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Chemistry

Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Die experimentellen Verfahren zur Durchführung einer diethylpyrocarbonat-basierten kovalenten Markierung mit massenspektrometrischem Nachweis werden beschrieben. Diethylpyrocarbonat wird einfach mit dem interessierenden Protein oder Proteinkomplex gemischt, was zur Modifikation von lösungsmittelzugänglichen Aminosäureresten führt. Die modifizierten Rückstände können nach proteolytischem Aufschluss und Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie identifiziert werden.

Abstract

Die Charakterisierung der Struktur höherer Ordnung eines Proteins ist für das Verständnis seiner Funktion unerlässlich. Die Massenspektrometrie (MS) hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für diesen Zweck entwickelt, insbesondere für Proteinsysteme, die mit herkömmlichen Methoden schwer zu untersuchen sind. Um die Struktur eines Proteins durch MS zu untersuchen, werden spezifische chemische Reaktionen in Lösung durchgeführt, die die Strukturinformationen eines Proteins in seine Masse kodieren. Ein besonders effektiver Ansatz ist die Verwendung von Reagenzien, die lösungsmittelzugängliche Aminosäure-Seitenketten kovalent modifizieren. Diese Reaktionen führen zu Massenzuwächsen, die in Kombination mit proteolytischem Aufschluss und Tandem-Massenspektrometrie mit Rückstandsauflösung lokalisiert werden können. Hier beschreiben wir die Protokolle, die mit der Verwendung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) als kovalentes Markierungsreagenz zusammen mit dem MS-Nachweis verbunden sind. DEPC ist ein hochelektrophiles Molekül, das in der Lage ist, bis zu 30% der Rückstände im durchschnittlichen Protein zu kennzeichnen und dadurch eine hervorragende strukturelle Auflösung zu bieten. DEPC wurde erfolgreich zusammen mit MS eingesetzt, um Strukturelle Informationen für kleine Single-Domain-Proteine wie β2-Mikroglobulin bis hin zu großen Multi-Domain-Proteinen wie monoklonalen Antikörpern zu erhalten.

Introduction

Proteine sind essentielle Biomoleküle in praktisch jedem physiologischen Prozess. Die Vielfalt der Funktionen, die Proteine erfüllen, ist aufgrund der Strukturen, die sie annehmen, und der Wechselwirkungen, die sie mit anderen Biomolekülen haben, möglich. Um die Proteinfunktion auf einer tieferen Ebene zu verstehen, werden biochemische und biophysikalische Werkzeuge benötigt, um diese wichtigen strukturellen Merkmale und Wechselwirkungen aufzuklären. Traditionell haben Röntgenkristallographie, kryogene Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) die gewünschten Details auf atomarer Ebene geliefert, um die Proteinstruktur aufzudecken. Zahlreiche Proteinsysteme können jedoch aufgrund eines schlechten Kristallisationsverhaltens, einer begrenzten Proteinverfügbarkeit, einer übermäßigen Probenheterogenität oder molekularer Gewichtsbeschränkungen nicht mit diesen Techniken abgefragt werden. Folglich sind neuere Analysemethoden entstanden, die diese Einschränkungen überwinden. Zu den aufkommenden Techniken, die Proteinstrukturinformationen liefern können, gehört die Massenspektrometrie.

Die Massenspektrometrie (MS) misst das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/ z) eines Moleküls, so dass Proteinstrukturinformationen höherer Ordnung erhalten werden müssen, indem die gewünschte Strukturinformation in die Masse des Proteins kodiert wird. Es wurden mehrere Ansätze zur Kodierung dieser Informationen entwickelt, darunter Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX)1,2,3,4, chemische Vernetzung (XL)5,6und kovalente Markierung (CL)7,8,9,10. In HDX werden Backbone-Amid-Wasserstoffe durch etwas massivere Deuteriume mit Raten ausgetauscht, die von der Lösungsmittelzugänglichkeit und dem H-Bindungsumfang abhängen. Das Ausmaß von HDX kann lokalisiert werden, indem das Protein schnell in Peptidfragmente verdaut wird, bevor diese Fragmente durch das Massenspektrometer getrennt und gemessen werden oder indem das Protein in einem Top-Down-Experiment dissoziiert wird. Die Bestimmung der Austauschrate liefert weitere Einblicke in die Proteindynamik. HDX hat sich trotz der Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Rückaustausch und der Notwendigkeit spezieller Geräte zur Maximierung der Reproduzierbarkeit als wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung der Proteinstruktur erwiesen. Bei XL-MS werden Proteine mit bifunktionellen Reagenzien umgesetzt, die kovalent benachbarte Rückstandsseitenketten innerhalb eines gegebenen Proteins oder zwischen zwei Proteinen verbinden. Auf diese Weise kann XL-MS Entfernungsbeschränkungen bereitstellen, die zur Charakterisierung der Proteinstruktur verwendet werden können. Die Regionen des Proteins, die vernetzt sind, können durch proteolytische Verdauung identifiziert werden, gefolgt von einer Flüssigkeitschromatographie (LC)-MS-Analyse. Während XL-MS ein vielseitiges Werkzeug ist, das zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinkomplexen, einschließlich innerer Zellen, verwendet wurde, ist die Identifizierung der XL-Produkte eine Herausforderung und erfordert spezielle Software.

CL-MS hat sich in letzter Zeit als komplementäres und manchmal alternatives MS-basiertes Werkzeug zur Untersuchung der Proteinstruktur und -interaktionen herausgestellt. Bei CL-MS wird ein Protein oder Proteinkomplex kovalent mit einem monofunktionellen Reagenz modifiziert, das mit lösungsmittelexponierten Seitenketten reagieren kann (Abbildung 1). Durch den Vergleich der Modifikationsausdehnungen eines Proteins oder Proteinkomplexes unter verschiedenen Bedingungen können Konformationsänderungen, Bindungsstellen und Protein-Protein-Grenzflächen aufgedeckt werden. Nach der CL-Reaktion können ortsspezifische Informationen, oft auf der Ebene einzelner Aminosäuren, mit typischen Bottom-up-Proteomik-Workflows gewonnen werden, bei denen Proteine proteolytisch verdaut, Peptidfragmente durch LC getrennt und modifizierte Stellen mit Tandem-MS (MS / MS) identifiziert werden. Die reiche Geschichte der Biokonjugatchemie hat zahlreiche Reagenzien für CL-MS-Experimente zur Verfügung gestellt. CL-Reagenzien lassen sich in zwei allgemeine Kategorien einteilen: (i) spezifisch und (ii) unspezifisch. Spezifische Reagenzien reagieren mit einer einzigen funktionellen Gruppe (z. B. freieAmine) 8,10 und sind einfach zu implementieren, liefern jedoch tendenziell nur begrenzte strukturelle Informationen. Unspezifische Reagenzien reagieren mit einer Vielzahl von Seitenketten, erfordern aber oft spezielle Geräte wie Laser oder Synchrotronquellen, um diese hochreaktiven Spezies herzustellen. Hydroxylradikale sind das am häufigsten verwendete unspezifische Reagenz, das in Hydroxyl radical footprinting (HRF)7, 11,12,13 Experimenten angewendetwurde,um eine breite Palette von Proteinen und Proteinkomplexen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen.

Unsere Forschungsgruppe hat erfolgreich ein weiteres relativ unspezifisches Reagenz namens Diethylpyrocarbonat (DEPC) verwendet, um die Proteinstruktur und -wechselwirkungen im Rahmen der CL-MS-Experimente14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25zuuntersuchen. DEPC bietet die Einfachheit spezifischer Markierungsreagenzien (d.h. es ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich, um die Reaktionen durchzuführen), während es mit bis zu 30% Aminosäuren im durchschnittlichen Protein reagiert. Als hochelektrophiles Reagenz ist DEPC in der Lage, mit dem N-Terminus und den nukleophilen Seitenketten von Cystein-, Histidin-, Lysin-, Tyrosin-, Serin- und Threoninresten zu reagieren. Typischerweise wird ein einzelnes Produkt dieser Reaktionen erzeugt, was zu einer Massenzunahme von 72,02 Da führt. Diese einzelne Art von Produkt steht im Gegensatz zu den bis zu 55 verschiedenen Produkten, die hergestellt werden können, wenn Proteine mit Hydroxylradikalen reagieren7. Eine solche einfache Chemie erleichtert die Identifizierung von markierten Stellen.

Hier stellen wir Protokolle für die Verwendung von DEPC-basiertem CL-MS zur Verfügung, um Proteinstruktur und -interaktionen zu untersuchen. Details im Zusammenhang mit der Reagenzienvorbereitung, DEPC-Proteinreaktionen, Proteinverdauungsbedingungen, LC-MS- und MS / MS-Parametern und Datenanalyse werden beschrieben. Wir demonstrieren auch den Nutzen der DEPC-Markierung, indem wir Beispielergebnisse aus Protein-Metall-, Protein-Liganden- und Protein-Protein-Interaktionen sowie Protein-Protein-Interaktionen liefern, die beim Erhitzen strukturelle Veränderungen erfahren.

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Protocol

1. Protein- und Reagenzienzubereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält einen Beispiel-Workflow für die Kennzeichnung eines Proteins mit DEPC. Einige der aufgeführten Bedingungen und Reagenzkonzentrationen können je nach Protein der Wahl variieren.

  1. Bereiten Sie alle Reagenzlösungen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
  2. Bereiten Sie eine Proteinlösung der gewünschten Konzentration, normalerweise im Bereich von zehn μM, in einem 10 mM 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS) Puffer bei pH 7,4 vor. Alternativ können Sie eine vorhandene Proteinlösung mit Pufferaustausch in 10 mM pH 7,4 MOPS vorbereiten, wenn die Probe einen nukleophilen Puffer enthält, der mit DEPC reaktiv wäre. Andere Puffer (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung) können ebenfalls verwendet werden, sofern sie keine nukleophilen funktionellen Gruppen aufweisen.
  3. Bereiten Sie eine 100 mM DEPC-Lösung in trockenem Acetonitril (ACN) vor, indem Sie 1,45 μL der 6,9 M DEPC-Stammlösung in 98,55 μL des ACN pipettieren.
    HINWEIS: Es gibt nicht den einen Satz von Konzentrationen, die mit jedem Protein funktionieren, obwohl die optimalen Konzentrationen basierend auf der Anzahl der His- und Lys-Rückstände geschätzt werden können23. Beispielsweise reagiert das Protein mit 50 μL einer 50 μM β2-Mikroglobulinlösung mit 0,2 μL des 100 mM DEPC für eine endgültige DEPC-Konzentration von 200 μM (entspricht dem 4-fachen der Proteinkonzentration), um das gewünschte molare Verhältnis anhand dieses allgemeinen Beispiels zu gewährleisten (Tabelle 1). Die DEPC-Markierung ist eine Reaktion2. Ordnung, so dass die Änderung der Proteinkonzentration oder der DEPC-Konzentration im Reaktionsgemisch die Markierungsrate ändert.
  4. 1 M Imidazollösung durch Wiegen von 10 mg Imidazol und Auflösen in 146,9 μL HPLC-Wasser vorbereiten.

2. Kovalente Markierung intakten Proteins

  1. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 37 °C ein und warten Sie, bis das Bad eine stabile Temperatur erreicht hat.
    HINWEIS: Reagenzkonzentrationen und -volumina für ein Beispiel-Kennzeichnungsprotokoll finden Sie in Tabelle 1.
  2. Mischen Sie in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen MOPS-Puffer und Proteinlösung in den in Tabelle 1aufgeführten Volumina .
  3. Zum Protein und Puffer werden 0,2 μL der DEPC-Lösung hinzugefügt, wobei Sie sicherstellen, dass die resultierende Lösung richtig gemischt wird, und legen Sie dann das Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch für 1 Minute in das 37 ° C-Wasserbad.
    HINWEIS: Das zugesetzte ACN-Volumen sollte 1% des gesamten Reaktionsvolumens nicht überschreiten, um eine Störung der Proteinstruktur während der Markierungsreaktion zu vermeiden. Die Reaktionszeit liegt beim Anwender, obwohl eine 1-minütige Reaktion unter den Beispielbedingungen die Überetikettierung und die potenzielle Hydrolyse von DEPC14minimiert.
  4. Nach 1 Minute das Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch aus dem Wasserbad entfernen und die Reaktion mit 1 μL der 1 M Imidazollösung abschrecken, um den verbleibenden nicht umgesetzten DEPC aufzufangen.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von Imidazol im Reaktionsgemisch sollte dem 50-fachen der DEPC-Konzentration im Reaktionsgemisch entsprechen. Dadurch wird sichergestellt, dass verbleibende nicht umgesetzte DEPC abgesplündert wird.

3. Herstellung von Protein digest für Bottom-up LC-MS

HINWEIS: Wählen Sie Verdauungsbedingungen, die für das interessierende Protein bereit sind. Übliche Schritte beinhalten die Entfaltung des Proteins und die Reduzierung und Alkylierung von Disulfidbindungen.

  1. Entfalten Sie das Protein, indem Sie dem Reaktionsgemisch ein geeignetes Entfaltungsreagenz hinzufügen.
    HINWEIS: Häufige Entfaltungsmittel sind ACN, Harnstoff und Guanidinhydrochlorid (GuHCl).
  2. Herstellung von Lösungen von Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) und Jodoacetamid (IAM), indem jeweils 5 mg wiegen und in neuen Mikrozentrifugenröhrchen in 174,4 und 270,3 μL mit 10 mM pH 7,4 MOPS Puffer für die Reduktions- und Alkylierungsschritte gelöst werden.
  3. Reduzieren Sie die Disulfidbindungen, indem Sie 2 μL der 100 mM TCEP-Lösung (Endkonzentration von 2 mM in Reaktionsgemisch) in das Reaktionsgemisch geben und 3 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von TCEP sollte dem 40-fachen der Proteinkonzentration pro Disulfidbindung entsprechen, die in der Lösung vorhanden ist.
  4. Alkylat reduzierte Cysteine mit 4 μL der 100 mM IAM-Lösung (Endkonzentration von 4 mM in Reaktionsgemisch) für 30 Minuten im Dunkeln. IAM ist lichtempfindlich und zersetzt sich unter direktem Licht.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von IAM in Lösung sollte doppelt so hoch sein wie die für TCEP verwendete Konzentration oder das 80-fache der Proteinkonzentration pro Disulfidbindung.
  5. Verdauen Sie das Protein mit einem geeigneten Enzym wie Trypsin oder Chymotrypsin. Ein Protein:Enzym-Verhältnis von 10:1 für eine 3-stündige Verdauung bei 37 °C mit immobilisiertem Enzym bei einer Schüttelrate von 300 Hüben/min ist typischerweise ausreichend für DEPC-markierte Proteine. Siehe Diskussion.
  6. Trennen Sie nach der Verdauung das immobilisierte Enzym von den verdauten Peptiden durch Zentrifugation bei 12.000 U / min für 5 Minuten.
  7. Analysieren Sie die Probe sofort per LC-MS/MS oder frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um den Probenabbau und den Markierungsverlust zu minimieren. Lagern Sie die tiefgefrorenen Proben bei < -20 °C, bis sie für die LC-MS/MS-Analyse bereit sind.

4. LC-MS/MS Analyse

HINWEIS: Standard-LC-MS/MS-Parameter für die Bottom-up-Proteomik können verwendet werden, um markierte Stellen auf den proteolytischen Peptidfragmenten zu identifizieren. Im Folgenden finden Sie ein allgemeines Beispiel.

  1. Trennen Sie die DEPC-markierten Peptide mit einer stationären C18-Phase in umgekehrter Phase. Verwenden Sie eine typische mobile LC-Phase von zwei Lösungsmitteln: (A) Wasser + 0,1% Ameisensäure und (B) ACN + 0,1% Ameisensäure unter Verwendung eines Gradienten (z. B. Abbildung 2),um die beste Trennung von Peptiden zu erreichen.
    HINWEIS: Die Trennzeit kann basierend auf der Probenkomplexität optimiert werden, und die mobile Phasendurchflussrate hängt davon ab, ob Kapillar- oder Nano-LC verwendet wird.
  2. Verwenden Sie ein Massenspektrometer, das in der Lage ist, Online-LC-MS und MS / MS zu tun, um DEPC-Modifikationsstellen auf dem Peptid zu identifizieren. In unseren Experimenten haben wir erfolgreich verschiedene Arten von Massenspektrometern eingesetzt. Jedes Massenspektrometer, das in der Lage ist, ms/MS vieler Peptide im Verlauf einer LC-MS-Analyse automatisch durchzuführen, sollte geeignet sein. Relevante MS-Parameter sind: ESI-Quellspannung = -4000 V für reguläre ESI; -2000 V für Nanospray; Orbitrap-Auflösung = 60.000; Dynamische Ausschlussdauer = 30 s; MS/MS-Aktivierungstyp: CID, ETD oder beides; Massenscanbereich = 200-2.000; Automatic Gain Control = 4.0E5 (MS1 in Orbitrap) und 5.0E4 (MS2 in linearer Quadrupol-Ionenfalle).
  3. Laden und injizieren Sie die verdaute, markierte Proteinprobe in das LC-System und starten Sie die LC-MS/MS-Erfassung. Wenn die Probe blitzgefroren wurde, vor der Analyse auftauen. Leiten Sie das LC-Abwasser für die ersten 5 Minuten in den Abfall um, um zu vermeiden, dass übermäßige Salze in die ESI-Quelle gelangen.
    HINWEIS: Im Allgemeinen wird eine 5-μL-Injektionsschleife verwendet, die die Injektion von etwa 2,5 μg Protein in die LC-MS/MS ermöglicht. Dies ist abhängig von den Belastungsbedingungen des LC, um den Probeninjektor nicht zu verstopfen.

5. Datenanalyse

  1. Identifizieren Sie DEPC-Markierungsstellen und quantifizieren Sie Peptidspitzenbereiche mit geeigneter Software für das verwendete Massenspektrometer.
  2. DePC-Addition (72,02 Da) und Carbamidomethylierung (57,02 Da) als variable Modifikationen einschließen. Weitere Suchparameter für die MS/MS-Analyse sind wie folgt: Maximale verpasste Spaltungen = 3; Fragmentionentypen = b und y; Vorläufer-m/z-Toleranz = 10 ppm (dieser Wert sollte höher sein, wenn ein Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer verwendet wird); Fragment-m/z-Toleranz = 0,5 Da (dieser Wert sollte niedriger sein, wenn ein hochauflösendes Massenspektrometer für einen Produktionenscan verwendet wird); Vorläuferladung = 1-4.
    HINWEIS: Verschiedene Datenbanksuchalgorithmen haben unterschiedliche Bewertungssysteme, und viele können Schwierigkeiten haben, DEPC-modifizierte Peptide zu identifizieren, da die Modifikationsstufen niedrig sein können. Eine Anpassung des Score-Cutoffs kann erforderlich sein, um mehr markierte Peptide zu identifizieren. Wenn ja, sollte die manuelle Abfrage der MS/MS-Daten verwendet werden, um Peptide mit niedriger Punktzahl zu überprüfen. Das Produkt der Hydrolyse des DEPC-Labels wird nicht in die Datensuche einbezogen, da das hydrolysierte DEPC nicht mehr auf nukleophile Seitenketten reaktiv ist.
  3. Bestimmen Sie die Prozentsätze der Modifikation auf Rückstandsebene unter Verwendung der chromatographischen Spitzenbereiche der modifizierten und unveränderten Versionen der Peptide.
    HINWEIS: Jedes Peptid, das den modifizierten Rückstand von Interesse enthält, muss berücksichtigt werden und alle enthaltenen Ladungszustände müssen in allen gemessenen Proben vorhanden sein. Peptide mit unterschiedlichen Ionisationswirkungsgraden und Eluierungen zu unterschiedlichen Zeiten führen dazu, dass dieser Wert ein relatives und kein absolutes Maß für die Modifikation einer bestimmten Stelle ist.
    Equation 1
    wobei Ai,z die Spitzenfläche eines bestimmten Peptids (i) darstellt, das den interessierende Rückstand enthält und alle nachgewiesenen Ladungszustände berücksichtigt (z).
  4. Bestimmen Sie, ob eine Markierungsänderung zwischen einer Kontroll- und einer Versuchsprobe signifikant ist, indem Sie statistische Auswertungen verwenden. Drei Replikatmessungen für jede Probe sind typisch, und t-Tests werden am häufigsten mit 95- oder 99%-Konfidenzintervallen verwendet.

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Representative Results

Identifizieren von DEPC-Änderungsstandorten und Änderungsprozentsätzen
Die Massenzugabe aufgrund kovalenter Markierung kann an den (a) intakten Protein- und (b) Peptidspiegeln8,9gemessen werden. Auf intakter Ebene kann eine Verteilung von Proteinspezies mit unterschiedlicher Anzahl von Markierungen durch direkte Analyse oder LC-MS von markierten Proteinproben erhalten werden. Um strukturell höher aufgelöste Informationen (d.h. ortsspezifische Markierungsdaten) zu erhalten, müssen Messungen auf Peptidebene durchgeführt werden. Nach den Markierungs- und Abschreckschritten werden die markierten Proteine einer Bottom-up-Proteomanalyse unterzogen (d.h. Disulfidreduktion, Alkylierung, proteolytische Verdauung und LC-MS/MS). Abbildung 3 zeigt, wie die DEPC-markierten Stellen identifiziert und ihre Modifikationsgrade für ein DEPC CL-MS-Experiment am Protein β-2-Mikroglobulin (β2m)21berechnet werden. MS/MS wird verwendet, um die markierten Peptide zu sequenzieren und ihre DEPC-markierten Stellen zu lokalisieren, während Modifikationsprozentsätze aus ihren relativen Spitzenbereichen in extrahierten Ionenchromatogrammen berechnet werden (siehe Abbildung 3A).

Proteinoberflächen-Mapping mit DEPC CL-MS
Aufgrund der Beziehung zwischen Proteintopologie und Markierungsrate wurde DEPC verwendet, um Veränderungen in der Proteinstruktur höherer Ordnung (HOS) zu untersuchen und Proteininteraktionsstellen8,9zuidentifizieren. Ein Beispiel ist die Wirkung der Cu(II)-Bindung auf die Struktur von β2m. DEPC-Modifikationsratenkoeffizienten von Peptidfragmenten aus ungebundenen β2m- und Cu(II)-gebundenen β2m (b2m-Cu) können gemessen werden (Tabelle 2) durch Variation der DEPC-Konzentrationen und Erzeugung kinetischer Diagramme zweiter Ordnung14,24. Die DEPC-Reaktivität von Rückständen in β2m-Cu zeigt signifikante Änderungen der Markierungsrate für His31, Ser33 und Thr4, während andere Stellen, einschließlich verschiedener His-Rückstände, statistisch unverändert sind. Diese Daten stimmen mit der Tatsache überein, dass His31, aber nicht andere Seine Rückstände in β2m, Cu binden und strukturelle Veränderungen in der Nähe von His31 (dh Ser33) und in der Nähe des N-Terminus (dh Thr4) verursachen (Abbildung 4)14,26,27.

DEPC CL-MS zur Identifizierung von HoS-Veränderungen
Die DEPC-Markierung mit MS-Nachweis ist auch ein wertvolles Werkzeug zur Charakterisierung von HOS-Veränderungen an Proteinen, was wichtige Auswirkungen auf Proteintherapeutika hat, die derzeit das am schnellsten wachsende Segment des Pharmamarktes sind28. DEPC CL kann spezifische Proteinregionen identifizieren, die bei thermischem und oxidativem Stress strukturelle Veränderungen erfahren18. Nachdem β2m Hitzestress ausgesetzt ist, gruppieren sich viele Rückstände, die eine signifikante Abnahme der Markierungsausdehnungen erfahren (N-Terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58), auf einer Seite des Proteins, was darauf hindeutet, dass diese Region des Proteins eine Konformationsänderung erfährt oder möglicherweise eine Aggregation vermittelt(Abbildung 5A). Zusätzlich zu diesen Rückständen bilden nach der Exposition des Proteins gegenüber oxidativem Stress andere Rückstände mit einer Abnahme der Markierung (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) einen Cluster auf einer anderen Seite des Proteins, was darauf hinweist, dass die oxidationsinduzierten Konformationsänderungen an anderer Stelle auftreten (Abbildung 5B). Andere Arbeiten aus unserer Gruppe haben auch gezeigt, dass DEPC CL-MS Stellen von Konformationsänderungen in hitzebelasteten monoklonalen Antikörpertherapeutika erkennen und identifizieren kann20.

DEPC CL-MS zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen
Einblicke in Protein-Protein-Interaktionsstellen und Aggregationsschnittstellen für amyloidbildende Proteine können auch durch DEPC-Markierung gewonnen werden9. Eine Abnahme der Modifikationsgrade von Rückständen bei oligomerer Bildung kann die Bindungsschnittstellen aufdecken. DEPC CL-MS wurde verwendet, um die Prä-Amyloid-Oligomere von β2m, dem Protein, das Amyloide bei dialysebedingter Amyloidosebildet, 29zu charakterisieren, nachdem die Amyloidbildung mit Cu(II)15,16,26eingeleitet wurde . Ein Vergleich der DEPC-Reaktivität des β2m-Monomers mit dem Prä-Amyloid-β2m-Dimer, das 2 h nach Zugabe von Cu(II) gebildet wird, zeigt, dass neun Rückstände eine Abnahme der Markierung erfahren, während sechs Rückstände keine Veränderung oder leichte Erhöhung der Markierung erfahren (Abbildung 6A). Bei der Abbildung dieser Veränderungen auf dem β2m ist sofort ersichtlich, dass die Dimerschnittstelle die ABED-β-Sheets von β2m-Monomeren beinhaltet (Abbildung 6B)15.

DEPC CL-MS zur Untersuchung der Protein-Liganden-Bindung
Die Bindung von Liganden an Proteine führt zu einer Abnahme der Lösungsmittelzugänglichkeit von Rückständen, die mit dem Liganden interagieren, und DEPC-basierte CL-MS kann verwendet werden, um Ligandenbindungsstellen auf Proteinen zu identifizieren. Beispielsweise können die Bindungsstellen von Epigallocatechin-3-gallat (EGCG) auf β2m unter amyloidbildenden Bedingungen durch signifikante Abnahmen der DEPC-Markierung an den durch EGCG-Bindung vergrabenen Rückständen identifiziert werden. In Gegenwart von ECGC haben Lys6 und Lys91 niedrigere DEPC-Modifikationsprozentsätze (Abbildung 7), und diese Rückstände sind in einem Bereich des Proteins gruppiert, was auf einen Rückstandsschutz aufgrund der Ligandenbindung hinweist. Der N-Terminus, Thr4 und His31 unterliegen unterdessen einer Zunahme der Markierungsausdehnungen (Abbildung 7), die auf ECGC-induzierte strukturelle Veränderungen hinweisen und darauf hindeuten, dass die Cu(II)-Bindungsstellen auf β2m (N-Terminus und His31)14,30,31 infolge der ECGC-Bindung32gestört sein können. Darüber hinaus wurden die Bindungsstellen der beiden anderen niedermolekularen Inhibitoren der β2m-Amyloidbildung, Rifamycin SV und Doxycyclin, mit CL-MS19identifiziert. In dieser Studie reichten die Ergebnisse der DEPC-Kennzeichnung allein jedoch nicht aus, um die Bindungsstellen mit ausreichender struktureller Auflösung abzubilden. Ergebnisse von drei verschiedenen CL-Reagenzien, nämlich DEPC, BD und 1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimid-Glycinethylester (EDC/GEE) Paar waren notwendig, um die Bindungsstellen besser zu lokalisieren19.

Verbesserung der strukturellen Auflösung und Reduzierung des Etikettenverklemmens
Obwohl die DEPC-Markierung die Bildung einer kovalenten Bindung verursacht, kann es insbesondere bei Ser-, Thr- und Tyr-Rückständen zu einem Markierungsverlust durch Hydrolyse kommen (Abbildung 8). Der Etikettenverlust kann minimiert werden, indem die Zeit zwischen der DEPC-CL-Reaktion und der LC-MS-Analyse mit kurzen proteolytischen Aufschlüssen (z. B. 2-Stunden-Verdauung mit immobilisierten Enzymen) anstelle von Übernachtvergärungen verringert wird. Schnelle Verdauungen führen dazu, dass modifiziertere Rückstände gemessen werden, wodurch die Menge an Proteinstrukturinformationen erhöht wird. Beispielsweise führt ein 2 h Aufschluss mit immobilisiertem Chymotrypsin durchweg zur Identifizierung weiterer DEPC-modifizierter Rückstände in β2m (Abbildung 9)17. Bei einer Verdauung über Nacht werden etwa 75% der Ser-, Thr-, Tyr-, His- und Lys-Rückstände in β2m nachgewiesen, aber wenn die Zeit zwischen Markierung und LC-MS durch eine 2-h-Verdauung reduziert wird, werden 95% dieser Rückstände in β2m nachgewiesen. Die meisten der neu entdeckten modifizierten Rückstände sind Tyr- und Thr-Rückstände, die zur Hydrolyse neigen.

Im Laufe unserer Arbeit mit DEPC haben wir festgestellt, dass in einigen Proteinen Cys-Rückstände aus Disulfidbindungen durch DEPC modifiziert werden, obwohl die Disulfidbindungen während der DEPC-Markierungsreaktionen intakt sind. Eine solche Markierung von Cys-Rückständen erfolgt, weil freie Thiole mit anderen modifizierten Rückständen in Lösung reagieren können (Abbildung 10), was zu einem sogenannten "Label Scrambling" führt, da die Carbethoxygruppe auf den Cys-Rückstand übertragen wird. Label Scrambling verringert die Modifikationsstufen an anderen Rückständen und liefert falsche Proteinstrukturinformationen. Um ein Verkleinern der Markierung zu vermeiden, müssen die freien Cys-Thiole direkt nach der Disulfidreduktion vollständig alkyliert werden33.

Figure 1
Abbildung 1: Kovalente Markierungs-Massenspektrometrie (CL-MS). Ein monofunktionales Reagenz wird verwendet, um lösungsmittelzugängliche Aminosäuren zu modifizieren und kann verwendet werden, um ortsspezifische Informationen über Konformationsänderungen oder Interaktionsschnittstellen in Proteinen bereitzustellen (Bild oben vs. unten). Das modifizierte Protein wird proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden mittels Flüssigkeitschromatographie (LC) in Verbindung mit MS und Tandem-MS (MS/MS) analysiert. Die Abbildung wurde von Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Study Protein Structure and Interactions adaptiert. Methoden 144, 79-93 (2018). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Verwendetes Volumen (μL) Konzentration in Lösung (μM)
Eiweiß (100 μM, MOPS) 50 50
MOPS (10 mM, pH 7,4) 48.8 n/a
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[Protein])
Imidazol (1 M) 1 10.000 (=50x[DEPC])
Gesamtvolumen 100

Tabelle 1. Allgemeines DEPC-Kennzeichnungsprotokoll.

Figure 2
Abbildung 2. Beispiel LC-Gradient zur Trennung von Peptiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 Illustration, wie DEPC-gekennzeichnete Standorte identifiziert und deren Änderungsgrad berechnet werden. Nach der DEPC-Markierung und der proteolytischen Verdauung wird eine (A) LC-MS-Analyse des verdauten Proteins durchgeführt. Peak-Bereiche von (B) unmarkierten und (C) markierten Peptiden in einem Chromatogramm werden verwendet, um den Markierungsprozentsatz zu berechnen. Während lc-MS werden Peptide CID MS/MS unterzogen. Tandem-Massenspektren von (D) unmarkierten und (E) & (F) markierten Peptiden, die zu bestimmten Retentionszeiten erhalten wurden, werden für die Peptidsequenzierung und Identifizierung von DEPC-markierten Stellen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Rückstand b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
Seine13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
His31 0,010 ± 0,001 0,003 ± 0,001
Ser33 0,010 ± 0,002 0,004 ± 0,001
His51 0,036 ± 0,003 0,030 ± 0,004
Ser88 0,029 ± 0,007 0,020 ± 0,006

Tabelle 2 Standortspezifische DEPC-Änderungsratenkoeffizienten (k, M-1s-1) für b2m in Abwesenheit und Anwesenheit von Cu(II).

Figure 4
Abbildung 4 Verwendung von DEPC CL-MS zur Bestimmung der Wirkung der Cu(II)-Bindung auf die Struktur von β2m: (A) Proteinoberflächenkartierung der Rückstände mit signifikanter Abnahme der DEPC-Markierungsraten (blau), die Änderungen ihrer Lösungsmittelzugänglichkeit auf cu(II)-Bindung anzeigen, und solche ohne signifikante Änderungen der Markierungsrate (Magenta) (PDB-Beitrittscode 1JNJ). (B) Beispiel ortsspezifische kinetische Diagramme zweiter Ordnung der Reaktion von β2m mit unterschiedlichen KONZENTRATIONEN von DEPC in Gegenwart und Abwesenheit von Cu(II). Der Beschriftungsratenkoeffizient (k) kann aus der Steigung des kinetischen Diagramms ermittelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 Kovalente Markierungsergebnisse für gestresst vs. native β2m: (A) Hitzestress - Erwärmung bei 75 °C für 24 h und (B) oxidativer Stress - mit 3%H2O2für 24 h. Signifikante Veränderungen der Änderungsprozentsätze werden in Blau (Abnahme der Kennzeichnung) und Rot (Zunahme der Kennzeichnung) angezeigt, während Rückstände ohne signifikante Kennzeichnungsänderungen in hellgrün (PDB-Beitrittscode 1JNJ) dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6 Verwendung von DEPC CL-MS zur Bestimmung der Dimerschnittstelle für das Prä-Amyloid-Dimer von β2m: (A) Zusammenfassung der Änderungen des DEPC-Modifikationsniveaus für modifizierte Rückstände im Monomer (d. h. t = 0) und Dimer 2 h nach Zugabe von Cu(II). Rückstände mit signifikanter Abnahme der Markierungsausdehnung werden mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. (B) Kovalente Markierungsergebnisse, die auf die β2m-Struktur abgebildet sind. Rückstände mit verminderter Kennzeichnung sind blau und Rückstände ohne Änderungen oder geringfügige Erhöhungen der Kennzeichnung rot (PDB-Beitrittscode 1LDS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7 Kovalente Markierungsergebnisse für EGCG-gebunden vs. ungebunden b2m. Für die angezeigten Rückstände werden die DEPC-Modifikationsprozentsätze angezeigt. Statistisch signifikante Unterschiede im kovalenten Markierungsprozentsatz werden durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet. Erhöhungen der Beschriftung bei ECGC-Bindung werden rot angezeigt, während Abnahmen blau dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8 DEPC kovalente Markierungsreaktionen (nukleophile Acylsubstitution) und Markierungsverlust (Hydrolyse von carbethoxylierten Rückständen) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9 Kartierung der gemessenen Modifikationsstellen auf β2m. (A) Markierte Stellen nach konventioneller Übernachtvergärung und (B) markierte Stellen nach einer 2- h-Verdauung mit immobilisiertem Chymotrypsin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10 Hypothesized mechanism of DEPC label scrambling (Cys capture of carbethoxylated His) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Kritische Schritte
Mehrere Punkte in Bezug auf das experimentelle Design sollten berücksichtigt werden, um zuverlässige Kennzeichnungsergebnisse zu gewährleisten. Erstens, um die Proteinmarkierung zu maximieren, ist es notwendig, Puffer mit stark nukleophilen Gruppen (z. B. Tris) zu vermeiden, da sie mit DEPC reagieren und das Ausmaß der Markierung verringern können. Es ist auch denkbar, dass solche Puffer mit markierten Rückständen reagieren könnten, was zur Entfernung des Etiketts und damit zum Verlust von Strukturinformationen führt. Wir empfehlen MOPS als Puffer, aber auch phosphatgepufferte Kochsalzlösung funktioniert. Zweitens sollte Dithiothreitol zur Verringerung der Disulfidbindungen vermieden werden, da die freien Thiole in diesem Reagenz mit markierten Rückständen reagieren und die DEPC-Modifikation entfernen können. Dieselbe Chemie ist der Grund, warum es wichtig ist, reduzierte Disulfide zu alkylieren, da freie Cys intraproteine Markierungsverknümmelung verursachen kann33. Drittens ist der Abschreckschritt mit Imidazol (Protokollschritt 2.4) entscheidend für das Stoppen der Markierungsreaktion, so dass ein verbleibender DEPC nicht mehr mit dem Protein reagieren kann.

Es ist auch wichtig zu verstehen, dass die DEPC-Markierungsreaktion2. Ordnung ist, was bedeutet, dass die Änderung der Protein- oder DEPC-Konzentration das Ausmaß der Markierung beeinflusst. Wir haben empirisch festgestellt, dass ein DEPC:Proteinkonzentrationsverhältnis von 4:1 ein vernünftiger Wert ist, wenn das Protein eine Konzentration im Bereich von 10 μM aufweist, da es dazu neigt, markierungsinduzierte strukturelle Veränderungen zu vermeiden14. Das optimale DEPC:Protein-Konzentrationsverhältnis ist jedoch sowohl proteinabhängig als auch konzentrationsabhängig, und einige Proteine benötigen höhere Verhältnisse, um eine ausreichende Markierung zu erreichen. Die optimale DEPC-Konzentration zur Minimierung der strukturellen Störung der Markierung eines bestimmten Proteins kann aus der Anzahl der verfügbaren Lösungsmittel His- und Lys-Rückstände23geschätzt werden.

Um Variabilitäten in den Markierungsausdehnungen aufgrund des Reagenzienabbaus im Laufe der Zeit zu vermeiden, sollten die Kontroll- und experimentellen Reaktionen idealerweise am selben Tag durchgeführt werden. DEPC wird einer schnellen Hydrolyse unterzogen, wenn es Wasser ausgesetzt wird, und wird auch während der Lagerung abgebaut, so dass eine gute Laborpraxis und der Umgang mit Reagenzien der Schlüssel sind. Bei Nichtgebrauch sollte die DEPC-Vorratsflasche in einem Absenkator aufbewahrt werden.

Änderungen und Fehlerbehebung
Da DEPC CL eine kinetisch gesteuerte Reaktion ist, wird die Markierungsrate und damit der Modifikationsgrad durch Protein- und Reagenzkonzentrationen, Markierungszeit und Temperatur gesteuert. Wie oben angegeben, wird DEPC CL oft für 1 Minute bei 37 °C mit einem DEPC-zu-Protein-Molarenverhältnis von 4 zu 1 durchgeführt. Bei diesem molaren Verhältnis (4x) können Proteine ohne strukturelle Störungen sicher markiert werden14. DEPC: Proteinmolarenverhältnisse, die größer als 4 sind, können für einige Proteine verwendet werden, und es überrascht nicht, dass höhere DEPC-Konzentrationen zu einer umfangreicheren Markierung und mehr strukturellen Informationen führen. Der sicherste Weg, höhere DEPC-Konzentrationen ohne störungsfreie Struktur zu verwenden, besteht darin, Dosis-Wirkungs-Diagramme zu erstellen, in denen die Reaktivität der proteolytischen Fragmente eines Proteins in Abhängigkeit von der DEPC-Konzentration gemessen wird (siehe Abbildung 4B)14,24. Dieser Ansatz kann jedoch zeitaufwändig sein, da mehrere Messungen erforderlich sind. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass die optimale DEPC-Konzentration für ein bestimmtes Protein aus der Anzahl und SASA von His- und Lys-Rückständen in diesem Protein23geschätzt werden kann. In neueren Arbeiten haben wir auch alternative Wege vorgeschlagen, um zu beurteilen, dass die Struktur eines Proteins während CL9,24nicht gestört wird.

Die proteolytische Verdauung ist auch ein wichtiger Schritt bei DEPC CL-MS, da die erzeugten Peptide es ermöglichen, Strukturelle Informationen nach der LC-MS / MS-Analyse zu lokalisieren. Im Allgemeinen sind Serinproteasen wie Trypsin und Chymotrypsin wirksam für die Proteinverdauung. Trypsin wird aufgrund seiner Spaltungseffizienz und Spezifität an der C-terminalen Seite von Lys- und Arg-Rückständen häufiger verwendet. Trypsin spaltet sich jedoch normalerweise nicht nach DEPC-markierten Lys-Rückständen, was zu einer verpassten Spaltung an markierten Lys-Rückständen führt, die die Datenanalyse manchmal erschweren kann. Die Aktivität von Chymotrypsin, das sich nach sperrigen hydrophoben Rückständen spaltet, wird typischerweise nicht durch die DEPC-Markierung beeinflusst, aber dieses Enzym hat eine geringere Spaltungseffizienz und -spezifität als Trypsin. Darüber hinaus kann Chymotrypsin für Proteine mit zahlreichen hydrophoben Rückständen mehrere kurze Peptidfragmente erzeugen, die unter Standard-LC-MS-Bedingungen schwer getrennt und nachgewiesen werden können.

LC-ESI-MS/MS-Analysen von Proteinverdauungen erfordern ein stabiles Elektrospray, um zuverlässige semiquantitative Ergebnisse zu erhalten. Kapillar- und Nano-LC sind häufig verwendete Trennplattformen, bei denen eine effiziente Trennung mit kleinen Mengen an Protein erreicht werden kann. Unserer Erfahrung nach liefert Kapillar-LC jedoch zuverlässigere quantitative Informationen (d. H. Modifikationsniveaus) als Nano-LC aufgrund der höheren Probenmengen, die verwendet werden. Bei großen Proteinen, die zu einer großen Anzahl von markierten und unmarkierten Peptiden verdaut werden, kann es zu einer Coelution von Peptiden mit ähnlicher Hydrophobie kommen. In diesen Fällen sollten längere LC-Gradienten für bessere Trennungen verwendet werden.

Schnelle und effiziente MS/MS ist wichtig für eine gute Sequenzabdeckung und Identifizierung der Etikettenstelle. Massenspektrometer mit Quadrupol-Ionenfallen sind hierfür hervorragende Instrumente. Im Allgemeinen ist CID eine gängige und hochwirksame Methode zur Peptiddissoziation; Wir haben jedoch Fälle von DEPC-Markierungsverwirrn während der CID von markierten Peptidionen beobachtet, was zu Mehrdeutigkeiten bei der Identität der Markierungsstelleführte 34. In diesen etwas seltenen Fällen liefert ETD Informationen, die zuverlässiger sind. Folglich kann, wenn möglich, ein Wechsel zwischen beiden Dissoziationstechniken hilfreich sein. Da DEPC viele verschiedene Rückstandstypen kennzeichnen kann, ist es üblich, dass Isomere eines bestimmten Peptidfragments erzeugt werden, die sich in der modifizierten Seitenkette unterscheiden. Oft können diese Peptidisomere durch LC getrennt werden, obwohl sie dazu neigen, zu sehr ähnlichen Zeiten zu eluieren. Diese Wahrscheinlichkeit sollte bei der Einstellung der MS/MS-Ausschlusszeiten während automatisierter LC-MS/MS-Analysen berücksichtigt werden. In der Regel sollten kürzere Ausschlusszeiten als üblich verwendet werden.

Begrenzungen
Während DEPC CL-MS für die Untersuchung der Proteinstruktur und -interaktionen enorm vorteilhaft ist und erhebliche Fortschritte bei der Bewältigung einer Vielzahl von Proteinsystemen erzielt wurden, bleiben einige Einschränkungen dieser Technik bestehen. Wenn die Markierungsbedingungen nicht gut optimiert sind (z. B. bei verwendung einer zu hohen DEPC-Konzentration), kann eine Übermarkierung die Proteinstruktur beeinträchtigen und zu ungenauen Strukturinformationen führen14,23,24. Darüber hinaus wird die Genauigkeit und Präzision der gemessenen Modifikationsgrade durch mehrere Faktoren beeinflusst, darunter Etikettenverlust, wenn Proben zu lange vor der LC-MS-Analyse sitzen, und Fehler bei den chemischen Markierungsschritten. Konsistenz in jedem experimentellen Schritt ist wichtig für zuverlässige Ergebnisse. Eines der schwierigeren Probleme, die derzeit mit DEPC-basiertem CL-MS verbunden sind, ist Datenanalysesoftware. Leicht verfügbare Datenanalyseprogramme sind nicht darauf optimiert, Peptide mit geringen Modifikationsprozentsätzen (z. B. < 1%) erfolgreich zu identifizieren. Folglich haben wir eine spezielle Software entwickelt und verwendet, um Peptide mit geringen Modifikationsgraden leicht identifizieren zu können18.

Obwohl DEPC CL-MS eine moderate Proteinstrukturauflösung bieten kann, kann aus der Markierungstechnik keine detaillierte 3D-Struktur erhalten werden. In jüngster Zeit wurden einige strukturelle Vorhersagewerkzeuge entwickelt, die auf Kennzeichnungsdaten basieren35,36. Es sind jedoch weitere Entwicklungen erforderlich, um die DEPC-Markierungsergebnisse optimal in die computergestützte Modellierung zur Vorhersage der Proteinstruktur einzubeziehen.

Signifikanz im Vergleich zu alternativen Methoden
Die strukturelle Auflösung, die mit DEPC-basiertem CL-MS möglich ist, ist im Vergleich zu Techniken wie Röntgenkristallographie oder NMR moderat, daher ist es am besten geeignet, die Technik mit HDX-MS, XL-MS und anderen CL-MS- oder Footprinting-Ansätzen zu vergleichen. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ist CL-MS komplementär zu HDX-MS, da es Informationen über die Seitenketten von Rückständen in einem Protein liefert, während HDX-MS über Die Struktur und Dynamik des Rückgrats berichtet. Diese Komplementarität ermöglicht es, die beiden Techniken zusammen zu verwenden, um mehr strukturelle Informationen zu erhalten, wie mehrere Gruppen37,38,39,40,41gezeigt haben . Eine aufkommende Idee, die für DEPC-basierte CL-MS relevant ist, sind die synergistischen Informationen, die verfügbar sind, wenn sie in Verbindung mit HDX-MS22verwendet werden. Aufgrund der Mit den beiden Techniken verbundenen Markierungszeiträume kann DEPC-basierte CL-MS oft Unklarheiten mit Proteinregionen klären, die einem verminderten HDX unterliegen. Vermindertes HDX kann entweder durch eine verminderte Lösungsmittelzugänglichkeit aufgrund von Bindung oder eine verminderte Proteindynamik entstehen. DEPC-Reaktionen sind von Natur aus 2-3 Größenordnungen langsamer als HDX-Reaktionen, so dass die DEPC-Markierung weitgehend nicht von Veränderungen der Proteindynamik beeinflusst wird, solange sie nicht mit Änderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit einhergehen.

CL-MS hat einige Vorteile gegenüber HDX-MS-Experimenten, da Etikettenverklerren und Etikettenverlust minimal sind, wenn geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. In HDX-Experimenten ist der Verlust oder Der Rückaustausch von Etiketten ein Standardmerkmal der Technik, und schnelle Aufschlüssungen und LC-Trennungen bei niedrigem pH-Wert sind Versuche, dieses Problem zu minimieren. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass das Problem des Rückaustauschs durch die höhere Anzahl von markierten Standorten ausgeglichen wird, die typischerweise in HDX-MS gemessen werden. Labeling Scrambling ist ein größeres Problem in HDX-MS, da dann falsche Informationen erhalten würden, so dass die Analysebedingungen optimiert werden müssen, um dieses Problem zu minimieren.

XL-MS und CL-MS haben ähnliche Vorteile in Bezug auf Markierungsverlust und Scrambling, da beide die Bildung einer kovalenten Bindung beinhalten, die robust genug ist, um während der Verdauung und LC-MS-Analysen zu bleiben. Die Sequenzierung und Identifizierung vernetzter Peptide ist jedoch schwieriger als bei kovalent markierten Peptiden und erfordert den Einsatz spezieller Software. Ein wesentlicher Vorteil, den XL-MS gegenüber CL-MS hat, ist seine Fähigkeit, Entfernungsbeschränkungen bereitzustellen, die bei der Vorhersage oder Eingrenzung möglicher Proteinstrukturen wertvoll sein können. CL-MS-Daten wurden verwendet, um die Vorhersage der Proteinstruktur36,42,43zu erleichtern, aber dieser Bereich erfordert mehr Arbeit, um sein Potenzial voll auszuschöpfen.

Im Vergleich zu anderen CL-MS-Methoden, einschließlich solcher, die spezifische oder unspezifische Kennzeichnungsreagenzien verwenden, hat DEPC einige Vor- und Nachteile. Wie bei Methoden, die aminosäurespezifische Reagenzien verwenden, ist die DEPC-Markierung einfach; das Reagenz muss nur der interessierenden Probe hinzugefügt werden. Diese Einfachheit steht im Gegensatz zu Methoden wie der schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen (FPOP) oder synchrotronbasierter HRF, die ausgeklügelte Lichtquellen zur Herstellung von Hydroxylradikalen erfordern. Im Gegensatz zu Methoden, die spezifische Reagenzien verwenden, kann DEPC sechs verschiedene Aminosäuren und den N-Terminus kennzeichnen, wodurch eine höhere strukturelle Auflösung bereitgestellt werden kann. Die Anzahl der Rückstände, die von DEPC markiert werden können, ist jedoch geringer als die Anzahl, die durch Hydroxylradikale oxidiert werden kann, so dass die strukturelle Auflösung, die mit DEPC-basiertem CL-MS erzielt werden kann, niedriger ist. Eine praktische Auswirkung von weniger Rückständen, die von DEPC markiert werden, besteht darin, dass die Verwendung des Reagenzes manchmal nicht alle gewünschten Strukturinformationen liefert und daher von der Verwendung in Verbindung mit anderen Kennzeichnungsreagenzien profitieren kann. Wir haben kürzlich den Wert der Verwendung von DEPC zusammen mit dem Reagenzpaar 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/Glycinethylether (GEE) nachgewiesen, das Glutamat- und Aspartatrückstände kennzeichnen kann19.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Die Autoren bestätigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) unter Grant R01 GM075092. Das Thermo Orbitrap Fusion Massenspektrometer, mit dem einige der hier beschriebenen Daten erfasst wurden, wurde mit Mitteln des National Institutes of Health Grant S10OD010645 erworben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

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Chemie Heft 172 Massenspektrometrie kovalente Markierung Proteinstruktur höherer Ordnung Protein-Liganden-Komplexe Proteinkomplexe Diethylpyrocarbonat lösungsmittelzugängliche Oberfläche
Kovalente Markierung mit Diethylpyrocarbonat zur Untersuchung der Proteinstruktur höherer Ordnung durch Massenspektrometrie
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