Summary
Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.
Abstract
Bu makale, hücre hattında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA'sını ve insan hava yolu epitelinin üç boyutlu (3D) kültürlerini görselleştirmek için immünofluoresans ile birlikte in situ hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, prob lokalizasyonu tarafından başlatılan HCR'ye güvenerek viral RNA'nın son derece spesifik ve hassas görselleştirilmesine izin verir. Bölünmüş başlatıcı problar, floresan etiketli amplifikatörler tarafından sinyalin güçlendirilmiş hale gelir ve konfokal mikroskopide ihmal edilebilir arka plan floresan ile sonuçlanır. Amplifikatörlerin farklı floresan boyalarla etiketlenerek çeşitli hedeflerin aynı anda tanınmasını kolaylaştırır. Bu da, dokulardaki enfeksiyonun haritalandırılmasının viral patogenez ve replikasyonunu tek hücre düzeyinde daha iyi anlamasını sağlar. Bu yöntemin immünofluoresans ile birleşmesi, konak epigenomunun değişimi ve immün yanıt yolları da dahil olmak üzere konak-virüs etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Hassas ve spesifik HCR teknolojisi sayesinde, bu protokol bir tanı aracı olarak da kullanılabilir. Tekniğin, gelecekte ortaya çıkabilecek kodlamayan RNA'lar ve RNA virüsleri de dahil olmak üzere herhangi bir RNA'nın algılanmasını sağlamak için kolayca değiştirilebileceğini hatırlamak da önemlidir.
Introduction
SARS-CoV-2, 2019'un sonunda ortaya çıkan ve birkaç ay sonra benzeri görülmemiş bir pandemiye neden olan yeni bir insan betakoronavirüsüdür. Virüs bilimde yeni olduğu için biyolojisinin çoğu ve konak hücreler üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, temel biyolojik özellikleri ve konak üzerindeki etkileri anlaşılacaksa, enfeksiyon sırasında virüs-hücre ve -doku tromizminin haritalandırılması önemlidir. Biyokimyasal, biyolojik ve fiziksel tahliller de dahil olmak üzere virüs konak etkileşimlerini incelemek için çeşitli teknikler kullanılır. In situ hibridizasyon, bir hücre veya dokudaki belirli DNA veya RNA dizilerine lokalize olan etiketli tamamlayıcı DNA, RNA veya değiştirilmiş nükleik asit probları kullanan yaygın bir yöntemdir.
Bir HCR1ile sinyal-gürültü oranını yükselterek hassasiyeti artırmak için değişiklikler içeren yeni bir RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) yöntemi geliştirilmiştir. HCR, RNA lokalizasyonunun tek hücre düzeyinde incelenmesine izin verir. Yüksek özgüllüğü, duyarlılığı ve çözünürlüğü nedeniyle, bu yöntem sadece temel bilim çalışmaları için değil, aynı zamanda uygulama projeleri için de yararlıdır, örneğin teşhis. Son zamanlarda, bu yöntemin fizibilitesi, tamamen farklılaştırılmış 3D insan hava yolu epitel (HAE) kültürleri içinde siliated hücrelere lokalize SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için gösterilmiştir2. HAE kültürleri, "doğal enfeksiyon" mikroçevrimiz3,4bağlamında viral enfeksiyonu incelemek için kullanılan en gelişmiş araçlardan birini oluşturur.
SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere insan koronavirüsleri (HCoV) hakkında çeşitli raporlar, HCoV enfeksiyonu ve patofizyolojisi açısından epigenetik değişikliklerin önemini vurgulamaktadır [5'tegözden geçirilmiştir ], örneğin, anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE-2) reseptörü6,7'yikodlayan genin metilasyon deseni. İlginçtir ki, kütle spektrometrik taraması SARS-CoV-2 proteom8ile etkileşime giren birkaç epigenetik faktör tanımladı. Daha spesifik olarak, yapısal olmayan protein 5 (NSP5) epigenetik regülatöre bağlanır, histone deacetylaz 2 ve katalitik olarak inaktif NSP5 (C145A) tRNA metiltransfeaz 1 (24) ile etkileşime girer. Ek olarak, NSP16 metiltransferaz aktivitesi metiltransferaz inhibitörü, sinefungin9tarafından engellenir. Ancak bu epigenetik faktörlerin COVID-19'daki kesin rolü belirsizliğini korumaktadır. HCoV replikasyonu enfekte hücrenin sitoplazmında gerçekleşir ve epigenetik değişikliklerle düzenlenen enflamatuar yanıtları tetikler10.
Örneğin, HCoV-229E nükleer faktör-kappa B sinyalini ince ayarlar ve belirli bölgelerde H3K36 ve H4K5'in asetilasyonını artırarak konak hücresel kromatin manzarasını derinden yeniden programlar11. Orta Doğu solunum sendromuna bağlı koronavirüs enfeksiyonu H3K27me3 seviyelerini arttırır ve spesifik interferon duyarlı genlerin alt kümelerinin promotör bölgelerinde H3K4me3'ün tükenmesi12. Ek olarak, viral RNA, flavivirüsler13, retrovirüsler 14,15ve koronavirüsler16için gösterildiği gibi hücre immün yanıtlarını tetikler. Viral RNA'daki epigenetik belirteçler, insan immün yetmezlik virüsünün m7A metilasyonunda gösterildiği gibi hücresel sensörler tarafından tanınmada rol oynayabilir-1 RNA17. Bununla birlikte, sorular devam etmektedir: SARS-CoV-2 RNA'nın bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisi nedir ve epigenetik izler söz konusu mudur?
Burada, hücre hatlarının ve 3D dokuların (tamamen farklılaştırılmış HAE) immünofluoresans analizi ile birlikte optimize edilmiş bir RNA-FISH yöntemi tanımlanmıştır. FISH ve immunofluorescence gibi sitolojik yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, HCR tabanlı bu yeni nesil in situ hibridizasyon yöntemi hiçbir zaman virüs tespiti için kullanılmamıştır (yeni bir yayın hariç)2. Genel olarak, immünostaining ve FISH aşağıdaki adımları gerektirir: probların veya antikorların penetrasyonunu sağlamak için permeabilizasyon; hücresel malzemenin sabit ve korunduğu sabitleme; antikorların veya nükleik asit problarının uygulandığı tespit; ve son olarak, görselleştirme için örneklerin montajı.
Mevcut protokoller bu genel özellikleri paylaşsa da, ilgili parametrelere göre belirgin bir şekilde değişir. Burada, HAE kültürlerinde ve Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA'sını tespit etmek için optimize edilmiş, basit, immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Teknik aşağıdaki adımları içerir: (1) paraformaldehitli hücrelerin sabitlenmesi; (2) deterjan veya metanol (MeOH) ile permeabilizasyon; (3) dereceli bir dizi MeOH çözümü ile rehidrasyon (yalnızca HAE kültürleri); (4) algılama; (5) SARS-CoV-2 RNA'yı tespit etmek için HCR teknolojisini kullanarak amplifikasyon; (6) immünostaining; ve (7) konfokal mikroskop altında görüntüleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tampon hazırlığı
- 500 mL 2x PHEM tampon için, 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-etanesülfonic asit) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazine etanesülfonic asit (HEPES), 3.8 g etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) ve 0.99 g magnezyum sülfat (MgSO4). Damıtılmış su (dH2O) ile hacmi ~400 mL'ye kadar yapın, karıştırın ve 10 M potasyum hidroksit (KOH) veya sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak pH'ı 7,0'ye ayarlayın. Son sesi 500 mL'ye kadar yapın ve ardından 50 mL aliquots'a bölün. Gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.
NOT: pH 7.0'a ulaşana kadar arabellek temiz olmayacaktır. - %37 w/v paraformaldehit (PFA) stok çözeltisi hazırlayın. 50 mL için, bir cam şişede 18,5 g PFA ve 35 mL dH2O karıştırın. Şişeyi ısıtmalı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. 900 μL 1 M KOH veya NaOH ekleyin ve çözelti netleşene kadar karıştırın. Soğumaya bırakın ve 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın; dH2O ile 50 mL'ye kadar yükleme. Çözelti gerekli olana kadar -20 °C'de saklanabilir.
NOT: Formaldehit, koruyucu eldiven ve laboratuvar önlüğü giyerken duman kaputunda ele alınmalıdır. - Fiksasyon tamponunu hazırlayın (%3,7 PFA PHEM ile arabelleğe alındı). 50 mL için, 50 mL konik santrifüj tüpünde 5 mL% 37 PFA çözeltisi, 25 mL 2x PHEM tamponu ve20mL dH 2 O'nu birleştirin. Gerekli olana kadar -20 °C'de saklayın.
NOT: Çözdükten sonra tampon 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. - PBST'i hazırlayın (1x fosfat tamponlu salinde [PBS]) %0,1 Ara-20). 50 mL için, 50 μL% 100 Ara-20 ila 50 mL 1x PBS ekleyin ve iyice karıştırın.
NOT: Çözelti oda sıcaklığında (RT) saklanabilir. - MeOH/PBST'yi 3:1, 1:1 ve 1:3 oranlarında birleştirerek rehidrasyon tamponları hazırlayın (her birinin 100 mL'lik son hacmi; bkz. Tablo 1).
NOT: MeOH çok toksik ve yanıcıdır. Optik sinire zarar verebildiğinden, herhangi bir açık alevden kaçınarak duman kaputunda ele alınmalıdır. MeOH ve PBST'nin karıştırılması eksotermik reaksiyon oluşturduğundan, çözeltileri buz üzerinde birleştirin. - 1000 mL 20x SSC için, 175,3 g sodyum klorür (NaCl) ve 88,2 g sodyum sitratını bir beherde birleştirin ve çözünene kadar 800 mL dH2O. Stir ile doldurun ve NaOH kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Toplam 1000 mL hacme dH2O ekleyin ve 0,22 μm'lik bir filtreden otomatik kapatılmış bir şişeye otoklavlayın veya filtreleyin.
- 50 mL 5x SSCT için, 12,5 mL 20x SSC tamponu 37,5 mL dH2O ile birleştirin ve %100 Ara-20'nin 50 μL'sini ekleyin. İyice karıştırın.
- %50 5x SSCT/%50 PBST'nin 50 mL'si için, 5x SSCT'nin 25 mL'sini 25 mL PBST ile birleştirin.
- 50 mL 2x SSC için, 5 mL 10x SSC tamponu 45 mL dH2O ile birleştirin.
NOT: Tüm SSC arabellekleri karanlıkta RT'de saklanmalıdır.
2. Hedef tanımı, problar ve amplifikatörler
- Amplifikatörler ve problar tasarlamak için üreticinin web sitesinde bulunan araçları kullanın. Probların SARS-CoV-2 N geninin ters DNA ipliğini tamamlayıcı olduğundan emin olun (Ek Şekil 1).
- En iyi prob kümesi boyutunu belirleyin (görselleştirme için 20 prob kümesi yeterlidir).
- Hedef RNA algılaması için kullanılan amplifikatörleri ayarlayın.
- Alexa Fluor 647 etiketli HCR amplifikatörü B1 kullanın.
NOT: Bir HCR amplifikatörü, h1 ve h2'nin metastable HCR saç tokalarından oluşur. Çoklayıcılı denemeler bu protokol kullanılarak tasarlanabilir. Bu planlanmışsa, her hedef RNA'nın aynı örnek içinde görüntülenecek farklı bir HCR amplifikatörü (B1, B2, ...) seçin (örneğin, hedef 1 için amplifikatör B1, hedef 2 için amplifikatör B2, ...).
- Alexa Fluor 647 etiketli HCR amplifikatörü B1 kullanın.
3. Hücre kültürü ve SARS-CoV-2 ile enfeksiyon
- Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında %5 fetal sığır serumu içeren Kültür Vero (maymun böbrek epitel hücreleri) hücreleri.
- 12 kuyulu bir tabakta kapak örtülerine (No. 1, 15 × 15 mm) 50.000 hücre tohumu.
- Geçirgen Transwell kesici uç desteklerinde18 olarak tanımlandığı gibi tamamen farklılaştırılmış HAE kültürlerini bir membran (çap = 6,5 mm) ve bronşiyal epitel büyüme ortamında tamamen birleştiğinde kültür hazırlayın.
- Virüs enfeksiyonu
- ML başına 1000x ortanca doku kültürü enfeksiyöz dozunda (TCID50)SARS-CoV-2 ile hücreleri aşıla
- Hücreleri 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatır.
- İlişkisiz virüsü temizlemek için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
- 48 saat boyunca kültür hücreleri.
4. Kapaklar üzerinde kültürlenmiş Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA-FISH
1. GÜN
- Hücreleri sabitleme ve nüfuz etme
- RT'de 1 saat boyunca %3,7 w/v PFA çözümü ile enfekte olmuş hücreleri düzeltin.
- %3,7 PFA çözeltisini emiş ve hücreleri 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın.
- RT'de 10 dakika pbst çözeltisi ile hücreleri ajitasyon ile permeabilize edin.
- PBST'yi aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Algılama
- 1x PBS çözeltisini epire edin ve hücreleri RT'de 2x SSC ile iki kez yıkayın.
- 2x SSC çözeltisini epire edin ve en az 300 μL prob hibridizasyon tamponu ekleyerek numuneleri önceden dengeler. Hücreleri içeren kuyuları örtün ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Prob hibridizasyon tamponuna 1,2 pmol prob karışımı ekleyerek prob çözümünü hazırlayın.
- 300 μL çalışma stoğu hazırlamak için 1 μM prob stoğunun 1,2 μL'sini kullanın.
- Prehidrizasyon çözeltisini çıkarın ve kapakları nemlendirilmiş bir odaya aktarın.
- Pipet 30-50 μL prob çözeltisi parafilm üzerine bireysel damlacıklar oluşturmak için.
- Numuneleri 37 °C'de bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.
2. GÜN - Kapakları tekrar 12 kuyulu bir tabağa aktarın ve 37 °C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 5 dakika yıkayarak fazla prob çözeltisini çıkarın.
NOT: 30-50 μl aliquots'u parafilme ve kuluçka için kapak altlarına yerleştirmeye alternatif olarak, 12 kuyulu bir plakadaki kapaklara doğrudan 300 μL prob çözeltisi ekleyin. Bu prosedür daha basittir, ancak önemli miktarda reaktif gerektirir. Kullanmadan önce prob yıkama tamponu 37 °C'ye ısıtın. Gereken tampon miktarını hesaplayın ve 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. - RT'de 5x SSCT ile numuneleri 2 x 5 dakika yıkayın.
- 5x SSCT solüsyonunun yerine 1x PBS kullanın ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.
- Amplifikasyon
- 1x PBS çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her kuyuya en az 300 μL amplifikasyon tamponu ekleyin. RT'de örnekleri 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- İstediğiniz hacmi ayrı tüplerde snap soğutma ile her bir HCR saç tokasını (h1 ve h2) hazırlayın.
- 300 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için her saç tokasının 18 pmolünü kullanın (örneğin, 300 μL için 3 μM stok saç tokası çözeltisinin 6 μL'sini kullanın).
- Saç tokası çözeltisini tüplere aktarın.
- 90 sn için 95 °C'de kuluçkaya yatır.
- Karanlıkta 30 dakika RT'ye soğutun.
- Ek soğutmalı "h1" ve "h2" saç tokalarını amplifikasyon tamponuna ekleyerek bir saç tokası karışımı hazırlayın.
- Parafilm üzerine 30-50 μL saç tokası karışımı damlaları yerleştirin.
- RT'de örnekleri karanlıkta bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.
3. GÜN - Kapakları tekrar 12 kuyu plakasına aktarın ve RT'de 5x SSCT ile 5 x 5 dakika boyunca ajitasyonla yıkayarak fazla saç tokalarını çıkarın.
- 5x SSCT arabelleğini aspire edin ve 1x PBS ile değiştirin.
NOT: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofluoresans testinde kullanın, ardından çekirdeklerin lekelenmesini takip edin (bkz. bölüm 5).
- Nükleer boyama ve kayma montajı
- 1x PBS çözeltisini epire edin ve 1x PBS çözeltisinde 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 0.2 μg / mL) ile değiştirin.
- Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Montaj ortamının her birine 10 μL'lik iki damla yerleştirin; damlaların tek bir kaydırağa iki kapaklı yerleştirilmesine izin vermek için yeterince ayrıldığından emin olun.
- Kapakları temiz bir havluya dokunarak fazla sıvıyı çıkarın ve ardından hücreler aşağı bakacak şekilde antifade montaj ortamına yerleştirin.
- Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru, düz bir yüzeye yerleştirin ve tedavi etmelerine izin verin.
- Kürlemenin ardından, numunelerin kurumasını önlemek için kapak kapaklarının kenarlarını VALAP dolgu macun veya oje ile kapatın.
5. HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA-FISH
1. GÜN
- HAE kültürünü sabitleme ve permeabilizasyon
- Ortamı aspire edin ve RT'de 1 saat boyunca% 3.7 PFA çözeltisi kullanarak enfekte hücreleri sabitle.
- %3,7 PFA çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Transwell kesici ucun altında %3,7 PFA çözümünü 1x PBS ile değiştirin.
- PBS'yi atın ve %100 MeOH önsezikli -20 °C'ye kadar 2 x 5 dakikalık yıkamalar kullanarak numuneleri susuz verin.
- İkinci yıkamadan sonra, Transwell kesici ucun altında permeabilizasyon için tamponu taze, soğutulmuş MeOH ile değiştirin. Gece boyunca -20 °C'de saklayın.
2. GÜN
- Rehidrasyon
Numuneleri buz üzerinde dereceli bir dizi MeOH/PBST çözeltisi (her biri 5 dakika boyunca) ile yeniden sulendir: %75 MeOH/%25 PBST, %50 MeOH/%50 PBST, %25 MeOH/%75 PBTS ve %100 PBST (iki kez).- Hücreleri % 50 5x SSCT / % 50 PBST ile buzda 5 dakika yıkayın.
- Hücreleri 5x SSCT ile buzda 5 dakika yıkayın.
- 5x SSCT arabelleği 1x PBS ile değiştirin.
- Algılama
- Hücreleri (Transwell kesici ucunun içinde) 100 μL prob hibridizasyon tamponu ile buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, plakayı 37 °C'de (prehidrizasyon) 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
NOT: Prob hibridizasyon tamponu kullanılmadan önce önceden 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Gerekli hacmi hesaplayın: Tek bir Transwell kesici uç için 100 μL gereklidir. - Prob çözeltisini hazırlayın. 1 mL prob çözeltisi 4 pmol prob gerektirdiğinden, 1 mL prob hibridizasyon tamponuna 4 μL 1 μM prob stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
NOT: RNA algılama için Transwell kesici uç başına 100 μL prob çözeltisi kullanın. Prob çözeltisini önhidrizasyon adımının sonuna kadar buzda bırakın. - Prehidrizasyon çözeltisini çıkarın ve prob çözeltisini ekleyin.
- Hücreleri 37 °C'de bir gecede (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.
3. GÜN - Fazla probu 37 °C'de 100 μL prob yıkama tamponu ile 4 x 15 dakika yıkayarak çıkarın.
- Rt'de 5x SSCT ile numuneleri 2 x 5 dakika yıkayın.
- 5x SSCT'yi 1x PBS ile değiştirin ve numuneleri amplifikasyona kadar 4 °C'de saklayın.
- Hücreleri (Transwell kesici ucunun içinde) 100 μL prob hibridizasyon tamponu ile buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, plakayı 37 °C'de (prehidrizasyon) 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
- Amplifikasyon
- Rt'de 30 dakika boyunca amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek numuneleri önceden örnekle.
- İstediğiniz hacimleri ayrı tüplerde soğutarak her saç tokasını hazırlayın.
- 500 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için, her saç tokasının 30 pmolunu kullanın (örneğin, 500 μL için 10 μL 3 μM stok saç tokası çözeltisi kullanın).
- Saç tokası çözeltisini tüplere aktarın.
- 90 sn için 95 °C'de kuluçkaya yatır.
- Karanlıkta 30 dakika RT'ye soğutun.
- RT'de 500 μL amplifikasyon tamponuna tüm snap soğutmalı saç tokalarını ekleyerek saç tokası çözümünü hazırlayın.
- Önamplifikasyon çözümünü çıkarın ve tam saç tokası çözeltisini ekleyin.
- Karanlıkta RT'de numuneleri gece boyunca (12-18 saat) kuluçkaya yatırın.
- RT'de 5x SSCT ile yıkayarak fazla saç tokalarını şu şekilde çıkarın: 2 x 5 dk, 2 x 15 dk ve 1 x 5 dk.
- 5x SSCT solüsyonunun yerine 1x PBS kullanın ve 4 °C'de 2-3 günden fazla saklamayın veya doğrudan nükleer lekeleme işlemine geçin.
NOT: Gerekirse, RNA-FISH örneklerini standart bir immünofluoresans testinde ve ardından nükleer boyamada kullanın (bkz. bölüm 6).
- Nükleer boyama ve kayma montajı
- 1x PBS çözeltisini epire edin ve 1x PBS'de DAPI çözeltisi (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
- Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Transwell kesici uçlardan kesilen membranı, hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL antifade montaj ortamına yerleştirin ve membrana ekstra montaj ortamı (5 μL) ekleyin.
- Zarları kapakçıklarla örtün.
- Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru ve düz bir yüzeyde iyileştirin.
- Kürlemenin ardından, numunelerin kurumasını önlemek için kapak kapaklarının kenarlarını VALAP dolgu macun veya oje ile kapatın.
6. Vero hücrelerinin ve HAE kültürlerinin immünoresans analizi
NOT: Hücre hatları için 3. günde veya HAE kültürleri için 4. günde immünofluoresans testini gerçekleştirin. Her model için farklı bir yaklaşım kullanın. Tüm farklılıklar açıkça belirtilmiştir.
- Kuyulardan 1x PBS çözeltisini epire edin.
- PBST çözeltisinde %1 w/v sığır serum albümin ile örnekleri 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübasyonla engelleyin.
- Blokaj çözeltisinde uygun seyreltmeler hazırlayarak birincil antikorları hazırlayın ve kuluçkaya yatırın.
- Kapaklardaki Vero hücreleri için:
- Antikor çözeltisinin damlalarını (30-50 μL) bir nem odasında parafilmin üzerine yerleştirin.
- Kapakları, hücreler aşağı bakacak şekilde antikor damlalarının üzerine yerleştirin.
- HAE için kesici uçlardaki blokaj maddesini antikor çözeltisi (100 μL) ile değiştirin ve numuneleri nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
NOT: Birincil antikor ile her inkübasyon için zamanı ve sıcaklığı ayarlayın. Tipik parametreler RT'de 2 saat veya 4 °C'de bir gecededir.
- Kapaklardaki Vero hücreleri için:
- Örnekleri PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
- Kapaklardaki hücreler için 12 kuyulu bir tabağa aktarın ve PBST çözeltisi ekleyin.
- HAE kültürleri için antikor çözeltisini PBST çözeltisi ile değiştirin.
- Konfokal mikroskop için mevcut ışık kaynaklarını ve filtreleri kontrol edin.
- Konak türlerine göre ikincil antikorları seçin. Florofor parametrelerini seçin (mevcut ışık kaynağına göre heyecan ve emisyon dalga boyları, spektrum genişliği ve heyecan verimliliği).
NOT: Spektral parametreler çevrimiçi araçlar kullanılarak modellenebilir (bkz. Malzeme Tablosu). - Uygun ikincil antikor çözeltilerini blokaj çözeltisi ile seyrelterek hazırlayın.
- sekonder antikorlarla kuluçkaya yatırın (6.3'te olduğu gibi), ancak 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Örnekleri adım 6.4'teki gibi yıkayın.
- Nükleer boyama ve kayma montajı
- Kapaklardaki hücreler için
- PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
- Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Kapakları, hücreler aşağı bakacak şekilde 10 μL montaj ortamı damlalarına yerleştirin.
- Kapakları oje ile kapatın.
- HAE kültürleri için
- 1x PBST'yi aspire edin ve 1x PBS çözeltisinde DAPI (0,2 μg/mL) ile değiştirin.
- Karanlıkta RT'de örnekleri 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- DAPI çözeltisini epire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- Kesme zarlarını hücreler yukarı bakacak şekilde 10 μL montaj ortamının damlalarına yerleştirin ve zara ekstra (5 μL) montaj ortamı ekleyin.
- Zarları kapakçıklarla örtün.
- Kapakları oje ile kapatın.
- Kapaklardaki hücreler için
7. Konfokal mikroskopi
- Kullanılan floroforları belirterek parçaları tanımlayın.
- Tarama modunu ve hızını seçin.
- Her florofor için lazer gücünü, kazancını ve ofset değerlerini ilgili negatif kontrollerle karşılaştırarak ayarlayın: virüs, sahte enfekte hücreler için; hücresel proteinler için, uygun bir konaktan izotip kontrol antikorları ile lekelenmiş örnekler.
- 3B görüntü elde etmek için z yığını modunu etkinleştirin ve üst ve alt sınırları ayarlayın. Adım boyutunu/numarasını ayarlayın.
NOT: Koronavirüs görüntüleme hakkında dahafazla bilgi için, bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda açıklanan immün-RNA-FISH protokolü iki hücresel sistem kullanılarak gerçekleştirilmiştir: Bir Vero hücre hattı ve 3D HAE kültürü. Her iki hücresel model için ana adımlar Tablo 2. SARS-CoV-2'nin HAE kültürlerinde görselleştirilmesi için RNA-FISH protokolü, doku örnekleri için tipik olan adımları içerir, yani% 100 MeOH ile permeabilizasyon ve dereceli bir Dizi MeOH-PBS ve% 0.1 Ara çözeltisi ile rehidrasyon. RNA-FISH tamamlandıktan sonra immünoresans yapıldı. Zstack görüntüleri elde edildi ve işlendi.
Şekil 1, sars-CoV-2 ile enfekte olmuş sahte aşılanmış kontrol Vero hücrelerinde veya hücrelerinde immün RNA FISH'i göstermektedir. Şekil 2, sars-CoV-2 ile enfekte olmuş sahte aşılanmış kontrol HAE kültürlerinde veya kültürlerinde immün RNA FISH'i göstermektedir. Şekil 3, Vero hücrelerindeki permeabilizasyon protokolünün optimizasyonunu göstermektedir: PBS'de RT'de 5 dakika boyunca -20 °C'de gece boyunca %70 etanol veya %0,1 Ara-20. Deterjanla permeabilizasyon SARS-CoV-2 subgenomik RNA için net ve spesifik bir sinyalle sonuçlanırken, etanol kullanımı bulanık bir odaklanmamış görüntü ile sonuçlanır.
Şekil 1: Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA ve β-tubulin tespit etmek için immuno-RNA-FISH. SARS-CoV-2 subgenomik RNA'nın (A) enfekte ve (B) sahte aşılanmış Vero hücrelerinde lokalizasyonu. Viral RNA FISH (kırmızı) tarafından görselleştirildi. β-tubulin, fare β5tubulin (1:100, 4 °C'de gece kuluçka) ve Alexa florofor 488 konjuge sekonder antikorlara (RT'de 1:400, 1 saat inkübasyon) karşı antikorlarla lekelenir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Her görüntü tek bir konfokal düzlemdir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; BALIK = floresan in situ hibridizasyon; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SARS-CoV-2 ile enfekte olmuş insan hava yolu epitel hücreleri. SARS-CoV-2 subgenomik RNA'nın(A)enfekte ve (B) sahte aşılanmış HAE kültürlerinde lokalizasyonu. Viral RNA FISH (kırmızı) tarafından görselleştirildi. Siliated hücreler fare β5-tubulin (1:100, 4 °C'de gecelik inkübasyon) ve Alexa florofor 488 konjuge sekonder antikorlara (RT'de 1:400, 1 saat inkübasyon) karşı antikorlar kullanılarak görselleştirilir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Her görüntü, konfokal görüntü yığınlarından (kalınlık = 3 μm) yeniden yapılandırılmış maksimum projeksiyonu temsil eder. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; BALIK = floresan in situ hibridizasyon; HAE = insan hava yolu epitel; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vero hücreleri için permeabilizasyon koşullarının optimizasyonu. PBS'de %0,1 Ara-20 ile(A) %70 etanol ve(B)ile Vero hücrelerinin permeabilizasyonu. Deterjanla permeabilizasyon SARS-CoV-2 subgenomik RNA için net bir spesifik sinyalle sonuçlanırken, etanol bulanık bir görüntüyle sonuçlanır. Viral RNA kırmızı renkte gösterilir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Her görüntü, konfokal görüntü yığınlarından (kalınlık = 3 μm) yeniden yapılandırılmış maksimum projeksiyonu temsil eder. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: SARS-CoV-2 = şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2; PBS = fosfat tamponlu salin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: SARS-CoV-2 N gen dizisi (5'-3') Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| arabellek | Metanol hacmi [mL] | PBST Hacmi [mL] |
| %75 MeOH/%25 PBST | 75 | 25 |
| %50 MeOH/%50 PBST | 50 | 50 |
| %25 MeOH/%75 PBST | 25 | 75 |
| %100 PBST | 0 | 100 |
| toplam | 100 mL | |
Tablo 1: Rehidrasyon için degrade metanol/PBST çözeltilerinin hazırlanması. Mutlak metanolde (MeOH) gece kuluçkadan sonra insan hava yolu epitel örneklerini yeniden sulandırmak için, ortamın yavaş bir değişimi gereklidir. Bunu yapmak için, MeOH ve PBST (1x fosfat tamponlu salinde% 0.1 Ara-20) oranlarının kademeli olarak değiştiği tamponlarla inkübasyon yaparak yavaş değişim gerçekleşmelidir. Her çözümün 100 mL'sini hazırlamak için yeterli olan reaktif hacimleri, çeşitli deneyler yapmak için yeterlidir.
| modül | adım | Vero hücreleri | HAE kültürleri |
| RNA Floresan yerinde hibridizasyon (RNA FISH) | Fiksasyon | (%3,7 PFA) Oda sıcaklığında 10-40 dk veya oda sıcaklığında geceleme | |
| Permeabilizasyon | (PBST: 1x PBS'de % 0,1 Ara-20) Oda sıcaklığında 10 dk | (0.1% Ara-20 1x PBS içinde) Oda sıcaklığında 2 × 5 dk | |
| (%100 MeOH) -20 °C'de geceleme | |||
| Rehidrasyon | (Dereceli metanol (MeOH)/PBST) 5 x 5 dk, %50 5x SSCT/PBST yıkama 5 dk, 5x SSCT yıkama 5 dk buz üzerinde | ||
| Algılama (ön hibridizasyon) | (Prob hibridizasyon tamponu) 37 °C'de 30 dk, 200-300 μL | (Prob hibridizasyon tamponu) Buz üzerinde 5 dk, daha sonra 37 °C'de 30 dk, 100 μL | |
| Algılama | (Prob çözeltisi) 37 °C'de 12-18 saat, 30 - 50 μL | (Prob çözeltisi) 37 °C'de 12-18 saat, 100 μL | |
| Prob yıkama | (Prob yıkama tamponu) 4 x 5 dk | (Prob yıkama tamponu) 4 x 15 dk | |
| (5 × SSCT) 2 x 5 dk | |||
| Amplifikasyon (ön amplifikasyon) | (Amplifikasyon tamponu) Oda sıcaklığında 30 dk, 200-300 μL | (Amplifikasyon tamponu) Oda sıcaklığında 30 dk, 100 μL | |
| Amplifikasyon | (Amplifikatör çözeltisi) Karanlık yerde oda sıcaklığında 12-18 saat, 30-50 μL | (Amplifikatör çözeltisi) Karanlık yerde oda sıcaklığında 12-18 saat, 100 μL | |
| Amplifikatör yıkama | (5x SSCT) 5 x 5 dk | (5x SSCT) 2 x 5 dk, 2 x 15 dk, 1 x 5 dk | |
| ImmunoFluorescence (IF) | Engelleme | (PBST'de %1 BSA) 37 °C'de 30 dk | |
| Primer antikor inkübasyonu | (Blokaj çözeltisinde uygun konsantrasyonun antikor çözeltisi) 2 saat oda sıcaklığında / gece boyunca 4 °C, 30-50 μL | (Blokaj çözeltisinde uygun konsantrasyonun antikor çözeltisi) 2 saat oda sıcaklığında / gece boyunca 4 °C, 100 μL | |
| Birincil antikor yıkama | (PBST) Oda sıcaklığında 3 x 5 dk | ||
| İkincil antikor inkübasyonu | (Blokaj çözeltisinde uygun konsantrasyonun antikor çözeltisi) 37 °C'de 1 saat, 30-50 μL | (Blokaj çözeltisinde uygun konsantrasyonda antikor çözeltisi) 37 °C'de 1 saat, 100 μL | |
| İkincil antikor yıkama | (PBST) Oda sıcaklığında 3 x 5 dk | ||
| Nükleer boyama | (DAPI çözeltisi) Oda sıcaklığında 10 dk, ardından 1x PBS ile 2 x 5 dk | ||
Tablo 2: Hücre hatlarında ve HAE kültürlerinde Immuno-RNA-FISH protokolünün iş akışı. Immuno-RNA-FISH her iki hücresel modelde de uygulanabilir, ancak farklı yaklaşımlar gerektirir. Ana adımlar, kullanılan tamponlarla birlikte (parantez içinde), ardından kuluçka süresi ve sıcaklığı gösterilir. Birkaç adımda, hesaplamaları basitleştirmek için numune başına inkübasyon reaktif hacmindeki kritik farklılıklar verilmiştir. Hacim belirtilmezse, örneği (genellikle 200 μL) ajitasyonla tamamen kaplar şekilde keyfi olarak seçilir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; HAE = insan hava yolu epitel; PFA = paraformaldehit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; BSA = sığır serum albümin; PBS = fosfat tamponlu salin; MeOH = metanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-RNA-FISH, RNA ve hücresel proteinlerin çift boyanma için güvenilir bir yöntemdir. Burada, hücre hatlarında ve HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA ve hücresel proteinlerin tespit edilmesine izin veren değiştirilmiş bir immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Bu protokol, hücre monolayerleri veya belirli dokular dahil olmak üzere farklı hücre modellerinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yöntem, uygun prob yerelleştirmesi tarafından başlatılan bir HCR kavramına dayanır. Daha sonra, sinyalin floresan etiketli amplifikatörler tarafından amplifikasyonuna başlamak için bölünmüş başlatıcı probların kullanılması, konfokal mikroskop kullanılarak gözlendiğinde minimum veya hiç arka plan floresan ile sonuçlanır. Amplifikatörler farklı floresan boyalarla etiketlenebilir ve çeşitli hedefleri tanımak için tasarlanmış farklı problarla uyumludur; bu nedenle, aynı anda kullanılabilirler. Bu protokolde açıklanan prosedürler basittir, ancak zaman alıcıdır (3-4 gün). Bununla birlikte, sonuçlar, doğrudan etiketli floresan probları kullanan diğer protokollerin aksine, düşük gürültü-sinyal oranı ile karakterize edilir.
Burada Vero hücreleri ve HAE kültürleri kullanılmıştır. Kapak üzerindeki hücreler ve doku kültüründeki hücreler için farklı protokoller gereklidir. Farklılıkların çoğu, hücreleri (kapakta veya bir zarda) ve kullanılan malzeme miktarlarını işlerken karşılaşılır. Genel RNA-FISH protokolleri, etanol veya metanol çözeltileri kullanılarak permeabilizasyonun yanı sıra -20 °C'de bir gecede inkübasyon gerektirir. Daha da önemlisi, permeabilizasyon için deterjan kullanmak immünofluoresans için daha faydalıdır, prosedürü 1 gün kısaltır ve deneyin daha verimli planlanmasını sağlar. Birincil yaklaşım, istenmeyen etkilerin fark edilip edilmediğini görmek için alkol veya deterjanla permeabilizasyon içeren genel protokolleri takip etmekti. Daha da önemlisi, Vero hücrelerinin% 70 etanol çözeltisi ile gece boyunca permeabilizasyonu belirsiz, bulanık bir sinyalle sonuçlandı; aksine, Tween20 ile permeabilizasyon SARS-CoV-2 RNA'nın net ve spesifik görselleştirilmesine izin verdi ve protokolü 1 gün kısalttı (Şekil 3).
Aynı yaklaşım, -20 °C'de mutlak metanol ile gecelik inkübasyondan sonra HAE kültürleri üzerinde test edildi (doku örnekleri için genel RNA-FISH protokollerine göre) ve RT'de 5 dakika boyunca% 0.1 Tween20. Metanol ile gece boyunca inkübasyon, hiçbir eser olmadan son derece spesifik bir sinyale yol açtı. Daha da önemlisi, metanol tutkalını erittiği için Transwell zarının dekarakrasyonu gözlendi. Bu sorun, zarın ayrılarak ve kapak protokolü ile devam ederek ele alındı. Klasik RNA-FISH prosedürleri, proteinleri temizler ve RNA-protein komplekslerini temizler, hücreleri kimyasallar ve boyalar tarafından delinebilir hale getirdiği için hassasiyeti artırmak için proteinaz K kullanır. Mevcut protokol, proteinAZ K protein lekelemeyi önlediği için bu adımı atladı. Proteinaz K olmadığında RNA-FISH duyarlılığında herhangi bir farklılık gözlenmedi (veriler gösterilmedi).
RNA-FISH'i takiben immünoresans tahlillerinin yapılması RNA sinyalini etkilemedi ve her iki yöntemin de başarılı bir şekilde birleştirilmesiyle sonuçlandı. Bu nedenle, protokolün tamamı RNA'yı ve proteinlerle etkileşimlerini tek hücre düzeyinde görselleştirmenin uygun bir yolunu temsil eder. Not olarak, hücrelerin sabitlenmesi (immün-RNA-FISH için gereklidir), zaman atlamalı deneylerin dinamik olayları tek hücre düzeyinde incelemesine izin vermez. SARS-CoV-2 RNA'nın görselleştirilmesi, bir hücre içinde SARS-CoV-2 replikasyonunun analiz edilmesine ve immünofluoresans ile birleştiğinde, epigenom ile etkileşim de dahil olmak üzere hücre içi SARS-CoV-2 RNA / konak protein etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Son olarak, bu protokol SARS-CoV-2 ve diğer gelişmekte olan virüslerin tek hücreli çözünürlükte tespiti de dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Hassas ve spesifik HCR teknolojisi sayesinde tanı aracı olarak da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma SARS-CoV-2 ile ilgili araştırmalar için Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından ve Ulusal Bilim Merkezi'nden hibelerle desteklendi (UMO2017/27/B/NZ6/02488'i K.P.'ye ve UMO-2018/30/E/NZ1/00874'ü A.K.-P.'ye verir).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
