Summary
Denne protokollen beskriver en reporteranalyse for å studere reguleringen av mRNA-oversettelse i enkle oocytter under in vitro modning.
Abstract
Hendelser knyttet til oocytt kjernefysisk modning er godt beskrevet. Imidlertid er mye mindre kjent om molekylære veier og prosesser som foregår i cytoplasma som forberedelse til befruktning og oppkjøp av totipotens. Under oocyttmodning avhenger endringer i genuttrykk utelukkende av oversettelse og nedbrytning av mors budbringer-RNAer (mRNAer) i stedet for transkripsjon. Gjennomføring av oversettelsesprogrammet spiller derfor en nøkkelrolle i etableringen av oocyttutviklingskompetanse for å opprettholde embryoutvikling. Dette dokumentet er en del av et fokus på å definere programmet for mors mRNA-oversettelse som foregår under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen. I dette metodenotatet presenteres en strategi for å studere regulering av oversettelse av mål-mRNAer under in vitro oocyttmodning. Her er en Ypet-reporter smeltet sammen til 3's uoversatte region (UTR) av genet av interesse og deretter mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylert mRNA-koding for mCherry for å kontrollere for injisert volum. Ved å bruke intervallmikroskopi for å måle reporterakkumulering, beregnes oversettelseshastigheter ved ulike overganger under oocyttmet meiotisk modning. Her er protokollene for oocyttisolasjon og injeksjon, tidsforløpopptak og dataanalyse beskrevet ved hjelp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reporter som eksempel.
Introduction
En fullvoksen pattedyr oocytt gjennomgår raske endringer i forberedelsen til befruktning og oppkjøp av totipotens. Disse endringene er avgjørende for å opprettholde embryonal utvikling etter befruktning. Selv om hendelsene knyttet til kjernefysisk modning er relativt godt beskrevet, er mye mindre kjent om molekylære prosesser og veier i oocyttcyttcytoplasma. I de siste stadiene av oocyttmodning er oocytter transkripsjonelt stille, og genuttrykk er helt avhengig av mRNA-oversettelse og nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som er kritisk for utviklingskompetanse, er derfor avhengig av et program for tidsbelastet oversettelse av langvarige mRNAer som har blitt syntetisert tidligere under oocyttvekst1,3. Som en del av et fokus på å definere dette programmet for mors mRNA-oversettelse utført under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen, presenterer denne artikkelen en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelsen av mål maternal mRNAer i enkle oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metoden klones den åpne leserammen YPet oppstrøms for 3' UTR av transkripsjonen av interesse. Deretter blir mRNAer som koder denne reporteren mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylerte mRNAer som koder mCherry for å kontrollere for injisert volum. Reporter akkumulering måles under in vitro oocytt meiotisk modning ved hjelp av tidsforløpmikroskopi. Akkumuleringen av gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres av det platåede nivået av co-injisert mCherry. Etter datainnsamling beregnes oversettelseshastigheter for ulike tidsintervaller under in vitro oocytt meiotisk modning ved å beregne hellingen av kurven oppnådd ved kurvetilpasning.
Denne tilnærmingen gir et verktøy for å eksperimentelt bekrefte endringer i oversettelsen av utvalgte endogene mRNAer. I tillegg forenkler denne metoden karakterisering av regulatoriske elementer som kontrollerer oversettelse under oocytt meiotisk modning ved å manipulere cis-regulatoriske elementer i 3' UTR for mål mRNAer4,5,6. Manipulering av poly (A) hale lengde gir også innsikt i adenylase / deadenylase aktivitet i oocytter5. Mutagenese av cis-fungerende elementer eller RNA immunoprecipitation kan brukes til å studere interaksjoner med cognate RNA bindende proteiner6,7. I tillegg kan denne metoden brukes til å identifisere viktige komponenter i oversettelsesprogrammet som er kritiske for oocyttutviklingskompetanse ved å måle mål 3' UTR-oversettelse i modeller knyttet til redusert oocyttkvalitet 8,9,10. Dette metodepapiret presenterer et representativt eksperiment der denuderte oocytter av 21-dagers C57/BL6-mus har blitt mikroinjisert med en Ypet-reporter smeltet sammen til 3' UTR av IL-7. Oppsettet og protokollen for oocyttinjeksjon, tidsforløpregistrering og dataanalyse er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle prosedyrene som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California i San Francisco (protokoll AN182026).
1. Utarbeidelse av medier
- Legg til alle komponentene, som beskrevet i Tabell 1, for å lage det grunnleggende oocyttsamlingsmediet og oocyttmodningsmediet. For det grunnleggende samlingsmediet setter du pH til 7,4. For både oppsamlings- og modningsmedium, tilsett 3 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) og 1 μM cilostamid på bruksdagen.
2. Klargjøring av mRNA-koding for Ypet-3' UTR og mCherry
- Få 3′ UTR sekvenser av mRNAer av interesse.
MERK: For denne studien ble sekvenser tidligere hentet fra mus oocytt cDNA. - Design primere for å forsterke målet 3'UTRs fra oocyte cDNA og deler av pcDNA 3.1 vektoren som inneholder en Ypet koding sekvens, V5-epitop tag, og en T7 promotør.
- Forsterk ved hjelp av et DNA-polymerasesett med høy kvalitet. Kjør polymerasekjedereaksjonsproduktene (PCR) på en gel for å sjekke om fragmentene har riktig størrelse, kutt ut båndene og trekk ut DNA-et fra gelen ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sikring PCR-fragmentene til en vektor ved hjelp av et PCR-kloningssett.
MERK: PCR-fragmenter ble inkubert på is i 4 timer for å lette en mer effektiv rekombinasjonsprosess. Dette er i strid med produsentens instruksjoner, som anbefaler en inkubasjonstid på bare 45 min. - Transfekt PCR fragmenter til kompetente 5-α Escherichia coli bakterier.
- Tilsett blandingen og plasmiden til bakteriene, og inkuber på is i 30 min.
- Varm sjokk blandingen og plasmid ved å plassere blandingen i et vannbad ved 42 °C i 45 s, og avkjøl umiddelbart på is i 3 minutter.
- Tilsett 500 μL Super Optimal kjøttkraft med Catabolite undertrykkelse (SOC) medium og inkuber i 1 time ved 37 °C.
- Spinn ned på 7000 × g i 2 min, og fjern det meste av supernatanten. Resuspend og plate på en Luria Broth (LB) agarplate med riktig utvalg antibiotika.
MERK: Carbenicillin ble brukt i denne studien. - Inkuber over natten ved 37 °C. Isoler koloniene ved å trykke lett på en pipettespiss på en av koloniene og plassere den i 3 ml LB-medium med 100 μg/ml carbenicillin. Inkuber i 12-24 timer ved 37 °C.
- Trekk ut DNA-et til plasmidene ved hjelp av det plasmide DNA-isolasjonssettet i henhold til produsentens instruksjoner og bekreft sekvensene via DNA-sekvensering.
- For Ypet/3' UTR:
- Lag en lineær PCR-mal for in vitro-transkripsjon. Bruk en fremoverprimer oppstrøms av Ypet-sekvensen og en omvendt primer med 20 ekstra tyminrester. Se tabell 2 for sekvensen av Ypet/IL-7 3' UTR og sekvensene til de fremre og omvendte primerne.
MERK: Disse ekstra tyminrester vil legge oligo (A) til den lineære mRNA etter in vitro transkripsjon. - In vitro transkriberer PCR-produktet ved hjelp av et T7 transkripsjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Rens det resulterende komplementære RNA (cRNA) ved hjelp av et transkripsjonsoppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Elute renset cRNA i RNAse-fritt vann, måle konsentrasjon og evaluere integritet ved agarose elektroforese. Oppbevars ved −80 °C.
- Lag en lineær PCR-mal for in vitro-transkripsjon. Bruk en fremoverprimer oppstrøms av Ypet-sekvensen og en omvendt primer med 20 ekstra tyminrester. Se tabell 2 for sekvensen av Ypet/IL-7 3' UTR og sekvensene til de fremre og omvendte primerne.
- For mCherry:
- Produser en lineær PCR-mal for in vitrotranskripsjon ved hjelp av et høygjengivelsesbegrensningsenzym; Bruk begrensningsenzymet mfEI-HF hvis du replikerer dette eksemplet. Fordøye i en fordøyelsesbuffer over natten ved 37 °C.
- Kjør en gel for å rense prøven, og trekk ut det lineære DNA-et ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- In vitro transkriberer PCR-produktet ved hjelp av et T7 transkripsjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Polyadenylat cRNA (150-200 nukleotider) ved hjelp av et poly (A) tailing kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Rens den resulterende cRNA ved hjelp av et transkripsjonsoppryddingssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Elute renset cRNA i RNAse-fritt vann, måle mRNA konsentrasjoner, og vurdere meldingen integritet ved gel elektroforese. Oppbevars ved −80 °C.
3. Eksperimentell prosedyre
MERK: En skjematisk oversikt over oocyttmikroinjeksjon og påfølgende intervallmikroskopi er gitt i figur 1.
- Dag 1
- Intraperitoneally injisere 21-dagers gamle mus med 5 IE av gravid mare serum gonadotropin for å fremme follikkel vekst til antral stadium11.
- Dag 3
- Oocyte-samling
- Ofre mus 44-48 timer etter priming for å samle eggstokkene, og legg dem i en plast Petri-tallerken med grunnleggende oocyttoppsamlingsmedium.
- Åpne forsiktig antralsekkene ved å lage et lite kutt i follikkelveggen med en 26 G nål. Isoler intakte cumulus-lukkede oocytter (COCer) med flere lag cumulusceller ved hjelp av en munndrevet glasspipette.
- Bruk en mindre pipette (litt større enn diameteren på oocytten), og øk COCene mekanisk ved gjentatt pipettering.
MERK: Alternativt kan du utføre mikroinjeksjon på intakte COCer. - Ved hjelp av en større pipette aspirerer du de denuderte oocyttene og legger dem i en Petri-tallerken med modningsmedium supplert med 1 μM fosfodiesterasehemmer, cilostamid, for å forhindre gjenopptakelse av meiotisk modning12. Legg parabolen i inkubatoren i 2 timer for å la oocyttene komme seg fra stresset forårsaket av isolasjon av oocyttene fra folliklene.
- Oocytt mikroinjeksjon
- Forbered injeksjonsnålene ved å plassere et 10 cm langt borosilikatglasskapillært rør i en mekanisk trekker. For optimal injeksjon, bøy nålespissen i en 45° vinkel ved hjelp av en oppvarmet filament.
- Forbered polystyrenretter med 20 μL dråper grunnleggende oocyttoppsamlingsmedium, og dekk dråpene med lett mineralolje.
- Forbered en reporterblanding ved å legge til 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR og 12,5 μg/μL mCherry. Forbered et større volum og lag aliquots for fremtidige eksperimenter for å sikre lignende reporterkonsentrasjoner. Oppbevar disse aliquots ved -80 °C. Ved opptining, først sentrifuger aliquot i 2 min ved 20,000 x g, og overfør til et nytt mikrocentrifuge rør.
MERK: Denne sentrifugeringen forhindrer at injeksjonsnålen blir tilstoppet av potensielle aggregater i reporterblandingen. - Last injeksjonsnålen med kapillæritet med ca. 0,5 μL reporterblanding.
- Plasser pipetten og den ladde injeksjonsnålen i holderne, og plasser den i dråpen av oocyttoppsamlingsmedium. Aspirer noe av mediet inn i pipetten.
- Åpne injeksjonsnålen ved å banke den forsiktig mot pipetten.
- Plasser oocytter i en dråpe med grunnleggende samlingsmedium, og injiser 5-10 pL av reporterblandingen.
- Inkuber oocyttene i modningsmediet med 1 μM cilostamid i 16 timer for å la mCherry-signalet platå.
- Forbered en Petri-tallerken som skal brukes til intervallmikroskopi med minst to 20 μL dråper modningsmedium for hver injisert reporter: en dråpe med 1 μM cilostamid for kontrollprofase I-arresterte oocytter og en dråpe uten cilostamid for modning av oocytter. Dekk dråpene med lett mineralolje og legg i inkubator.
- Mikroskopi for tidsforløp
- Etter pre-inkubasjon, fjern de injiserte oocyttene fra inkubatoren, og vask dem fire ganger i modningsmedium uten cilostamid. Hold noen oocytter i modningsmedium med 1 μM cilostamid som en profase I-arrestert oocytt kontrollgruppe.
- Overfør de injiserte oocyttene til sine respektive dråper på den tidligere forberedte mikroskopfatet. Grupper oocyttene ved hjelp av en lukket glasspipette (en lukket pipette kan tilberedes ved å holde spissen i en flamme i noen sekunder).
MERK: Klynging av oocyttene bidrar til å forhindre bevegelse under innspillingen. - Plasser fatet under mikroskopet utstyrt med et lysemitterende diodebelysningssystem og et motorisert stadium utstyrt med et miljøkammer opprettholdt ved 37 °C og 5 % CO2. For å replikere denne studien, bruk følgende parametere: filtersett: dikroisk speil YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-kanal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Utslipp (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; T: 632/60 m).
- Angi de riktige innstillingene for tidsforløpeksperimentet (se Tabell over materialer for programvaren som brukes i denne studien): Klikk på Apper | Flerdimensjonal anskaffelse. Velg den første kategorien Hoved, og velg tidsforløp, flere faseposisjonerog flere bølgelengder.
- Velg fanen Lagre for å angi stedet der eksperimentet skal lagres.
- Velg kategorien Tidsforløp for å angi antall tidspoeng, varighet og tidsintervall.
MERK: Varigheten av tidsforløpeksperimentet avhenger av dyreartene som studeres, da tidspunktet for oocytt meiotisk modning varierer mellom arter. I dette eksperimentet med musoocytter ble oocytter registrert hver 15 min i 16 timer. - Velg kategorien Fase. Slå på brightfield og finn posisjonen til oocyttene ved å åpne et nytt vindu ved å velge Hent | Skaff deg | Vis direkte. Når oocyttene er plassert, bytter du tilbake til multidimensjonal anskaffelse-vinduet og trykker på + for å angi plasseringen av oocyttene.
- Velg kategorien Bølgelengder, og angi 3 forskjellige bølgelengder for brightfield (eksponering 15 ms), YFP (eksponering 150 ms for Ypet/IL7 3' UTR) og mCherry (eksponering 75 ms for Ypet/IL7 3' UTR).
MERK: Juster eksponeringen for hver Ypet/3' UTR-reporter basert på nivået av reporterakkumulering og det injiserte volumet. Forsikre deg om at YFP-signalet faller i midten av deteksjonsområdet ved starten av eksperimentet for å forhindre underestimering eller metning i tilfelle aktivering av oversettelse. For mCherry justerer du eksponeringen for hver batch av mCherry, da signalet avhenger av antall adeninkjerner som ble tilsatt under polyadenyleringsprosedyren. På grunn av variasjonen i polyadenyleringseffektivitet, bruk samme batch av mCherry i forskjellige eksperimenter for en bedre sammenligning mellom eksperimenter. - Start tidsforløpeksperimentet ved å klikke Påkjøp. Se figur 2 og tilleggsfilen for et eksempel på et tidsforløpopptak i én enkelt oocytt.
- Analyse av Ypet-3' UTR-oversettelse
- For denne analysen (se Materialfortegnelse for programvaren som brukes i denne studien), utfør to regionmålinger for hver oocytt: oocytten selv-klikk på ellipseområdet og omgi oocytten - og en liten region nær oocytten som skal brukes til bakgrunnsdeltraksjon-klikk på rektangulær region.
MERK: Pass på at oocyttene ikke beveger seg ut av det valgte området under tidsforløpopptaket. Vær spesielt oppmerksom på plasseringen av regionmålingen rundt polar kroppsprofilering, da dette forårsaker bevegelse i oocytten og kan forvrenge opptaket. - Eksporter områdemålingsdataene til et regneark ved å klikke først på Åpne logg og deretter loggdata for å eksportere dataanalyseprogramvaren.
- For hver enkelt oocytt og for alle målte tidspunkter trekker du bakgrunnsområdemålingen fra målingen av oocyttområdet. Gjør dette for YFP- og mCherry-bølgelengder separat.
- Registrer tidspunktet for germinal vesicle breakdown (GVBD) og polar kroppsekstrudering (PBE) for senere referanse.
MERK: Utelat modning av museoocytter når GVBD overstiger 2 timer. - Plott YFP og mCherry uttrykk over tid for hver oocyte å sjekke for outliers.
MERK: Dette bør være en jevn kurve, hvis det ikke er dette, kan det tyde på at oocytten beveget seg under innspillingen. - For hver enkelt oocytt beregner du gjennomsnittlig mCherry-uttrykk for de ti siste tidspunktene i innspillingen. For hvert tidspunkt deler du YFP-uttrykket med det gjennomsnittlige mCherry-uttrykket for å korrigere for injisert volum for å oppnå et YFP/mCherry-forhold ved hvert tidspunkt for hver enkelt oocytt.
- Beregn oversettelseshastigheter for et bestemt tidsintervall ved å tilpasse kurvens helling ved lineær regresjon. Vurder forskjellene i oversettelsesrater ved hjelp av statistisk inferens.
- For denne analysen (se Materialfortegnelse for programvaren som brukes i denne studien), utfør to regionmålinger for hver oocytt: oocytten selv-klikk på ellipseområdet og omgi oocytten - og en liten region nær oocytten som skal brukes til bakgrunnsdeltraksjon-klikk på rektangulær region.
- Oocyte-samling
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denuded prophase I-arresterte oocytter av 21-dagers C57/BL6 mus ble injisert med en reporter blanding som inneholder mRNA koding Ypet reporter smeltet til 3 ' UTR av IL-7 og mRNA koding mCherry. YFP og mCherry uttrykk ble registrert i 39 oocytter, hvorav 30 ble modnet, og 9 ble arrestert i profase I som en negativ kontroll. Tre modne oocytter ble utelukket for analyse fordi de enten hadde en forsinket GVBD (N = 2) eller flyttet i parabolen under innspillingen (N = 1). Figur 3 viser mCherry- og YFP-uttrykk i profase I og modne oocytter. Figur 4 viser YFP-uttrykk for modning av oocytter korrigert for platået mCherry-uttrykk (gjennomsnittet mCherry-uttrykk i de siste 10 tidspunktene) for å korrigere for det injiserte volumet. Reporterens oversettelseshastigheter ble målt ved kurvetilpasning (lineær regresjon) av YFP/mCherry-verdiene i profase I og ved modning av oocytter i løpet av de første 0-2 t eller 8-10 h etter cilostamid-utgivelsen (Figur 5A). Akkumuleringen av reporteren følger ikke et lineært mønster, som indikert av en betydelig forskjell i oversettelseshastigheter mellom 0-2 t og 8-10 timer etter cilostamidfrigivelse (s<0.0001; Figur 5B). Derfor indikerer disse resultatene aktivering av IL-7 oversettelse under oocytt meiotisk modning.
Figur 1: Skjematisk oversikt over den eksperimentelle prosedyren. Oligoadenylert Ypet/3' UTR og polyadenylert mRNA-koding mCherry injiseres mikroinjisert i denuderte oocytter av 21-dagers gamle C57/BL6-mus. Oocytter er forhåndsinkubert i 16 timer i cilostamid som inneholder modningsmedium for å tillate mCherry-signalet å nå et platå. Etter pre-inkubasjon startes et tidsforløpopptak der oocytter enten holdes i medium med cilostamid for å skape en profase I-arrestert kontrollgruppe eller utgitt i cilostamidfritt medium for å modnes. Forkortelser: UTR = ikke-oversatt område; YFP = gult fluorescerende protein; fw primer = fremover primer; rev primer = omvendt primer; Ampr = ampicillin motstand; polyA = polyadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = germinal vesicle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på en enkelt oocytt tidsforløpopptak. Brightfield- og YFP- og mCherry-opptak av en enkelt oocytt injisert med mRNAs koding Ypet/Interleukin-7 3' UTR og polyadenylert mCherry ved profase I, MI (6 timer etter cilostamide release) og MII (15 timer etter cilostamide release). Skalastang = 25 μm. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; GV = germinal vesicle; MI = metafase I; MII = metafase II. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: YFP- og mCherry-signaler registrert ved intervallmikroskopi. YFP- og mCherry-signaler om oocytter injisert med oligoadenylert Ypet/IL7 3' UTR og polyadenylert mRNA-koding mCherry. Oocytter ble enten holdt i medium med cilostamid for å generere en profase I-arrestert kontrollgruppe (N = 9) eller utgitt i cilostamidfritt medium for å tillate modning (N = 30). Data er individuelle oocyttmålinger. Forkortelser: IL-7 = interleukin-7; YFP = gult fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: YFP-signal korrigert for co-injisert mCherry-nivå. YFP-signaler om profase I-arresterte og modne oocytter ble korrigert for injisert volum ved å dele YFP-signalet med det gjennomsnittlige mCherry-signalet fra de siste 10 tidspoengene. Individuelle YFP/mCherry-forhold for (A) profase I-arresterte oocytter og (B) modning av oocytter og bety ± standardfeil i de gjennomsnittlige YFP/mCherry-forholdet mellom (C) profase I-arresterte og (D) modne oocytter. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; GVBD = germinal vesicle sammenbrudd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Beregnede oversettelseshastigheter ved 0-2 t og 8-10 t modning. (A) Gult fluorescerende protein (YFP) signaler om enkeltoocytter korrigert for mCherry (YFP/mCherry) ved 0-2 t eller 8-8-2 10 timer etter cilostamid-frigjøring og (B) oversettelseshastigheter (gjennomsnitt ± standardfeil i gjennomsnittet) som beregnet ved kurvetilpasning (lineær regresjon) YFP/mCherry-verdiene ved 0-2 t og 8-10 timer etter cilostamid-frigjøring. Data ble analysert ved hjelp av den ubetalte tosidige t-testen. *p < 0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksempel på undertrykking av oversettelse: Oosp2. Re-analyserte data fra et eksperiment der oocytter ble injisert med Ypet-Oosp2 3′ UTR og polyadenylert mRNA-koding mCherry. YFP-signaler om profase I-arrestert (N = 63) og modning av oocytter (N = 72) ble korrigert for injisert volum ved å dele YFP-signalet med det gjennomsnittlige mCherry-signalet fra de siste 10 tidspunktene. YFP- og mCherry-uttrykksdata ble innhentet ved hjelp av en Xenon Arc-lampe, i motsetning til IL-7-eksperimentet der en LED-lyskilde ble brukt. Data representerer gjennomsnittet ± standardfeil ved gjennomsnittet av individuelle oocyttmålinger og ble tidligere publisert i Luong et al. 5. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; Oosp2 = oocytt utskilt protein 2; UTR = uoversatt område; IL-7 = interleukin-7; LED = lysdiode; GVBD = germinal vesicle sammenbrudd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Effekt av mikroinjeksjon og fluorescenseksponering på tidspunktet for GVBD og PBE. Tidspunkt for GVBD og PBE av oocytter som enten ble mikroinjisert og eksponert for fluorescens (injisert), eller ikke injisert og ikke utsatt for fluorescens (ikke injisert). Data er individuelle oocyttmålinger. Data ble analysert ved hjelp av den ubetalte tosidige t-testen. *p<0.001. Forkortelser: GVBD = germinal vesicle sammenbrudd; PBE= polar kroppsekstrudering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Grunnleggende oocyttsamlingsmedium | ||
| komponent | For 500 ml | |
| HEPES modifisert Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g | |
| natron | 252 mg | |
| Natrium pyruvat | 1,15 ml | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 ml | |
| Ultrarent destillert vann (Invitrogen, 10977-015) | Opptil 500 ml | |
| Modningsmedium | ||
| komponent | For 500 ml | |
| MEM alfa 1x | Opptil 500 ml | |
| Natrium pyruvat | 1,15 ml | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 ml | |
Tabell 1: Forberedelse av medier. Liste over komponenter som må legges til for å forberede grunnleggende oocyttoppsamlingsmedium og oocyttmodningsmedium.
| sekvens | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTATTACGACTCACTATAGGGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGCGCGCCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC KATAGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTCATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATAATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTAG ACTGGAGATACTGGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACA KATAAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCTATCTATATATATA ATTTCATATACTACCAATTGCGTACTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTCTTGTTTTATAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTGTAAGGTCTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCACCCCTATAATGCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAAACACCAATTGTTTAAAGTTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCAACTTGTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATATTTTT |
||||
| Fremoverprimer | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Omvendt primer | TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTG CCAAAATC |
||||
Tabell 2: Eksempel på reporter- og primersekvenser Sekvens av YFP/IL7 3'UTR-reporter og sekvenser av fremre og omvendte primere som ble brukt til å produsere en lineær PCR-mal for in vitro-transkripsjon.
Tilleggsfil: Gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry tidsforløpopptak. YFP og mCherry tidsforløp opptak av en enkelt oocytt injisert med mRNAs koding Ypet / Interleukin-7 3 ' UTR og polyadenylated mCherry. YFP-kanal (f.eks. S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; T: 632/60 m). Oocyttene ble spilt inn hvert 15. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte metoden beskriver en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelse av mål mRNA ved ulike overganger under in vitro oocytt meiotisk modning. IL-7, en cytokin utgitt av oocytten som kan være involvert i oocyte-cumulus cellekommunikasjon8,13, ble valgt med det formål å beskrive denne metoden. IL-7 er kjent for å bli stadig mer oversatt under oocyttmodning8 og muliggjør god visualisering av translasjonell aktivering ved hjelp av denne metoden. Hvis oversettelsen imidlertid skjer i konstant hastighet gjennom hele eksperimentet, vil akkumulering av en reporter følge et lineært mønster, og oversettelsesratene i begynnelsen og slutten av eksperimentet vil være like. Denne konklusjonen kan verifiseres ved god passform (R) av en lineær regresjon gjennom hele opptaksintervallet. En undertrykkelse i reporteroversettelse vil presentere seg som platåingen av YFP-signalet.
Et eksempel på undertrykkelse av 3' UTR-oversettelse, finnes i studiet av Luong et al. 5, hvor forfatterne rapporterer undertrykkelse av Oocyte Utskilt Protein 2 (Oosp2) under oocytt meiotisk modning. Disse dataene er analysert på nytt og vises i figur 6. De modne oocyttene viser platåing av YFP-signalet, som indikerer undertrykkelse av oversettelse, mens den profase I-arresterte kontrollgruppen følger et lineært mønster av reporterakkumulering, noe som indikerer lignende oversettelseshastigheter i begynnelsen og slutten av eksperimentet. Når du studerer undertrykkelse av oversettelse, er det spesielt viktig å inkludere en profase I-arrestert kontrollgruppe for å sikre at platåingen av YPF-signalet ikke forklares av en nedgang i oocyttkvaliteten på grunn av dårlige kulturforhold, og dermed bekrefter levedyktigheten til oocyttene. Akkumulering av reporteren kan valideres ved kvantitativ omvendt transkripsjon PCR ved hjelp av primere for YFP eller ved vestlig blotting ved å dra nytte av V5-epitop-taggen som er inkludert i reporteren i denne protokollen.
Platåing av YFP-signalet skyldes kanskje ikke utelukkende aktivt regulert undertrykkelse av oversettelse, men kan også forklares med nedbrytning av reporteren under oocytt meiotisk progresjon. Dette kan speile destabilisering av den endogene mRNA, som er avgjørende for overgangen til embryonalt genomuttrykk14,15,16. Denne muligheten kan verifiseres ved å måle målgentranskripsjonsnivåer i det profase jeg iscenesetter vs. metafase II-stadiet for å bekrefte stabiliteten til mRNAene. Når du forbereder oocytt cDNA, er det å foretrekke å bruke tilfeldig heksamer som grunner over oligo-dT-grunning. Sistnevnte metode presenterer tydelige forskjeller i gentranskripsjonsnivåer som kan reflektere forskjeller i poly (A) lengde på disse transkripsjonene i stedet for faktiske forskjeller i transkripsjonsnivå7.
Det finnes flere metoder for å studere genom-bred endogen mRNA oversettelse i mus oocytter. Disse metodene inkluderer polysomprofilering7,17,18 og RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Ribosomprofilering er en annen metode for å studere genom-bred oversettelse som har blitt brukt i gjær, som er en annen modellorganisme som brukes til å studere meiosis21,22. Imidlertid krever disse genomomfattende analysene for å studere mRNA-oversettelse i musen bruk av 150-200 oocytter per prøve, mens antall oocytter tilgjengelig for analyse vanligvis er begrenset. Enkelt-oocyttanalysen som er beskrevet her, for å vurdere oversettelse av 3' UTR av mål-mRNAer utfyller genomomfattende analyser av oversettelse, da det tillater karakterisering av elementer fra 3' UTR som regulerer oversettelsesprogrammet under oocytt meiotisk modning4,5,6. Tidligere ble luciferasebaserte analyser brukt til å vurdere oversettelse av 3' UTR av mål mRNAer10,20,23, da det er en svært følsom metode som krever bare noen få oocytter per prøve; Oocyttene må imidlertid lyses for å oppdage mengden luciferase i en prøve.
Andre har brukt en 3 ' UTR / grønn fluorescerende protein (GFP) reporter for å vurdere GFP akkumulering i levende mus oocytter4. Men i disse forsøkene ble bare to tidspunkter brukt: begynnelsen av inkubasjon (profase I) og slutten av inkubasjonen (metafase II). Dette reduserer kraften i målingene sterkt og øker muligheten for feil. Kinetiske data gir nøyaktige målinger basert på priser (flere punkter) og definerer nøyaktig tiden når oversettelsesaktivering eller undertrykkelse finner sted. I tillegg kan ikke undertrykking av oversettelse vurderes på disse engangspunktene, noe som kan føre til en unøyaktig konklusjon. Derfor ble denne metoden justert ved å bruke intervallmikroskopi for å vurdere Ypet/3' UTR-reporterakkumulering gjennom in vitro modning av museoocytter5,6,9. Ved å bruke denne strategien er det mulig å studere oversettelse ved ulike overganger under oocyttmodning.
Det er flere viktige aspekter ved denne metoden å vurdere. For det første inkluderer reporterne en oligo (A) hale hvis utelatelse reduserer reporterakkumulering betydelig. Dette kan skyldes både redusert oversettelse samt reporter mRNA destabilisering24,25. Under pre-inkubasjonen i profase I justeres oversettelsen av en oligoadenylert sonde for å gjenspeile oversettelseshastigheten til den endogene mRNA5. For det andre er det viktig å innse at en økning i antall opptak eller varighet av fluorescenseksponering potensielt kan indusere fototoksisitet og dermed svekke oocyttkvaliteten. Selv om det nåværende eksperimentet tok i bruk intervaller på 15 minutter, kan samplingsfrekvensen reduseres når en høy fluorescenseksponering må brukes ved lavt reporteruttrykk.
For å begrense mengden fototoksisitet ble det brukt en kald LED-lyskilde, noe som krever en kortere eksitasjon26. For å vurdere potensielle fototoksisitetseffekter i oocyttene ble tidspunktet for GVBD og PBE sammenlignet i oocytter som enten ble mikroinjisert og utsatt for fluorescens eller ikke injisert og ikke utsatt for fluorescens. Kombinasjonen av mikroinjeksjon og fluorescenseksponering ble funnet å forsinke GVBD (p<0,001), mens tidspunktet for PBE var lik (figur 7).
Denne metoden har blitt brukt til å studere translasjonelle regulatoriske elementer i 3' UTR under in vitro oocyte meiotic modning. På samme måte kan den også brukes til å studere funksjonelle 5' UTR-elementer som er avgjørende for regulering av oversettelse eller for å studere oversettelse under in vitro oocytt befruktning. Selv om denne metoden har blitt brukt på menneskelige og mus oocytter, gjelder den også for andre dyrearter. Fordi denne reporteranalysen utføres i enkle oocytter, er den spesielt egnet for bruk i mono-ovulatoriske arter der antall oocytter tilgjengelig for analyse er begrenset. I motsetning til å bruke denuded oocytter, er en annen anvendelse av denne teknikken injeksjonen av reporteren i cumulus-lukkede oocytter, da cumuluscellene spiller en viktig rolle i reguleringen av oversettelsesprogrammet8,10,27. Det bør imidlertid tas i betraktning at cumulus-lukkede oocytter er mer sannsynlig å bevege seg bort fra opptaksplanet under eksperimentet sammenlignet med denuded oocytter på grunn av bevegelsen av cumulus-cellene under COC-utvidelse. Dette kan føre til en større andel oocytter som må utelukkes fra analyse. I fremtiden kan cellesporingsprogramvare brukes som er i stand til å spore x-, y- og z-posisjoner til oocyttene i dråpen, noe som kan løse dette problemet.
Til slutt representerer den beskrevne enkelt oocyttreporteranalysen en strategi for å undersøke oversettelsesprogrammet som utføres ved oocytt-til-zygote-overgangen. Økt kunnskap om dette oversettelsesprogrammet kan gi viktige ledetråder om molekylær regulering av oocytt utviklingskompetanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello ble støttet av et stipend fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans ble støttet av et Rubicon-stipend fra Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
