Summary
Un método preciso y reproducible para la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas se describe aquí. Este método emplea una HPLC-MS/MS.
Abstract
Los nucleósidos/nucleótidos son bloques de construcción de ácidos nucleicos, partes de cosubstratos y coenzimas, moléculas de señalización celular y portadores de energía, que están involucrados en muchas actividades celulares. Aquí, describimos un método rápido y confiable para la calificación absoluta del contenido de nucleósidos / nucleótidos en plantas. Brevemente, se extrajeron 100 mg de material vegetal homogeneizado con 1 mL de tampón de extracción (metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1). Más tarde, la muestra se concentró cinco veces en un liofilizador y luego se inyectó en una HPLC-MS / MS. Los nucleótidos se separaron en una columna de carbono grafítico poroso (PGC) y los nucleósidos se separaron en una columna C18. Las transiciones de masa de cada nucleósido y nucleótido fueron monitoreadas por espectrometría de masas. El contenido de los nucleósidos y nucleótidos se cuantificó contra sus estándares externos (ESTDs). Usando este método, por lo tanto, los investigadores pueden cuantificar fácilmente nucleósidos/nucleótidos en diferentes plantas.
Introduction
Los nucleósidos/nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos, que son los precursores de los ácidos nucleicos y muchas coenzimas, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), e importantes en la síntesis de macromoléculas como fosfolípidos, glicolípidos y polisacáridos. Estructuralmente, el nucleósido contiene una nucleobase, que puede ser una adenina, guanina, uracilo, citosina o timina, y una mitad de azúcar, que puede ser una ribosa o una desoxirribosa1,2. Los nucleótidos tienen hasta tres grupos fosfato que se une a la posición de 5 carbonos de la mitad azucarada de los nucleósidos3. El metabolismo de los nucleótidos en las plantas es esencial para la germinación de las semillas y el crecimientode las hojas 4,5,6. Para comprender mejor sus funciones fisiológicas en el desarrollo de las plantas, deben establecerse los métodos para la cuantificación absoluta de diferentes nucleósidos/nucleótidos in vivo.
Uno de los enfoques más comúnmente utilizados para medir nucleósidos /nucleótidos emplea una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) junto con un detector ultravioleta-visible (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. En 2013, utilizando HPLC, Dahncke y Witte cuantificaron varios tipos de nucleósidos en Arabidopsis thaliana7. Identificaron un contenido mejorado de guanosina en un mutante de inserción de ADN T dirigido en el gen de la guanosina desaminasa en comparación con la planta de tipo salvaje. Otro nucleósido de pirimidina, la citidina, también se detectó cuantitativamente en plantas que empleaban este método, lo que resultó en la identificación de un gen de buena fe de la citidina desaminasa4. Basado en el detector UV, este método, sin embargo, no puede distinguir fácilmente los nucleósidos que tienen espectros y tiempos de retención similares, por ejemplo, guanosina o xantosina. El límite de detección del método de HPLC es relativamente alto, por lo tanto, se utiliza con frecuencia para la medición del alto contenido de nucleósidos in vivo, como citidina, uridina y guanosina.
Además, la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS) también se puede utilizar en la medición de nucleósidos. Beneficiándose de ella, Hauck et al. al. detectaron con éxito uridina y ácido úrico, que es un metabolito aguas abajo de la vía catabólica de nucleósidos, en las semillas de A. thaliana12. Sin embargo, gc se utiliza normalmente para separar compuestos volátiles, pero no es adecuado para las sustancias térmicamente lábiles. Por lo tanto, una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) es probablemente una técnica analítica más adecuada y precisa para la identificación in vivo, separación y cuantificación de los nucleósidos/nucleótidos13,14. Varios estudios previos informaron que una columna HILIC puede ser utilizada para la separación de nucleósidos y nucleótidos15,16 y se emplearon estándares internos marcados isotópicamente para la cuantificación de compuestos17. Sin embargo, ambos componentes son relativamente caros, especialmente los estándares comerciales etiquetados con isótopos. Aquí, se presenta un enfoque de LC-MS / MS económicamente aplicable para la medición de nucleósidos / nucleótidos. Este método ya se ha utilizado con éxito para la cuantificación de diversos nucleósidos / nucleótidos, incluyendo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina y pseudouridina1,5,6,18,en plantas y Drosophila. Por otra parte, el método que divulgamos aquí se puede utilizar en otros organismos también.
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Protocol
1 Crecimiento de planta y colección de materiales
- Asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilizan en etanol al 70% durante 10 min y se siembran en las placas de agar, que se prepararon con nutrientes Murashige y Skoog de media fuerza.
- Incubar las placas que contienen semillas de Arabidopsis bajo la oscuridad a 4 °C durante 48 h, y luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 h de luz de 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C y 8 h de oscuridad a 20 °C.
- Cosechar 100 mg de plántulas de 2 semanas (peso fresco) y congelar nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos.
PRECAUCIÓN: Los investigadores deben usar apropiadamente guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio para evitar la contaminación de tejido humano durante la recolección de materiales.
2 Extracción de nucleósidos/nucleótidos
- Molido 100 mg de tejidos vegetales congelados con 7-8 perlas de acero en un molino mezclador pre-frío durante 5 min a una frecuencia de 60 Hz.
- Prepare la solución de extracción, que contiene metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1.
- Resuspend los materiales homogeneizados (incluyendo la mayoría de los metabolitos pero no las proteínas) con 1 mL de solución de extracción.
- Centrifugar la solución resultante a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Transferir 0,5 mL de la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 mL y congelar el nitrógeno líquido.
- Evaporar la muestra congelada en un congelador y resuspend en 0,1 mL de acetonitrilo al 5% y 95% de agua.
- Centrifugar la solución resultante (0,1 mL) a 40.000 x g durante 10 min a 4 °C. Cargue el sobrenadante en un vial para la medición de LC-MS/MS.
3 Medición LC-MS/MS
- Preparar un tampón de acetato de amonio de 10 mM disolviendo 1,1 g de acetato de amonio en 2 L de agua doblemente desionizada (fase móvil A). Ajuste el pH a 9.5 por 10% de ácido de amonio y acetato.
- Preparar 2 L de ultrapuro 100% metanol (Fase móvil B1) para la medición de nucleósidos. Además, prepare 2 L de ultrapuro 100% acetonitrilo (fase móvil B2) para la medición de nucleótidos.
- Inyecte 0,02 mL de extracción de metabolitos pre-tratados de cada muestra del paso 2,7 en un sistema de HPLC con bombas binarias (LC) junto con un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (MS).
PRECAUCIÓN: El sistema hplc emplea una columna C18 (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) buffering con fase móvil A y B1 (Figura 1A) para la separación de nucleósidos y utilizar una columna de carbono grafítico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) con fase móvil A y B2 (Figura 1B) para la separación de nucleótidos. Cada muestra fue inyectada tres veces para la replicación técnica. - Programe el método como se muestra en la tabla 1 para la columna C18, y el método como se muestra en la tabla 2 para la columna PGC. Establecer un caudal de 0,65 mL min-1.
NOTA: Las transiciones de masa (Tabla 3) fueron monitoreadas por espectrómetro de masas. Las condiciones de análisis del espectro de masas de ocho nucleósidos y cinco nucleótidos que contienen canónicos y modificados se enumeran en la Tabla 3. - Registrar las áreas máximas de cada compuesto objetivo (Figura 1).
4 Generación de las curvas estándar de la calibración
- Agrupar seis extracciones de muestras juntas, que se produjeron siguiendo la descripción en la sección 2, y vórtice. Luego, alícuota a seis extracciones (mismo volumen) de nuevo para obtener cada fondo.
- Añadir seis concentraciones diferentes de cada estándar a estas seis extracciones, respectivamente, e inyectarlas una por una siguiendo el paso 3.3.
- Registre las áreas de pico de cada estándar en diferentes concentraciones a través de las transiciones de masa como se describe en los pasos 3.4 y 3.5.
- Trace el área de pico contra la concentración nominal de cada estándar para generar una curva de seis puntos.
NOTA: Las áreas de pico de nucleósidos/nucleótidos registrados en el paso 3.5 deben estar dentro del rango de curvas de calibración estándar. - Calcular la ecuación de una línea recta para cada compuesto estándar: Y = aX + b
5 Cuantificación de metabolitos
- Calcular el contenido de metabolitos utilizando la zona de cresta registrada en el paso 3.5 y la ecuación del paso 4.5.
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Representative Results
Aquí, mostramos la identificación y cuantificación de N1-metiladenosina, un nucleósido modificado conocido, en 2 semanas de edad Arabidopsis tipo salvaje (Col-0) plántulas como un ejemplo. El perfil de espectrometría de masas indicaque los iones producto generados a partir del estándar N 1-metiladenosina son 150 m/z y 133 m/z(Figura 2A),y el mismo perfil también se observa en la extracción de Col-0(Figura 2B). Debido a la alta abundancia del ion producto de 150 m/z, la transición de masa de 282,1 a 150 (m/z) se selecciona para la cuantificación de N1-metiladenosina. Además, el tiempo de retención (RT) del pico objetivo(Figura 3B)es de 7,05 min, que es el mismo que el RT de N 1-metiladenosina estándar(Figura 3A). Teniendo en cuenta los datos mencionados anteriormente, se demuestra que las plántulas de tipo salvaje contienen in vivo N1-metiladenosina piscina.
Se añadióuna serie de concentración de N 1-metiladenosina estándar (0, 1, 2,5, 5, 10, y 50 ng/mL) en seis extracciones de muestras producidas siguiendo los pasos 4.1 y 4.2, respectivamente (Figura 4A). 0,02 mL de cada muestra estándar fueron inyectados en el LC-MS/MS, y las áreas máximas crecientes deN1- methyladenosine fueron trazadas contra las concentraciones nominales deN1- estándares del methyadenosine. La ecuación de la línea recta es Y = 0.0004X - 0.163 (Figura 4B).
Tres réplicas de plántulas de Col-0 fueron extraídas y pre-tratadas como se describió anteriormente. El área máxima de N1- methyladenosine en estas tres muestras fue registrada como 8.659, 12.147, y 12.711. Teniendo en cuenta las cinco veces el enriquecimiento durante la extracción (ver pasos 2.5 y 2.6) y utilizando la ecuación Y = 0.0004X - 0.163, la concentración deN1-metiladenosina se calculó en tres líneas de tipo salvaje para ser 0.66, 0.94 y 0.98 ng / mL, respectivamente. Por lo tanto, 100 mg de cada plántulas de tipo salvaje se utilizaron para la extracción y resuspended en 1 mL de tampón de extracción. Por lo tanto, 8,6 ± 1,7 ng de N1- methyladenosine fue cuantificado en 1 g de 2 semanas de edad Arabidopsis tipo salvaje plántulas.
| Hora | Caudal (mL min-1) | Fase móvil A (%) | Fase móvil B (metanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabla 1: El método para la columna C18. Representación esquemática de los cambios de disolvente para el equilibrio de la columna C18. Fase móvil A = acetato de amonio de 10 mM, pH 9,5. Fase móvil B = 100% metanol.
| Hora | Caudal (mL min-1) | Fase móvil A (%) | Fase móvil B (acetonitrilo %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabla 2: El método para la columna PGC. Representación esquemática de los cambios de disolvente para el equilibrio de la columna PGC. Fase móvil A = acetato de amonio de 10mM, pH 9,5. Fase móvil B = 100% acetonitrilo.
| Nucleósidos/nucleótidos | Transición de masa (m/z) | polaridad | Fragmentor | Energía de colisión (eV) | Voltaje del acelerador de celdas | Tiempo de retención (mín.) | Ventana de retención (min)Retention Window (min) | Modo de supervisión | |
| Ion precursor | Ion del producto | ||||||||
| adenosina | 268.1 | 136 | Positivo | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-metiladenosina | 282.12 | 150 | Positivo | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| guanosina | 284.1 | 135 | Positivo | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-metilguanosina | 298.12 | 166 | Positivo | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| Inosina | 269.1 | 136.9 | Positivo | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| uridina | 245.21 | 133 | Positivo | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| pseudouridina | 245.21 | 125 | Positivo | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| citidina | 244.2 | 112 | Positivo | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| amperio | 348.07 | 136 | Positivo | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| BPF | 364.07 | 152 | Positivo | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| duende | 348.9 | 137 | Positivo | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positivo | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | Positivo | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
Tabla 3: Condiciones de análisis de MS de nucleósidos y nucleótidos detectados por espectrómetro de masas. El ion precursor y el ion producto de ocho nucleósidos y seis nucleótidos se enumeran aquí y pueden ser monitoreados por ms para la identificación y cuantificación de compuestos.
Figura 1: Los picos cromatográficos de ocho nucleósidos y cinco nucleótidos. Los perfiles de separación de ocho nucleósidos por la columna C18(A),y cinco nucleótidos por la columna PGC(B). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Identificación de N1-metiladenosina por transición de masa. Espectros MS/MS de iones precursores m/z 282.1 e iones producto m/z 150 y m/z 133 detectados a partir de N 1-metiladenosina estándar(A)y col-0 muestras(B). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: El pico cromatográfico de N 1-metiladenosina. La transición total de 282,1 a 150 fue supervisada para la cuantificación del methyladenosine deN1. Los tiempos de retención de N1- picos de metiladenosina en la medición estándar y de la muestra fueron similares. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4: Generación de la curva estándar N-metiladenosina. (A)Se añadieron seis concentraciones diferentes de N 1-metiladenosina en seis matrices de extracción de muestras, respectivamente. Y se registraron las áreas pico de aumento resultante. (B) La curva de calibración de N1-metiladenosina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Los organismos contienen varios nucleósidos/nucleótidos, incluyendo los canónicos y aberrantes. Sin embargo, el origen y los puntos finales metabólicos de ellos, especialmente nucleósidos modificados, son todavía obscuros. Además, la comprensión actual de la función y la homeostasis del metabolismo de nucleósidos/nucleótidos sigue siendo explorada y ampliada. Para investigarlos, es necesario emplear un método preciso y de referencia para la identificación y cuantificación de estos metabolitos. Aquí, se describió un protocolo utilizando el espectro de masa para la detección de nucleósidos / nucleótidos. Tomando N1-metiladenosina como ejemplo, este método podría detectar tan bajo como 0,02 ng estándar, y la precisión de la curva de calibración es bastante alta (R2 = 0,999; Figura 4B). En comparación con el método hplc, un protocolo basado en MS proporciona mucho mejor límite de detección y precisión. Más importante aún, este método puede ser fácilmente realizado por investigadores en un laboratorio biológico que tiene un LC-MS / MS. Por otra parte, también se puede utilizar para la identificación de otras estructuras metabolitos conocidos en las plantas.
Para la cuantificación absoluta in vivo del contenido de nucleósidos/nucleótidos, se requieren productos químicos estándar comerciales. Producen las curvas estándar rectas, que permiten calcular los metabolitos objetivo en muestras a través de áreas pico registradas por espectrometría de masas. Es importante que la gama de zonas de cresta en las curvas de calibración estándar cubra la zona de cresta del metabolito objetivo leído en la EM. Además, se debe añadir una serie de normas de concentración en las extracciones de muestras, pero no disolverse en agua para la generación de curvas de calibración. Esto se debe a que evitará el efecto de matriz, que es tremendamente significativo para la precisión de la cuantificación.
El método descrito aquí proporciona una herramienta poderosa para la cuantificación de nucleósidos/nucleótidos. Su aplicación puede extenderse a todas las plantas e incluso a otros organismos. Todo el procedimiento de pretratamiento de las muestras debe mantenerse frío y rápido para evitar la degradación de los metabolitos, aunque el tampón de extracción contiene un 80% de productos químicos orgánicos, que podrían precipitar la mayoría de las proteínas (enzimas). Sin embargo, este método no es adecuado para la identificación de objetivos desconocidos. La identificación y cuantificación de la sustancia química objetivo en este método depende en gran medida de las normas químicas comerciales. Otra limitación de este método es que la medición de nucleósidos y nucleótidos tiene que hacerse por separado mediante el empleo de una columna C18 y una columna PGC, respectivamente. Es porque el rendimiento de la columna C18, si bien, es más estable y reproducible que la columna PGC, esta última podría distinguir especialmente los nucleótidos mucho mejor (Figura 1B).
En conclusión, el método presentado permite la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas. Desde el crecimiento de las plántulas hasta la obtención de los resultados finales, los experimentos se pueden completar dentro de las 3 semanas. Los pre-tratamientos completos de las muestras y los análisis lc-ms/ms toman cerca de 2 días para un sistema de 10 a 20 muestras.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado financieramente por los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (KJQN202060), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900907), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20190528), el Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (CRP/CHN20-04_EC) a M.C., y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (LGZD202004) a X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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