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Developmental Biology

एक एकल Oocyte रिपोर्टर परख का उपयोग कर इन विट्रो परिपक्वता के दौरान मातृ mRNA अनुवाद के कार्यक्रम को परिभाषित

Published: June 16, 2021 doi: 10.3791/62041
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2
1Center for Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 2Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Sciences, University of California at San Francisco, 3Present affiliation: Laboratoire de Biologie du Développement-Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Sorbonne Université

Summary

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो परिपक्वता के दौरान एकल ओसाइट्स में एमआरएनए अनुवाद के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक रिपोर्टर परख का वर्णन करता है।

Abstract

ओसाइट परमाणु परिपक्वता से जुड़ी घटनाओं को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है । हालांकि, निषेचन और totipotency के अधिग्रहण की तैयारी में साइटोप्लाज्म में होने वाले आणविक रास्तों और प्रक्रियाओं के बारे में बहुत कम जाना जाता है। oocyte परिपक्वता के दौरान, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन विशेष रूप से ट्रांसक्रिप्शन के बजाय मातृ दूत आरएनए (mRNAs) के अनुवाद और गिरावट पर निर्भर करता है। इसलिए, अनुवाद कार्यक्रम का निष्पादन भ्रूण विकास को बनाए रखने के लिए ओसाइट विकासात्मक क्षमता स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पेपर मातृ एमआरएनए अनुवाद के कार्यक्रम को परिभाषित करने पर ध्यान केंद्रित करने का हिस्सा है जो मेइटिक परिपक्वता के दौरान और ओसाइट-टू-ज़िगोट संक्रमण पर होता है। इस विधि पत्र में, इन विट्रो ओसाइट परिपक्वता के दौरान लक्ष्य mRNAs के अनुवाद के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति प्रस्तुत की जाती है। यहां, एक Ypet रिपोर्टर ब्याज के जीन के 3 ' अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर) के लिए जुड़ा हुआ है और फिर माइक्रो-इंजेक्शन मात्रा के लिए नियंत्रित करने के लिए mCherry के लिए पॉलीडैनील mRNA एन्कोडिंग के साथ एक साथ oocytes में इंजेक्शन । रिपोर्टर संचय को मापने के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, अनुवाद दरों की गणना ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न संक्रमणों पर की जाती है। यहां, oocyte अलगाव और इंजेक्शन, समय चूक रिकॉर्डिंग, और डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल वर्णित किया गया है, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3 ' UTR रिपोर्टर एक उदाहरण के रूप में उपयोग कर ।

Introduction

एक पूरी तरह से विकसित स्तनधारी ओसाइट निषेचन और टोटिपेंसी के अधिग्रहण की तैयारी में तेजी से परिवर्तन से गुजरता है। निषेचन के बाद भ्रूणीय विकास को बनाए रखने के लिए ये परिवर्तन आवश्यक हैं। यद्यपि परमाणु परिपक्वता से जुड़ी घटनाओं को अपेक्षाकृत अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, लेकिन ओसाइट साइटोप्लाज्म में आणविक प्रक्रियाओं और रास्तों के बारे में बहुत कम जाना जाता है। ओसाइट परिपक्वता के अंतिम चरण के दौरान, ओसाइट्स ट्रांसक्रिप्शनली रूप से चुप होते हैं, और जीन अभिव्यक्ति पूरी तरह से एमआरएनए अनुवाद और गिरावट1,2पर निर्भर है। विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन का संश्लेषण, इसलिए, लंबे समय तक रहने वाले एमएचआरएन के समय पर अनुवाद के कार्यक्रम पर निर्भर करता है जिसे ओसाइट विकास1,3के दौरान पहले संश्लेषित किया गया है। मेयोटिक परिपक्वता के दौरान और ओसाइट-टू-ज़िगोट संक्रमण के दौरान निष्पादित मातृ एमआरएनए अनुवाद के इस कार्यक्रम को परिभाषित करने पर ध्यान केंद्रित करने के हिस्से के रूप में, यह पेपर विट्रो मेइटिक परिपक्वता के दौरान एकल ओसाइट्स में लक्षित मातृ एमएचएनए के अनुवाद के सक्रियण और दमन का अध्ययन करने की रणनीति प्रस्तुत करता है।

इस विधि में, वाईपेट ओपन रीडिंग फ्रेम को ब्याज की ट्रांसक्रिप्ट के 3 'यूटीआर' के ऊपर क्लोन किया जाता है। इसके बाद, इस रिपोर्टर को एन्कोडिंग करने वाले एमआरएएनए को इंजेक्शन की मात्रा के लिए नियंत्रित करने के लिए पॉलीडीनेलेटेड एमआरएएनए एन्कोडिंग एमसीएचरी के साथ एक साथ ओसाइट्स में माइक्रो-इंजेक्ट किया जाता है। रिपोर्टर संचय समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान मापा जाता है। पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) और रीचेरी का संचय व्यक्तिगत ओसाइट्स में दर्ज किया जाता है, और वाईएफपी संकेतों को सह-इंजेक्शन मचेरी के पठार स्तर द्वारा ठीक किया जाता है। डेटा अधिग्रहण के बाद, वक्र-फिटिंग द्वारा प्राप्त वक्र की ढलान की गणना करके इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न समय अंतराल के लिए अनुवाद दरों की गणना की जाती है।

यह दृष्टिकोण चयनित अंतर्जात आरएएनए के अनुवाद में परिवर्तनों की प्रयोगात्मक पुष्टि करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, यह विधि नियामक तत्वों के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है जो लक्ष्य एमआरएएनए4,5,6 के 3 ' यूटीआर के सीआईएस-नियामक तत्वों में हेरफेर करके ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान अनुवाद कोनियंत्रितकरते हैं। पॉली (ए) पूंछ की लंबाई में हेरफेर भी oocytes5में adenylase/डेडनेलीज गतिविधि में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है । सीआईएस-अभिनय तत्वों या आरएनए इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के म्यूटेनेसिस का उपयोग कॉग्नेट आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन6,7के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि का उपयोग अनुवाद कार्यक्रम के आवश्यक घटकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो कम ओसाइट गुणवत्ता 8,9,10से जुड़े मॉडलों में लक्ष्य 3 ' यूटीआर अनुवाद को मापकर ओसाइट विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह विधि कागज एक प्रतिनिधि प्रयोग प्रस्तुत करता है जहां 21 दिन पुराने C57/BL6 चूहों के denuded oocytes माइक्रो एक Ypet रिपोर्टर के साथ इंजेक्शन दिया गया है आईएल-7 के 3 ' UTR को जुड़े । ओसाइट इंजेक्शन, समय-चूक रिकॉर्डिंग और डेटा विश्लेषण के लिए सेटअप और प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को सैन फ्रांसिस्को (प्रोटोकॉल AN182026) में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मीडिया की तैयारी

  1. बुनियादी ओसाइट संग्रह माध्यम और ओसाइट परिपक्वता माध्यम बनाने के लिए तालिका 1में वर्णित सभी घटकों को जोड़ें। बुनियादी संग्रह माध्यम के लिए, पीएच को 7.4 सेट करें। संग्रह और परिपक्वता माध्यम दोनों के लिए, उपयोग के दिन गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 1 माइक्रोन माइक्रोओस्टैमाइड के 3 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें।

2. वाईपेट-3 ' यूटीआर और रीचेरी के लिए एमआरएनए एन्कोडिंग की तैयारी

  1. ब्याज के mRNAs के 3 ' यूटीआर दृश्यों को प्राप्त करें।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, दृश्यों को पहले माउस ओसाइट सीडीएनए से प्राप्त किया गया था।
  2. ओसाइट सीडीएनए से लक्ष्य 3'यूटीआर और पीसीडीएनए 3.1 वेक्टर के कुछ हिस्सों को बढ़ाने के लिए प्राइमर डिजाइन करें जिसमें वाईपेट कोडिंग सीक्वेंस, वी 5-एपिटोप टैग और एक T7 प्रमोटर शामिल हैं।
  3. एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक किट का उपयोग कर बढ़ाना। एक जेल पर पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पादों को चलाने के लिए अगर टुकड़ों का सही आकार है, बैंड को काट लें, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके जेल से डीएनए निकालें।
  4. पीसीआर क्लोनिंग किट का उपयोग करके पीसीआर के टुकड़ों को वेक्टर से फ्यूज करें।
    नोट: पीसीआर के टुकड़ों को अधिक कुशल पुनर्संयोजन प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए 4 घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेटेड किया गया था । यह निर्माता के निर्देशों के विपरीत है, जो केवल 45 मिनट के इनक्यूबेशन समय की सलाह देते हैं।
  5. पीसीआर के टुकड़ों को सक्षम 5-α एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया में स्थानांतरित करें।
    1. बैक्टीरिया के लिए मिश्रण और प्लाज्मिड जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट ।
    2. गर्मी 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मिश्रण रखकर मिश्रण और प्लाज्मिड झटका, और तुरंत 3 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा।
    3. कैटाबोलाइट दमन (एसओसी) माध्यम के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के 500 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 2 मिनट के लिए 7000 × जी पर नीचे स्पिन, और सुपरनेट के अधिकांश हटा दें। उचित चयन एंटीबायोटिक के साथ एक लुरिया शोरबा (पौंड) आगर प्लेट पर पुनर्सुपेंड और प्लेट।
      नोट: इस अध्ययन में कार्बेनेसिलिन का उपयोग किया गया था।
    5. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया। कालोनियों में से एक पर हल्के से एक पिपेट टिप दबाकर कॉलोनियों को अलग करें और इसे एलबी मीडियम के 3 एमएल में 100 माइक्रोग्राम/एमएल कार्बेनिकिन के साथ रख दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लाज्मिड डीएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके प्लाज्मिड के डीएनए को निकालें और डीएनए अनुक्रमण के माध्यम से दृश्यों की पुष्टि करें।
  6. Ypet/3 ' यूटीआर के लिए:
    1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए एक रैखिक पीसीआर टेम्पलेट का उत्पादन करें। Ypet अनुक्रम के एक फॉरवर्ड प्राइमर अपस्ट्रीम और 20 अतिरिक्त थायमीन अवशेषों के साथ एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग करें। Ypet/IL-7 3 ' यूटीआर के अनुक्रम और आगे और रिवर्स प्राइमर के दृश्यों के लिए तालिका 2 देखें ।
      नोट: ये अतिरिक्त थायमीन अवशेष इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के बाद लीनियर एमआरएनए में ओलिगो (ए) जोड़ देंगे।
    2. इन विट्रो निर्माता के निर्देशों के अनुसार T7 ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को टाइप करें।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रांसक्रिप्शन क्लीन-अप किट का उपयोग करके परिणामी पूरक आरएनए (CRNA) को शुद्ध करें।
    4. आरएनएई-मुक्त पानी में शुद्ध cRNA को एल्यूट करें, एकाग्रता को मापें और एगरॉल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अखंडता का मूल्यांकन करें। −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. एमसीएचरी के लिए:
    1. एक उच्च निष्ठा प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए एक रैखिक पीसीआर टेम्पलेट का उत्पादन; इस उदाहरण को दोहराते हुए प्रतिबंध एंजाइम एमएफईआई-एचएफ का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक पाचन बफर में पचा।
    2. नमूना को शुद्ध करने के लिए एक जेल चलाएं, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके रैखिक डीएनए निकालें।
    3. इन विट्रो निर्माता के निर्देशों के अनुसार T7 ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को टाइप करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉली (ए) टेलिंग किट का उपयोग करके क्रैन (150-200 न्यूक्लियोटाइड) को पॉलीडीलेट करें।
    5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रांसक्रिप्शन क्लीन-अप किट का उपयोग करके परिणामस्वरूप क्रेना को शुद्ध करें।
    6. RNAse-मुक्त पानी में शुद्ध cRNA Elute, mRNA सांद्रता को मापने, और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा संदेश अखंडता का मूल्यांकन । −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. प्रायोगिक प्रक्रिया

नोट: ओसाइट माइक्रो-इंजेक्शन और बाद में समय-चूक माइक्रोस्कोपी का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1में दिया गया है ।

  1. दिन 1
    1. इंट्रापेरिटोनली ने 21 दिन पुराने चूहों को गर्भवती घोड़ी के सीरम गोंडोट्रोपिन के 5 आईयू के साथ इंजेक्ट किया ताकि एंट्रल स्टेज11में कूप विकास को बढ़ावा दिया जा सके ।
  2. तीसरा दिन
    1. ऊसाइट संग्रह
      1. अंडाशय को इकट्ठा करने के लिए भड़काने के बाद चूहों 44-48 घंटे का बलिदान करें, और उन्हें बुनियादी ओसाइट संग्रह माध्यम के साथ प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें।
      2. 26 जी सुई के साथ कूप की दीवार में एक छोटा सा कट बनाकर एंटील रोम को सावधानी से खोलें। मुंह से संचालित ग्लास पिपेट का उपयोग करके क्यूमुलस कोशिकाओं की कई परतों के साथ अक्षुण्ण क्यूमुलस-संलग्न ओसाइट्स (सीओसी) को अलग करें।
      3. एक छोटे पिपेट (ओसाइट के व्यास से थोड़ा बड़ा) का उपयोग करें, और यांत्रिक रूप से बार-बार पिपटिंग करके सीओसी को डिंड करें।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, बरकरार COCs पर माइक्रो इंजेक्शन प्रदर्शन करते हैं।
      4. एक बड़े पिपेट का उपयोग करके, डेन्ड ओसाइट्स को एस्पिरेट करें और उन्हें मेइओटिक परिपक्वता12की बहाली को रोकने के लिए फॉस्फोडिस्टेरेस अवरोधक, सिलोस्टामाइड के 1 माइक्रोन के साथ परिपक्वता माध्यम के साथ एक पेट्री डिश में रखें। 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में पकवान रखें oocytes रोम से oocytes के अलगाव से प्रेरित तनाव से उबरने के लिए।
    2. ऊसाइट माइक्रो-इंजेक्शन
      1. एक यांत्रिक खींचने में 10 सेमी लंबी बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका ट्यूब रखकर इंजेक्शन सुइयों को तैयार करें। इष्टतम इंजेक्शन के लिए, एक गर्म फिलामेंट का उपयोग करके सुई टिप को 45 डिग्री कोण में मोड़ें।
      2. बुनियादी ओसाइट संग्रह माध्यम की 20 माइक्रोन बूंदों के साथ पॉलीस्टीरिन व्यंजन तैयार करें, और बूंदों को हल्के खनिज तेल के साथ कवर करें।
      3. 12.5 μg/μL Ypet-3' यूटीआर और 12.5 μg/μL mCherry जोड़कर एक रिपोर्टर मिश्रण तैयार करें। एक बड़ी मात्रा तैयार करें और इसी तरह के रिपोर्टर सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए भविष्य के प्रयोगों के लिए aliquots बनाते हैं। इन एलिकोट्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विगलन पर, पहले 20,000 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए एलिकोट को अपकेंद्रित्र करें, और एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
        नोट: यह अपकेंद्रित्र रिपोर्टर मिश्रण में संभावित समुच्चय द्वारा भरा हो रही से इंजेक्शन सुई को रोकने जाएगा ।
      4. रिपोर्टर मिश्रण के लगभग 0.5 माइक्रोन के साथ केशिका द्वारा इंजेक्शन सुई लोड करें।
      5. धारकों में होल्डिंग पिपेट और लोडेड इंजेक्शन सुई रखें, और ओसाइट संग्रह माध्यम की बूंद में स्थिति। कुछ माध्यम को होल्डिंग पिपेट में एएसपिरेट करें।
      6. इंजेक्शन सुई को धीरे-धीरे पकड़े हुए पिपेट के खिलाफ टैप करके खोलें।
      7. बुनियादी संग्रह माध्यम की एक बूंद में oocytes रखें, और रिपोर्टर मिश्रण के 5-10 पीएल सुई ।
      8. 16 घंटे के लिए 1 माइक्रोन सिलोस्टामाइड के साथ परिपक्वता माध्यम में ओसाइट्स को इनक्यूबेट करें ताकि 16 घंटे तक रीचेरी सिग्नल को पठार में जाने दिया जा सके।
      9. एक पेट्री डिश तैयार करें जिसका उपयोग प्रत्येक इंजेक्शन रिपोर्टर के लिए परिपक्वता माध्यम के कम से कम दो 20 माइक्रोल बूंदों के साथ समय-चूक माइक्रोस्कोपी के लिए किया जाएगा: नियंत्रण के लिए 1 माइक्रोन सिलोस्टामाइड के साथ एक बूंद ओएसिसेस को गिरफ्तार किया गया और एक बूंद परिपक्व ओसाइट्स के लिए सिलोस्टामाइड के बिना। बूंदों को हल्के खनिज तेल से ढककर इनक्यूबेटर में रखें।
    3. समय-चूक माइक्रोस्कोपी
      1. प्री-इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से इंजेक्शन वाले ओसाइट्स को हटा दें, और उन्हें बिना सिल्ओस्टामाइड के परिपक्वता माध्यम में चार बार धोएं। एक प्रोफ़ेसी आई-गिरफ्तार ओसाइट नियंत्रण समूह के रूप में 1 माइक्रोन सिलोस्टामाइड के साथ परिपक्वता माध्यम में कुछ ओसाइट्स रखें।
      2. इंजेक्शन ओसाइट्स को पहले से तैयार समय-चूक माइक्रोस्कोप डिश पर अपने संबंधित बूंदों में स्थानांतरित करें। एक बंद ग्लास पिपेट का उपयोग करके ओसाइट्स को क्लस्टर (कुछ सेकंड के लिए एक लौ में टिप पकड़कर एक बंद पिपेट तैयार किया जा सकता है)।
        नोट: ओसाइट्स को क्लस्टर करने से रिकॉर्डिंग के दौरान उनके आंदोलन को रोकने में मदद मिलती है।
      3. एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड रोशनी प्रणाली और एक मोटर चालित मंच 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर बनाए रखा एक पर्यावरण चैंबर से लैस से लैस माइक्रोस्कोप केनीचेपकवान रखें । इस अध्ययन को दोहराने के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: फ़िल्टर सेट: डिक्रोइक मिरर वाईएफपी/सीएफपी/एमचेरी 69008BS; YFP चैनल (उत्तेजन (पूर्व): S500/20 × ४९०५७; उत्सर्जन (EM): D535/30 मीटर 47281), mCherry चैनल (पूर्व: 580/25 × 49829; Em: 632/60 मीटर) ।
      4. समय-चूक प्रयोग के लिए उपयुक्त सेटिंग्स दर्ज करें (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें): ऐप्स | पर क्लिक करें बहुआयामी अधिग्रहण। पहला टैब मेन चुनें और टाइमलैप्स, कई चरण पदोंऔर कई तरंगदैर्ध्य काचयन करें।
      5. उस स्थान को दर्ज करने के लिए टैब सेविंग चुनें जहां प्रयोग को सहेजा जाना चाहिए।
      6. समय अंक, अवधि और समय अंतराल की संख्या दर्ज करने के लिए टैब टाइमलैप्स का चयन करें।
        नोट: समय-चूक प्रयोग की अवधि पशु प्रजातियों पर निर्भर करती है, क्योंकि ओसाइट मेइटिक परिपक्वता का समय प्रजातियों के बीच अलग होता है। माउस ओसाइट्स के साथ इस प्रयोग में, 16 घंटे के लिए हर 15 मिनट में ओसाइट्स दर्ज किए गए थे।
      7. टैब स्टेजका चयन करें । ब्राइटफील्ड पर स्विच करें और अधिग्रहण का चयन करके एक नई विंडो खोलकर ओसाइट्स की स्थिति का पता लगाएं | | हासिल करें लाइव दिखाओ। एक बार ओसाइट्स स्थित हो जाने के बाद, बहुआयामी अधिग्रहण विंडो पर वापस स्विच करें, और ओसाइट्स का स्थान निर्धारित करने के लिए + दबाएं।
      8. टैब वेवलेंथका चयन करें, और ब्राइटफील्ड (एक्सपोजर 15 एमएस), वाईएफपी (वाईपेट/आईएल7 3' यूटीआर के लिए एक्सपोजर 150 एमएस) और रीचेरी (वाईपेट/आईएल7 3' यूटीआर के लिए एक्सपोजर 75 एमएस) के लिए 3 अलग-अलग तरंगदैर्ध्य सेट करें।
        नोट: रिपोर्टर संचय और इंजेक्शन मात्रा के स्तर के आधार पर प्रत्येक Ypet/3 ' यूटीआर रिपोर्टर के लिए एक्सपोजर को समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि YFP संकेत अनुवाद की सक्रियता के मामले में कम अनुमान या संतृप्ति को रोकने के लिए प्रयोग की शुरुआत में पता लगाने की सीमा के केंद्र में आता है। रीचेरी के लिए, रीचेरी के प्रत्येक बैच के लिए एक्सपोजर को समायोजित करें क्योंकि सिग्नल पॉलीएडेनिलेशन प्रक्रिया के दौरान जोड़े गए एडेनिन न्यूक्लियोटाइड की संख्या पर निर्भर करता है। पॉलीएडेनिलेशन दक्षता में भिन्नता के कारण, प्रयोगों के बीच बेहतर तुलना के लिए विभिन्न प्रयोगों में रीचेरी के एक ही बैच का उपयोग करें।
      9. अधिग्रहण पर क्लिक करके समय चूक प्रयोग शुरू करो। एक ही oocyte में एक समय चूक रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 और पूरक फ़ाइल देखें ।
    4. यपेट-3 के यूटीआर अनुवाद का विश्लेषण
      1. इस विश्लेषण के लिए (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें), प्रत्येक ओसाइट के लिए दो क्षेत्र माप करें: ओसाइट स्वयं-एलिप्स क्षेत्र पर क्लिक करें और ओसाइट के चारों ओर और आयताकार क्षेत्रपर पृष्ठभूमि घटाव-क्लिक के लिए उपयोग किए जाने वाले ओसाइट के करीब एक छोटा सा क्षेत्र।
        नोट: सुनिश्चित करें कि समय-चूक रिकॉर्डिंग के दौरान ओसाइट्स चयनित क्षेत्र से बाहर न जाएं। ध्रुवीय शरीर निष्कासन के आसपास क्षेत्र माप के प्लेसमेंट पर विशेष ध्यान दें, क्योंकि यह ओसाइट में आंदोलन का कारण बनता है और रिकॉर्डिंग को विकृत कर सकता है।
      2. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर को निर्यात करने के लिए ओपन लॉग पर पहले क्लिक करके और फिर लॉग डेटा पर क्लिक करके क्षेत्र माप डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
      3. प्रत्येक व्यक्ति के लिए oocyte और सभी मापा समय अंक के लिए, oocyte क्षेत्र माप से पृष्ठभूमि क्षेत्र माप घटाना । वाईएफपी और रीचेरी तरंगदैर्ध्य के लिए ऐसा अलग से करें।
      4. बाद के संदर्भ के लिए अंकुरित वेसिकल ब्रेकडाउन (जीवीबीडी) और ध्रुवीय शरीर एक्सट्रूज़न (पीबीई) के समय को रिकॉर्ड करें।
        नोट: जीवीबीडी 2 घंटे से अधिक होने पर परिपक्व माउस ओसाइट्स को बाहर करें।
      5. आउटलर्स की जांच करने के लिए प्रत्येक ओसाइट के लिए समय के साथ प्लॉट वाईएफपी और रीचेरी अभिव्यक्ति।
        नोट: यह एक चिकनी वक्र होना चाहिए, अगर यह नहीं है यह संकेत हो सकता है कि oocyte रिकॉर्डिंग के दौरान चले गए ।
      6. प्रत्येक व्यक्ति के लिए oocyte, रिकॉर्डिंग के पिछले दस समय-अंक के लिए औसत mCherry अभिव्यक्ति की गणना करें । हर समय बिंदु के लिए, प्रत्येक व्यक्ति oocyte के लिए हर समय बिंदु पर एक YFP/mCherry अनुपात प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन मात्रा के लिए सही करने के लिए औसत mCherry अभिव्यक्ति द्वारा YFP अभिव्यक्ति विभाजित करें ।
      7. रैखिक प्रतिगमन द्वारा वक्र की ढलान को फिट करके एक विशिष्ट समय-अंतराल के लिए अनुवाद दरों की गणना करें। सांख्यिकीय अनुमान का उपयोग कर अनुवाद दरों में अंतर का आकलन करें।

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Representative Results

Denuded prophase मैं-21 दिन पुराने C57/BL6 चूहों के oocytes गिरफ्तार एक रिपोर्टर मिश्रण के साथ इंजेक्शन थे mRNA encoding Ypet रिपोर्टर आईएल-7 और mRNA एन्कोडिंग mCherry के 3 ' UTR को जुड़े । वाईएफपी और रीचेरी अभिव्यक्ति 39 ओसाइट्स में दर्ज की गई थी, जिनमें से 30 परिपक्व थे, और 9 को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रोफ़ेसी I में गिरफ्तार किया गया था। तीन परिपक्व oocytes विश्लेषण के लिए बाहर रखा गया था क्योंकि वे या तो एक देरी GVBD (एन = 2) था या रिकॉर्डिंग (एन = 1) के दौरान पकवान में चले गए । चित्रा 3 प्रोफ़ेसी आई और परिपक्व ओसाइट्स में एमचेरी और वाईएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है। चित्रा 4 इंजेक्शन मात्रा के लिए सही करने के लिए पठार 1Cherry अभिव्यक्ति (पिछले 10 समय अंक में औसत mCherry अभिव्यक्ति) के लिए सही oocytes परिपक्व oocytes की YFP अभिव्यक्ति से पता चलता है । रिपोर्टर की अनुवाद दरों वक्र फिटिंग (रैखिक प्रतिगमन) द्वारा मापा गया था YFP/mCherry मूल्यों में prophase मैं और परिपक्व oocytes में पहले 0-2 घंटे या 8-10 घंटे के दौरान cilostamide रिलीज(चित्रा 5A)के बाद । रिपोर्टर का संचय एक रैखिक पैटर्न का पालन नहीं करता है, जैसा कि सिलोस्टामाइड रिलीज (पी<0.0001) के बाद 0-2 घंटे और 8-10 घंटे के बीच अनुवाद दरों में महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है; चित्रा 5B)। इसलिए, ये परिणाम ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान आईएल-7 अनुवाद की सक्रियता का संकेत देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:प्रायोगिक प्रक्रिया का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। ओलिगोडेनेलेटेड Ypet/3' यूटीआर और पॉलीडेनेलेटेड एमआरएनए एन्कोडिंग एमसीएचरी को 21 दिन पुराने C57/BL6 चूहों के डेन्ड ओसाइट्स में माइक्रो-इंजेक्ट किया जाता है । Oocytes को एक पठार तक पहुंचने के लिए 16 घंटे के लिए परिपक्वता माध्यम युक्त सिलोस्टामाइड में पूर्व-इनक्यूबेटेड किया जाता है। प्री-इनक्यूबेशन के बाद, एक समय-चूक रिकॉर्डिंग शुरू की जाती है जहां ओसाइट्स को या तो सिलोस्टैमाइड के साथ माध्यम में रखा जाता है ताकि एक प्रोफ़ेसी आई-गिरफ्तार नियंत्रण समूह बनाया जा सके या परिपक्व होने के लिए सिलोस्टामाइड-मुक्त माध्यम में जारी किया जा सके। संक्षिप्त रूप: यूटीआर = अनट्रालेटेड क्षेत्र; YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; FW प्राइमर = फॉरवर्ड प्राइमर; रेव प्राइमर = रिवर्स प्राइमर; एम्पर = एम्पिसिलिन प्रतिरोध; पॉलीए = पॉलीडेनिल; ओलिगोवा = ओलिगोडेनिल; जीवी = अंकुरित वेसिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एक एकल oocyte समय चूक रिकॉर्डिंग का उदाहरण। ब्राइटफील्ड, वाईएफपी, और mCherry mRNAs encoding Ypet/Interleukin-7 3 ' यूटीआर और पॉलीडीनेलेटेड mCherry के साथ इंजेक्शन की रिकॉर्डिंग, मैं, एमआई (6 cilostamide रिलीज के बाद 6 घंटे), और MII (15 घंटे के बाद सिलावटाइड रिलीज) । स्केल बार = 25 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; जीवी = अंकुरित वेसिकल; एमआई = मेटाफेज I; एमआईई = मेटाफेज II। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:वाईएफपी और मचेरी सिग्नल समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज किए गए हैं। YFP और oocytes के 14tes के संकेतों को ओलिगोडिएलेटेड Ypet/IL7 3 ' यूटीआर और पॉलीडैनीलेटेड एमआरएनए एन्कोडिंग रीचेरी के साथ इंजेक्ट किया गया । ओसाइट्स को या तो सिलोस्टेमाइड के साथ माध्यम में रखा गया था ताकि एक प्रोफ़ेस आई-गिरफ्तार नियंत्रण समूह (एन = 9) उत्पन्न हो सके या परिपक्वता (एन = 30) के लिए अनुमति देने के लिए सिलोस्टामाइड-मुक्त माध्यम में जारी किया जा सके। डेटा व्यक्तिगत ओसाइट माप हैं। संक्षिप्त रूप: आईएल-7 = इंटरल्यूकिन-7; YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:वाईएफपी सिग्नल को सह-इंजेक्शन मचेरी स्तर के लिए सही किया गया। प्रोफ़ेस आई-गिरफ्तार और परिपक्व ओसाइट्स के वाईएफपी संकेतों को पिछले 10 समय-बिंदुओं के औसत रीचेरी सिग्नल द्वारा वाईएफपी सिग्नल को विभाजित करके इंजेक्शन मात्रा के लिए सही किया गया था। व्यक्तिगत वाईएफपी/एमचेरी अनुपात(ए)प्रोफसे आई-गिरफ्तार ओसाइट्स और(बी)परिपक्व ओसाइट्स और मतलब ± मानक त्रुटि का मतलब है YFP/mCherry अनुपात(C)प्रॉपहास आई-गिरफ्तार और(डी)परिपक्व ओसाइट्स । संक्षिप्त रूप: वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; जीवीबीडी = अंकुरित वेसिकल टूटना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:0-2 घंटे और परिपक्वता के 8-10 घंटे पर अनुवाद दरों की गणना की । (A)पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) एक oocytes के संकेतों को 0-2 घंटे या 8-8-1 पर mCherry (YFP/mCherry) के लिए सही 10 एच सिलोस्टामाइड रिलीज के बाद और(बी)अनुवाद दरों (मतलब ± मतलब की मानक त्रुटि) के रूप में वक्र फिटिंग (रैखिक प्रतिगमन) द्वारा गणना YFP/mCherry मूल्यों पर 0-2 घंटे और 8-10 घंटे पर cilostamide रिलीज के बाद । डेटा का विश्लेषण बिना मरम्मत वाले दो पूंछ वाले टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया । *पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:अनुवाद के दमन का उदाहरण: Oosp2। एक प्रयोग के डेटा का फिर से विश्लेषण किया गया जहां ओसाइट्स को वाईपेट-Oosp2 3 ' यूटीआर और पॉलीडीनेलेटेड एमआरएनए एन्कोडिंग एमसीएचरी के साथ इंजेक्ट किया गया था। प्रोफ़ेसी आई-गिरफ्तार (एन = 63) और परिपक्व ओसाइट्स (एन = 72) के वाईएफपी संकेतों को पिछले 10 समय-बिंदुओं के औसत रीचेरी सिग्नल द्वारा वाईएफपी सिग्नल को विभाजित करके इंजेक्शन मात्रा के लिए सही किया गया था। आईएल-7 प्रयोग के विपरीत, YFP और चापरी अभिव्यक्ति डेटा एक ज़ेनन आर्क लैंप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था जहां एक एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग किया गया था। डेटा व्यक्तिगत ओसाइट माप के मतलब ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं और पहले लुओंग एट अल में प्रकाशित किए गएथे। 5.संक्षिप्त: YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; Oosp2 = oocyte स्रावित प्रोटीन 2; यूटीआर = अअनुवादित क्षेत्र; आईएल-7 = इंटरल्यूकिन-7; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; जीवीबीडी = अंकुरित वेसिकल टूटना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:जीवीबीडी और पीबीई के समय पर माइक्रो-इंजेक्शन और फ्लोरेसेंस एक्सपोजर का प्रभाव। जीवीबीडी का समय और ओसाइट्स का पीबीई जो या तो माइक्रो-इंजेक्ट किए गए थे और फ्लोरेसेंस (इंजेक्शन) के संपर्क में थे, या इंजेक्शन नहीं दिया गया था और फ्लोरेसेंस (इंजेक्शन नहीं) के संपर्क में नहीं था। डेटा व्यक्तिगत ओसाइट माप हैं। डेटा का विश्लेषण बिना मरम्मत वाले दो पूंछ वाले टी-टेस्टका उपयोग करके किया गया था । *पी<0.001। संक्षिप्त रूप: जीवीबीडी = अंकुरित वेसिकल ब्रेकडाउन; PBE = ध्रुवीय शरीर निष्कासन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बेसिक ओसाइट संग्रह माध्यम
घटक 500 एमएल के लिए
HEPES संशोधित न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल 7.1 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 252 मिलीग्राम
सोडियम पायरुवेट 1.15 एमएल
पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन 100x 5 एमएल
अल्ट्रापुरे आसुत पानी (इनविटरोजन, 10977-015) 500 एमएल तक
परिपक्वता माध्यम
घटक 500 एमएल के लिए
एमईएम अल्फा 1x 500 एमएल तक
सोडियम पायरुवेट 1.15 एमएल
पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन 100x 5 एमएल

तालिका 1: मीडिया की तैयारी। उन घटकों की सूची जिन्हें बुनियादी ओसाइट संग्रह माध्यम और ओसाइट परिपक्वता माध्यम तैयार करने के लिए जोड़े जाने की आवश्यकता है।

अनुक्रम
Ypet/Interleukin-7 3 ' यूटीआर GAGAACCCACTGCTTACTGGCATATCTAGAATAATACगटैकेक्टैकगटागैगकैगेकटीसीटीजी
GCTAGTAGCTAGTAGCCCCGCTCGGATCCCGGTCCCCCACCATGGGGCAAAGGCGA
AGAGCTGTTCACCGGGTGGTGCCCCCCCCTGGTGGGCTGGACGGCGGGGGGGCCCCCC
ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGGGGGGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTCCCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCT
AAGCTGCTGTGCACCACCCCCCCACTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCCCCCTGCCCCCCCTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
जीजीसीटीसीजीटीसीटीसीजीटीसीटीसीजीजीटीसीसीसीक्काक्कागैगक्काैकैकाक्टीसी
AGAGCGCCATCATGCCGGGGCTACGTCTCTCTCTCAAGGACGCGGCAAa
सीटीएकागागेक्गागचांगगचिगाचिगगगचिगाचिगाचिगगगचटगा
AGGGCATCGACTCAAGGGGGCAAACACCCCCGGGCACACTCGTATAACTCAAC
AGCCACAACGTGTACATCACCCCCCCAAGAGAAGAAGAAGACATCATCAGCAACTTCAAGAT
CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGGGGCCCCCCCCCCACTACCAGCAACCCCCCCC
CATCGGCGACGGCCCCCCGTGCTGCTGCCCCCCAACCACTACCTGAGCTACCAGAGGGCCCCCCCTGCTGCTTGCCCCCTCTGCTTGCTCTCT
TTCAAGGACCCCAACAGAAGAAGAAGCGGGACCACATGGTCTGCTGGTTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
जीजीसीएसीसीसीजीसीटीसीटीएजीगेटटीसीटीटीसीजीजीएजीटीसीटीए
सीसीसीसीटीसीजीटीसीजीजीजीटीकैटकैटैकैकैकैकागागैकैक
एटगटाकैकेकासीटीसीकैगाटकैक्टगेटेटक्टैक्टगटाचैक्टगकैकैग
AAGTTCCTGGATGCCTCTCCTGATAATAAGAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATTG
अगगटगगाकागागागेकेकासीटीसीटीजीसीटीसीएटीएटीएगाटा
CTATACAGATTTTTTTATATCAATCATTCAACTCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATTTTTC
TAACACTACAAAGTCTACAAAAAAGAAGAAGAGTAGCTATAGAAGAGGTCACCACTTTCTTAGCTTAGC
AAAATGATGGTATTAGTTAAACATTCATTAGTTAGTAGATCTGGGGGgtaggaACTGTCTTTTAG
ACTGGGATGATGATGATGGGATCCGGGATGATGATATAATATTCTCAGAAGAAGAAGAAGATCTCTATAAGAAGC
AGCAGCAAAGAAGAAGATAGTAGCACTTAAGAGGCATACACACAAATTAGTAGTATAAATATATAATAATACA
कैटाएक्टागैगागागटागगटागा
टीसीसीएएएजीएक्टैक्टागाए
टीटीकेटागगता
टीजीजीकेटीटीसी
ATTTTCATATACTACCAATTATTGCGTACTTTTAGTAGTTTCTCTTTATTAACCTATATATCCTATTAACAC
TGTCAGGTTTCCCCCCTTTTGATCTCTCTCTCTCTTTTTTCATCATTTGCTGACTTTTTTTTTTTGAACAC
ATATCCTTTAACACACACACACCGTCCAGATTAGTAGCAAGAGATTAGCCCTATAACTTGTAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA
AACACTAATTTTTTAGTAGTAGTAGTTTTGTATCTAAGGCAGGCTAGगटागाकागगसी
CAATATGCTTAATTAAAACATTCTTTTTTTTTTTAAACTCATTCTCTTTTACAAGATCCTACATATATCCTATTTAT
GTATGCCTTTTTAATATCCTTTTTTTTTTTTTTTCTCTCTCTCTCTCCCCCCCCAGTTATGGAGAAAACACTAA
TGTTGTAGAGGCCCCCCAATTTCTTAGAGGATgatgatGATTTTTTTTTTTACTGATGATGATCATCATTCTCCCTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
टीटीसीसीएसीसीजीएसीएसीटीसीजीटीसीटीजीटीजीटीटीटीसीटीसीजीजीटीसी
ATTGCATGTGTTAGTAGCCATGCCTCTCTCTCTCTCCCCCCCCCCCCCCCCCCTCTATACTCTCCCCCCCCCCCCCCCCCTCTATATC
TACAGATAGCTTAGGATTATCAATTTAGGAGAAACACATTTTTTAAAGTTTTTTTTTTCATAATCACCATTT
GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATAAGAACTCAATTTTTAATATATACTT
टीसीजीएएक्टेटक्ट्टीगेटाटैसीसीकेटसीटीसीजीटीजीटीजीटीसीजीएगटाएएटाएटगगग््ग्टा
AGCCCTCTCTAGCGACTGAAGGCATTCTCGCATCATCTCTCTATACCTGCAAGGCTGTCTCTGGAT
जीजीसीटीसीएटेटगाएकाATCTGATTTTGGCAAAATAAAGATATAATATT
फॉरवर्ड प्राइमर GAGAACCCACTGCTTAC
रिवर्स प्राइमर टीटीटीटीटीटीएटाटावाटेटट्टाटट्टटीटीजी
सीसीएएएटीसी

तालिका 2:YFP/IL7 3'UTR रिपोर्टर केरिपोर्टर और प्राइमर सीक्वेंस का उदाहरण और फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के दृश्य जिनका उपयोग इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए रैखिक पीसीआर टेम्पलेट का उत्पादन करने के लिए किया जाता था ।

पूरक फ़ाइल: पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन(वाईएफपी) और रीचेरी समय-चूक रिकॉर्डिंग। YFP और mCherry समय-चूक mRNAs एन्कोडिंग Ypet/Interleukin-7 3 ' यूटीआर और पॉलीडीनेलेटेड एमसीएचरी के साथ इंजेक्शन एक oocyte की चूक रिकॉर्डिंग । YFP चैनल (पूर्व: S500/20 × ४९०५७; Em: D535/30 मीटर 47281), mCherry चैनल (पूर्व: 580/25 × 49829; Em: 632/60 मीटर) । oocytes 16 घंटे (7 फ्रेम/दूसरे) के लिए हर 15 मिनट दर्ज किए गए । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रस्तुत विधि इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान विभिन्न संक्रमणों पर लक्ष्य एमआरएनए के अनुवाद और दमन का अध्ययन करने की रणनीति का वर्णन करती है। आईएल-7, ओसाइट द्वारा जारी एक साइटोकिन जो ओसाइट-क्यूमुलस सेल कम्युनिकेशन8,13में शामिल हो सकता है, को इस विधि का वर्णन करने के उद्देश्य से चुना गया था। आईएल-7 को ओसाइट परिपक्वता 8 के दौरान तेजी से अनुवादित होने के लिए जानाजाता है और इस विधि का उपयोग करके ट्रांसलेशनल एक्टिवेशन के अच्छे दृश्य के लिए अनुमति देता है। यदि, हालांकि, अनुवाद पूरे प्रयोग में एक निरंतर दर पर होता है, तो रिपोर्टर का संचय एक रैखिक पैटर्न का पालन करेगा, और प्रयोग की शुरुआत और अंत में अनुवाद दरें समान होंगी। इस निष्कर्ष को पूरे रिकॉर्डिंग अंतराल के माध्यम से एक रैखिक प्रतिगमन के फिट (आर) की अच्छाई से सत्यापित किया जा सकता है। रिपोर्टर अनुवाद में एक दमन खुद को YFP संकेत के पठार के रूप में पेश करेंगे ।

लुओंग एट अल के अध्ययन में 3 'यूटीआर अनुवाद के दमन का एक उदाहरण पाया जा सकताहै। 5,जहां लेखक ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान ओसाइट स्रावित प्रोटीन 2 (Oosp2) के दमन की रिपोर्ट करते हैं। इन आंकड़ों का फिर से विश्लेषण किया गया है और चित्र 6में दिखाया गया है । परिपक्व ओसाइट्स वाईएफपी सिग्नल के पठार दिखाते हैं, जो अनुवाद के दमन को इंगित करता है, जबकि प्रोफ़ेस आई-गिरफ्तार नियंत्रण समूह रिपोर्टर संचय के रैखिक पैटर्न का अनुसरण करता है, जो प्रयोग की शुरुआत और अंत में समान अनुवाद दरों को इंगित करता है। अनुवाद के दमन का अध्ययन करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रोफ़ेसी आई-गिरफ्तार नियंत्रण समूह को शामिल करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि वाईपीएफ सिग्नल के पठार को खराब संस्कृति स्थितियों के कारण ओसाइट गुणवत्ता में कमी से समझाया नहीं गया है, इस प्रकार ओसाइट्स की व्यवहार्यता की पुष्टि करता है। रिपोर्टर के संचय को मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर द्वारा वाईएफपी के लिए प्राइमर का उपयोग करके या इस प्रोटोकॉल में रिपोर्टर में शामिल V5-epitope टैग का लाभ उठाकर पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा मान्य किया जा सकता है।

YFP संकेत के पठार केवल अनुवाद के सक्रिय रूप से विनियमित दमन के कारण नहीं हो सकता है, लेकिन यह भी oocyte meiotic प्रगति के दौरान रिपोर्टर के क्षरण से समझाया जा सकता है । यह अंतर्जात एमआरएनए के अस्थिर होने का दर्पण हो सकता है, जो भ्रूणीय जीनोमअभिव्यक्ति14, 15,16में संक्रमणकेलिए आवश्यक है। इस संभावना को mRNAs की स्थिरता की पुष्टि करने के लिए प्रोफैस I स्टेज बनाम मेटाफेज II चरण में लक्ष्य जीन ट्रांसक्रिप्ट स्तर को मापकर सत्यापित किया जा सकता है। ओसाइट सीडीएनए तैयार करते समय, ओलिगो-डीटी प्राइमिंग पर यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमिंग का उपयोग करना बेहतर होता है। उत्तरार्द्ध विधि जीन ट्रांसक्रिप्ट स्तरों में स्पष्ट अंतर प्रस्तुत करती है जो ट्रांसक्रिप्ट स्तर7में वास्तविक अंतर के बजाय इन प्रतिलिपियों की पाली (ए) लंबाई में अंतर को प्रतिबिंबित कर सकती है ।

माउस ओसाइट्स में जीनोम-वाइड एंडोजेनस एमआरएनए अनुवाद का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं। इन तरीकों में पॉलीसोम प्रोफाइलिंग7,17,18 औररिबोटैग/आरएनए-सेक्यू5,19,20शामिल हैं । राइबोसोम प्रोफाइलिंग जीनोम-व्यापी अनुवाद का अध्ययन करने के लिए एक और तरीका है जिसका उपयोग खमीर में किया गया है, जो एक अन्य मॉडल जीव है जिसका उपयोग मेयोसिस21, 22का अध्ययन करने के लिए कियाजाताहै। हालांकि, माउस में एमआरएनए अनुवाद का अध्ययन करने के लिए इन जीनोम-वाइड विश्लेषणों के लिए प्रति नमूना 150-200 ओसाइट्स के उपयोग की आवश्यकता होती है जबकि विश्लेषण के लिए उपलब्ध ओसाइट्स की संख्या आमतौर पर सीमित होती है। लक्ष्य mRNAs के 3 ' यूटीआर के अनुवाद का आकलन करने के लिए यहां वर्णित एकल-ओसाइट परख अनुवाद के जीनोम-व्यापी विश्लेषणों का पूरक है, क्योंकि यह 3 ' यूटीआर के तत्वों के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है जो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता4,5,6के दौरान अनुवाद कार्यक्रम को विनियमित करते हैं। अतीत में, लूसिफ़ेरेस आधारित परख का उपयोग लक्ष्य mRNAs10, 20,23के 3 ' यूटीआर के अनुवाद का आकलन करने के लिए कियाजाता था क्योंकि यह एक बहुत ही संवेदनशील तरीका है जिसके लिए प्रति नमूना केवल कुछ ओसाइट्स की आवश्यकता होती है; हालांकि, एक नमूने में लूसिफ़ेरेस की मात्रा का पता लगाने के लिए ओसाइट्स को lysed की आवश्यकता होती है।

दूसरों ने लाइव माउस ओसाइट्स 4 में जीएफपी संचय का आकलन करने के लिए3' यूटीआर/ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) रिपोर्टर का इस्तेमाल किया है । हालांकि, इन प्रयोगों में, केवल दो बार-बिंदुओं का उपयोग किया गया था: इनक्यूबेशन की शुरुआत (प्रोफैस I) और इनक्यूबेशन (मेटाफेज II) का अंत। यह माप की शक्ति को बहुत कम करता है और त्रुटियों की संभावना को बढ़ाता है। गतिज डेटा दरों (कई बिंदुओं) के आधार पर सटीक माप प्रदान करते हैं और उस समय को सटीक रूप से परिभाषित करते हैं जब ट्रांसलेशनल सक्रियण या दमन होता है। इसके अलावा, अनुवाद के दमन का आकलन इन एकल समय-बिंदुओं पर नहीं किया जा सकता है, जिससे गलत निष्कर्ष निकल सकता है । इसलिए, इस विधि को समय-चूक माइक्रोस्कोपी लागू करके समायोजित किया गया था ताकि माउस ओसाइट्स5, 6,9के विट्रो परिपक्वता में पूरे Ypet/3' यूटीआर रिपोर्टर संचय का आकलन किया जा सके। इस रणनीति का उपयोग करके, ओसाइट परिपक्वता के दौरान विभिन्न संक्रमणों पर अनुवाद का अध्ययन करना संभव है।

विचार करने के लिए इस विधि के बारे में कई महत्वपूर्ण पहलू हैं। सबसे पहले, इस्तेमाल किए गए संवाददाताओं में एक ओलिगो (ए) पूंछ शामिल है जिसकी चूक रिपोर्टर संचय को काफी कम कर देती है । यह दोनों कम अनुवाद के कारण हो सकता है और साथ ही रिपोर्टर एमआरएनए अस्थिरता24,25. प्रोफहास I में प्री-इनक्यूबेशन के दौरान, एक अल्पाधिकार जांच का अनुवाद अंतर्जात एमआरएनए5की अनुवाद दर को प्रतिबिंबित करने के लिए समायोजित करता है। दूसरा, यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि रिकॉर्डिंग की संख्या या फ्लोरेसेंस एक्सपोजर की अवधि में वृद्धि संभावित रूप से फोटोटोक्सीसिटी को प्रेरित कर सकती है और इस तरह ओसाइट गुणवत्ता को ख़राब कर सकती है। हालांकि वर्तमान प्रयोग 15 मिनट के अंतराल को अपनाया, नमूना दर कम हो सकता है जब एक उच्च फ्लोरेसेंस जोखिम कम रिपोर्टर अभिव्यक्ति के मामले में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

फोटोटॉक्सिसिटी की मात्रा को सीमित करने के लिए, एक ठंडा एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग किया गया था, जिसके लिए एक छोटी उत्तेजन26की आवश्यकता होती है। ओसाइट्स में संभावित फोटोटॉक्सिसिटी प्रभावों का आकलन करने के लिए, जीवीबीडी और पीबीई के समय की तुलना ओसाइट्स में की गई थी जो या तो सूक्ष्म इंजेक्शन थे और फ्लोरेसेंस के संपर्क में थे या इंजेक्शन नहीं थे और फ्लोरेसेंस के संपर्क में नहीं थे। माइक्रो-इंजेक्शन और फ्लोरेसेंस एक्सपोजर का संयोजन जीवीबीडी (पी<0.001) में थोड़ी देरी करने के लिए पाया गया, जबकि पीबीई का समय समान था(चित्रा 7)।

इस विधि का उपयोग इन विट्रो ओसाइट मेइटिक परिपक्वता के दौरान 3 'यूटीआर के अनुवादीय नियामक तत्वों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसी प्रकार, इसका उपयोग अनुवाद के नियमन के लिए आवश्यक कार्यात्मक 5' यूटीआर तत्वों का अध्ययन करने या इन विट्रो ओसाइट निषेचन के दौरान अनुवाद का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकताहै। यद्यपि यह विधि मानव और माउस ओसाइट्स पर लागू की गई है, यह अन्य जानवरों की प्रजातियों पर भी लागू होती है। क्योंकि यह रिपोर्टर परख एकल ओसाइट्स में किया जाता है, यह मोनो-अंडाशय प्रजातियों में उपयोग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जिसमें विश्लेषण के लिए उपलब्ध ओसाइट्स की संख्या सीमित है। जैसा कि डेन्ड ओसाइट्स का उपयोग करने के विपरीत, इस तकनीक का एक और आवेदन रिपोर्टर का इंजेक्शन क्यूमुलस-संलग्न ओसाइट्स में है, क्योंकि क्यूमुलस कोशिकाएं ट्रांसलेशनल प्रोग्राम8,10,27के नियमन में प्रमुख भूमिका निभाती हैं। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि क्यूमुलस-संलग्न ओसाइट्स को सीओसी विस्तार के दौरान क्यूमुलस कोशिकाओं के आंदोलन के कारण डीन्ड ओसाइट्स की तुलना में प्रयोग के दौरान रिकॉर्डिंग विमान से दूर जाने की अधिक संभावना है। इसके परिणामस्वरूप ओसाइट्स का एक बड़ा हिस्सा हो सकता है जिसे विश्लेषण से बाहर रखा जाना है। भविष्य में, सेल-ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है जो बूंद में ओसाइट्स के एक्स, वाई और जेड पदों को ट्रैक करने में सक्षम है, जो इस समस्या को हल कर सकता है।

अंत में, वर्णित एकल oocyte रिपोर्टर परख एक रणनीति के लिए अनुवाद कार्यक्रम की जांच करने के लिए oocyte-से-zygote संक्रमण पर मार डाला का प्रतिनिधित्व करता है । इस अनुवाद कार्यक्रम का ज्ञान बढ़ा ओसाइट विकासात्मक क्षमता के आणविक विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच आर01 GM097165, GM116926 और यूनिस कैनेडी श्रिवर एनआईसीएचडी नेशनल सेंटर्स फॉर ट्रांसलेशनल रिसर्च इन रिप्रोडक्शन एंड इन कॉन्वर्टी P50 HD055764 का समर्थन किया गया था। एनरिको एम डाल्डेलो को लालोर फाउंडेशन से फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था और नटजा जी जे कॉस्टरमैन को नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ) से रूबिकॉन फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra Sigma-Aldrich SIAL-A3311
Cilostamide EMD Millipore 231085
MEM alpha Gibco 12561-056
Minimum Essential Medium Eagle  Sigma-Aldrich M2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered Genesee Scientific Corporation (GenClone) 25-512
Sodium Bicarbonate  JT-Baker 3506-1
Sodium Pyruvate Gibco  11360-070
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
Agarose Apex Biomedical  20-102QD
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C1389-1G
Choo-Choo Cloning Kit McLab CCK-20
CutSmart Buffer (10x) New England Biolabs B7204
DNA loading dye (6x) Thermo Scientific R0611
dNTP Solution New England Biolabs N0447S
DpnI New England Biolabs R0176
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Fisher SM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova  Teknova L1010
LB Medium (Capsules) MP Biomedicals 3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Life Technologies AM1908
MfeI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit Invitrogen AM1344
Phusion High Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530
Poly(A) Tailing kit Invitrogen AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit  Qiagen 27106
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
S.O.C. medium Thermo Fisher 15544034
TAE buffer  Apex Biomedical  20-193
Ultrapure Ethidium Bromide Solution Life Technologies 15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA
Calibrated micro-pipettes Drummond Scientific Company 2-000-025 
PMSG- 5000 Mybiosource MBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 BD 305111
Syringe 1 ml BD 309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated MatTek P35G-0-20-C For time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filament Sutter Instrument BF100-78-10
Oil for Embryo Culture Irvine Scientific 9305
Petri Dish Falcon 351006 For micro-injection
Tissue Culture Dish Falcon 353001 For oocyte incubation
VacuTip Holding Capillary Eppendorf 5195000036
Software
Biorender BioRender Preparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0  Molecular Devices  For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

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References

  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 172 ऊसाइट एमआरएनए अनुवाद मेइटिक परिपक्वता समय-चूक माइक्रोस्कोपी रिपोर्टर परख माइक्रो-इंजेक्शन
एक एकल Oocyte रिपोर्टर परख का उपयोग कर इन विट्रो परिपक्वता के दौरान मातृ mRNA अनुवाद के कार्यक्रम को परिभाषित
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Costermans, N. G. J., Daldello, E.… More

Costermans, N. G. J., Daldello, E. M., Marathe, R. J., Conti, M. Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay. J. Vis. Exp. (172), e62041, doi:10.3791/62041 (2021).

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