider, der har lignende spektrum og retentionstider, f.eks. Påvisningsgrænsen for HPLC-metoden er relativt høj, derfor anvendes den ofte til måling af højt indhold af nukleotider in vivo, såsom cytidin, uridin og guanosin.
Desuden kan gaskromatografi kombineret med massespektrometri (GC-MS) også anvendes til nukleosidemåling. Nyder godt af det, Hauck et. al. med succes påvist uridin og urinsyre, som er en downstream metabolit af nukleoside kataboliske vej, i frøene af A. thaliana12. GC bruges dog normalt til at adskille flygtige forbindelser, men ikke egnet til de termiske labile stoffer. Derfor er en flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS/MS) sandsynligvis en mere egnet og nøjagtig analyseteknik til in vivo-identifikation, -adskillelse og -kvantificering af nukleotider/nukleotider13,14. Flere tidligere undersøgelser rapporterede , at der kan anvendes en HILIC-kolonne til nukleotider og nukleotiderseparation15,16 , og at der blev anvendt isotopisk mærkede interne standarder for den sammensatte kvantificering17. Begge komponenter er dog relativt dyre, især de kommercielle isotopmærkede standarder. Her rapporterer vi en økonomisk anvendelig LC-MS/MS-tilgang til nukleotider/nukleotider. Denne metode er allerede med succes blevet anvendt til kvantantitation af forskellige nukleotider / nukleotider, herunder ATP, N6-methyl-AMP, AMP, GMP, uridin, cytidin og pseudouridin1,5,6,18, i planter og Droilasoph. Desuden kan den metode, vi rapporterer her, også anvendes i andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Plantevækst og materialeindsamling
- Sørg for, at Arabidopsis frø steriliseres i 70% ethanol i 10 min og sået på agarpladerne, som blev tilberedt med en halv styrke Murashige og Skoog næringsstoffer.
- Pladerne med Arabidopsisfrø inkuberes under mørke ved 4 °C i 48 timer, og de overføres derefter til et kontrolleret vækstkammer under 16 h lys på 55 μmol m-2 s-1 ved 22 °C og 8 h mørke ved 20 °C.
- Høst 100 mg 2-ugers frøplanter (frisk vægt) og fryse i flydende nitrogen til metabolitter ekstraktion.
ADVARSEL: Forskere bør bære handsker, beskyttelsesbriller og en laboratoriekittel for at undgå kontaminering af menneske-væv under materialesamlingen.
2 Nukleotider/Nukleotider ekstraktion
- Jord 100 mg frosset plantevæv med 7-8 stålperler i en forkold mixermølle i 5 minutter med en frekvens på 60 Hz.
- Ekstraktionsopløsningen, som indeholder methanol, acetonær og vand i et forhold på 2:2:1, forberedes.
- De homogeniserede materialer (herunder de fleste metabolitter, men ikke proteiner) blev genbrugt med 1 ml ekstraktionsopløsning.
- Den resulterende opløsning centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- 0,5 mL af suspensionen overføres til et nyt 1,5 mL rør, og det flydende nitrogen fryses.
- Den frosne prøve inddampes i en frysefarve og opsuspendes i 0,1 ml på 5% acetonomitril og 95% vand.
- Centrifuge den resulterende opløsning (0,1 ml) ved 40.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Lad supernatanten i et hætteglas til LC-MS/MS-måling.
3 LC-MS/MS-måling
- Forbered en 10 mM ammoniumacetatbuffer ved at opløse 1,1 g ammoniumacetat i 2 L dobbelt deioniseret vand (Mobil fase A). PH-filen justeres til 9,5 med 10 % ammonium og acetatsyre.
- Forbered 2 L ultrapure 100% methanol (Mobil fase B1) til nukleosides måling. Forbered også 2 L ultrapure 100% acetonitrile (Mobil fase B2) til nukleotider måling.
- Der injiceres 0,02 mL forbehandlet metabolitterekstraktion af hver prøve fra trin 2.7 i et HPLC-system med binære pumper (LC) kombineret med et tredobbelt firdobbelt massespektrometer (MS).
ADVARSEL: HPLC-systemet anvender en C18-kolonne (50 x 4,6 mm, partikelstørrelse 5 μm; arbejder ved 25 °C) buffering med mobil fase A og B1(figur 1A) for nukleotiderseparation og bruger en porøs grafitisk kulstofkolonne (PGC) (50 x 4,6 mm, partikelstørrelse 5 μm; arbejder ved 25 °C) med mobil fase A og B2 (figur 1B) for kerneadskillelsen. Hver prøve blev injiceret tre gange for den tekniske replikation. - Metoden er programmeret som vist i tabel 1 for kolonnen C18 og metoden som vist i tabel 2 for kolonnen PGC. Indstil en strømningshastighed på 0,65 mL min-1.
BEMÆRK: Masseovergangene (tabel 3) blev overvåget af massespektrometeret. Massespektrumanalysebetingelserne for otte nukleotider og fem nukleotider, der indeholder kanoniske og modificerede, er anført i tabel 3. - Registrer topområderne for hver målforbindelse(figur 1).
4 Generering af standardkalibreringskurverne
- Pulje seks prøveudtrækninger sammen, som blev produceret efter beskrivelsen i afsnit 2, og vortex det. Derefter aliquot det til seks ekstraktioner (samme volumen) igen for at få hver baggrund.
- Der tilsættes seks forskellige koncentrationer af hver standard til disse seks ekstraktioner, og de injiceres en efter et efter trin 3.3.
- Topområderne for hver standard registreres i forskellige koncentrationer via masseovergangene som beskrevet i trin 3.4 og 3.5.
- Udjyr toparealet i forhold til den nominelle koncentration af hver standard for at generere en sekspunktskurve.
BEMÆRK: De topområder af nukleotider/nukleotider, der er registreret i trin 3.5, skal falde inden for intervallet af standardkalibreringskurver. - Beregn ligningen af en lige linje for hver standardforbindelse: Y = aX + b
5 Metabolitternes kvantificering
- Metabolitternes indhold beregnes ved hjælp af det topareal, der er registreret i trin 3.5, og ligningen fra trin 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi identifikation og kvantificeringaf N 1-methyladenosin, en kendt modificeret nukleoside, i 2 uger gamle Arabidopsis vilde type (Col-0) frøplanter som et eksempel. Massespektrometriprofilen angiver, at de produktioner, der genereres fra N 1-methyladenosinstandarden, er 150 m/z og 133 m/z (figur 2A), og at samme profil også observeres i ekstraktion af Kol-0 (figur 2B). På grund af høj forekomst af produktets ion på 150 m/z vælges masseovergangen på 282,1 til 150 (m/z) til N 1-methyladenosinkvantificeringen. Desuden er retentionstiden (RT) for måltoppen (figur 3B) 7,05 min., hvilket er det samme som RT for N 1-methyladenosinstandarden (figur 3A). I betragtning af ovenstående data viser vi, at frøplanteraf vild type indeholder in vivo N 1-methyladenosinpulje.
Der blev tilføjet en koncentrationsserie på N1-methyladenosinstandarder (0, 1, 2,5, 5, 10 og 50 ng / mL) i seks prøveekstraktioner, der blev produceret efter henholdsvis trin 4.1 og 4.2 (Figur 4A). 0,02 mL af hver standardprøver blev sprøjtet ind i LC-MS/MS, og de øgede topområder på N1-methyladenosin blev afbildet i forhold til de nominelle koncentrationer af N 1-methyadenosinstandarder. Ligningen af den lige linje er Y = 0,0004X - 0,163 (Figur 4B).
Tre replikater af Col-0 frøplanter blev udvundet og forbehandlet som beskrevet ovenfor. Det højeste areal på N 1-methyladenosin i disse tre prøver blev registreret som 8.659, 12.147 og 12.711. I betragtning af de fem gange tilsætning under ekstraktionen (se trin 2.5 og 2.6) og ved hjælp af ligningen Y = 0,0004X - 0,163, N1-methyladenosinkoncentrationen blev beregnet i tre vilde typelinjer til henholdsvis 0,66, 0,94 og 0,98 ng / mL. Derfor blev 100 mg af hver frøplanter af vild type anvendt til ekstraktion og genbrugt i 1 mL ekstraktionsbuffer. Derfor blev 8,6 ± 1,7 ng N1-methyladenosin kvantificeret i 1 g af 2 uger gamle Arabidopsis vilde typeplanter.
| Tidspunkt | Strømningshastighed (mL min-1) | Mobil fase A (%) | Mobil fase B (methanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabel 1: Metoden for C18-kolonnen. Skematisk repræsentation af opløsningsmiddelændringer til ekvilibrering af C18-kolonnen. Mobil fase A = 10 mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fase B = 100% methanol.
| Tidspunkt | Strømningshastighed (mL min-1) | Mobil fase A (%) | Mobil fase B (acetonitrile %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabel 2: Metoden for PGC-kolonnen. Skematisk repræsentation af opløsningsmiddelændringer til ekvilibrering af PGC-kolonnen. Mobil fase A = 10mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fase B = 100% acetonitrel.
| Nukleotider/nukleotider | Masseovergang (m/z) | Polaritet | Fragmentor | Kollisionsenergi (eV) | Spænding for celleaccelerator | Retentionstid (min.) | Opbevaringsvindue (min.) | Overvågningstilstand | |
| Prækursorer | Produktion | ||||||||
| adenosin | 268.1 | 136 | Positiv | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-methyladenosin | 282.12 | 150 | Positiv | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| Guanosine | 284.1 | 135 | Positiv | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-methylguanosin | 298.12 | 166 | Positiv | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| inosin | 269.1 | 136.9 | Positiv | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| uridin | 245.21 | 133 | Positiv | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| pseudouridin | 245.21 | 125 | Positiv | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| cytidin | 244.2 | 112 | Positiv | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| Amp | 348.07 | 136 | Positiv | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP | 364.07 | 152 | Positiv | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| Imp | 348.9 | 137 | Positiv | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positiv | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | Positiv | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
Tabel 3: MS-analysebetingelser for nukleotider og nukleotider, der påvises ved massespektrometer. Prækursoren ion og produktion af otte nukleotider og seks nukleotider er opført her og kan overvåges af medlemsstaterne med henblik på identifikation og kvantificering af forbindelser.
Figur 1: Kromatografiske toppe af otte nukleotider og fem nukleotider. Adskillelsesprofilerne for otte nukleotider i C18-kolonnen (A) og fem nukleotider i PGC-kolonnen (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Identifikation af N1-methyladenosin ved masseovergang. MS/MS spektre af prækursor ion m/z 282.1 og produktioner m/z 150 og m/z 133 påvist fra N1-methyladenosinstandard (A) og Col-0 prøver (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Den kromatografiske top af N1-methyladenosin. Masseovergangen på 282,1 til 150 blev overvåget for N 1-methyladenosin kvantificering. Retentionstiderne for N 1-methyladenosintoppe i standard- og prøvemålingen var de samme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Generering af N 1-methyladenosinstandardkurven. (A)Der blev tilsat seks forskellige koncentrationer af N 1-methyladenosin i henholdsvis seks prøveekstraktionsmatrixer. Og den der resulterede stigning peak områder blev registreret. (B) Kalibreringskurven for N1-methyladenosin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organismer indeholder forskellige nukleotider/nukleotider, herunder kanoniske og afvigende organismer. Imidlertid er oprindelsen og metaboliske endepunkter af dem, især modificerede nukleotider, stadig uklare. Desuden er den nuværende forståelse af funktionen og homøostase af nukleotider / nukleotider metabolisme stadig skal udforskes og udvides. For at undersøge dem skal der anvendes en præcis og guldstandardmetode til identifikation og kvantificering af disse metabolitter. Her beskrev vi en protokol ved hjælp af massespektret til nukleotider / nukleotider detektion. Hvis N1-methyladenosin anvendes som eksempel, kan denne metode registrere så lavt som 0,02 ng standard, og kalibreringskurvens nøjagtighed er ret høj (R2 = 0,999; Figur 4B). Sammenlignet med HPLC-metoden giver en MS-baseret protokol meget bedre registreringsgrænse og nøjagtighed. Endnu vigtigere er det, at denne metode let kan udføres af forskere i et biologisk laboratorium, der har en LC-MS/ MS. Desuden kan det også bruges til identifikation af andre strukturer kendte metabolitter i planter.
For at in vivo absolut kvantificering af nukleotider/nukleotider indhold kræves kommercielle standardkemikalier. De frembringer de lige standardkurver, som gør det muligt at beregne målmetabolitterne i prøver gennem spidsområder, der registreres ved massespektrometri. Det er vigtigt, at rækken af topområder i standardkalibreringskurver dækker det højeste område af målmetabolit, der læses i MS. Desuden bør der tilsættes en koncentrationsserie af standarder til prøveekstraktionerne, men ikke opløses i vand til generering af kalibreringskurve. Dette skyldes, at det vil undgå matrixeffekten, som er enormt vigtig for kvantificeringsnøjagtighed.
Den her beskrevne metode giver et effektivt værktøj til nukleotider/nukleotider kvantificering. Dens anvendelse kan udvides til alle planter og endda andre organismer. Hele proceduren for prøvernes forbehandling skal forblive kold og hurtig for at undgå nedbrydning af metabolitter, selv om ekstraktionsbufferen indeholder 80% organiske kemikalier, som kan udfælde de fleste proteiner (enzymer). Denne metode er dog ikke egnet til ukendt målidentifikation. Identifikationen og kvantificeringen af målkemikaliet i denne metode afhænger i høj grad af de kommercielle kemiske standarder. En anden begrænsning af denne metode er, at målingen af nukleotider og nukleotider skal foretages separat ved at anvende henholdsvis en C18-kolonne og en PGC-kolonne. Det skyldes, at C18-kolonnens ydeevne, selv om den er mere stabil og reproducerbar end PGC-kolonnen, især kunne skelne mellem nukleotider meget bedre (figur 1B).
Det kan konkluderes, at den fremlagte metode giver mulighed for in vivo-kvantificering af nukleotider/nukleotider i planter. Fra kimplanter vækst til at opnå de endelige resultater, kan forsøgene være afsluttet inden for 3 uger. Komplette prøver forbehandlinger og LC-MS/MS-analyser tager ca. 2 dage for et sæt på 10 til 20 prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet økonomisk af grundforskningsfondene for de centrale universiteter (KJQN202060), National Natural Science Foundation of China (31900907), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20190528), International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) til M.C., og grundforskningsfondene for de centrale universiteter (LGZD202004) til X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
