وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

Zachary J. Kirsch; Blaise G. Arden; Richard W. Vachet; Patanachai Limpikirati

doi:10.3791/61983

Method Article

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

DOI:

10.3791/61983

⸱

June 15th, 2021

Zachary J. Kirsch¹ , Blaise G. Arden¹ , Richard W. Vachet*¹^,² , Patanachai Limpikirati*³

¹Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, ²Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, ³Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف الإجراءات التجريبية لأداء الوسم التساهمي القائم على النظام الغذائي مع الكشف الطيفي الشامل. يتم خلط Diethylpyrocarbonate ببساطة مع مجمع البروتين أو البروتين من الفائدة، مما يؤدي إلى تعديل بقايا الأحماض الأمينية المذيبات التي يمكن الوصول إليها. ويمكن تحديد المخلفات المعدلة بعد الهضم البروتيولي وتحليل الكروماتوغرافيا السائلة/قياس الطيف الكتلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن توصيف بنية البروتين ذات الترتيب الأعلى أمر ضروري لفهم وظيفته. وقد برز قياس الطيف الكتلي كأداة قوية لهذا الغرض، وخاصة بالنسبة لأنظمة البروتين التي يصعب دراستها بالطرق التقليدية. لدراسة بنية البروتين عن طريق التصلب المتعدد ، يتم إجراء تفاعلات كيميائية محددة في محلول يشفر المعلومات الهيكلية للبروتين في كتلته. أحد النهج الفعالة بشكل خاص هو استخدام الكواشف التي تعدل بشكل مشترك المذيبات سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية يمكن الوصول إليها. تؤدي ردود الفعل هذه إلى زيادات كتلية يمكن توطينها بدقة على مستوى المخلفات عند دمجها مع الهضم البروتيوليكي وقياس الطيف الكتلي المترادف. هنا، نحن نصف البروتوكولات المرتبطة باستخدام ديثيليبيروكربونات (DEPC) ككواشف وضع العلامات التساهمية جنبا إلى جنب مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. DEPC هو جزيء كهربائي للغاية قادر على وضع علامات تصل إلى 30٪ من المخلفات في البروتين المتوسط ، وبالتالي توفير دقة هيكلية ممتازة. وقد استخدمت DEPC بنجاح جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد للحصول على معلومات هيكلية للبروتينات الصغيرة ذات المجال الواحد، مثل β2-microglobulin، إلى البروتينات الكبيرة متعددة المجالات، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات هي الجزيئات الحيوية الأساسية في كل عملية فسيولوجية تقريبا. إن تنوع الوظائف التي تؤديها البروتينات ممكن بسبب الهياكل التي تعتمدها والتفاعلات التي لديها مع الجزيئات الحيوية الأخرى. لفهم وظيفة البروتين على مستوى أعمق، هناك حاجة إلى أدوات بيوكيميائية وبيولوجية فيزيائية لتوضيح هذه السمات والتفاعلات الهيكلية الهامة. تقليديا، قدمت الأشعة السينية البلورية، المجهر الإلكتروني المبرد، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية التفاصيل المطلوبة على المستوى الذري للكشف عن بنية البروتين. ومع ذلك، لا يمكن استجواب العديد من أنظمة البروتين من خلال هذه التقنيات بسبب سوء سلوك التبلور، وتوافر البروتين المحدود، والتباين المفرط في العينة، أو قيود الوزن الجزيئي. ونتيجة لذلك، ظهرت أ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد البروتين والكواشف

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول على سبيل المثال سير العمل لتسمية بروتين مع DEPC. قد تختلف بعض الحالات وتركيزات الكاشف المذكورة استنادا إلى البروتين المفضل.

إعداد جميع حلول الكاشف في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
إعداد محلول البروتين من التركيز المطلوب، وعادة في حدود عشرات ميكرومتر، في 10 M 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS) العازلة في درجة الحموضة 7.4. بدلا من ذلك، قم بإعداد محلول البروتين الموجود في 10 mM pH 7.4 MOPS إذا كانت العينة تحتوي على مخزن مؤقت للنيوكليوفيليا يكون رد الفعل مع DEPC. ويمكن أيضا استخدام مخازن عازلة أخرى (مثل الملحية العازلة للفوسفات)، طالما أنها لا تحتوي على ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد مواقع تعديل DEPC ونسب التعديل
ويمكن قياس الإضافة الشاملة بسبب وضع العلامات التساهمية في (أ) البروتين سليمة و (ب) مستويات الببتيد⁸^،⁹. على مستوى سليم، يمكن الحصول على توزيع أنواع البروتين مع أعداد مختلفة من التسميات من التحليل المباشر أو LC-MS من عينات البروتين المسمى. للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة (أي بيانات وضع العلامات الخاصة بالموقع)، يجب إجراء القياسات على مستوى الببتيد. بعد وضع العلامات وخطوات التبريد ، تخضع البروتينات المسماة لتحليل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الهامة
وينبغي النظر في عدة نقاط تتعلق بالتصميم التجريبي لضمان نتائج موثوقة لوضع العلامات. أولا، لتحقيق أقصى قدر من وضع العلامات البروتين، فمن الضروري تجنب المخازن المؤقتة مع مجموعات نوى بقوة (على سبيل المثال، تريس) لأنها يمكن أن تتفاعل مع DEPC وانخفاض مدى وضع العلامات. ومن المتصور أيضا أن هذه المخازن المؤقتة يمكن أن تتفاعل مع المخلفات المسماة، مما يؤدي إلى إزالة الملصق وبالتالي فقدان المعلومات الهيكلية. نوصي MOPS كمخزن مؤقت، ولكن الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة يعمل كذلك. ثانيا، ينبغي تجنب ثنائي ميثيل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بدعم المعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب منحة R01 GM075092. تم الحصول على مطياف الكتلة الحرارية Orbitrap فيوجن المستخدمة للحصول على بعض البيانات الموصوفة هنا بأموال من المنحة الوطنية للمعاهد الصحية S10OD010645.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 مل أنبوب الطرد المركزي	الدقيق Thermo Fisher Scientific	3448
3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك	Millipore Sigma	M1254
3- (N-morpholino) ملح الصوديوم حمض البروبان سلفونيك	Millipore Sigma	M9381
الإشادة PepMap RSLC C18 العمود	164537 العلمي الحراري		300 & مو ؛ م × 15 سم ، C18 ، 2 & mu ؛ م ، 100 أ
أسيتونيتريل	فيشر Scientific	A998-1
ثنائي إيثيل بيروكربونات	ميليبور سيجما	D5758
مياه HPLC	الصف فيشر Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
الكيموتريبسين الثابت	ProteoChem	g4105
التربسين الثابت ، TPCK معالج	ثيرمو فيشر Scientific	20230
يودوأسيتاميد	ميليبور سيجما	I1149
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين	ميليبور سيجما	C4706

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles