Summary
В настоящем исследовании экспрессия сбивается двумя нисходящими сигнальными компонентами пути PERK, цитопротекторным кальциневрином и проапоптотическим CHOP, с использованием специфических шРНК. Противоположным образом, они модулируют восприимчивость первичных корковых нейронов к атрофии нейритов после индукции стресса эндоплазматического ретикулума.
Abstract
Накопление развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER), вызванное любым стрессовым состоянием, вызывает реакцию развернутого белка (UPR) посредством активации специализированных датчиков. УПО пытается сначала восстановить гомеостаз; Но если повреждение сохраняется, передача сигналов вызывает апоптоз.
Появляется все больше доказательств того, что устойчивый и неразрешенный стресс ER способствует развитию многих патологических состояний, включая нейродегенеративные заболевания. Поскольку UPR контролирует судьбу клеток, переключаясь между цитопротекторными и апоптотическими процессами, важно понимать события, определяющие этот переход, а также элементы, участвующие в его модуляции.
Недавно мы продемонстрировали, что аномальное накопление ганглиозидов GM2 вызывает истощение содержания ERCa 2+ , что, в свою очередь, активирует PERK (PKR-подобную киназу ER), один из датчиков UPR. Кроме того, передача сигналов PERK участвует в атрофии нейритов и апоптозе, вызванных накоплением GM2. В связи с этим мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам молекулярно модулировать экспрессию нижестоящих компонентов PERK и, таким образом, изменять уязвимость нейронов к нейритной атрофии.
Мы выполнили нокдаун экспрессии кальциневрина (цитопротекторного) и CHOP (проапоптотического) в культурах нейронов коры крыс. Клетки инфицировали доставляемой лентивирусом специфической шРНК, а затем обрабатывали GM2 в разное время, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против MAP2 (микротрубка-ассоциированный белок 2). Позже изображения клеток были записаны с помощью флуоресцентного микроскопа, а общий рост нейрита был оценен с помощью общедоступного программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Ингибирование экспрессии этих сигнальных компонентов PERK явно позволяло либо ускорить, либо отсрочить нейритную атрофию, вызванную стрессом ER.
Этот подход может быть использован в моделях клеточной системы стресса ER для оценки уязвимости нейронов к атрофии нейритов.
Introduction
Стресс эндоплазматического ретикулума (ER) определяется как любое возмущение, которое ставит под угрозу способность сворачивать белок в органелле. Накопление развернутых белков в просвете ER активирует сигнал каскада трансдукции, называемый развернутым белковым ответом (UPR). Этот сложный сигнальный путь управляется тремя датчиками стресса: PERK (протеинкиназная РНК [PKR]-подобная ER-киназа), IRE1 (инозитол-требующий фермент 1) и ATF6 (активированный транскрипционный фактор 6). Все вместе пытаются восстановить гомеостаз. Но если стресс сохраняется, UPR в конечном итоге вызывает гибель клеток путем апоптоза1.
PERK, трансмембранный белок ER, при стрессе ER приводит к фосфорилированию эукариотического фактора инициации-2 альфа (eIF2α), снижая глобальный синтез белка и, следовательно, белковую нагрузку в ER2. Показано, что кальциневрин A/B (CNA/B), гетеродимерная фосфатазаCa2+, непосредственно связывает цитозольный домен PERK, увеличивая его аутофосфорилирование и значительно усиливая ингибирование трансляции белка и жизнеспособность клеток 3,4. Интересно, что CNA/B в изобилии встречается в мозге млекопитающих, различая две изоформы субъединицы A CN: α и β.
При длительном стрессе ER сигнальный путь PERK является единственной ветвью UPR, которая остается активированной, тем самым опосредуя как выживаемость, так и апоптотическую реакцию. В хронической фазе одним из основных последующих событий является индукция фактора транскрипции, CHOP (гомологичный белок, связывающий CCAAT/энхансер)5. Хронический стресс ER также все чаще признается в качестве общего фактора, способствующего широкому спектру патологических расстройств, включая нейродегенеративные заболевания6. Важно понять, как УПО может способствовать цитопротекторной передаче сигналов вместо гибели клеток 7. Однако в настоящее время мало что известно о точном механизме, контролирующем переход между этими двумя фазами УПО.
Недавно мы обнаружили, что в культивируемых нейронах ганглиозид GM2 накапливается в мембранах ER и индуцирует истощение кальция в просвете. Это, в свою очередь, активирует передачу сигналов PRK, которая опосредует атрофию нейритов и апоптоз 8. В этом исследовании накопление GM2 в культивируемых нейронах используется в качестве модели клеточной системы атрофии нейритов, вызванной стрессом ER. В частности, манипулируются двумя экспрессиями фактора PERK, CN-Aα и CHOP, которые переключают переход между ранними/защитными событиями и хронической/апоптотической фазой. Для этого соответствующие гены заглушаются; таким образом, первичные культуры корковых нейронов инфицируются доставляемой лентивирусом специфической шРНК. Вестерн-блоттинг выявляет значительное снижение уровней экспрессии CN-Aα и CHOP по сравнению с контрольными клетками, инфицированными лентивирусом, несущим скремблированную шРНК. После этого лечения нейроны подвергаются различным инкубационным периодам экзогенного GM2, фиксированного и иммуноокрашенного антителом 9 к ассоциированному белку 2 (MAP2)против микротрубочек. Изображения получаются с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Общий рост нейрита оценивается по отношению к общему количеству клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры на животных выполняются в соответствии с утвержденными протоколами Руководства Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Разрешение на проведение исследования выдается Комитетом по уходу за животными и этике (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (резолюции No 014/2017 B и 006/2017 A).
1. Первичные культуры нейронов коры крысы
- Анестезируйте беременных крыс E18 Wistar в камере CO 2 смесью 80% CO 2/20% O 2 в течение 60 с воздействия, а затем жертвуйте, затем вывихивая шейные позвонки.
- Выполните следующие действия в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Извлеките головной мозг из эмбрионов с помощью щипцов #3 и прямых острых маленьких пружинных ножниц (Таблица материалов) для раствора Хэнкса в чашках для клеточных культур.
- Рассеките ткань под 20-кратным увеличительным стеклом, используя два щипца с тонким наконечником в стиле #5, отделяющих лобную кору от мозговых оболочек. Перенесите лобную кору в коническую трубку объемом 15 мл и инкубируйте ткань с 3-4 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в течение 15 минут при 37 ° C для химического разложения.
- После пищеварения разбавьте его 3-4 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Затем промойте его 3 раза раствором сбалансированной соли Хэнкса без Ca 2+/Mg2+ и 0,1% глюкозы центрифугированием (3000 г в течение 5 мин).
- Механически диссоциируйте ткань 10 раз, пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника 1000 мкл в DMEM плюс 10% FCS (таблица материалов). Затем центрифугируют гомогенат при 100 х г в течение 1 мин, собирают надосадочную жидкость и заполняют оставшийся объем до 1000 мкл.
- Планшет клеточной суспензии на чашках для клеточных культур плотностью 520 клеток/мм 2 с2 мл DMEM, содержащего 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% незаменимой аминокислотной добавки (см. Таблицу материалов). Затем инкубировать при 37 °C в увлажненной среде с 5%CO2 в течение 2 ч.
- Удаление органических веществ и поли-L-лизиновое покрытие чашек для культивирования клеток
- Удалите органическое вещество, поместив стеклянный материал в реакционную камеру и добавив 96% этилового спирта, чтобы покрыть материал. Затем добавляйте 68% (мас./об.) азотной кислоты по каплям, пока не начнут появляться коричневато-зеленоватые пузырьки. Как только это произойдет, частично накройте контейнер и дайте реакции продолжаться до тех пор, пока взрыв не прекратится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите органические вещества под кабиной для вытяжки газа, чтобы избежать воздействия вредных газов. - Перед нанесением поли-L-лизинового покрытия промойте стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз. Затем инкубируют культуральные стаканы и чашки с 0,1 мкг/мкл поли-L-лизина в течение 4 ч перед использованием. После инкубации ополосните стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз.
- Удалите органическое вещество, поместив стеклянный материал в реакционную камеру и добавив 96% этилового спирта, чтобы покрыть материал. Затем добавляйте 68% (мас./об.) азотной кислоты по каплям, пока не начнут появляться коричневато-зеленоватые пузырьки. Как только это произойдет, частично накройте контейнер и дайте реакции продолжаться до тех пор, пока взрыв не прекратится.
- Удаление органических веществ и поли-L-лизиновое покрытие чашек для культивирования клеток
- Чтобы обеспечить дифференцировку нервных клеток, замените среду на нейробазальную среду без сыворотки с добавкой без сыворотки (таблица материалов). Хранить культуры при температуре 37 °C с содержаниемСО2 5% до обработки.
2. Производство лентивирусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды, содержащие последовательности, нацеленные на 3'UTRs изоформы CN-Aα или CHOP, и с нецелевыми последовательностями (скремблами), перечислены в таблице 1.
- Для отжига смешайте два одноцепочечных олигонуклеотида с комплементарными последовательностями в равных молярных количествах, используя буфер для отжига (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
- Нагрейте при 95 °C в течение 2 минут, а затем медленно охладите, перенеся образцы из нагревательного блока или водяной бани на столешницу при комнатной температуре. Разбавьте полученный продукт [короткую шпилечную РНК (шРНК) с когезионными концами] до конечной концентрации 0,5 мкМ, аликвотируйте их и храните при -20 °C.
- Клонируйте вставку шРНК в лентивирусный вектор pLKO.3G с GFP в качестве зеленого флуоресцентного маркера. Для этого переваривают 1 мкг вектора с ферментами рестрикции EcoRI и PacI, смешивая в стерильной пробирке следующее: 2 мкл 10-кратного буфера рестрикционного фермента (100 мМ бис-трис пропана-HCl, рН 6,5, 100 мМ MgCl2, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина), 1 мкл 1 мкг/мкл pLKO.3G, 0,5 мкл 10 ЕД/мкл ECoRI, 0,5 мкл PacI (10 ЕД/мкл) и 16 мкл стерильной ионизированной воды.
- Аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать реакцию в течение 3-4 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ночные пищеварения, как правило, не нужны и могут привести к деградации ДНК.
- Аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать реакцию в течение 3-4 ч при 37 °C.
- Для лигирования смешайте переваренный вектор и вставьте в молярном соотношении 3:1 и инкубируйте его с лигазой Т4 и буфером лигазы (предоставленными производителем) в течение ночи при 16 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе реакцию лигирования можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования. - Трансформируют DH5α компетентные клетки (таблица материалов) или другой подходящий штамм E. coli с реакцией лигирования следующим образом.
- Смешайте компетентную кишечную палочку с общим объемом реакции лигирования и охладите ее на льду в течение 15 минут, поместите в ванну с температурой 42 ° C на 2 минуты, а затем снова охладите ее на льду в течение 15 минут.
- Перенесите весь объем, подвергшийся тепловому удару, в пробирку объемом 15 мл и дополните объем до 1000 мкл жидкой средой Лурия-Бертани (LB), которая ранее поддерживалась при температуре 37 °C. Встряхните бактерии в течение 90 мин при 37 ° C в орбитальном шейкере примерно при 330 об/мин.
- Центрифугируйте их при 5000 x g в течение 5 мин при 4 ° C и выбросьте 900 мкл надосадочной жидкости. Используйте оставшуюся надосадочную жидкость для ресуспендирования гранулы. Равномерно распределите суспензию бактерий по твердой пластине ампициллина (100 мкг / мл) LB.
- Инкубировать при 37 °C в течение ночи, затем проверить рост бактерий. На этом этапе бактерии могут храниться при температуре 4 ° C в течение 4-5 дней.
- Выберите одну колонию для переноса в пробирку объемом 50 мл с 10 мл жидкой среды LB и ампициллином (100 мкг / мл). Встряхните бактерии при 37 °C при примерно 330 об/мин.
- Центрифугируйте культуру, чтобы гранулировать бактерии в 5,000 x g в течение 5 мин при 4 ° C, выбросьте надосадочную жидкость и сохраните бактериальную гранулу. Его можно хранить при температуре -20 °C.
- Очистите плазмиду с помощью набора для очистки ДНК от гранул бактерий, следуя инструкциям производителя (таблица материалов). Рассчитайте концентрацию ДНК, измерив поглощение при 260 нм и умножив на коэффициент разбавления, используя следующее соотношение: A260 1,0 = 50 мкг/мл чистой двухцепочечной (ds) ДНК.
3. Лентивирусная инфекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру генерации лентивируса в капюшоне с ламинарным потоком класса II.
- За 24 ч до трансфекции высевают семена 1-5 × 106 HEK 293 клетки в культуральные чашки диаметром 100 мм в 8 мл питательной среды и инкубируют их при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
- Смешайте 14 мкг вектора pKLO.3G со специфической вставкой, 10,5 мкг упаковочной плазмиды psPAX и 3,5 мкг плазмиды оболочки pMD2.G (Таблица материалов). Разведите 45 мкл реагента для трансфекции плазмиды (Таблица материалов) в 700 мкл восстановленной сывороточной среды (Таблица материалов) и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем смешайте смесь ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции плазмиды, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Между тем, замените на свежий DMEM среду чашки для культивирования клеточных культур HEK 293 (70% сливающихся во время трансфекции). Затем добавьте весь объем раствора ДНК по каплям. Аккуратно покачайте блюдо. Нет необходимости добавлять/менять среду после трансфекции.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 в течение 48-72 часов, чтобы позволить шРНК достичь оптимальной трансдукции, проверенной флуоресценцией GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. После этого соберите среду с лентивирусом и храните при температуре 4 °C.
- Фильтрат вирусной надосадочной жидкости с нейлоновой мембраной 0,45 мкм. Аликвота проточной в 1 мл. Затем центрифугу при 17 000 х г в течение 4 ч. Выбросьте надосадочную жидкость и законсервируйте гранулы. Дайте невидимым гранулам высохнуть, а после высыхания храните при температуре -80 °C.
- Выполняют титрование вирусов с помощью флюсовой цитометрии. Засейте 4 x 105 HEK 293 ячейки в 24-луночные планшеты и инкубируйте при 37 ° C в течение 24 часов. Затем ресуспендируют вирусные частицы в 200 мкл питательной среды DMEM (таблица материалов) и добавляют 0,05, 0,02 и 0,005 мкл в каждую лунку.
- Инкубировать вирусную инфекцию в течение 72 ч, удалить среду и трипсинизировать (0,05% трипсина, 1 мл) в течение 3 мин. Добавьте 1 мл DMEM в 10% раствор FCS и центрифугу при 500 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте гранулы с помощью PBS.
- Ресуспендируют гранулу 100 мкл PBS и фиксируют ячейки 100 мкл 2% параформальдегида (PFA) в PBS. Проанализируйте клетки с помощью флюометрического цитометра и определите процент флуоресцентных клеток GFP. Соберите эти данные, чтобы рассчитать титрование вируса по следующей формуле:
Титрование вирусов
4. Культуры первичных нейронов, подвергшиеся стрессу с накоплением ганглиозида GM2 и иммуноцитохимией с использованием антител против MAP2
- Инфицируют первичные культуры корковых нейронов (15 дней in vitro) специфическими олигонуклеотидами шРНК, нацеленными на 3'-UTR CN-Aα или CHOP, и инкубируют их при 37 ° C с 5% CO2 в течение 1 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные культуры корковых нейронов в течение 7-8 дней in vitro также могут быть использованы, если клетки демонстрируют высокий рост нейритов.- Приготовьте 500 мкМ исходный раствор ганглиозида GM2 в этаноле и обработайте его ультразвуком в течение 1 часа.
- Добавьте исходный раствор GM2 в питательную среду в конечной концентрации 2 мкМ. Дайте инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 в течение 16, 24 и 48 часов.
- Используйте некоторые культуры для приготовления клеточного гомогената для анализа вестерн-блоттинга (спецификацию антител см. в Таблице материалов).
- Выполните шаги 1.4. и 1.5. а затем зафиксируйте ячейки 4% PFA и сахарозой 120 мМ в PBS на 20 мин при 37 °C, а затем промойте PBS. Выполняйте эту процедуру на противоскользящей мембране во влажной камере. После этого добавьте раствор для пермеабилизации (0,2% Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и смойте PBS.
- Используйте 5% BSA, разведенный в PBS, в течение 45 мин, чтобы обеспечить блокировку, затем инкубируйте с антителом против MAP2, разбавленным 1:800 в блокирующем растворе, при 4 ° C в течение ночи.
- По окончании инкубационного времени дважды промыть PBS и инкубировать со вторичными антителами (Таблица материалов) в течение 1 ч. Затем промойте ячейки с помощью PBS и установите стекла на предметные стекла с помощью водной монтажной среды (Таблица материалов).
5. Анализ атрофии нейритов
- Получение изображений с помощью 20-кратной воздушной линзы (NA 0.8) с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой. Анализируйте изображения с помощью подключаемых модулей ImageJ. Для этого загрузите изображение в ImageJ и вычтите фон, нажав « Обработать» | Вычтите фон.
- Нажмите на изображение | Отрегулируйте | Пороговое значение или введите следующие клавиши: Ctrl (или Cmd) + Shift + T. Откроется окно для настройки минимальных значений, что позволит различить трассировку пути и сомы. Кликните по бинарному изображению (нейриты и сомы белого цвета). На этом изображении используйте выделение от руки, чтобы удалить сомы; Выбранная область сомы снова становится черной.
- Выберите трассировки и нажмите кнопку Редактировать | Выбор | Создать выделение. Получите ROI, нажав клавиши Ctrl (или Cmd) и T выделения, и сохраните его. Откройте исходное изображение, затем нажмите на панель менеджера ROI и выберите принадлежащий ROI, полученный ранее. Затем нажмите на исходное изображение.
- Как только ROI будет отслеживаться на изображении, введите клавиши Ctrl (или Cmd) и M (Analyze | Мера). Окно открывается; Скопируйте среднее значение (произвольные единицы а.е.) для обработки статистического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить значения в мкм, нажмите «Анализировать» | Установите масштаб. Откроется окно для установки значений. Убедитесь, что вы добавили правильный масштаб (Analyze | Set Scale) в зависимости от характеристик используемого микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы рассматриваем вопрос о том, влияет ли молчание двух последующих компонентов PERK на переходную фазу UPR в модели стрессовых клеток ER. Чтобы достичь этого, мы заглушаем ген CN-Aα, а также ген CHOP двумя специфическими последовательностями шРНК для каждой (таблица 1) в культуре клеток первичных нейронов в течение 1 дня10. Выражение анализируется методом вестерн-блоттинга (рис. 1 и рис. 2). Наблюдается явное ингибирование ER-опосредованного стрессом увеличения CN-Aα и CHOP в нокдаун-клетках, но не в контрольных клетках (скремблы шРНК). Следует отметить, что это состояние лечения не влияет на базальный уровень экспрессии CN.
Мы также исследуем возможную связь вызванного накоплением GM2 стресса ER с дегенерацией нейронов путем проведения иммуноокрашивания MAP2 первичных культур нейронов (рис. 3 и рис. 4).
Атрофия нейрита анализируется как общий рост нейрита по отношению к общему количеству клеток. Это значительно увеличивается после индуцирования стресса ER путем инкубации GM2 через 16-48 часов. Интересно, что подавление экспрессии CN-Aα значительно усиливает атрофию нейритов, особенно через 16 часов после накопления GM2, по сравнению с группами, не получавшими GM2 (рис. 3). Таким образом, нокдаун CN-Aα ускорял процессы дегенерации в нейронах, подтверждая про-выживающий эффект CN на ранней фазе UPR. И наоборот, нокдаун CHOP приводил к значительному уменьшению атрофии нейрита по сравнению с контрольной группой, особенно через 16-24 часа (рис. 4).
Рисунок 1. Анализ данных для эффективности глушения CN-Aα. Нокдаун оценивается с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против CN-Aα и GADPH (контроль нагрузки). Первичное антитело визуализируется с помощью флуоресцентной системы визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне. Приведенные ниже числа представляют собой относительное отношение интенсивности между диапазонами CN-Aα и GADPH. Этот рисунок был переиздан из Virgolini, M.J. et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Анализ данных для повышения эффективности глушения CHOP. Нокдаун оценивается с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против CHOP и β актина (контроль нагрузки). Первичное антитело визуализируется, а затем данные анализируются, как показано на рисунке 1. Этот рисунок был переиздан из Virgolini, M.J. et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Анализ данных визуализации нейритной атрофии в нокдаунных клетках CN-Aα. (Наверх) Культивируемые первичные нейроны загружены GM2. Репрезентативные изображения иммуноокрашенных клеток MAP2 показаны в контрольных и экспериментальных условиях. Изображения регистрируются с помощью эпифлуоресцентно-инвертированного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой. Масштабные линейки: 150 мкм (обычные изображения), 75 мкм (увеличенные изображения). (Внизу) Гистограмма (среднее ± SEM) представляет собой рост нейритов по отношению к общему количеству клеток, проанализированный плагинами ImagJ. *** и # ##: p 0,0001 для сравнения с контролем, из односторонней ANOVA. Этот рисунок был переиздан из Virgolini, M.J. et al.4.
Рисунок 4. (Наверх) Анализ данных для визуализации нейритной атрофии в клетках, подавляющих CHOP. Первичные культуры нейронов обрабатываются, как показано на рисунке 3 (вверху). (Внизу) Гистограммы и статистические обозначения, как показано на рисунке 3 (внизу ), за исключением ##: p≤ 0,001. Этот рисунок был переиздан из Virgolini, M.J. et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Конструкции | Последовательность от 5' до 3' шРНК |
| CN-Aα 1 | AATTGCCAGGAATTGGATTCAGTTTCTCGA GAAACTGAATCCAATTCCTGGCTTTTTTTTTAT |
| CN-Aα 2 | AATTCGCCAACCTTAACTCCATCAACTCGAG TTGATGGAGTTAAGGTTGGCGTTTTTTTAT |
| CN-Aα Scrb | AATTGAGTGAATTGTCGCTCTAAGTCTCGAG ACTTAGAGCGACAATTCACTCTTTTTTTAT |
| ОТБИВНАЯ 1 | AATTGGTCCTGTCCTCAGATGAAATCTCGAG ATTTCATCTGAGGACAGGACCTTTTTTTAT; |
| ОТБИВНАЯ 2 | AATTTGAAGAGAACGAGCGGCTCAACTCGA GTTGAGCCGCTCGTTCTCTCTTTTTTTTTTAT |
| ЧОП Scrb | AATTGAGAGAAAGCGAACAATACTCGAG TATTGTTCGCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTAT |
Таблица 1. Последовательности прямой конструкции, вставленные в вирусный вектор pKLG0.3. Scrb: схватка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем экспериментальную систему, которая обеспечивает молекулярную модуляцию перехода от фаз выживания к апоптотическим фазам UPR в модели нейрональной клетки.
Для правильного анализа атрофии нейритов необходимо получить первичные культуры нейронов с многочисленными, длинными, сильно разветвленными отростками 9,11. Это облегчает изучение расширения нейронного процесса, позволяя обнаружить четкие различия между методами лечения. Важно отметить, что, если первичные культуры корковых нейронов на 7-8 день in vitro уже показывают высокий рост нейритов, они могут быть использованы для индуцирования стресса и выполнения последующего анализа вместо 15-дневного культивирования in vitro.
Кроме того, процент ингибирования сверхэкспрессии CHOP, опосредованной стрессом ER, должен составлять около 65-70% или выше. Важно отметить, что подавление уровня экспрессии CN-Aα должно влиять только на индуцированное стрессом ER увеличение экспрессии CN-Aα без изменения его базального уровня. Это делается для того, чтобы свести к минимуму влияние на функции CN, не связанные с передачей сигналов PERK12,13.
Что касается процедуры анализа атрофии нейритов, в этой статье представлена альтернативная методология, которая требует меньше ручной работы, чем специальные плагины ImageJ, которые помогают отслеживать нейриты. Как правило, они требуют, чтобы процессы были индивидуально прослежены для каждого нейрона, в то время как шаги, описанные в этой статье, отслеживают процессы нескольких нейронов одновременно с использованием 5 наборов общих доступных команд ImageJ. Как подключаемые модули, так и этот протокол позволяют количественно оценить значение всех процессов в образце изображения.
Ранее мы продемонстрировали новую цитопротекторную роль вездесущей КН в ранней фазе UPR, вызванную либо фармакологическими инструментами, либо ишемическими процессами 3,4,8. Мы описали влияние ингибирования экспрессии CHOP на выживаемость клеток в различных системах 8,11,14. Здесь мы предлагаем методологию, в которой манипулирование экспрессией любого из этих генов позволяет противоположно модулировать начало процесса невритной атрофии в клеточной модели стресса ER, модулируемого в противоположном режиме.
Мы предполагаем, что эта методология может быть использована для оценки восприимчивости нейронов к нейритной атрофии в различных моделях клеточной системы стресса ER и, таким образом, способствовать пониманию молекулярных основ перехода между острой и хронической фазами УПО в различных моделях нейродегенеративных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Гонсало Квасолло за его неоценимую помощь в визуализации и доктора Андреа Пеллегрини за техническую поддержку клеточных культур.
Это исследование было поддержано грантами: Национального института здравоохранения, США (#RO1AG058778-01A1, Соглашение No 165148/165147 между UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) и Национального агентства Национального агентства по развитию науки и технологий, Аргентина (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J.
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G.
- Rusnak, F., Mertz, P.
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
