Summary
Hier stellen wir eine modifizierte TGA-Methode zur Abschätzung des Ligningehalts in krautiger pflanzlicher Biomasse vor. Diese Methode schätzt den Ligningehalt durch Bildung spezifischer Thioetherbindungen mit Lignin und stellt einen Vorteil gegenüber der Klason-Methode dar, da sie eine relativ kleine Stichprobe für die Ligningehaltsschätzung erfordert.
Abstract
Lignin ist ein natürliches Polymer, das nach Cellulose das zweithäufigste Polymer auf der Erde ist. Lignin wird hauptsächlich in pflanzlichen sekundären Zellwänden abgelagert und ist ein aromatisches Heteropolymer, das hauptsächlich aus drei Monolignolen mit erheblicher industrieller Bedeutung besteht. Lignin spielt eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung von Pflanzen, schützt vor biotischen und abiotischen Belastungen und in der Qualität von Tierfutter, Holz und industriellen Ligninprodukten. Eine genaue Abschätzung des Ligningehalts ist sowohl für das grundlegende Verständnis der Ligninbiosynthese als auch für die industriellen Anwendungen von Biomasse unerlässlich. Die Thioglykolsäure (TGA)-Methode ist eine sehr zuverlässige Methode zur Abschätzung des Gesamtligningehalts in der pflanzlichen Biomasse. Diese Methode schätzt den Ligningehalt durch Bildung von Thioethern mit den Benzylalkoholgruppen von Lignin, die unter alkalischen Bedingungen löslich und unter sauren Bedingungen unlöslich sind. Der Gesamt-Ligningehalt wird anhand einer Standardkurve geschätzt, die aus kommerziellem Bambus-Lignin erzeugt wird.
Introduction
Lignin ist eine der lebenswichtigen tragenden Komponenten pflanzlicher Zellwände und das zweithäufigste Polymer auf der Erde1. Chemisch ist Lignin ein vernetztes Heteropolymer, das aus hochmolekularen komplexen phenolischen Verbindungen besteht, die eine natürliche erneuerbare Quelle aromatischer Polymere und die Synthese von Biomaterialien bilden2,3. Dieses natürliche Polymer spielt eine wichtige Rolle bei Pflanzenwachstum, Entwicklung, Überleben, mechanischer Unterstützung, Zellwandsteifigkeit, Wassertransport, Mineraltransport, Unterbringungsresistenz, Gewebe- und Organentwicklung, Energieablagerung und Schutz vor biotischen und abiotischen Belastungen4,5,6,7. Lignin besteht hauptsächlich aus drei verschiedenen Monolignolen: Coniferyl-, Sinapyl- und p-Cumarinalkohole, die aus dem Phenylpropanoidweg8,9abgeleitet sind . Die Menge an Lignin und die Zusammensetzung der Monomere variieren je nach Pflanzenart, Gewebe- / Organtyp und verschiedenen Stadien der Pflanzenentwicklung10. Lignin wird grob in Nadelholz, Hartholz und Graslignin klassifiziert, basierend auf der Quelle und der Monolignolzusammensetzung. Nadelholz besteht hauptsächlich aus 95% Coniferylalkohol mit 4% p-Cumarin und 1% Sinapylalkoholen. Laubholz hat Nadel- und Sinapylalkohole in gleichen Anteilen, während Gras lignin aus verschiedenen Anteilen von Coniferyl-, Sinapyl- und p-Cumarinalkoholenbesteht 11,12. Die Zusammensetzung der Monomere ist entscheidend, da sie die Ligninstärke, den Abbau und den Abbau der Zellwand bestimmt sowie die molekulare Struktur, Verzweigung und Vernetzung mit anderen Polysaccharidenbestimmt 13,14.
Die Ligninforschung gewinnt aufgrund ihrer niedrigen Kosten und hohen Häufigkeit an Bedeutung in der Nahrungssuche, Textilindustrie, Papierindustrie und für Bioethanol, Biokraftstoffe und Bioprodukte15,16. Verschiedene chemische Methoden (z. B. Acetylbromid, saure Reinigungsmittel, Klason und Permanganatoxidation) sowie instrumentelle Methoden (z. B. Nahinfrarotspektroskopie (NIR), Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Ultraviolettspektrophotometrie (UV) wurden zur Ligninquantifizierungverwendet 9,17. Die Analysemethoden von Lignin werden im Allgemeinen nach elektromagnetischer Strahlung, Gravimetrie und Löslichkeit klassifiziert. Das Prinzip der Ligninabschätzung durch elektromagnetische Strahlung basierte auf der chemischen Eigenschaft von Lignin, mit der es Licht bei bestimmten Wellenlängen absorbiert. Diese Ergebnisse wurden auf der Grundlage des Prinzips geschätzt, dass Lignin eine stärkere UV-Absorption als Kohlenhydrate hat. Im Jahr 1962 verwendeten Bolker und Somerville Kaliumchloridpellets, um den Ligningehalt in Holz zu schätzen18. Diese Methode hat jedoch Nachteile bei der Abschätzung des Ligningehalts aus krautigen Proben aufgrund des Vorhandenseins von Nicht-Ligninphenolverbindungen und des Fehlens eines geeigneten Extinktionskoeffizienten. Im Jahr 1970 fanden Fergus und Goring heraus, dass die Absorptionsmaxima von Guaiacyl und Syringylverbindung bei 280 nm und 270 nm lagen, was das Problem des Extinktionskoeffizienten der Bolker- und Somerville-Methodekorrigierte 19. Später wurde die Infrarotspektroskopie, eine hochempfindliche Technik zur Charakterisierung von Phenolen, auch zur Ligninschätzung mit einer kleinen Menge pflanzlicher Biomasseproben eingesetzt. Ein Beispiel für eine solche Technologie war die diffreflektierte Fourier-Transformationsspektrophotometrie. Diesem Verfahren fehlt jedoch ein geeigneter Standard ähnlich dem UV-Verfahren20. Später wurde der Ligningehalt mittels NIRS (Nahinfrarotspektroskopie) und NMR (Kernspinresonanzspektroskopie) geschätzt. Obwohl es Nachteile in diesen Methoden gibt, verändern sie nicht die chemische Struktur von Lignin und behalten seine Reinheit20.
Die gravimetrische Klason-Methode ist eine direkte und zuverlässigste Analysemethode zur Ligninschätzung von holzigen Stängeln. Grundlage für die gravimetrische Ligninschätzung ist die Hydrolyse/Solubilisierung von Nicht-Ligninverbindungen und die Sammlung von unlöslichem Lignin für die Gravimetrie21. Bei diesem Verfahren werden die Kohlenhydrate durch Hydrolyse der Biomasse mit konzentriertemH2SO4 entfernt, um Ligninreste20,22zu extrahieren. Der mit dieser Methode geschätzte Ligningehalt wird als säureunlösliches Lignin oder Klason-Lignin bezeichnet. Die Anwendung der Klason-Methode hängt von der Pflanzenart, dem Gewebetyp und dem Zellwandtyp ab. Das Vorhandensein variabler Mengen an Nicht-Lignin-Komponenten wie Tanninen, Polysacchariden und Proteinen führt zu proportionalen Unterschieden bei der Abschätzung des gehalts an säureunlöslichem/löslichem Lignin. Daher wird die Klason-Methode nur für die Ligninschätzung von Biomasse mit hohem Ligningehalt wie holzigen Stängelnempfohlen 17,23. Löslichkeitsmethoden wie Acetylbromid (AcBr), säureunlösliches Lignin und Thioglykolsäure (TGA) sind am häufigsten verwendete Methoden zur Abschätzung des Ligningehalts aus verschiedenen pflanzlichen Biomassequellen. Kim et al. etablierten zwei Methoden zur Ligninextraktion durch Solubilisierung. Das erste Verfahren extrahiert Lignin als unlöslichen Rückstand durch Solubilisieren von Cellulose und Hemicellulose, während das zweite Verfahren Lignin in der löslichen Fraktion trennt, wobei Cellulose und Hemicellulose als unlöslicher Rückstand24 verbleiben.
Ähnliche Methoden, die bei der Ligninschätzung auf der Grundlage der Löslichkeit verwendet werden, sind Thioglykolsäure (TGA) und Acetylbromid (AcBr) Methoden25. Sowohl TGA- als auch Acetylbromidmethoden schätzen den Ligningehalt, indem sie die Absorption des solubilisierten Lignins bei 280 nm messen; Die AcBr-Methode baut jedoch Xyle während des Prozesses der Lignin-Solubilisierung ab und zeigt einen falschen Anstieg des Ligningehalts26. Die Thioglykolat-Methode (TGA) ist die zuverlässigere Methode, da sie von einer spezifischen Bindung mit den Thioethergruppen der Benzylalkoholgruppen von Lignin mit TGA abhängt. Das TGA-gebundene Lignin wird unter sauren Bedingungen unter Verwendung von HCl gefällt, und der Ligningehalt wird anhand seiner Absorption auf 280 nm27geschätzt. Die TGA-Methode hat zusätzliche Vorteile von weniger strukturellen Modifikationen, einer löslichen Form der Ligninschätzung, weniger Interferenzen durch Nicht-Lignin-Komponenten und einer präzisen Schätzung von Lignin aufgrund spezifischer Bindung mit TGA.
Diese TGA-Methode wird basierend auf der Art der pflanzlichen Biomasseprobe modifiziert, die für die Schätzung des Ligningehalts verwendet wird. Hier haben wir die schnelle TGA-Methode von Reisstrohhalmen27 auf Baumwollgewebe modifiziert und angepasst, um den Ligningehalt abzuschätzen. Kurz gesagt, die getrockneten pulverförmigen Pflanzenproben wurden einem Proteinlösibilisierungspuffer und einer Methanolextraktion unterzogen, um Proteine und die alkohollösliche Fraktion zu entfernen. Der alkoholunlösliche Rückstand wurde mit TGA und gefälltem Lignin unter sauren Bedingungen behandelt. Eine Lignin-Standardkurve wurde mit kommerziellem Bambus-Lignin erzeugt und eine Regressionslinie (y = mx+c) erhalten. Der "x"-Wert verwendet durchschnittliche Absorptionswerte von Lignin bei 280 nm, während "m"- und "c"-Werte aus der Regressionslinie eingegeben wurden, um unbekannte Ligninkonzentrationen in Baumwollpflanzen-Biomasseproben zu berechnen. Diese Methode ist in fünf Phasen unterteilt: 1) Vorbereitung von Pflanzenproben; 2) Waschen der Proben mit Wasser und Methanol; 3) Behandlung des Pellets mit TGA und Säure zum Ausfällung von Lignin; 4) Ausfällung von Lignin; und 5) die Standardkurvenvorbereitung und die Schätzung des Ligningehalts der Probe. Die ersten beiden Phasen konzentrieren sich in erster Linie auf die Pflanzenmaterialaufbereitung, gefolgt von Wasser-, PSB- (Protein-Solubilization Buffer) und Methanolextraktionen, um das alkoholunlösliche Material zu erhalten. Dann wurde es mit TGA (Thioglykolsäure) und HCl behandelt, um in der dritten Phase einen Komplex mit Lignin zu bilden. Am Ende wurde HCl verwendet, um Lignin auszuscheiden, das in Natriumhydroxid gelöst wurde, um seine Absorption bei 280 nm28zu messen.
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Protocol
1. Vorbereitung von Pflanzenproben
- Sammeln Sie zwei Monate alte Baumwollpflanzen aus dem Gewächshaus (Abbildung 1A).
- Kehren Sie pflanzentöpfe vorsichtig um, um Erde und Wurzeln mit intakten Seitenwurzeln zu trennen, indem Sie den Boden um die Pflanze herum lockern (Abbildung 1B).
- Waschen Sie die gesammelten Pflanzen gründlich in mit Wasser gefüllten Schalen, um den gesamten Schmutz (für Wurzelproben) zu entfernen (Abbildung 1C).
- Verwenden Sie Papierhandtücher, um getrennte Wurzel-, Stängel- und Blatttücher zu trocknen, und beschriften Sie sie (Abbildung 1D). 2 Tage an der Luft bei Raumtemperatur trocknen, um eine Pilzkontamination zu vermeiden (Abbildung 1E).
- Probengewebe in markierte Behälter/Aluminiumfolien überführen und in 7 bis 10 Tage in einem temperaturgeführten Inkubator bei 49 °C inkubieren (Abbildung 1F).
HINWEIS: Höhere Temperaturen können die Ligninstruktur verändern. Alternativ kann ein Gefriertrockner verwendet werden, um Proben für 1 bis 2 Tage zu trocknen, ohne chemische Veränderungen an der Pflanzenbiomasse zu verursachen. - Verwenden Sie eine Klinge, um das inkubatorgetrocknete Gewebe in 5 mm große Stücke zu schneiden, oder verwenden Sie alternativ eine Biomassemühle, um das Pflanzengewebe zu mahlen (Abbildung 1G, Abbildung 1H).
HINWEIS: Die Biomassemühle/ -klinge muss gereinigt werden, nachdem jede Probe geschnitten / gemahlen wurde. - Das geschnittene Gewebe/Biomasse gemahlene Pflanzenmaterial in Mahlfläschchen überführen und mit einer Gefriermühle oder kryogenen Mühle mit FlüssigkeitN2zu feinem Pulver von 1 mm Größe mahlen.
- Mahlen Sie Proben für drei Zyklen mit einer Geschwindigkeit von 10 CPS (jede Zyklusspanne von 2 min) zu einem gleichmäßigen Pulver (Abbildung 1I, 1J, 1K).
HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle pausiert werden und Proben können bei Raumtemperatur in luftdichten Behältern zur Langzeitlagerung gelagert werden.
2. Waschen von Proben mit Wasser, PSB und Methanol
- Messen und erfassen Sie das Gewicht aller leeren 2-ml-Mikrofugenröhrchen, die zur Schätzung des Ligningehalts verwendet werden, im Labornotizbuch.
- 20 mg des gemahlenen Probenpulvers in das vorgewogene Röhrchen geben. Wiegen Sie den Schlauch mit Gewebe und Gewebepulver und notieren Sie diese Gewichte im Labornotizbuch.
- Alle 2 ml Mikrofugenröhrchen (mit offenen Deckeln) mit 20 mg Gewebepulver in einem Wärmeblock oder Ofen bei 60 °C für 1 Stunde inkubieren.
- Nach der Inkubation die Proben 10 min bei Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen.
- Fügen Sie 1,8 ml Wasser zu jedem Mikrofugenröhrchen hinzu und mischen Sie es durch Wirbeln. Zentrifugieren Sie dann bei 25.200 x g (15.000 U /min) für 10 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand (Abbildung 2).
- 1,8 ml Protein Solubilization Buffer (PSB)(Tabelle 1)zu jedem zurückgehaltenen Pellet geben und durch Vortexing mischen. Zentrifuge bei 25.200 x g (15.000 U/min) für 10 min bei RT und verwerfen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 für jedes Beispiel erneut.
- 1,8 ml Wasser zu jedem Pellet geben, durch Wirbeln mischen und bei 25.200 x g (15.000 U/min) zentrifugieren, für 10 min. Bewahren Sie nach der Zentrifugation das Pellet auf und entsorgen Sie den Überstand.
- Zum zurückgehaltenen Pellet 1,8 ml Methanol geben und in einem 60 °C Wärmeblock für 20 min inkubieren. Dann Zentrifuge bei 25.200 x g (15.000 U/min) für 10 min bei RT zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet behalten (Abbildung 2).
- Wiederholen Sie Schritt 2.9 für jedes Beispiel erneut.
- Trocknen Sie das Pellet an der Luft bei RT oder fahren Sie sofort mit der Vakuumtrocknung fort. Vakuumtrocknen sie mit einem Vakuumtrockner bei 30 °C für 2 bis 3 Stunden oder bis das Pellet vollständig getrocknet ist.
HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle durch Lufttrocknung über Nacht pausiert oder durch Vakuumtrocknung fortgesetzt werden. - Nach dem Trocknen Probenröhrchen mit dem getrockneten Pellet wiegen und das Gewicht neben dem jeweiligen Leerröhrchengewicht im Labornotizbuch festhalten. Schätzen Sie das Pelletgewicht, indem Sie die beiden Werte subtrahieren. Diese Gewichte werden für die Ligninschätzung am Ende des Ligninextraktionsprozesses verwendet.
- An diesem Punkt der Ligningewinnung schließen Sie das kommerzielle Bambuslignn zur Erzeugung der Lignin-Standardkurve ein. Messen Sie kommerzielles Bambuslignin in separaten Röhrchen von 0,5 mg bis 5 mg in Schritten von 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg und 5,0 mg). Messen Sie jede Konzentration dreimal für drei technische Replikate.
HINWEIS: Von hier an wurden die im obigen Schritt gemessenen Standards auf die gleiche Weise verarbeitet wie die getrockneten Proben.
3. Behandlung von Pellets mit TGA und Säure zum Ausfällung von Lignin
- Behandelte Proben aus dem obigen Schritt zusammen mit gemessenen Standards der TGA-Behandlung (Thioglykolsäure).
- Zu jedem Pellet werden 1 ml 3 N HCl(Tabelle 1)und 100 μL TGA hinzugefügt.
- Wirbel und inkubieren in einem 80 °C vorgewärmten Wärmeblock für 3 Stunden in einem Abzug (Abbildung 2).
HINWEIS: Der Heizschritt bei 80 °C muss überwacht werden. Hochdruckaufbau kann die Deckel öffnen und zu Chemikalienaustritten führen. Schraubverschlussrohre werden empfohlen, aber 2 mL-Rohre können während dieses Schritts als Alternative lose verschlossen werden, um solche Verschüttungen zu verhindern. - Nach der Inkubation die Röhrchen bei RT für 10-15 min abkühlen und bei 25.200 x g (15.000 U/min) für 10 min bei RT zentrifugieren.
HINWEIS: Abfälle aus sauren und organischen Lösungsmitteln müssen getrennt und in Glasbehältern mit belüfteten Kappen gelagert werden. Verwenden Sie separate Glasbehälter für die Sammlung von TGA-sauren Abfällen und sauren Abfällen. - Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet behalten. 1 ml Wasser hinzufügen, durch Wirbeln mischen und bei 25.200 x g (15.000 U/min) zentrifugieren, für 10 min bei RT.
- Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in 1 N NaOH für 24 h bei 37 °C Shaker/Thermomischer bei niedriger Geschwindigkeit mischen (Abbildung 2).
HINWEIS: Diese Inkubationszeit kann auf 1 Stunde7reduziert werden. - Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die 2 mL Mikrofugenröhrchen bei 25.200 x g (15.000 U/min) für 10 min bei RT. Behalten Sie den Überstand für den nächsten Schritt bei.
HINWEIS: Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von starken Säuren und anderen Chemikalien, die in der Natur korrosiv sind. Daher wird empfohlen, während des gesamten Prozesses der Ligninschätzung eine geeignete PSA zu tragen. TGA hat einen starken unangenehmen Geruch und ist von Natur aus ätzend. Daher wird empfohlen, nur im Abzug zu verwenden.
4. Ausfällung von Lignin
- Den Überstand in ein frisches 2-ml-Mikrofugenröhrchen geben und 200 μL konzentriertes HCl hinzufügen.
HINWEIS: Der Extraktionsprozess kann an dieser Stelle pausiert werden, indem der Kühlschritt auf über Nacht verlängert wird. - Zentrifuge bei 25.200 x g (15.000 U/min) für 10 min bei RT und lösen Sie das Pellet in 1 mL 1 N NaOH.
- Im Shaker bei RT für 10 min inkubieren, um das Pellet vollständig in NaOH zu suspendieren.
- Schließlich messen Sie die Absorption von Proben bei 280 nm mit einem Spektralphotometer und vergleichen Sie mit der Standard-Ligninkurve.
- Messen Sie die unbekannte Konzentration von Lignin mithilfe der Regressionslinienwerte der Kalibrierkurve und der Absorptionen extrahierter Proben bei 280 nm.
5. Standardkurvenvorbereitung und Ligninschätzung in der Probe
- Verarbeiten Sie Ligninstandards auf die gleiche Weise wie experimentelle Proben aus der TGA-Behandlung.
- Messen Sie kommerzielle Bambus-Lignin-Standards in Schritten von 0,5 mg, beginnend mit 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg und 5 mg. Anschließend wird durch TGA, HCl, in 1 N NaOH gelöst, gefolgt von der Messung der Absorption bei 280 nm(Abbildung 3A).
- Verwenden Sie Werte der Ligninkonzentration und Absorptionswerte, um ein verstreutes Diagramm der Standard-Ligninkurve zu erzeugen (Abbildung 3B).
- Verwenden Sie die Regressionslinie y = mx+c, die im Streudiagramm generiert wird, für die Schätzung des unbekannten Ligningehalts von vorbereiteten Proben unter Verwendung von "x"-Werten aus durchschnittlichen Absorptionen extrahierter Proben bei 280 nm und "m"- und "c"-Werten aus der Lignin-Standardkurvenregressionslinie.
- Teilen Sie den Ligningehalt im resultierenden y-Wert durch das Gesamtgewicht der vakuum-/luftgetrockneten Pflanzlichen Biomasseprobe nach Methanolextraktion in mg (ca. 15 mg), um die Ligninkonzentration pro mg zu erhalten. Multiplizieren Sie dann diesen Wert mit 100, um den Ligninanteil pro mg zu berechnen.
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Representative Results
Zwei verschiedene Baumwoll-Versuchslinien wurden auf Unterschiede in ihrem Ligningehalt in verschiedenen Geweben verglichen. Der extrahierte Ligningehalt jeder Probe wurde bei 280 nm gemessen und die jeweiligen Absorptionswerte aufgezeichnet. Die durchschnittlichen Absorptionswerte jedes biologischen Replikats wurden mit der Regressionslinie der Lignin-Standardkurve verglichen (Tabelle 2, Abbildung 3C). Die Regressionslinie y = mx + c wird verwendet, um den unbekannten Ligningehalt der extrahierten Versuchslinien, Probe 1 und Probe 2, zu berechnen. Die Ergebnisse der durchschnittlichen OD-Werte wurden in "x" substituiert, während "m"- und "c"-Werte aus der Regressionslinie der Lignin-Standardkurve gestopft wurden, um die Ligninkonzentration "y" in mg zu erhalten (Tabelle 3, Abbildung 3B). Im nächsten Schritt, um pro 1 mg Ligningehalt zu berechnen, dividieren Sie den "y" -Wert durch das Gewicht der Probe (15 mg) nach der Methanolextraktion. Im folgenden Schritt wurde zur Berechnung pro Gramm (= 1.000 mg) der y/15-Wert mit 1.000 multipliziert. Um % lignin zu erhalten, dividieren wir den y/15-Wert durch 1.000 und multiplizieren ihn mit 100. Der Durchschnitt von Lignin % für drei biologische Replikate (jeder Linie, Probe 1 und Probe 2) wurde zwischen den beiden Versuchslinien Probe 1 (11,7%) und Stichprobe 2 (10,3 %). Die Ligninwerte waren unter den biologischen Replikaten konsistent, was darauf hindeutet, dass die TGA-Methode eine zuverlässige Methode und hochspezifisch zur Messung des Ligningehalts ist. Vergleichsstudien wurden auch zwischen verschiedenen Gewebetypen (Wurzel, Stamm und Blätter) von zwei experimentellen Baumwolllinien durchgeführt, und beide Linien zeigten einen relativ niedrigeren Ligningehalt in Blättern (3,4%) im Vergleich zu Stängeln (9,4% bis 9,9%) und Wurzeln (9,4% bis 9,2%) (Tabelle 4, Abbildung 4).
Abbildung 1: Vorbereitung der pflanzlichen Biomasseprobe. (A) Gesammeltes Baumwollpflanzenmaterial aus Gewächshaus. (B) Vorsichtig umgedrehte Töpfe, um Wurzeln zu trennen. (C) Gründlich in Wasser gewaschen, um den gesamten Schmutz zu entfernen. (D) Getrennte Wurzel-, Stängel- und Blattgewebe. (E) Luftgetrocknetes Gewebe für 2 Tage nach der Trennung des Gewebes. (F) Luftgetrocknetes Gewebe wird 10 Tage lang bei 49 °C in den Inkubator überführt. (G) Biomassemühle wurde verwendet, um biomassenliche Proben zu mahlen. (H) Gemahlene pflanzliche Biomasseproben von Wurzel, Stängel und Blatt. (I) Gemahlene Proben werden in die Mahlfläschchen geladen, in die Gefriermühlenkammer gegeben und in der Gefriermühle mit einer Rate von 10 CPS für 3 Zyklen gemahlen. (J) Gemahlene Durchstechflaschen mit fein gemahlenem Gewebepulver nach dem Mahlen in der Gefriermühle. (K) Fein gemahlenes Gewebepulver von Wurzel, Stängel und Blatt nach Verwendung der Gefriermühle zum Mahlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kritische Schritte bei der TGA-vermittelten Ligninextraktion. Flussdiagramm der kritischen Schritte bei der Ligninextraktion aus pflanzlicher Biomasse zur Ligningehaltsschätzung mit TGA-Methode: 1. Vorbereitung von Pflanzenproben durch ausreichende Trocknung und Vermahlung zu feinem Pulver mit Gefriermühle; 2. 20 mg Gewebepulver wurden PSB-, Methanol- und Wasserwäschen, getrocknetem und extrahiertem alkoholunlöslichem Material unterzogen; 3. Unter Verwendung von TGA und Säure wurde Lignin gefällt; 4. Herstellung der Lignin-Standardkurve unter Verwendung von kommerziellem Bambuslignin; 5. Abschätzung des Ligningehalts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Standardkurvenvorbereitung und Ligninschätzung in der Probe. (A) Tabelle mit verschiedenen Konzentrationen von handelsüblichem Bambuslign, das zur Erzeugung von Lignin-Standardkurve aus Absorptionswerten bei 280 nm verwendet wird. (B) Streudiagramm, das mit excel-Programm unter Verwendung der Werte aus Tabelle A. (C) Balkendiagramme generiert wurden, die den geschätzten Ligningehalt des Wurzelgewebes von Probe 1 und Probe 2 darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Benötigte Bestände | Präparat | ||
| Protein-Solubilisierungspuffer (PSB) | 1 M Tris HCl pH 8,8 und 0,5 M EDTA pH 8,0 | Um 100 ml Arbeitslösung von PSB mit einer Endkonzentration von 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA und 10 % SDS herzustellen, fügen Sie 5 ml 1 M Tris, 1 ml EDTA und 10 g SDS bis 80 ml steriles Wasser hinzu, mischen, lösen und das Endvolumen mit sterilem Wasser auf 100 ml auffüllen. Autoklav bei 121 °C, 15 psi Druck, für 30 min. | ||
| 1 M Tris HCl | Um 100 ml 1 M Tris vorzubereiten, fügen Sie 12,1 g Tris HCl (Molekulargewicht = 121,14 g) in 80 ml Wasser hinzu. Mischen Sie Tris HCl durch Rühren auf einem Magnetrührer, stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 8,8 ein und machen Sie das Volumen mit sterilem Wasser und Autoklaven bei 121 °C, 15 psi Druck, für 30 min auf 100 ml. | |||
| 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraacetsäure) | Um 100 ml 0,5 M EDTA vorzubereiten, fügen Sie 18,6 g EDTA in 70 ml Wasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxidpellets auf 8,0 ein (EDTA löst sich bei pH 8,0 vollständig auf) und machen Sie das Volumen auf 100 ml. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psi Druck, für 30 min. | |||
| 3 N Salzsäure (HCL) | Um 100 ml 3 N HCl vorzubereiten, fügen Sie 26 ml konzentriertes HCL zu 74 ml sterilem Wasser hinzu. | |||
| 4 % Natriumhydroxid (NaOH) | 1 N Natriumhydroxidlösung vorbereiten, 4 g Natriumhydroxid in 90 ml sterilem Wasser hinzufügen, auflösen, das Volumen auf 100 ml auffüllen und bei 121 °C, 15 psi Druck, für 30 min autoklavieren. | |||
Tabelle 1: Herstellung der im Protokoll verwendeten Lösungen. Tabelle, die die Herstellung verschiedener Lösungen zeigt, die im Protokoll verwendet werden.
Tabelle 2: Lignin-Standardkurve von 0,5 mg bis 3,5 mg industriellem Bambus-Lignin. Streudiagramm mit Regressionslinie, die m- und c-Werte anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Lignin-Vorlage zur Berechnung des unbekannten Ligningehalts unter Verwendung von Absorptionsmesswerten von Proben bei 280 nm (als x) und Standardkurvenregressionslinien 'm' und 'c' Aus der Standardkurve. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Ligningehalt aus verschiedenen Geweben (Wurzel, Stängel und Blätter) der Baumwollpflanze im Stadium nach der Blüte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Lignin spielt eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung von Pflanzen und wurde kürzlich umfassend für Biokraftstoff-, Bioenergie- und Bioproduktanwendungen untersucht. Lignin ist reich an aromatischen Verbindungen, die in allen sekundären Zellwänden von Gefäßpflanzen gespeichert sind. Es hat mehrere industrielle Anwendungen wie Holzplattenprodukte, Biodispergiermittel, Flockungsmittel, Polyurethanschäume und in Harzen von Leiterplatten29,30,31. Der größte Teil des aus der Papier- und Zellstoffindustrie erzeugten Lignins wird als Abfall freigesetzt oder zur Wärmeerzeugung verbrannt. So kann Lignin bei effizienter Verarbeitung als Alternative zu den auf fossilen Brennstoffen basierenden Produkten32,33 und der Bioelektrizitätsproduktion34verwendet werden. Daher ist eine genaue Abschätzung des Ligningehalts und der Zusammensetzung für industrielle Anwendungen von entscheidender Bedeutung, da die Zusammensetzung je nach Pflanzenart und Pflanzenorgantyp variiert. Die Haupteinschränkung für die Ligninschätzung ist die Differenz, die sich aus der für die Abschätzung des Ligningehalts gewählten Methodeergibt 35. Die Abschätzungsunterschiede zwischen den verschiedenen Methoden sind in erster Linie auf die Kontamination mit anderen Nicht-Lignin-Komponenten, Schwankungen in der Löslichkeit, die Zugabe neuer Gruppen zu Lignin, den Xylanabbau / die Kontamination, native Strukturveränderungen und den Verlust einiger Ligninfraktionen während der Eliminierung anderer Komponenten zurückzuführen. Darüber hinaus wurden die meisten Ligninprotokolle ursprünglich auf der Grundlage der Holzchemie entwickelt27. Daher besteht ein entscheidender Bedarf an der Erstellung von Ligninprotokollen für krautige Proben, da mehr Kulturpflanzen/ Pflanzenarten für Biokraftstoffe und Bioprodukte vorgesehen sind. Die TGA-Methode schätzt den reinen Ligningehalt basierend auf einer spezifischen Bindung mit TGA. Daher ergibt die Ligninschätzung durch TGA einen niedrigeren Ligningehalt im Vergleich zu Klason- und Acetylbromidmethoden35,36. Dies liegt an der spezifischen Bindung von Lignin mit TGA sowie dem Verlust eines gewissen Ligningehalts während der Ligninfällung (unlöslicher Teil).
Der mit der TGA-Methode geschätzte Ligningehalt ist reproduzierbar und konsistent. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse waren unter den biologischen Replikaten konsistent und zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen zwei Linien, was auf die Zuverlässigkeit der TGA-Methode für die Ligninschätzung hindeutet. Für die Reproduzierbarkeit der Daten und die genaue Abschätzung des Ligningehalts ist es wichtig, die Schritte zu befolgen und die folgenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen. Die Einbeziehung von Positivkontrollen in verschiedenen Konzentrationen, die von 0,5 mg bis 5 mg in drei Replikaten reichen, und deren Verarbeitung zusammen mit Proben aus dem TGA-Schritt vermeidet experimentelle Fehler und führt zu einer präzisen Abschätzung des Ligningehalts. Die Standardkurve muss für jeden Satz von Stichproben generiert werden und die Regressionslinienstatistik R2 muss im Bereich von 97% bis 99% liegen. Das genaue Gewicht des leeren Rohrs und des getrockneten Methanol-extrahierten Gewebes ist entscheidend für die genaue Schätzung des Ligningehalts. Darüber hinaus beeinflussen verschiedene Faktoren wie das spezifische Stadium der Pflanzen, die Wachstumsbedingungen, die Genotypen, die Art des Gewebes und das Alter der Pflanze den Ligningehalt30,37,38. Daher ist es wichtig, alle experimentellen Linien in der gleichen Umgebung zu züchten und die gleiche Art von Geweben gleichzeitig zu ernten. Die Ergebnisse der aktuellen Studie zeigten einen erwarteten Trend zu einem niedrigeren Ligningehalt in den Blättern, einem höheren Ligningehalt in Stängeln und Wurzeln und zeigten die Anwendbarkeit dieser Methode auf verschiedene Pflanzengewebe. Darüber hinaus deuteten weniger Variationen zwischen biologischen Replikaten darauf hin, dass TGA den reproduzierbaren Ligningehalt in allen Pflanzengeweben abschätzen kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Wir danken dem Department of Plant & Soil Science und Cotton Inc. für die teilweise Unterstützung dieser Studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
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