Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

يتم وصف الإجراءات التجريبية لأداء الوسم التساهمي القائم على النظام الغذائي مع الكشف الطيفي الشامل. يتم خلط Diethylpyrocarbonate ببساطة مع مجمع البروتين أو البروتين من الفائدة، مما يؤدي إلى تعديل بقايا الأحماض الأمينية المذيبات التي يمكن الوصول إليها. ويمكن تحديد المخلفات المعدلة بعد الهضم البروتيولي وتحليل الكروماتوغرافيا السائلة/قياس الطيف الكتلي.

Abstract

إن توصيف بنية البروتين ذات الترتيب الأعلى أمر ضروري لفهم وظيفته. وقد برز قياس الطيف الكتلي كأداة قوية لهذا الغرض، وخاصة بالنسبة لأنظمة البروتين التي يصعب دراستها بالطرق التقليدية. لدراسة بنية البروتين عن طريق التصلب المتعدد ، يتم إجراء تفاعلات كيميائية محددة في محلول يشفر المعلومات الهيكلية للبروتين في كتلته. أحد النهج الفعالة بشكل خاص هو استخدام الكواشف التي تعدل بشكل مشترك المذيبات سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية يمكن الوصول إليها. تؤدي ردود الفعل هذه إلى زيادات كتلية يمكن توطينها بدقة على مستوى المخلفات عند دمجها مع الهضم البروتيوليكي وقياس الطيف الكتلي المترادف. هنا، نحن نصف البروتوكولات المرتبطة باستخدام ديثيليبيروكربونات (DEPC) ككواشف وضع العلامات التساهمية جنبا إلى جنب مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. DEPC هو جزيء كهربائي للغاية قادر على وضع علامات تصل إلى 30٪ من المخلفات في البروتين المتوسط ، وبالتالي توفير دقة هيكلية ممتازة. وقد استخدمت DEPC بنجاح جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد للحصول على معلومات هيكلية للبروتينات الصغيرة ذات المجال الواحد، مثل β2-microglobulin، إلى البروتينات الكبيرة متعددة المجالات، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة.

Introduction

البروتينات هي الجزيئات الحيوية الأساسية في كل عملية فسيولوجية تقريبا. إن تنوع الوظائف التي تؤديها البروتينات ممكن بسبب الهياكل التي تعتمدها والتفاعلات التي لديها مع الجزيئات الحيوية الأخرى. لفهم وظيفة البروتين على مستوى أعمق، هناك حاجة إلى أدوات بيوكيميائية وبيولوجية فيزيائية لتوضيح هذه السمات والتفاعلات الهيكلية الهامة. تقليديا، قدمت الأشعة السينية البلورية، المجهر الإلكتروني المبرد، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفية التفاصيل المطلوبة على المستوى الذري للكشف عن بنية البروتين. ومع ذلك، لا يمكن استجواب العديد من أنظمة البروتين من خلال هذه التقنيات بسبب سوء سلوك التبلور، وتوافر البروتين المحدود، والتباين المفرط في العينة، أو قيود الوزن الجزيئي. ونتيجة لذلك، ظهرت أساليب تحليل أحدث تتغلب على هذه القيود. ومن بين التقنيات الناشئة التي يمكن أن توفر المعلومات الهيكلية البروتين هو قياس الطيف الكتلي.

يقيس قياس الطيف الكتلي (MS) نسبة الكتلة إلى الشحنة للجزيء (m/z)، لذلك يجب الحصول على المعلومات الهيكلية عالية الترتيب للبروتين عن طريق ترميز المعلومات الهيكلية المطلوبة في كتلة البروتين. وقد تم تطوير عدة طرق لترميز هذه المعلومات، بما في ذلك تبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX)1،2،3،4، الربط المتبادل الكيميائي (XL)5،6، ووضع العلامات التساهمية (CL)7،8،9،10. في HDX، يتم تبادل العمود الفقري وسط الهيدروجين من قبل الديوتريوم أكثر قليلا ضخمة بمعدلات تعتمد على إمكانية الوصول المذيبات ومدى الترابط H. يمكن ترجمة مدى HDX عن طريق هضم البروتين بسرعة إلى شظايا الببتيد قبل فصل وقياس هذه الشظايا عن طريق مطياف الكتلة أو عن طريق فصل البروتين في تجربة من أعلى إلى أسفل. تحديد سعر الصرف يوفر المزيد من التبصر في ديناميات البروتين. وقد ثبت HDX لتكون أداة قيمة لتميز بنية البروتين على الرغم من التحديات المرتبطة تبادل الظهر والحاجة إلى معدات متخصصة لتحقيق أقصى قدر من الاستنساخ. في XL-MS، يتم تفاعل البروتينات مع الكواشف ثنائية الوظائف التي تربط بشكل مشترك بين السلاسل الجانبية للبقايا المجاورة داخل بروتين معين أو بين بروتينين. عند القيام بذلك، يمكن أن توفر XL-MS قيود المسافة التي يمكن استخدامها لتوصيف بنية البروتين. يمكن تحديد مناطق البروتين المرتبطة عبر عن طريق الهضم البروتيولي يليها تحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS. في حين أن XL-MS هو أداة متعددة الاستخدامات تم استخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من مجمعات البروتين ، بما في ذلك داخل الخلايا ، فإن تحديد منتجات XL أمر صعب ويتطلب برامج متخصصة.

وقد برز CL-MS مؤخرا كأداة تكميلية وأحيانا بديلة تعتمد على التصلب المتعدد لدراسة بنية البروتين والتفاعلات. في CL-MS، يتم تعديل مجمع البروتين أو البروتين بشكل مكافئ مع كاشف أحادي الوظائف يمكن أن يتفاعل مع سلاسل جانبية معرضة للمذيبات(الشكل 1). من خلال مقارنة مدى تعديل مجمع البروتين أو البروتين في ظل ظروف مختلفة ، يمكن الكشف عن تغييرات تشكيل ، ومواقع ملزمة ، وواجهات البروتين والبروتين. بعد تفاعل CL ، يمكن الحصول على معلومات خاصة بالموقع ، غالبا على مستوى الأحماض الأمينية الواحدة ، باستخدام سير عمل البروتيوميات النموذجي من أسفل إلى أعلى حيث يتم هضم البروتينات بشكل بروتيوكليتيكي ، ويتم فصل شظايا الببتيد بواسطة LC ، ويتم تحديد المواقع المعدلة باستخدام MS جنبا إلى جنب (MS / MS). وقد أتاح التاريخ الغني لكيمياء التكيف البيولوجي العديد من الكواشف لتجارب CL-MS. وتندرج الكواشف الخاصة ب CL في فئتين عامتين: '1' محددة و'2' غير محددة. الكواشف محددة تتفاعل مع مجموعة وظيفية واحدة (على سبيل المثال، الأمينات الحرة)8،10 وسهلة التنفيذ ، لكنها تميل إلى توفير معلومات هيكلية محدودة. وتتفاعل الكواشف غير المحددة مع مجموعة واسعة من السلاسل الجانبية، ولكنها غالبا ما تتطلب معدات متخصصة مثل الليزر أو مصادر السنكروترون لإنتاج هذه الأنواع شديدة التفاعل. هيدروكسيل الجذور هي الكاشف غير محددة الأكثر استخداما، بعد أن تم تطبيقها في البصمة الراديكالية الهيدروكسيل (HRF)7،11،12،13 التجارب لدراسة مجموعة واسعة من البروتينات والمجمعات البروتينية في ظل مجموعة متنوعة من الشروط.

وقد استخدمت مجموعتنا البحثية بنجاح كاشفا آخر غير محدد نسبيا يسمى ديثيليبيروكربونات (DEPC) لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في سياق تجارب CL-MS14و15و16و17و18و19و20و21و22و 23و 24و25. DEPC يقدم بساطة الكواشف وضع العلامات محددة (أي، لا توجد معدات متخصصة ضرورية لأداء ردود الفعل)، في حين تتفاعل مع ما يصل إلى 30٪ من الأحماض الأمينية في البروتين المتوسط. كمكشف كهربائي للغاية ، DEPC قادر على التفاعل مع N-terminus والسلاسل الجانبية النووية من السيستين والهستيدين والليسين والتيروزين وسيرين ومخلفات الثريونين. عادة، يتم إنشاء منتج واحد من هذه التفاعلات، مما أدى إلى زيادة كتلة من 72.02 دا. هذا النوع واحد من المنتجات يتناقض مع ما يصل إلى 55 المنتجات المختلفة التي يمكن أن تنتج عندما تتفاعل البروتينات مع الجذور الهيدروكسيل7. هذه الكيمياء البسيطة تسهل تحديد المواقع المسماة.

هنا، نحن نقدم بروتوكولات لاستخدام CL-MS المستندة إلى DEPC لدراسة بنية البروتين والتفاعلات. يتم وصف التفاصيل المرتبطة بإعداد الكاشف ، وتفاعلات البروتين DEPC ، وظروف هضم البروتين ، ومعلمات LC-MS و MS / MS ، وتحليل البيانات. كما أننا نثبت فائدة وضع العلامات على DEPC من خلال تقديم نتائج نموذجية من التفاعلات بين البروتين والمعدن والبروتين والبروتين بالإضافة إلى البروتينات التي تخضع لتغييرات هيكلية عند التدفئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد البروتين والكواشف

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول على سبيل المثال سير العمل لتسمية بروتين مع DEPC. قد تختلف بعض الحالات وتركيزات الكاشف المذكورة استنادا إلى البروتين المفضل.

  1. إعداد جميع حلول الكاشف في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
  2. إعداد محلول البروتين من التركيز المطلوب، وعادة في حدود عشرات ميكرومتر، في 10 M 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS) العازلة في درجة الحموضة 7.4. بدلا من ذلك، قم بإعداد محلول البروتين الموجود في 10 mM pH 7.4 MOPS إذا كانت العينة تحتوي على مخزن مؤقت للنيوكليوفيليا يكون رد الفعل مع DEPC. ويمكن أيضا استخدام مخازن عازلة أخرى (مثل الملحية العازلة للفوسفات)، طالما أنها لا تحتوي على مجموعات وظيفية نيوكليوفيليا.
  3. إعداد محلول DEPC 100 mM في أسيتونيتريل الجاف (ACN) عن طريق الأنابيب 1.45 ميكرولتر من الأسهم 6.9 M DEPC حل في 98.55 ميكرولتر من ACN.
    ملاحظة: لا توجد مجموعة واحدة من التركيزات التي ستعمل مع كل بروتين، على الرغم من أن تركيزات الأمثل يمكن تقديرها على أساس عدد من له ومخلفات ليس23. على سبيل المثال، مع 50 ميكرولتر من محلول 50 ميكرومتر β2-microglobulin، تفاعل مع البروتين مع 0.2 ميكرولتر من 100 mM DEPC لتركيز DEPC النهائي من 200 ميكرومتر (يساوي 4x تركيز البروتين) لضمان نسبة الضرس المطلوب باستخدام هذا المثال العام(الجدول 1). DEPC وضع العلامات هو رد فعل 2 من أجلnd، لذلك تغيير إما تركيز البروتين أو DEPC في خليط رد الفعل سوف تغير معدل وضع العلامات.
  4. إعداد 1 M imidazole الحل عن طريق وزنها من أصل 10 ملغ من إيميدازول وحل في 146.9 ميكرولتر من المياه HPLC الصف.

2. وضع العلامات التكافؤية للبروتين سليمة

  1. حدد درجة حرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية وانتظر حتى يصل الحمام إلى درجة حرارة مستقرة.
    ملاحظة: يمكن العثور على تركيزات الكاشف ووحدات التخزين لبروتوكول وضع العلامات على سبيل المثال في الجدول 1.
  2. في أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق، امزج عازل MOPS ومحلول البروتين في الأحجام المدرجة في الجدول 1.
  3. إلى البروتين والتخزين المؤقت إضافة 0.2 ميكرولتر من محلول DEPC، والتأكد من خلط بشكل صحيح الحل الناتج، ومن ثم وضع أنبوب يحتوي على خليط التفاعل في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز حجم ACN المضاف 1٪ من إجمالي حجم التفاعل لتجنب اضطراب بنية البروتين أثناء رد فعل وضع العلامات. رد فعل الوقت متروك للمستخدم، على الرغم من رد فعل 1 دقيقة تحت شروط المثال يقلل من الإفراط في وضع البنود والتحلل المائي المحتملة من DEPC14.
  4. بعد 1 دقيقة، قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على خليط التفاعل من حمام الماء وإرواء التفاعل مع 1 ميكرولتر من محلول إيميدازول M 1 لمسح DEPC المتبقي غير المتفاعل.
    ملاحظة: يجب أن يساوي التركيز النهائي للimidazole في خليط التفاعل 50x تركيز DEPC في خليط التفاعل. سيضمن هذا أن يتم مسح DEPC غير المتفاعلة المتبقية.

3. إعداد هضم البروتين لLC-MS من أسفل إلى أعلى

ملاحظة: اختر شروط الهضم التي تكون قابلة للبروتين من الفائدة. وتشمل الخطوات الشائعة تتكشف البروتين والحد من و alkylating أي روابط ثنائي الكبريتيد.

  1. تتكشف البروتين عن طريق إضافة كاشف تتكشف المناسبة لخليط رد الفعل.
    ملاحظة: تشمل العوامل الشائعة التي تتكشف ACN واليوريا والهيدروكلوريد جوانيدين (GuHCl).
  2. إعداد حلول Tris (2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) و iodoacetamide (IAM) عن طريق وزن 5 ملغ من كل منها وحلها في أنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة في 174.4 و 270.3 ميكرولتر من 10 مللي متر في درجة الحموضة 7.4 MOPS العازلة، على التوالي، للحد من وخطوات الألكيل.
  3. تقليل الروابط ثنائية الكبريتيد بإضافة 2 ميكرولتر من 100 mM TCEP (التركيز النهائي من 2 mM في خليط التفاعل) حل لخليط التفاعل والتفاعل لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب أن يساوي التركيز النهائي ل TCEP 40x تركيز البروتين لكل سند ثنائي الكبريتيد الموجود في المحلول.
  4. خفضت الألكيلات السيستينات مع 4 ميكرولتر من محلول IAM 100 mM (التركيز النهائي من 4 mM في خليط التفاعل) لمدة 30 دقيقة في الظلام. IAM حساس للضوء وسوف تتحلل تحت الضوء المباشر.
    ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي لل IAM في المحلول ضعف التركيز المستخدم في TCEP ، أو 80x تركيز البروتين لكل رابطة ثنائي الكبريتيد.
  5. هضم البروتين مع انزيم مناسب مثل تريبسين أو تشيموتريبسين. نسبة البروتين:الانزيم 10:1 لعملية الهضم لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع إنزيم معطل بمعدل اهتزاز يبلغ 300 سكتة دماغية / دقيقة كافية عادة للبروتينات المسماة DEPC. راجع المناقشة.
  6. بعد الهضم، افصل الإنزيم المشلوم عن الببتيدات المهضومة عن طريق الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  7. تحليل العينة فورا بواسطة LC-MS/MS أو فلاش تجميد العينة مع النيتروجين السائل لتقليل تدهور العينة وفقدان التسمية. تخزين عينات فلاش المجمدة في < -20 درجة مئوية حتى جاهزة لتحليل LC-MS / MS.

4. LC-MS/ MS التحليل

ملاحظة: يمكن استخدام معلمات LC-MS/MS القياسية لعلم البروتيوميات من أسفل إلى أعلى لتحديد المواقع المسماة على شظايا الببتيد البروتيوليكية. ويرد أدناه مثال عام على ذلك.

  1. فصل الببتيدات التي تحمل علامة DEPC باستخدام مرحلة ثابتة C18 معكوسة. استخدم مرحلة LC المحمولة النموذجية من مذيبين: (A) الماء + 0.1٪ حمض الفورميك و (B) ACN + 0.1٪ حمض الفورميك باستخدام تدرج (على سبيل المثال، الشكل 2)لتحقيق أفضل فصل للببتيدات.
    ملاحظة: يمكن تحسين وقت الفصل استنادا إلى تعقيد العينة، ويعتمد معدل تدفق المرحلة المتنقلة على ما إذا كان يتم استخدام الشعيرات الدموية أو نانو LC.
  2. استخدام مطياف الكتلة قادرة على القيام على الانترنت LC-MS و MS / MS لتحديد مواقع تعديل DEPC على الببتيد. في تجاربنا، استخدمنا بنجاح عدة أنواع من مطياف الكتلة. يجب أن يكون أي مطياف كتلي قادر على إجراء MS/MS تلقائيا للعديد من الببتيدات أثناء تحليل LC-MS مناسبا. تتضمن معلمات MS ذات الصلة: الجهد المصدر ESI = -4000 V لESI العادية؛ -2000 V للرذاذ النانوي. دقة المركبة المدارية = 000 60؛ مدة الاستبعاد الديناميكي = 30 s; MS/MS نوع التنشيط: CID ETD أو كليهما; نطاق المسح الشامل = 200-2000؛ التحكم التلقائي في الكسب = 4.0E5 (MS1 في Orbitrap) و 5.0E4 (MS2 في فخ أيون رباعي الخطي).
  3. قم بتحميل عينة البروتين المهضومة والمحملة بحقنها في نظام LC وابدأ عملية الاستحواذ LC-MS/MS. إذا تم تجميد العينة فلاش، إذابة قبل التحليل. تحويل السائل السائل LC إلى النفايات لأول 5 دقائق لتجنب الأملاح المفرطة من الدخول إلى مصدر ESI.
    ملاحظة: تستخدم حلقة حقن 5 ميكرولتر بشكل عام، مما يسمح بحقن ما يقرب من 2.5 ميكروغرام من البروتين إلى LC-MS/MS. هذا يعتمد على شروط التحميل من LC لعدم تسد حاقن العينة.

5. تحليل البيانات

  1. تحديد مواقع تسمية DEPC وتحديد مناطق ذروة الببتيد باستخدام البرامج المناسبة لمطياف الكتلة المستخدمة.
  2. وتشمل DEPC إضافة (72.02 دا) وcarbamidomethylation (57.02 دا) كتعديلات متغيرة. معلمات بحث إضافية لتحليل MS/MS كما يلي: الحد الأقصى للانقسامات الفائتة = 3; أنواع أيونات الأجزاء = b و y; السلائف m/z التسامح = 10 ppm (يجب أن تكون هذه القيمة أعلى إذا تم استخدام مطياف كتلة فخ رباعي الأيونات); تفاوت جزء m/z = 0.5 Da (يجب أن تكون هذه القيمة أقل إذا تم استخدام مطياف كتلة عالي الدقة لمسح أيون المنتج)؛ شحنة السلائف = 1-4.
    ملاحظة: خوارزميات البحث قاعدة بيانات مختلفة لديها أنظمة تسجيل مختلفة، والعديد يمكن أن يكون صعوبة في تحديد الببتيدات DEPC المعدلة لأن مستويات التعديل يمكن أن تكون منخفضة. قد يكون تعديل قطع النتيجة ضروريا لتحديد الببتيدات الأكثر تسمية. إذا كان الأمر كذلك، ثم الاستجواب اليدوي للبيانات MS / MS ينبغي أن تستخدم للتحقق من الببتيدات منخفضة التهديف. لم يتم تضمين منتج التحلل المائي لعلامة DEPC في البحث عن البيانات لأن DEPC المتحللة لم تعد تفاعلية تجاه السلاسل الجانبية النووية.
  3. تحديد نسب تعديل مستوى المخلفات باستخدام مناطق الذروة الكروماتوغرافية للإصدارات المعدلة وغير المعدلة من الببتيدات.
    ملاحظة: يجب النظر في أي ببتيد يحتوي على بقايا معدلة من الفائدة ويجب أن تكون جميع الدول المسؤولة التي يتم تضمينها موجودة في جميع العينات المقاسة. الببتيدات لها كفاءات تأين مختلفة و eluting في أوقات مختلفة يسبب هذه القيمة لتكون مقياس نسبي بدلا من المطلق لتعديل موقع معين.
    Equation 1
    حيث يمثلA،z منطقة الذروة من أي الببتيد معين (1) الذي يحتوي على بقايا الفائدة ويعتبر جميع الدول تهمة الكشف (ض).
  4. تحديد ما إذا كان تغيير وضع العلامات بين عنصر التحكم والعينة التجريبية مهما باستخدام التقييم الإحصائي. ثلاثة قياسات تكرار لكل عينة نموذجية، وتستخدم أكثر t-الاختبارات الأكثر شيوعا مع فترات الثقة 95 أو 99٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد مواقع تعديل DEPC ونسب التعديل
ويمكن قياس الإضافة الشاملة بسبب وضع العلامات التساهمية في (أ) البروتين سليمة و (ب) مستويات الببتيد8،9. على مستوى سليم، يمكن الحصول على توزيع أنواع البروتين مع أعداد مختلفة من التسميات من التحليل المباشر أو LC-MS من عينات البروتين المسمى. للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة (أي بيانات وضع العلامات الخاصة بالموقع)، يجب إجراء القياسات على مستوى الببتيد. بعد وضع العلامات وخطوات التبريد ، تخضع البروتينات المسماة لتحليل بروتيومي من أسفل إلى أعلى (أي تقليل ثاني كبريتيد ، الألكيل ، الهضم البروتيوليكي ، وLC-MS / MS). ويبين الشكل 3 كيف يتم تحديد المواقع التي تحمل علامة DEPC ويتم حساب مستويات التعديل الخاصة بها لتجربة DEPC CL-MS على البروتين β-2-microglobulin (β2m)21. يستخدم MS/MS لتسلسل الببتيدات المسماة وتحديد مواقعها المسماة DEPC ، في حين يتم حساب نسب التعديل من مناطق الذروة النسبية في الكروماتوجرامات الأيونية المستخرجة (انظر الشكل 3A).

رسم خرائط سطح البروتين باستخدام DEPC CL-MS
بسبب العلاقة بين طوبولوجيا البروتين ومعدل وضع العلامات، وقد استخدمت DEPC لدراسة التغيرات في بنية البروتين أعلى ترتيبا (HOS) وتحديد مواقع التفاعل البروتين8،9. مثال على ذلك هو تأثير Cu(II) ملزمة على بنية β2m. DEPC معامل معدل التعديل من شظايا الببتيد من β2m غير منضم وCu(II) ملزمة β2m (b2m-Cu) يمكن قياسها (الجدول 2) بتركيزات DEPC متفاوتة وتوليد من الدرجة الثانية المؤامرات الحركية14،24. يكشف التفاعل DEPC من المخلفات في β2m-Cu تغييرات كبيرة في معدل وضع العلامات ل His31 و Ser33 و Thr4 ، في حين أن مواقع أخرى ، بما في ذلك بقاياه المختلفة ، لم تتغير إحصائيا. هذه البيانات تتفق مع حقيقة أن His31، ولكن ليس غيرها من مخلفات له في β2m، يربط كو مما تسبب في تغييرات هيكلية بالقرب من His31 (أي، Ser33) وبالقرب من ن-terminus (أي Thr4) (الشكل 4)14،26،27.

DEPC CL-MS لتحديد التغييرات في HOS
DEPC وضع العلامات مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد هو أيضا أداة قيمة لوصف التغييرات HOS إلى البروتينات، والتي لها آثار هامة على العلاج البروتين، والتي هي حاليا الجزء الأسرع نموا من سوق الأدوية28. DEPC CL يمكن تحديد مناطق البروتين المحددة التي تخضع لتغيرات هيكلية على الإجهاد الحراري والأكسدي18. بعد β2m يتعرض للإجهاد الحراري، يتم تجميع العديد من المخلفات التي تخضع لانخفاض كبير في مدى وضع العلامات (N-terminus، Ser28، His31، Ser33، Ser55، Ser57، Lys58) على جانب واحد من البروتين، مما يشير إلى أن هذه المنطقة من البروتين يخضع لتغيير تشكيلي أو ربما يتوسط التجميع(الشكل 5A). بالإضافة إلى هذه المخلفات ، بعد تعرض البروتين للإجهاد التأكسدي ، تشكل المخلفات الأخرى ذات الانخفاض في وضع العلامات (Ser11 ، His13 ، Lys19 ، Lys41 ، Lys94) مجموعة على وجه آخر من البروتين ، مما يشير إلى أن التغيرات التشكيلية الناجمة عن الأكسدة تحدث في مكان آخر(الشكل 5B). وقد أظهرت أعمال أخرى من مجموعتنا أيضا أن DEPC CL-MS يمكن الكشف عن وتحديد مواقع التغيرات تشكيلية في العلاجات الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تعاني من الإجهاد الحراري20.

DEPC CL-MS لدراسة التفاعلات البروتين البروتين
ويمكن الحصول على نظرة ثاقبة في مواقع التفاعل البروتين البروتيني وواجهات التجميع للبروتينات تشكيل اميلويد باستخدام وضع العلامات DEPC وكذلك9. انخفاض في مستويات تعديل المخلفات على تشكيل أوليغومر يمكن أن تكشف عن واجهات ملزمة. DEPC CL-MS كان يستخدم لتوصيف أوليغومرات ما قبل اميلويد من β2m, وهو البروتين الذي يشكل اميلويدس في اميلويدس المرتبطة بغسيل الكلى29, بعد بدء تشكيل اميلويد مع Cu(II)15,16,26. مقارنة التفاعل DEPC من مونومر β2m مع ديمر β2m ما قبل اميلويد التي تتشكل 2 ح بعد إضافة Cu(II) يظهر أن تسعة بقايا الخضوع لانخفاض في وضع العلامات في حين أن ستة بقايا تمر أي تغيير أو زيادات طفيفة في وضع العلامات (الشكل 6A). عند رسم خرائط لهذه التغييرات على β2m، فمن الواضح على الفور أن واجهة dimer ينطوي على ABED β ورقة من مونومرات β2m (الشكل 6B)15.

DEPC CL-MS لدراسة ربط البروتين ليغاند
الربط ليغاند للبروتينات يؤدي إلى انخفاض في إمكانية الوصول المذيبات من المخلفات التي تتفاعل مع ليغاند، ويمكن استخدام CL-MS المستندة إلى DEPC لتحديد المواقع الملزمة ليغاند على البروتينات. على سبيل المثال، يمكن تحديد المواقع الملزمة ل epigallocatechin-3-gallate (EGCG) على β2m في ظل ظروف تشكيل الأميلويد من خلال انخفاضات كبيرة في وضع العلامات DEPC في المخلفات المدفونة بواسطة ربط EGCG. في وجود ECGC، Lys6 و Lys91 لديها نسب تعديل DEPC أقل(الشكل 7)،وتتجمع هذه المخلفات في منطقة واحدة من البروتين، مما يشير إلى حماية المخلفات بسبب الربط ليغاند. ن-terminus, Thr4, و His31, وفي الوقت نفسه, تخضع لزيادات في مدى وضع العلامات(الشكل 7),التي تدل على التغيرات الهيكلية الناجمة عن ECGC وتشير إلى أن Cu(II) مواقع ملزمة على β2m (N-terminus و His31)14,30,31 قد تتعطل نتيجة ملزمة ECGC32. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد المواقع الملزمة للمثبطات جزيء صغير أخرى من تشكيل اميلويد β2m، ريفاميسين SV ودوكسيسيكلين، وذلك باستخدام CL-MS19. في هذه الدراسة، ومع ذلك، لم تكن النتائج من وضع العلامات DEPC وحدها كافية لرسم خريطة المواقع ملزمة مع دقة هيكلية كافية. وكانت النتائج من ثلاثة كاشفات CL مختلفة، وهي DEPC، دينار قبل الميلاد، و1-إيثيل-3-(3-(dimethylamino)بروبيل)كاربوديميد - الجليسين إيثيل استر (EDC / GEE) زوج ضرورية لتحديد أفضل للمواقعملزمة 19.

تحسين الدقة الهيكلية والحد من الهرولة التسمية
على الرغم من أن DEPC وضع العلامات يسبب تشكيل السندات التساهمية، يمكن أن يحدث فقدان التسمية بسبب التحلل المائي، وخاصة بالنسبة لسير، Thr، ومخلفات Tyr (الشكل 8). يمكن تقليل فقدان الملصق عن طريق تقليل الوقت بين تفاعل DEPC CL وتحليل LC-MS باستخدام عمليات الهضم البروتيوليكية القصيرة (على سبيل المثال، 2 ساعة هضم مع الإنزيمات المشلومة) بدلا من الهضم بين عشية وضحاها. الهضم السريع يؤدي إلى مزيد من المخلفات المعدلة التي يجري قياسها، وزيادة كمية المعلومات الهيكلية البروتين. على سبيل المثال، الهضم 2 ح مع chymotrypsin شلت يؤدي باستمرار إلى تحديد المزيد من المخلفات DEPC المعدلة في β2m (الشكل 9)17. مع الهضم بين عشية وضحاها حوالي 75٪ من سير، Thr، Tyr، له، ويتم الكشف عن بقايا ليس في β2m، ولكن عندما يتم تقليل الوقت بين وضع العلامات وLC-MS باستخدام الهضم 2 ساعة، يتم الكشف عن 95٪ من هذه المخلفات في β2m. معظم المخلفات المعدلة المكتشفة حديثا هي بقايا Tyr و Thr المعرضة للتحلل المائي.

على مدار عملنا مع DEPC ، لاحظنا أنه في بعض البروتينات ، يتم تعديل بقايا Cys من سندات ثاني كبريتيد من قبل DEPC ، على الرغم من أن روابط ثاني كبريتيد سليمة أثناء ردود فعل وضع العلامات على DEPC. مثل هذا وضع العلامات من بقايا سايس يحدث لأن الثيول الحرة يمكن أن تتفاعل مع غيرها من المخلفات المعدلة في الحل (الشكل 10)، مما يؤدي إلى ما يسمى "تسمية الهرولة" كما يتم نقل مجموعة كاربيثوكسي إلى بقايا سايس. الهرولة التسمية يقلل من مستويات التعديل في بقايا أخرى ويوفر معلومات هيكلية البروتين غير صحيحة. لتجنب الهرولة التسمية، يجب أن يكون مجانا Cys ثيولس alkylated تماما الحق بعد تخفيض كبريتيد33.

Figure 1
الشكل 1:قياس الطيف الكتليللوسم التساهمي (CL-MS). يستخدم الكاشف أحادي الوظائف لتعديل الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها للمذيبات ويمكن استخدامه لتوفير معلومات خاصة بالموقع حول التغيرات التوافقية أو واجهات التفاعل في البروتينات (الصورة العلوية مقابل السفلية). يتم هضم البروتين المعدل بروتيوكليتيكيلي، ويتم تحليل الببتيدات الناتجة عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة (LC) بالتزامن مع مرض التصلب العصبي المتعدد والتصلب المتعدد جنبا إلى جنب (MS / MS). وقد تم تكييف الشكل من Limpikirati، P.، ليو، T.، فاشيه، R. W. التكافؤ وضع العلامات الشامل الطيف لدراسة بنية البروتين والتفاعلات. الطرق 144، 79-93 (2018). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حجم المستخدمة (ميكرولتر) التركيز في محلول (ميكرومتر)
البروتين (100 ميكرومتر، MOPS) 50 50
MOPS (10 م م، 7.4 م. 48.8 ن/أ
DEPC (100 متر) 0.2 200 (=4x [بروتين])
إيميدازول (1 متر) 1 10,000 (=50x [DEPC])
إجمالي حجم التداول 100

الجدول 1 - الجداول بروتوكول وضع العلامات العامة DEPC.

Figure 2
الشكل 2. مثال LC الانحدار لفصل الببتيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 توضيح كيفية تحديد المواقع المسماة DEPC وحساب مستويات التعديل الخاصة بها. بعد وضع العلامات DEPC والهضم البروتيوليك، (A) يتم إجراء تحليل LC-MS للبروتين المهضوم. وتستخدم مناطق الذروة من (ب) الببتيدات غير المسماة و (C) المسمى في الكروماتوجرام لحساب نسبة وضع العلامات. خلال LC-MS، تتعرض الببتيدات لSCID MS/ MS. وتستخدم أطياف الكتلة الترادفية من (D) غير المسماة و (E) و (F) الببتيدات المسماة التي تم الحصول عليها في أوقات احتجاز محددة لتسلسل الببتيد وتحديد المواقع المسماة DEPC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بقايا b2m b2m-كو
Thr4 0.082 ± 0.004 0.052 ± 0.009
His13 0.041 ± 0.003 0.033 ± 0.005
His31 0.010 ± 0.001 0.003 ± 0.001
سير33 0.010 ± 0.002 0.004 ± 0.001
له51 0.036 ± 0.003 0.030 ± 0.004
سير88 0.029 ± 0.007 0.020 ± 0.006

الجدول 2 معاملات معدل تعديل DEPC الخاصة بالموقع (k, M-1s-1) ل b2m في غياب ووجود Cu(II).

Figure 4
الشكل 4 استخدام DEPC CL-MS لتحديد تأثير Cu(II) ملزمة على هيكل β2m: (أ) رسم خرائط سطح البروتين من المخلفات مع انخفاض كبير في معدلات وضع العلامات DEPC (الأزرق)، مما يشير إلى التغيرات في إمكانية الوصول المذيبات على Cu(II) ملزمة، وتلك التي ليس لديها تغييرات كبيرة في معدل وضع العلامات (أرجواني) (PDB رمز الانضمام 1JNJ). (ب) مثال على المؤامرات الحركية من الدرجة الثانية الخاصة بالموقع لرد فعل β2m بتركيزات مختلفة من DEPC في وجود وغياب Cu(II). يمكن الحصول على معامل معدل وضع العلامات (k) من منحدر قطعة الأرض الحركية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 نتائج وضع العلامات التكافؤية للإجهاد مقابل β2m الأصلي: (أ) الإجهاد الحراري - التدفئة عند 75 درجة مئوية لمدة 24 ساعة و (ب) الإجهاد التأكسدي - مع 3٪ H2O2 لمدة 24 ساعة. وتظهر تغييرات كبيرة في نسب التعديل باللون الأزرق (انخفاض في وضع العلامات) والأحمر (زيادة في وضع العلامات) في حين تظهر المخلفات التي لا توجد تغييرات كبيرة في وضع العلامات باللون الأخضر الشاحب (رمز الانضمام PDB 1JNJ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 استخدام DEPC CL-MS لتحديد واجهة dimer ل dimer ما قبل اميلويد β2m: (A) ملخص تغييرات مستوى تعديل DEPC للمخلفات المعدلة في مونومر (أي t = 0) و dimer 2 h بعد إضافة Cu(II). يتم الإشارة إلى المخلفات ذات الانخفاضات الكبيرة في نطاق وضع العلامات بواسطة النجمة (*). (ب) نتائج وضع العلامات التساهمية المعينة على بنية β2m. وتظهر المخلفات ذات العلامات المتناقصة باللون الأزرق وتظهر المخلفات بدون تغييرات أو زيادات طفيفة في وضع العلامات باللون الأحمر (رمز الانضمام إلى PDB 1LDS). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 نتائج وضع العلامات التكافؤية ل EGCG ملزمة مقابل b2m غير منضم. يتم عرض نسب تعديل DEPC للمخلفات المعروضة. يتم الإشارة إلى الاختلافات ذات الأهمية الإحصائية في نسبة وضع العلامات التساهمية بواسطة علامة نجمية (*). تظهر الزيادات في وضع العلامات على ربط ECGC باللون الأحمر بينما تظهر الانخفاضات باللون الأزرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8 DEPC التفاعلات الوسم التساهمي (استبدال أسيل النيوكليوفليك) وفقدان التسمية (التحلل المائي للمخلفات كاربيثوكسيلاتيد) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9 رسم خرائط لمواقع التعديل المقاسة على β2m. (أ) المواقع المسماة بعد الهضم التقليدي بين عشية وضحاها، و (ب) وصفت المواقع بعد هضم 2 ساعة مع chymotrypsin شلت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10 الآلية المفترضة للتدافع تسمية DEPC (التقاط Cys من carbethoxylated له) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الهامة
وينبغي النظر في عدة نقاط تتعلق بالتصميم التجريبي لضمان نتائج موثوقة لوضع العلامات. أولا، لتحقيق أقصى قدر من وضع العلامات البروتين، فمن الضروري تجنب المخازن المؤقتة مع مجموعات نوى بقوة (على سبيل المثال، تريس) لأنها يمكن أن تتفاعل مع DEPC وانخفاض مدى وضع العلامات. ومن المتصور أيضا أن هذه المخازن المؤقتة يمكن أن تتفاعل مع المخلفات المسماة، مما يؤدي إلى إزالة الملصق وبالتالي فقدان المعلومات الهيكلية. نوصي MOPS كمخزن مؤقت، ولكن الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة يعمل كذلك. ثانيا، ينبغي تجنب ثنائي ميثيل للحد من سندات كبريتيد لأن الثيول الحر في هذا الكاشف يمكن أن يتفاعل مع المخلفات المسماة وإزالة تعديل DEPC. هذه الكيمياء نفسها هو السبب في أنه من الضروري أن alkylate خفض كبريتيدات لأن سايس الحرة يمكن أن يسبب تسمية داخل البروتين الهرولة33. ثالثا، خطوة إخماد مع imidazole (البروتوكول الخطوة 2.4) أمر بالغ الأهمية لوقف رد فعل وضع العلامات حتى أي DEPC المتبقية غير قادر على الاستمرار في التفاعل مع البروتين.

من المهم أيضا أن نقدر أن رد فعل DEPC وضع العلامات هو 2الترتيب، وهذا يعني أن تغيير إما البروتين أو تركيز DEPC سيؤثر على مدى وضع العلامات. لقد وجدنا تجريبيا أن نسبة تركيز البروتين 4:1 DEPC هي قيمة معقولة عندما يكون للبروتين تركيز في 10 من نطاق μM ، لأنه يميل إلى تجنب أي تغييرات هيكلية ناجمة عن وضع العلامات14. ومع ذلك، فإن نسبة تركيز البروتين DEPC:الأمثل تعتمد على البروتين وكذلك تعتمد على التركيز، وبعض البروتينات تتطلب نسب أعلى لتحقيق وضع علامات كافية. ويمكن تقدير تركيز DEPC الأمثل لتقليل الاضطراب الهيكلي لوضع العلامات بروتين معين من عدد المذيبات التي يمكن الوصول إليها له ومخلفاتLys 23.

لتجنب التباين في مدى وضع العلامات بسبب تدهور الكاشف مع مرور الوقت ، يجب إجراء التحكم وردود الفعل التجريبية بشكل مثالي في نفس اليوم. يخضع DEPC للتحلل المائي السريع عند تعرضه للمياه وسيتحلل أثناء التخزين أيضا ، لذلك فإن الممارسة المختبرية الجيدة والمناولة الكاشفة هي المفتاح. عندما لا تكون قيد الاستخدام، يجب تخزين زجاجة مخزون DEPC في مجفف.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لأن DEPC CL هو رد فعل يتم التحكم فيه حركيا ، يتم التحكم في معدل وضع العلامات ، وبالتالي مستوى التعديل ، من خلال تركيزات البروتين والكواشف ، ووقت وضع العلامات ، ودرجة الحرارة. كما هو مبين أعلاه، غالبا ما يتم تنفيذ DEPC CL لمدة دقيقة واحدة في 37 درجة مئوية مع نسبة DEPC إلى البروتين الأضراس من 4 إلى 1. في هذه النسبة الضرس (4x) ، يمكن تسمية البروتينات بأمان دون الاضطرابات الهيكلية14. DEPC:يمكن استخدام نسب الضرس البروتين التي هي أكبر من 4 لبعض البروتينات، وليس من المستغرب تركيزات DEPC أعلى يؤدي إلى وضع العلامات على نطاق أوسع والمزيد من المعلومات الهيكلية. الطريقة الأكثر أمانا لاستخدام تركيزات أعلى DEPC دون هيكل اضطراب هو توليد المؤامرات الجرعة استجابة التي يتم قياس التفاعل من شظايا البروتين بروتيوليك كدالة لتركيز DEPC (انظر الشكل 4B)14،24. ومع ذلك، يمكن أن يستغرق هذا النهج وقتا طويلا، لأنه يتطلب قياسات متعددة. في الآونة الأخيرة، أظهرنا أن تركيز DEPC الأمثل يمكن أن يقدر لبروتين معين من عدد وSASA من بقايا له و ليس في هذا البروتين23. في العمل الأخير، اقترحنا أيضا طرقا بديلة لتقييم أن بنية البروتين لا تزعج خلال CL9،24.

الهضم البروتيوليكي هو أيضا خطوة هامة في DEPC CL-MS، حيث أن الببتيدات التي يتم إنشاؤها تسمح للمرء بترجمة المعلومات الهيكلية بعد تحليل LC-MS/MS. بشكل عام، بروتياز سيرين مثل تريبسين وchymotrypsin فعالة لهضم البروتين. يستخدم التريبسين بشكل أكثر شيوعا بسبب كفاءة الانقسام وخصوصية في الجانب C-المحطة الطرفية من مخلفات Lys و Arg. ومع ذلك، لا يشق التريبسين عادة بعد بقايا Lys المسماة DEPC، مما يسبب انشقاقا ضائعا في بقايا Lys المسماة التي يمكن أن تعقد تحليل البيانات في بعض الأحيان. نشاط chymotrypsin، الذي يشق بعد بقايا مسعور ضخمة، وعادة ما لا تتأثر وضع العلامات DEPC، ولكن هذا الإنزيم لديه أقل كفاءة الانقسام وخصوصية من التريبسين. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للبروتينات التي تحتوي على العديد من المخلفات الكارهة للماء ، يمكن أن يولد chymotrypsin العديد من شظايا الببتيد القصيرة التي يمكن أن تكون منفصلة وصعبة والكشف عنها في ظل ظروف LC-MS القياسية.

تتطلب تحليلات LC-ESI-MS/MS لهضم البروتين رشا كهربائيا مستقرا للحصول على نتائج شبه كوانتيفية موثوقة. تستخدم الشعيرات الدموية ونانو LC عادة منصات فصل حيث يمكن الحصول على فصل فعال مع كميات صغيرة من البروتين. ومع ذلك، من خلال تجربتنا، يوفر LC الشعرية معلومات كمية أكثر موثوقية (أي مستويات التعديل) من نانو LC بسبب كميات العينة الأعلى المستخدمة. بالنسبة للبروتينات الكبيرة التي يتم هضمها في عدد كبير من الببتيدات المسماة وغير المسماة ، قد يحدث coelution من الببتيدات ذات الرهاب المائي المماثل. في هذه الحالات، يجب استخدام تدرجات LC أطول لفصل أفضل.

سرعة وكفاءة MS / MS مهم لتغطية تسلسل جيدة وتحديد موقع التسمية. مطياف الكتلة مع الفخاخ أيون رباعية هي أدوات ممتازة لهذا الغرض. عموما، CID هو وسيلة شائعة وفعالة للغاية لابتهاد الببتيد. ومع ذلك ، لاحظنا حالات من تسمية DEPC تتدافع أثناء CID من أيونات الببتيد المسماة ، مما أدى إلى الغموض في وضع العلامات على هوية الموقع34. في هذه الحالات النادرة إلى حد ما، يوفر ETD معلومات أكثر موثوقية. وبالتالي، إذا كان ذلك ممكنا، بالتناوب بين كل من تقنيات الانفصال يمكن أن تكون مفيدة. لأن DEPC يمكن تسمية العديد من أنواع المخلفات المختلفة، فمن الشائع أن يتم إنشاء أيزومرات من جزء الببتيد معين التي تختلف في السلسلة الجانبية التي يتم تعديلها. في كثير من الأحيان ، يمكن فصل هذه الإيزومرات الببتيد عن طريق LC ، على الرغم من أنها تميل إلى التبلور في أوقات مشابهة جدا. وينبغي النظر في هذا الاحتمال عند تعيين أوقات استبعاد MS/MS أثناء التحليلات التلقائية LC-MS/MS. عادة، يجب استخدام أوقات استبعاد أقصر من المعتاد.

القيود
في حين أن DEPC CL-MS مفيد للغاية لدراسة بنية البروتين والتفاعلات ، وقد تم إحراز تقدم كبير لمعالجة مجموعة واسعة من أنظمة البروتين ، لا تزال هناك بعض القيود على هذه التقنية. إذا لم يتم تحسين ظروف وضع العلامات بشكل جيد (على سبيل المثال ، باستخدام تركيز عالي جدا من DEPC) ، فإن وضع العلامات على العلامات يمكن أن يؤدي إلى اضطراب بنية البروتين ويؤدي إلى معلومات هيكلية غير دقيقة14و23و24. وبالإضافة إلى ذلك، تتأثر دقة ودقة مستويات التعديل المقاسة بعدة عوامل، بما في ذلك فقدان التسمية إذا كانت العينات تجلس لفترة طويلة جدا قبل تحليل LC-MS والأخطاء في خطوات وضع العلامات الكيميائية. الاتساق في كل خطوة تجريبية مهم لتحقيق نتائج موثوقة. واحدة من أكثر القضايا الصعبة المرتبطة حاليا مع DEPC المستندة إلى CL-MS هو برنامج تحليل البيانات. برامج تحليل البيانات المتاحة بسهولة ليست الأمثل لتحديد الببتيدات بنجاح مع نسب تعديل منخفضة (على سبيل المثال، < 1٪). وبالتالي، قمنا بتطوير واستخدام برامج متخصصة لتمكين الببتيدات مع مستويات تعديل منخفضة ليتم تحديدها بسهولة18.

على الرغم من أن DEPC CL-MS يمكن أن توفر دقة هيكلية معتدلة للبروتين، لا يمكن الحصول على بنية ثلاثية الأبعاد مفصلة من تقنية وضع العلامات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير بعض أدوات التنبؤ الهيكلية على أساس بيانات وضع العلامات35،36. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التطورات لدمج نتائج وضع العلامات DEPC على النحو الأمثل مع النمذجة الحاسوبية للتنبؤ ببنية البروتين.

أهمية مقارنة بالطرق البديلة
الدقة الهيكلية الممكنة مع CL-MS المستندة إلى DEPC معتدلة بالمقارنة مع تقنيات مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية أو NMR ، لذلك من الأنسب مقارنة التقنية ب HDX-MS و XL-MS وغيرها من CL-MS ، أو تتبع المناهج. وكما ذكر في المقدمة، فإن CL-MS مكمل ل HDX-MS لأنه يوفر معلومات حول السلاسل الجانبية للمخلفات في البروتين، في حين أن تقارير HDX-MS عن البنية الأساسية والديناميكيات. هذا التكامل يسمح للتقنيات اثنين لاستخدامها معا للحصول على مزيد من المعلومات الهيكلية، كما تبين من قبل عدة مجموعات37،38،39،40،41. فكرة ناشئة ذات صلة DEPC المستندة إلى CL-MS هي المعلومات التآزرية التي تتوفر عند استخدامها بالاقتران مع HDX-MS22. بسبب الأطر الزمنية وضع العلامات المرتبطة بالتقنيات اثنين، DEPC المستندة CL-MS يمكن أن توضح في كثير من الأحيان الغموض مع مناطق البروتين التي تخضع لانخفاض HDX. انخفاض HDX يمكن أن تنشأ إما انخفاض إمكانية الوصول المذيبات بسبب ديناميات البروتين ملزمة أو انخفاض. ردود فعل DEPC بطبيعتها 2-3 أوامر من حجم أبطأ من ردود فعل HDX، لذلك لا يتأثر إلى حد كبير وضع العلامات DEPC من التغيرات في ديناميات البروتين طالما أنها ليست مصحوبة بتغييرات في إمكانية الوصول المذيبات.

CL-MS لديه بعض المزايا على تجارب HDX-MS في تلك التسمية الهرولة وفقدان التسمية هي الحد الأدنى عند اتخاذ الاحتياطات المناسبة. في تجارب HDX ، فقدان التسمية أو التبادل الخلفي هو سمة قياسية من هذه التقنية ، والهضم السريع وفصل LC عند درجة الحموضة المنخفضة هي محاولات لتقليل هذه المشكلة. من المهم أن ندرك، على الرغم من ذلك، أن مسألة تبادل الظهر يقابلها عدد أكبر من المواقع المسماة التي تقاس عادة في HDX-MS. الوسم scrambling مشكلة أكبر في HDX-MS لأنه سيتم الحصول على معلومات غير صحيحة ثم، لذلك يجب تحسين ظروف التحليل لتقليل هذا القلق.

XL-MS و CL-MS لديهما مزايا مماثلة فيما يتعلق بفقدان التسمية والهرولة ، حيث ينطوي كلاهما على تكوين رابطة تساهمية قوية بما يكفي للبقاء أثناء الهضم وتحليلات LC-MS. ومع ذلك، فإن تسلسل الببتيدات المرتبطة عبر الحدود وتحديدها أكثر تحديا من الببتيدات المسماة بشكل متناقض، مما يتطلب استخدام برامج متخصصة. إحدى المزايا الرئيسية التي يتمتع بها XL-MS على CL-MS هي قدرته على توفير قيود المسافة ، والتي يمكن أن تكون ذات قيمة عند التنبؤ بهياكل البروتين المحتملة أو تضييقها. وقد استخدمت بيانات CL-MS لتسهيل التنبؤ بنية البروتين36,42,43, ولكن هذا المجال يتطلب المزيد من العمل للوصول إلى إمكاناتها بشكل كامل.

عند مقارنة أساليب CL-MS الأخرى، بما في ذلك تلك التي تستخدم الكواشف وضع العلامات محددة أو غير محددة، DEPC لديه بعض المزايا والعيوب. مثل الطرق التي تستخدم الكواشف الأحماض الأمينية محددة, DEPC وضع العلامات واضحة; الكواشف يحتاج فقط إلى إضافته إلى عينة من الاهتمام. هذه البساطة يتناقض مع أساليب مثل أكسدة البروتينات (FPOP) أو الأكسدة الضوئية السريعة (FPOP) أو HRF المستندة إلى السنكروترون التي تتطلب مصادر ضوء متطورة لإنتاج الجذور الهيدروكسيل. على عكس الطرق التي تستخدم الكواشف المحددة، DEPC يمكن تسمية ستة الأحماض الأمينية المختلفة وN-terminus، مما يتيح لها توفير دقة هيكلية أعلى. ومع ذلك، فإن عدد المخلفات التي يمكن تصنيفها بواسطة DEPC أقل من العدد الذي يمكن أكسدتها بواسطة الجذور الهيدروكسيل، وبالتالي فإن الدقة الهيكلية التي يمكن الحصول عليها من قبل CL-MS المستندة إلى DEPC أقل. ومن التداعيات العملية لانخفاض المخلفات التي تصفها لجنة حماية النباتات أن استخدام الكاشف لا يوفر في بعض الأحيان جميع المعلومات الهيكلية المطلوبة، وبالتالي يمكن أن يستفيد من استخدامه بالاقتران مع الكواشف الأخرى التي تحمل العلامات. لقد أظهرنا مؤخرا قيمة استخدام DEPC جنبا إلى جنب مع زوج الكاشف 1-إيثيل-3-(3-dimethylaminopropyl)كاربوديميد (EDC)/الجليسين إيثيل الأثير (GEE)، والتي يمكن تسمية الغلوتامات وبقايا الأسبارتات19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بدعم المعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب منحة R01 GM075092. تم الحصول على مطياف الكتلة الحرارية Orbitrap فيوجن المستخدمة للحصول على بعض البيانات الموصوفة هنا بأموال من المنحة الوطنية للمعاهد الصحية S10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

الكيمياء، العدد 172، قياس الطيف الكتلي، وضع العلامات التساهمية، بنية النظام الأعلى للبروتين، مجمعات البروتين، مجمعات البروتين، ديتسيلبيروبونات، مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من المذيبات
وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter